Thử Nghiệm Sản Xuất Chế Phẩm Em Sử Dụng Xử Lý Môi Trường Nước Ao Nuôi Tôm

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

***000***

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM EM
SỬ DỤNG XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG NƯỚC AO NUÔI TÔM

Giáo viên hướng dẫn:
TS. NGUYỄN THỊ THANH KIỀU

Sinh viên thực hiện:
PHAN QUỐC DƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009


MỤC LỤC
Trang

LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................i
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. iv
Danh sách các hình ..........................................................................................................v
Danh sách các bảng ....................................................................................................... vi
Danh sách các đồ thị..................................................................................................... vii
PHẦN MỞ ĐẦU .............................................................................................................1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................2
1.1 Sinh học sinh thái về tôm sú ..................................................................................2
1.1.1 Đặc điểm phân bố............................................................................................2
1.1.2 Chu kỳ sống.....................................................................................................2
1.1.3 Đặc điểm sinh sản ...........................................................................................4
1.1.4 .Đặc điểm dinh dưỡng.....................................................................................5
1.1.5 Đặc điểm sinh trưởng......................................................................................5
1.2 Chất lượng môi trường nước đối với tôm sú nuôi .................................................5
1.2.1 Về nhiệt độ ......................................................................................................5
1.2.2 Độ mặn ...........................................................................................................6
1.2.3 Độ pH ..............................................................................................................6
1.2.4 Độ trong ..........................................................................................................6
1.2.5 Hàm lượng oxy hòa tan trong nước ................................................................6
1.2.6 Hàm lượng các chất khí độc............................................................................7
1.3 Vi sinh vật sử dụng trong thử nghiệm sản xuất EM ..............................................7
1.3.1 Bacillus subtilis ...............................................................................................7
1.3.2 Bacillus licheniformis ...................................................................................11
1.3.3 Bacillus cereus ..............................................................................................12
1.3.4 Enzyme protease ..........................................................................................13
1.3.5 Đường cong tốc độ sinh trưởng của các chủng vi sinh vật ...........................15
1.3.6 Cơ chế quá trình phân giải hiếu khí ..............................................................17
1.4 Tình hình sử dụng EM trong nước và trên thế giới .............................................17
1.4.1 Chế phẩm EM ...............................................................................................17
1.4.2 Trong nước....................................................................................................17
ii


1.4.3 Trên thế giới ..................................................................................................18
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................20
2.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm ........................................................20

2.1.1 Thời gian .......................................................................................................20
2.1.2 Địa điểm ........................................................................................................20
2.2 Nội dung nghiên cứu............................................................................................20
2.3 Dụng cụ, hóa chất, môi trường ............................................................................20
2.3.1 Dụng cụ, hóa chất..........................................................................................20
2.3.2 Môi trường nuôi cấy......................................................................................20
2.3 Phương pháp thí nghiệm......................................................................................22
2.3.1 Xác định đường cong tốc độ sinh trưởng......................................................22
2.3.2 Thu nhận enzyme thô từ nấm mốc Aspergillus oryzae.................................23
2.3.3 Quy trình thu nhận chế phẩm EM từ chủng Bacillus....................................26
2.3.2 Định lượng chủng Bacillus ...........................................................................27
2.3.4 Tỷ lệ phối trộn các chủng vi sinh vật và protease.........................................28
2.3.5 Phương pháp xử lý ao ...................................................................................28
2.3.6 Phương pháp đánh giá chất lượng nước.......................................................28
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................32
3.1 Đường cong tốc độ sinh trưởng ...........................................................................32
3.2 Xác định hoạt tính enzyme protease ....................................................................35
3.3 Định lượng vi sinh vật của chế phẩm ..................................................................36
3.4 Kết quả phối trộn vi sinh tạo chế phẩm EM xử lý nước ao.................................38
3.5 Xử lý nước ao nuôi thủy sản................................................................................39
3.5.1 Mẫu ban đầu trước khi xử lý vi sinh .............................................................39
3.5.2 Mẫu xử lý vi sinh sau 3 ngày ........................................................................40
3.5.3 Mẫu xử lý vi sinh sau 7 ngày ........................................................................41
3.5.4 Mẫu xử lý vi sinh sau 10 ngày ......................................................................43
3.5.5 Mẫu xử lý vi sinh sau 14 ngày ......................................................................44
3.6 Sự thay đổi của pH...............................................................................................45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................................49
4.1 Kết luận................................................................................................................49
4.2 Đề nghị.................................................................................................................49
Tài liệu tham khảo

Phụ lục
iii


Danh sách các chữ viết tắt
B. subtilis: Bacillus subtilis
B. cereus: Bacillis cereus
B. lichheniformis: Bacillus licheniformis
EM: Effective Microorganisms
COD: Chemical Oxygen Demand (nhu cầu oxygen hóa học)
CFU: Colony Forming Unit (đơn vị mật độ khuẩn lạc)
UI: đơn vị hoạt tính enzyme
g: gram
ml: milliliter
m3: cubic metre
mg: miligam

iv


Danh sách các hình
Hình 1: Vòng đời của tôm sú ..........................................................................................4
Hình 2: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ..................................................................9
Hình 3: Hình thái vi khuẩn Bacillus cereus ..................................................................12
Hình 4: Định lượng Bacillus trên môi trường PGA bằng phương pháp đổ đĩa ............36
Hình 5: Vibrio tổng số ban đầu .....................................................................................39

v

Danh sách các bảng
Bảng 1: Đặc điểm sinh hóa của Bacillus subtilis ............................................................9
Bảng 2: Dựng đường chuẩn tyrosin...............................................................................24
Bảng 3: Cách tiến hành xác định hoạt tính mẫu enzyme ..............................................25
Bảng 4: Mật độ vi khuẩn bacillus subtilis theo OD ......................................................32
Bảng 5: Mật độ vi khuẩn bacillus cereus theo OD........................................................33
Bảng 6: Mật độ vi khuẩn Bacillus licheniformis theo OD ............................................34
Bảng 7: Kết quả đo ΔOD mẫu protease ........................................................................35
Bảng 8: Mật độ khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trường PGA................................36
Bảng 9: Mật độ khuẩn lạc Bacillus cereus trên môi trường PGA.................................37
Bảng 10: Mật độ khuẩn lạc Bacillus licheniformis trên môi trường PGA ....................37
Bảng 11: Thành phần tỷ lệ của chế phẩm......................................................................38
Bảng 12: OD của mẫu ban đầu......................................................................................39
Bảng 14: Hàm lượng amoniac của mẫu sau 3 ngày ......................................................40
Bảng 15: Hàm lượng COD của mẫu sau 3 ngày ...........................................................41
Bảng 16: Hàm lượng amoniac của mẫu sau 7 ngày ......................................................41
Bảng 17: Hàm lượng COD của mẫu sau 7 ngày ...........................................................42
Bảng 18: Hàm lượng vibrio của mẫu sau 7 ngày ..........................................................42
Bảng 19: Hàm lượng amoniac của mẫu sau 10 ngày ....................................................43
Bảng 20: Hàm lượng COD của mẫu sau 10 ngày .........................................................43
Bảng 21: Hàm lượng amoniac của mẫu sau 14 ngày ....................................................44
Bảng 22: Hàm lượng amoniac của mẫu sau 14 ngày ....................................................44
Bảng 23: Hàm lượng vibrio của mẫu sau 14 ngày ........................................................45

vi


Danh sách các đồ thị
Đồ thị 1: Đường cong sinh trưởng Bacillus subtilis......................................................33
Đồ thị 2: Đường cong sinh trưởng chủng Bacillus cereus ............................................34

Đồ thị 3: Đường cong sinh trưởng chủng Bacillus licheniformis .................................35
Đồ thị 4: Biểu diễn sự biến đổi của pH môi trường của mẫu không.............................46
Đồ thị 5: Biểu diễn sự biến đổi của pH môi trường của mẫu BIO-DW........................46
Đồ thị 6: Biểu diễn sự biến đổi của pH môi trường của mẫu 1.....................................46
Đồ thị 7: Biểu diễn sự biến đổi của pH môi trường của mẫu 2.....................................47
Đồ thị 8: Biểu diễn sự biến đổi của pH môi trường của mẫu 3.....................................47
Đồ thị 9: biểu diễn sự biến đổi của pH môi trường của mẫu 4 .....................................47
Đồ thị 10: Biểu diễn sự biến đổi của pH môi trường của mẫu 5...................................48

vii


PHẦN MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề:
Việt Nam là nước đang phát triển, mặt hàng xuất khẩu chủ yếu là nông – ngư – thủy
hải sản do Việt Nam có bờ biển dài rất thuận lợi cho việc nuôi trồng, đánh bắt thủy
sản.
Hiện nay, do tình hình khai thác không hợp lý nên sản lượng tôm tự nhiên ngày càng
cạn kiệt, phần nào đã ảnh hưởng đến sản lượng chung của ngành, nên nghề nuôi tôm
đang giữ một vai trò quan trọng trong ngành nuôi thủy sản.
Trong nghề nuôi tôm yếu tố quyết định thành công gồm: giống, thức ăn và môi trường
nuôi. Để nuôi tôm bền vững người ta sử dụng chế phẩm EM xử lý môi trường trong
quá trình nuôi.
Từ những phân tích trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Thử nghiệm sản xuất chế phẩm
EM sử dụng xử lý môi trường nuôi tôm”.

Mục đích phạm vi đề tài:
Sản xuất chế phẩm EM sử dụng xử lý môi trường nuôi tôm để phục vụ cho nghiên cứu
và sản xuất.
Xác định và so sánh khả năng xử lý chất hữu cơ trong môi trường nước nuôi tôm.

Ý nghĩa của đề tài:
Đánh giá sơ bộ được khả năng xử lý môi trường nước nuôi tôm của chế phẩm thử
nghiệm sản xuất EM.
Tìm chế phầm rẻ tiền để xử lý nước ao giúp tiết kiệm chi phí nuôi.

1


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Sinh học sinh thái về tôm sú
1.1.1 Đặc điểm phân bố
a. Trên thế giới
Trên thế giới tôm biển phân bố rộng rãi ở các thủy vực nhiệt đới và á nhiệt đới, chúng
phân bố ở các vùng Ấn độ, Tây Thái Bình Dương, Đông và Nam Châu Phi, từ Pakitan
đến Nhật, từ Mã Lai đến Bắc Úc, Thái Lan, Hồng Kông, Philipines….
b. Ở Việt Nam
Tôm phân bố rộng từ bắc vào nam, nhưng không đều, tùy từng loài mà có sự tập trung
khác nhau. Tôm sú (Penaeus monodon) phân bố tập trung ở vùng Miền Trung và vùng
biển Kiên Giang.
1.1.2 Chu kỳ sống
Trong vòng đời tôm biển, thường được chia làm các giai đoạn: trứng, ấu trùng, tôm
giống, tiền trưởng thành và trưởng thành.
a. Giai đoạn trứng:
Còn gọi là giai đoạn phôi được tính từ khi trứng đẻ ra đến khi trứng nở, trứng đẻ ra sẽ
chìm xuống đáy và sau khi trương nước trứng sẽ lơ lững, thời gian trứng nở từ 12 – 18
giờ tùy thuộc vào nhiệt độ nước.
b. Giai đoạn ấu trùng
Được chia làm 3 giai đoạn: ấu trùng Nauplius, Zoea, Mysis, mỗi giai đoạn ấu trùng
được chia làm nhiều giai đoạn phụ.

Ấu trùng Nauplius:
Gồm 6 giai đoạn phụ từ N1 – N6, trải qua 6 lần lột xác để biến thành ấu trùng zoea,
thời gian mất từ 2,5 đến 3 ngày, tùy nhiệt độ nước, giai đoạn này chúng sống trôi nổi,
dinh dưỡng bằng noãn hoàng.
Ấu trùng Zoea:

2


Gồm 3 giai đoạn phụ từ Z1 – Z3, trải qua 3 lần lột xác để biến thành Mysis, thời gian
mất 3 – 5 ngày, tùy thuộc nhiệt độ nước, chúng sống trôi nổi, thức ăn là thực vật phù
du.
Ấu trùng Mysis:
Gồm 3 giai đoạn phụ từ M1 – M3, trải qua 3 lần lột xác để biến thành hậu ấu trùng,
thời gian mất từ 3 -5 ngày, tùy thuộc vào nhiệt độ nước, sống trôi nổi, thức ăn là động
vật phù du [9]
c. Giai đoạn hậu ấu trùng
Giai đoạn này chúng bắt đầu bơi về phía trước, dần dần hoàn chỉnh các cơ quan, cơ thể
gần giống tôm trưởng thành, sống trôi nổi, cuối giai đoạn này người ta gọi là tôm bột,
sống bám, chúng rất háu ăn, thức ăn là động vật phù du, thực vật phù du, thời gian mất
từ 8 – 10 ngày tùy thuộc vào nhiệt độ nước.
d. Giai đoạn tôm giống
Hệ thống mang phát triển hoàn toàn, chúng sống đáy, ăn thức ăn là động vật đáy, bùn
bã hữu cơ, xác chết động vật,….
e. Giai đoạn tăng trưởng
Cơ thể tôm cân đối, tôm đã có cơ quan sinh dục, chúng sống đáy và ăn thức ăn là động
vật đáy, bùn bã hữu cơ,…
f. Giai đoạn sắp trưởng thành
Tôm lúc này hoàn toàn thành thục sinh dục, tôm đực có tinh trùng trong tinh mang.
Một số con cái đã nhận túi tinh từ con đực, giai đoạn này con cái lớn nhanh hơn con

đực.
g. Giai đoạn trưởng thành
Đặc trưng cho sự chín muồi sinh dục, con cái tham gia sinh sản.
Giai đoạn từ tôm giống đến tôm sắp trưởng thành: Chúng sống ở các cửa sông, nơi có
vùng nước lợ, độ đục cao, nhiệt độ và độ mặn tăng giảm thất thường, nguồn nước giàu
dinh dưỡng.

3


Giai đoạn từ trưởng thành đến giai đoạn hậu ấu trùng: Chúng sống ngoài biển khơi,
nơi có độ mặn cao và ổn định, nhiệt độ ổn định, oxy cao, nước trong, nghèo dinh
dưỡng hơn ở vùng cửa sông.

Hình 1: Vòng đời của tôm sú [14]
1.1.3 Đặc điểm sinh sản
Quá trình sinh sản của tôm biển gồm các giai đoạn: giao vĩ, thành thục và đẻ trứng.
a. Giao vĩ
Đến giai đoạn sắp trưởng thành, tôm thành thục về mặt sinh dục và tiến hành giao vĩ.
Đầu tiên chúng kết cặp với nhau, sau đó con cái lột xác và chúng tiến hành giao vĩ với
nhau. Sau khi giao vĩ vỏ tôm cứng lại, chúng di chuyển ra biển để đẻ.
b. Thành thục
Trong thời gian di chuyển ra biển cũng là lúc buồng trứng phát triển để đạt mức độ
thành thục hoàn toàn, ở tôm cái đi cùng với sự phát triển của tuyến sinh dục là sự biến
đổi màu của buồng trứng, từ trong suốt sang màu xanh, sang màu xanh nâu nhạt đến
xanh nâu đậm là buồng trứng thành thục hoàn toàn.
c. Đẻ trứng
Trong tự nhiên quá trình đẻ trứng xảy ra khi con cái tìm được bãi đẻ, tôm thường đẻ
trứng về đêm lúc gần sáng. Khi đẻ tôm bơi chậm trong nước, phần sau cơ thể cong lại
đến đốt bụng thứ 3, 5 đôi chân bụng hoạt động liên tục, sự cử động của phần sau cơ

4


thể và các đôi chân bụng, giúp trứng đẻ ra ở gốc đôi chân bò thứ 3, qua túi tinh để thụ
tinh, chạy ra phía sau thân và từ từ chìm xuống đáy, khi đẻ trứng không cần có sự
tham gia của con đực, các tác động như ánh sáng và âm thanh có thể làm ảnh hưởng
hoặc ngưng hoạt động đẻ trứng của tôm [9]
1.1.4 .Đặc điểm dinh dưỡng
Tôm là loài ăn tạp, tập tính ăn và thức ăn tôm sử dụng khác nhau theo từng giai đoạn
phát triển.
a. Giai đoạn ấu trùng
Do tập tính trôi nổi bắt mồi thụ động, nên thức ăn phải phù hợp cỡ mồi. Trong tự
nhiên, ấu trùng thường sử dụng các loại thức ăn: khuê tảo, luân trùng, vật chất hữu cơ
phân hủy có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Trong sản xuất nhân tạo người ta sử
dụng khuê tảo, ấu trùng, thịt tôm, cá, mực, lòng đỏ trứng gà để cho ấu trùng ăn.
b. Giai đoạn từ tôm bột đến tôm trưởng thành
Chúng ăn các loài động vật đáy như: giáp xác nhỏ các loài nhuyển thể thân mềm, các
loại ấu trùng của động vật đáy… Xác chết động vật, bùn bã hữu cơ. Nhìn chung, tôm
là loài động vật háu ăn, chúng sử dụng các đôi chân bò để biến thành kẹp để gắp thức
ăn và có bộ hàm răng chắc để nghiền thức ăn, chúng có đôi râu dài để dò tìm thức ăn.
1.1.5 Đặc điểm sinh trưởng
Tôm là loài giáp xác được bao bọc bởi lớp vỏ kitin. vì vậy, trong quá trình sống tôm
muốn lớn lên phải lột xác, quá trình lột xác thường tùy vào điều kiện dinh dưỡng, môi
trường nước và giai đoạn phát triển. Thời gian hoàn tất cho quá trình lột xác mất
khoảng 5 – 10 phút. Sau khi lớp vỏ cũ được lột ra, lớp vỏ mới non mềm dưới áp suất
của khối mô lâu ngày bị dồn nén sẽ lớn lên. Sau 3 -6 giờ lớp vỏ mới đủ cứng để tôm
hoạt động bình thường

1.2 Chất lượng môi trường nước đối với tôm sú nuôi
1.2.1 Về nhiệt độ

Nhiệt độ trong nước có được do ánh sáng mặt trời bức xạ vào, do ảnh hưởng của gió
mùa đông bắc… Nhiệt độ nước luôn biến động theo mùa và theo ngày đêm, nhiệt độ
nước ở tầng mặt biến động hơn tầng đáy.
5


Nhiệt độ thích hợp cho tôm phát triển từ 26 – 30 oC. Trong phạm vi nhiệt độ này, nhiệt
độ càng cao tốc độ phát triển của tôm càng nhanh. Do tôm là động vật máu lạnh, biến
nhiệt, nhiệt độ cơ thể biến thiên theo nhiệt độ môi trường. Do đó, trong phạm vi nhiệt
độ trên, nhiệt độ càng cao thì cường độ trao đổi chất trong cơ thể tôm xảy ra nhanh.
Tôm bắt mồi nhiều, hoạt động mạnh, nhanh lột xác và mau lớn.
1.2.2 Độ mặn
Độ mặn trong nước biến động theo mùa, mùa mưa độ mặn giảm thấp và luôn biến
động, mùa khô, độ mặn cao và ổn định hơn. Sự thích nghi về độ mặn tùy từng giống
loài và từng giai đoạn phát triển mà có sự khác nhau.
Giai đoạn trứng, ấu trùng và hậu ấu trùng: thích nghi ở độ mặn từ 28 – 33 0/00.
Giai đoạn tôm giống đến sắp trưởng thành tôm sú sống được từ 0 – 450/00 thích hợp
nhất từ 15 – 200/00.
Trong nuôi tôm chúng ta nên khống chế độ mặn trong khoảng thích hợp để tôm lớn
nhanh. Độ mặn quá cao trên 300/00 vỏ tôm cứng, khó lột xác, chậm lớn. Nếu độ mặn
nhỏ hơn 100/00 vỏ tôm rất dễ bị mềm và bị nhiễm bệnh [9]
1.2.3 Độ pH
pH an toàn cho tôm trong khoảng 7 -9.
pH thích hợp nhất cho tôm phát triển từ 7,5 – 8,5
pH luôn biến động theo ngày và đêm. Trong một ngày và đêm pH biến động không
được quá 0,5 độ.
1.2.4 Độ trong
Độ trong có trong nước do 2 yếu tố:
- Do phù sa: nếu ao nuôi có quá nhiều phù sa cũng không tốt cho tôm, vì nó làm ao
mau cạn, khó tạo được nguồn thức ăn tự nhiên, hạn chế sự quang hợp của tảo, oxy

thấp. Để hạn chế, trước khi đưa nước vào ao cần phải cho vào ao lắng.
- Do thủy sinh vật: đây là nguồn để tạo thức ăn tự nhiên, tuy nhiên cần hạn chế sự phát
triển quá mức, nếu thủy sinh vật phát triển quá nhiều, ban đêm chúng hô hấp sẽ làm
thiếu oxy, khi chết chúng sẽ làm dơ ao, độ sâu của mặt nước thích hợp cho tôm phát
triển từ 30 – 35 cm [9].
1.2.5 Hàm lượng oxy hòa tan trong nước
Hàm lượng oxy có trong nước do thực vật thủy sinh quang hợp, do oxy trong không
khí khuếch tán vào, oxy trong nước mất đi do vi sinh vật hô hấp, sự phân hủy của bùn
6


bã hữu cơ, oxy luôn biến động theo ngày và đêm. Trong một ngày oxy cao nhất vào
lúc 14 -15 giờ và thấp nhất lúc 4 – 5 giờ.
Hàm lượng oxy thích hợp cho tôm từ 5 -9 mg/l.
1.2.6 Hàm lượng các chất khí độc
Trong môi trường ao nuôi tôm mgười ta quan tâm nhất là hai khí ammoniac và
sunfuhydro, chất khí này có trong nước là do vi khuẩn phân hủy mùn bã hữu cơ.
Không có oxy, chất hữu cơ sẽ phân hủy ra hydrosufur, có oxy chất hữu cơ phân hủy
thành ammoniac. Nếu hai chất khí này quá cao ảnh hưởng đến tôm nuôi.
Hàm lượng NH3 trong nước cao, sẽ cản trở sự bài tiết NH3 từ cơ thể tôm cá ra môi
trường làm hàm lượng NH3 và pH trong máu gia tăng, gây ảnh hưởng xấu đến tôm,
tôm bị bệnh chết. Nồng độ NH3 an toàn cho tôm < 0,4mg/l.
Hàm lượng H2S gây độc hại cho tôm cá khoảng 0.01 -0.05 mg/l.
Trong nuôi tôm mặc dù hàm lượng NH3 và H2S không đủ giết chết tôm nuôi, pH môi
trường trong một đêm biến động lớn hơn 0.5 độ thì 2 chất khí này cũng gây độc đối
với tôm. Nếu pH tăng cao NH3 gây độc, và ngược lại pH giảm thì H2S gây độc.
Để khống chế NH3 và H2S khi cho tôm ăn cần tránh dư thừa, hạn chế lượng bùn bã
hữu cơ có trong ao nuôi và giữ pH luôn ổn định, sử dụng vi sinh vật có lợi phân giải
bớt hàm lượng các khí độc [9].

1.3 Vi sinh vật sử dụng trong thử nghiệm sản xuất EM
1.3.1 Bacillus subtilis
1.3.1.1 Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi tổ
chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được sử dụng chủ yếu để phòng bệnh lị cho
các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
Năm 1949 - 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus
subtilis. Ngày nay, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trên thế
giới [7].

7


1.3.1.2 Đặc điểm của Bacillus subtilis
a. Đặc điểm phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Eubacillales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
b. Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.
Chúng phân bố hầu hết trong tự nhiên, phần lớn chúng cư trú trong đất và rơm cỏ
nên còn được gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”, thông thường đất trồng có khoảng 106 –
107 triệu CFU/g. Trong đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện
diện của vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các
nguyên liệu để sản xuất bột mì, bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương,

chao,….
c. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu gram dương, kích thước
0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đứng đơn lẽ hoặc thành chuỗi ngắn, có khả năng di
động, sinh bào tử hình bầu dục, kích thước từ 0,8 – 1,8 µm, bào tử có khả năng
chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ [7].

8


Hình 2: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis [20]
d. Đặc điểm sinh hóa
Đặc điểm sinh hóa của Bacillus subtilis được thể hiện ở bảng [7]
Bảng 1: Đặc điểm sinh hóa của Bacillus subtilis
Phản ứng sinh hóa
Kết quả
Phản ứng sinh hóa
Kết quả
Hoạt tính catalase

+

Arabinose

+

Sinh indol

-

Xylose

+

Methyl red

+

Saccharose

+

Voges – proskauer

+

Mannitol

+

Tan chảy gelatin

+

Glucose

+

Khử nitrate

+

Lactose

-

Phân giải tinh bột

+

Maltose

+

e. Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 370C, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4.
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trên hầu hết các môi trường thạch đĩa TSA, TSB,
peptone – cao thịt.
Nhu cầu dinh dưỡng chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi
lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đầy đủ Cacbon và Nitơ.

9


f. Bào tử
Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản như
ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có
thêm một số thành phần mới.
Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip hoặc hình cầu, kích thước từ 0,6 – 0,9µm x 1,0 –
1,5µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein,

peptidoglycan,…. bào tử Bacillus subtilis có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày,
tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non. Đây là đặc điểm quan trọng trong
sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis.
1.3.1.3 Một số enzyme quan trọng được tổng hợp từ Bacillus subtilis
α – amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ sung
vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dextrin, malt,….
Protease: Ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp dày da, dệt, tận thu phế liệu giàu
protein, y học, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc.
Ngoài ra, còn có β – glucanase, phytase, hemicellulase,…. cũng được sử dụng trong
chế biến thức ăn.
1.3.1.4 Tính đối kháng của Bacillus subtilis
Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau: subtilin,
subtilisin A, tas A, sublancin, bacilisocin,…. có khả năng kháng khuẩn và nấm rất hữu
ích [7]. Ngoài khả năng tổng hợp kháng sinh, vi khuẩn Bacillus subtilis còn khả năng
cạnh tranh dinh dưỡng, do đó chúng có tính đối kháng trên cả đồng loại và vi sinh vật
gây bệnh.
Với đồng loại: khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, nó sẽ tiêu diệt những tế
bào xung quanh để hút chất dinh dưỡng, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh.
Ngoài ra, theo nghiên cứu của nhóm chuyên gia đại học Havard (Mỹ), trong giai đoạn
sớm hình thành bào tử, một số vi khuẩn Bacillus subtilis đã tạo ra kháng sinh giết chết
tế bào bên cạnh, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành bào tử
tiêu thụ.
Do Bacillus subtilis là vi khuẩn có trong đường ruột nên ngoài khả năng chịu được
acid dạ dày, các chất dịch tiêu hóa có trong đường ruột, chúng còn có khả năng đấu
10


tranh chống lại các vi sinh vật ở đường ruột. Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển
nhanh trong 24 giờ, do đó có thể cạnh tranh dinh dưỡng, không gian sống đồng thời
tạo một số kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm và vi khuẩn gây bệnh bị hạn chế.

1.3.2 Bacillus licheniformis
a. Đặc điểm phân loại [18]
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus licheniformis
b. Đặc điểm phân bố
Bacillus licheniformis là một loại vi khuẩn thường thấy trong đất và lông chim. Trên
bộ lông chim nó là chủ yếu tập trung trên khắp vùng ngực của chim.
c. Đặc điểm hình thái
Bacillus licheniformis có dạng hình que, vi khuẩn gram dương. Nó có xu hướng hình
thành bào tử trong đất khi gặp điều kiện bất lợi làm cho nó được sử dụng cho các mục
đích công nghiệp như sản xuất các enzym, kháng sinh, và chất chuyển hóa nhỏ. Nó
sản xuất nhiều loại enzyme ngoại bào như amylase, protease.
d. Đặc điểm nuôi cấy
Tối ưu nhiệt độ tăng trưởng của nó là 50 °C, nhưng nó cũng có thể tồn tại ở nhiệt độ
cao hơn nhiều. Nhiệt độ tối ưu của nó cho tiết enzyme tiêu hóa là 37 ° C. Vi khuẩn có
thể tồn tại trong môi trường khắc nghiệt bằng cách chuyển thành bào tử; khi điều kiện
thuận lợi nó sẽ hoạt động trở lại.
B. licheniformis sản xuất một protease có thể tồn tại ở điều kiện pH cao, pH tối thích
khoảng 9 - 10. Protease này là một thành phần trong chất tẩy giặt là mong muốn do
khả năng của nó sẽ được sử dụng ở nhiệt độ thấp, do đó ngăn ngừa co rút và màu sắc
nhạt dần [17]
11


1.3.3 Bacillus cereus

a. Đặc điểm phân loại [11]
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus cereus

b. Đặc điểm phân bố
Phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có thể được phân lập từ đất, bào tử có khả năng chịu
nhiệt cao, và được tìm thấy rộng rãi, chúng thường gây hư hỏng nông sản, thực phẩm.
c. Đặc điểm hình thái
Bacillus cereus là một vi khuẩn gram dương, sống hiếu khí, tế bào có dạng hình que,
thường sống riêng rẽ, nhưng cũng có thể tạo thành chuỗi, tế bào có không bào và
chuyển động, có khả năng tạo bào tử hình oval hay hình ellip, thường phân bố ở trung
tâm tế bào [3].

Hình 3: Hình thái vi khuẩn Bacillus cereus [12]

12


d. Đặc điểm nuôi cấy
Nhiệt độ tối ưu để vi khuẩn phát triển là 30 – 370C.
pH tối thiểu đối với tăng trưởng là 4,3, tối đa khoảng 9,3.
Bị ức chế tốc độ tăng trưởng khi có sự hiện diện của acid axetic 0.1% [13].
f. Tính đối kháng
B. cereus cạnh tranh với các vi sinh vật khác như Salmonella và Campylobacter trong
ruột, do đó sự hiện diện của nó làm giảm số lượng của các vi sinh vật. Trong thức ăn

động vật như gà, thỏ và lợn, một số vô hại chủng Bacillus cereus được sử dụng làm
thức ăn probiotic phụ gia để giảm Salmonella ở ruột Điều này cải thiện tốc độ tăng
trưởng của các loài động vật cũng như an toàn thực phẩm cho con người.
1.3.4 Enzyme protease
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong
tế bào hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy.
Các loài có thể tổng hợp mạnh protease như Bacillus subtilis, Bacillus cereus, xạ
khuẩn… và một số nấm mốc như Aspergillus oryzae, Aspergillus niger….
1.3.4.1 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật
Các kết quả cho thấy các protease của cùng một giống vi sinh vật cũng có thể khác
nhau về tính chất [7].
Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp có thể chia làm 3 loại sau:
Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo.
Protease trung tính: có pH hoạt động thích hợp khoảng 6 – 7.
Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 – 11, trung tâm hoạt động có serin.
Ngoài ra người ta còn có thể chia thành 4 nhóm sau:
Protease serin
Protease thiol
Protease kim loại
Protease acid
Trong 4 nhóm này, các protease serin và protease thiol có khả năng phân giải liên kết
este và liên kết amide của dẫn xuất aminoacid.

13


Các protease serin có trọng lượng phân tử 20000 – 27000 dalton, trọng lượng của
protease kim loại lớn hơn 33800 – 48400 dalton, protease thiol và nhiều protease acid
có trọng lượng 30000 – 40000 dalton.
Trung tâm hoạt động của protease vi sinh vật ngoài gốc aminoacid đặc trưng cho từng

nhóm còn có 1 gốc amino acid khác.
Mặt dù trung tâm hoạt động của các protease có khác nhau nhưng các enzyme đều xúc
tác cho phản ứng thủy phân peptid.
1.3.4.2 Thu nhận enzyme protease thô
Trong quá trình xử lý các hợp chất hữu cơ vi sinh vật luôn tổng hợp các enzyme để
tham gia vào quá tình đồng hóa và dị hóa của chúng. Đối với các hợp chất hữu cơ có
cấu trúc đại phân tử như protein, lipid thì vi sinh vật luôn tổng hợp enzyme tương ứng
để phân giải thành các cấu trúc nhỏ hơn và được hấp thụ dễ dàng vào bên trong tế bào
vi sinh vật.
Trong nước nuôi thủy sản để cho quá trình xử lý các hợp chất hữu cơ diễn ra nhanh
hơn người ta bổ sung thêm các enzyme protease, amylase, lipase,… để phân giải thành
những chất có khối lượng phân tử nhỏ, đơn giản: peptid mạch ngắn, acid amin, đường
đơn,…. để vi sinh vật dể dàng hấp thụ.
Những enzyme này được vi sinh vật tiết ra môi trường bên ngoài được gọi là enzyme
ngoại bào. Khi tổng hợp ra enzyme, enzyme lẫn trong các thành phần môi trường và
sinh khối vi sinh vật. Toàn bộ vật chất thu được trong quá trình nuôi cấy gồm: sinh
khối vi sinh vật, enzyme trong và ngoài tế bào và cả khối lượng môi trường mà vi sinh
vật sử dụng hết, đây gọi là chế phẩm enzyme thô.
Trong nuôi nấm mốc Aspergillus oryzae người ta sử dụng cơ chất cảm ứng như
protein, tinh bột,… để nấm mốc sản sinh ra enzyme tương ứng với chúng là protease,
amylase,…đây là những enzyme cảm ứng..
Trong thủy sản người ta sử dụng những enzyme cảm ứng này để hỗ trợ tiêu hóa cho
động vật nuôi, hay sử dụng để làm chế phẩm xử lý môi trường nước.
Đặc điểm nấm mốc Aspergillus oryzae
Người nghiên cứu sớm nhất về loài nấm này là một nhà khoa học Nhật Bản tên là
Jokichi Takamine. Ông sinh ngày 03/10/1854 tại Takaoka. Năm 1894 ông lấy được
bằng sáng chế về quá trình sản xuất men đường hóa (US Patent số 252.823) trình bày
14

phương pháp nuôi nấm sợi Aspergillus trên cám và dùng cồn để chiết xuất ra enzyme
amylase (enzyme đường hóa tinh bột). Sau đó Takamine đã chứng minh được enzyme
này có thể ứng dụng trong y học và ông nhận được bằng sở hữu trí tuệ. [16]
Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylase, maltase, protease và catalase
có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin. Nấm mốc Aspergillus
oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước tương theo phương pháp vi
sinh vật. Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc này để sản xuất tương.
Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương. Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào tử bụi
phồng lên ở ngọn. Các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng. Bào tử
bụi có thể màu vàng (Aspergillus flavus), màu đen (Aspergillus niger). Hai loài không
độc là Aspergillus oryzae và Aspergillus sojae có hình thái và màu sắc rất giống với
hai loài rất nguy hiểm là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản sinh ra độc
tố aflatoxin gây bệnh ung thư.
1.3.5 Đường cong tốc độ sinh trưởng của các chủng vi sinh vật
Đường cong sinh trưởng
Chủng vi sinh vật được nuôi cấy tĩnh thì sự sinh trưởng sẽ tuân theo những quy luật
bắt buộc không chỉ đối với cơ thể đơn bào mà còn ở cơ thể đa bào.
Phương pháp nuôi cấy tĩnh là phương pháp nuôi không thêm chất dinh dưỡng cũng
không loại bỏ sản phẩm cuối cùng của trao đổi chất.
Chủng vi khuẩn sinh trưởng được biểu diễn dưới dạng đồ thị là đường cong tốc độ
sinh trưởng. Đường cong sinh trưởng được chia ra 4 pha sinh trưởng.
Pha lag
Khi cấy vi khuẩn vào môi trường, nó không phân chia hay sinh sản ngay lập tức. Chỉ
sau một thời gian, vi khuẩn sẽ bắt đầu phân chia. Giai đoạn này gọi là pha lag. Pha này
tính từ lúc cấy đến khi vi khuẩn bắt đầu phân chia.
Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia nhưng thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ
rệt do quá trình tổng hợp các chất diễn ra mạnh mẽ. Độ dài của pha lag phụ thuộc vào
tuổi của giống và thành phần của môi trường. Pha lag sẽ không có nếu ta dùng giống
gồm tế bào đang ở pha sinh trưởng và cấy chúng vào môi trường với điều kiện dinh
dưỡng như môi trường dang nuôi cấy chúng. Trái lại nếu ta cấy các tế bào ở pha ổn

15


định hoặc các bào tử vào cùng một môi trường dưới điều kiện nuôi cấy như nhau pha
lag vẫn có. Thường tế bào càng già thì pha lag càng dài. Nếu dùng các tế bào đang
sinh trưởng pha log cấy vào môi trường mới khác với trước đây thì vẫn có pha lag vì
vi sinh vật cần thời gian để thích ứng điều kiện nuôi cấy mới, sự thích ứng có liên
quan tới việc tổng hợp các enzyme mới mà trước đây tế bào chưa cần, các enzyme mới
này được tổng hợp nhờ sự cảm ứng của các cơ chất mới.
Pha log
Sau pha lag, tế bào bắt đầu phân chia đều đặn với tốc độ ổn định. Trong pha này, vi
khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa.
Kích thước tế bào, thành phần hóa học, hoạt tính sinh lý… nói chung không thay đổi
theo thời gian. Tế bào ở trạng thái động học và được xem là những tế bào tiêu chuẩn.
Thời gian thế hệ của tế bào là một hằng số, trong giai đoạn này tế bào nhạy cảm với
chất ức chế.
Đường biểu diễn theo lũy thừa của vi khuẩn là đường thẳng.
Pha ổn định
Trong pha này quần thể ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số
tế bào cũ chết đi. Kết quả là cả tế bào và cả sinh khối không tăng cũng không giảm.
Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Vì vậy, khi giảm nồng độ cơ chất
thì đã bắt đầu giảm tốc độ sinh trưởng.
Nguyên nhân tồn tại của pha ổn định là do sự cạn về cơ chất dinh dưỡng, mật độ quá
lớn của quần thể vi khuẩn, sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất cũng như các chất
độc…
Những tế bào mẫn cảm với các tác nhân của môi trường bị chết trước, một số tế bào
vẫn giữ được khả năng sống tiếp, trong khi một số tế bào mới vẫn được tạo ra, do đó
tạo thành trạng thái cân bằng động và số lượng tế bào ở trạng thái cố định động. Số
lượng tế bào và sinh khối ở giai đoạn này là cao nhất.
Pha suy vong

Trong pha này số tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa. Mặc dù số tế bào tổng
có thể không giảm. Đôi khi các tế bào bị tự phân nhờ các enzyme của bản thân. Ở các
vi khuẩn sinh bào tử quá trình phức tạo hơn do quá trình hình thành bào tử.
16


Chưa có quy luật nào cho pha tử vong. Sự chết của tế bào có thể diễn ra nhanh hay
chậm có liên quan đến sự tự phân hay không tự phân của tế bào.
1.3.6 Cơ chế quá trình phân giải hiếu khí
Quá trình phân giải các chất hữu cơ trong điều kiện hiếu khí có thể tóm tắt như sau:
Chất hữu cơ + O2 (vi khuẩn và chất dinh dưỡng) Æ CO2 + H2O + sinh khối vi khuẩn
Theo Eckenfekler W.W và Connon D.J thì quá trình phân hủy các chất hữu cơ trong
điều kiện hiếu khí được thực hiện bởi phản ứng sau:
a- Oxy hóa chất hữu cơ
CxHyOz + O2 Æ(enzyme) CO2 + H2O + AH
b- Tổng hợp để xây dựng tế bào
CxHyOz + O2 Æ(enzyme) sinh khối vi khuẩn + CO2 + H2O + C5H7NO2 + DH
c- Oxy hóa chất liệu tế bào
CxHyOz Æ(enzyme) CO2 + H2O + NH3 +/- ΔH
ΔH năng lượng được thải ra hoặc hấp thụ vào [3].

1.4 Tình hình sử dụng EM trong nước và trên thế giới
1.4.1 Chế phẩm EM
EM (Effective Microorganisms) có nghĩa là các vi sinh vật hữu hiệu. Chế phẩm do
Giáo sư Tiến sĩ Teruo Higa - trường Đại học Tổng hợp Ryukyus, Okinawoa, Nhật Bản
sáng tạo và áp dụng thực tiễn vào đầu năm 1980. Trong chế phẩm này có khoảng 80
loài vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí thuộc các nhóm: vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn
lactic, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn. 80 loài vi sinh vật này được lựa chọn từ hơn
2000 loài được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm và công nghệ lên men.
Từ công thức của chế phẩm EM, một số chế phẩm tương tự đã được sản xuất ở Việt

Nam. [15]
1.4.2 Trong nước
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về vi sinh vật mới chính thức được đưa vào các
chương trình khoa học từ những năm 1960.
Hiện nay tại Việt Nam có khoảng trên 130 loại chế phẩm sinh học được sử dụng bao
gồm chế phẩm trộn vào thức ăn và chế phẩm xử lý nước, chủ yếu là do các công ty
17


cung cấp, phân phối, đại lý cho nước ngoài hay sử dụng công nghệ của nước ngoài để
sản xuất và phân phối tại Việt Nam. Bởi vậy, dù cho nhiều công ty tham gia chuyển
giao tiến bộ khoa học kĩ thuật đến người nuôi thì trước hết vì mục đích thương mại để
có thể thu càng nhiều lợi nhuận càng tốt chứ không phải vì quyền lợi của người sử
dụng, chưa kể tác dụng của chế phẩm ra sao bởi vì những chế phẩm ngoại nhập hay
chủng vi sinh vật từ nước ngoài đưa vào Việt Nam có phù hợp với khí hậu của Việt
Nam hay không thì việc đưa một lượng đáng kể chủng vi sinh vật vào Việt Nam cũng
là mối nguy hiểm tiềm tàng, xét về khía cạnh an toàn sinh học [6].
1.4.3 Trên thế giới
EM được thử nghiệm tại nhiều quốc gia: Mỹ, Nam Phi, Thái Lan, Philippin,Trung
Quốc, Braxin, Nhật Bản, Singapore, Indonexia, Srilanca, Nepal,Việt Nam, Triều Tiên,
Belarus...và cho thấy những kết quả khả quan
a. Trong trồng trọt
EM có tác dụng đối với nhiều loại cây trồng (cây lương thực, cây rau màu, cây ăn
quả…) ở mọi giai đoạn sinh trưởng, phát triển khác nhau. Những thử nghiệm ở tất cả
các châu lục cho thấy rằng EM có tác dụng kích thích sinh trưởng, làm tăng năng suất
và chất lượng cây trồng, cải tạo chất lượng đất, làm tăng sức sống cho cây trồng, tăng
khả năng chịu hạn, chịu úng và chịu nhiệt, kích thích sự nảy mầm, ra hoa, kết quả và
làm chín (đẩy mạnh quá trình đường hoá), tăng cường khả năng quang hợp của cây
trồng, tăng cường khả năng hấp thụ và hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng, kéo dài
thời gian bảo quản, làm hoa trái tươi lâu, tăng chất lượng bảo quản các loại nông sản

tươi sống, cải thiện môi trường đất, làm cho đất trở nên tơi xốp, phì nhiêu, hạn chế sự
phát triển của cỏ dại và sâu bệnh.
b. Trong chăn nuôi
Làm tăng sức khoẻ vật nuôi, tăng sức đề kháng và khả năng chống chịu đối với các
điều kiện ngoại cảnh, tăng cường khả năng tiêu hoá và hấp thụ các loại thức ăn, kích
thích khả năng sinh sản, tăng sản lượng và chất lượng trong chăn nuôi, tiêu diệt các vi
sinh vật có hại, hạn chế sự ô nhiễm trong chuồng trại chăn nuôi.
EM có tác dụng đối với mọi loại vật nuôi, bao gồm các loại gia súc, gia cầm và các
loài thuỷ, hải sản.
18