Nghiên cứu tách chiết và tinh sạch enzym luciferase từ vi khuẩn tái tổ hợp E. Coli MC 1061 (pT 0031)

1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Luciferase xúc tác phản ứng giữa luciferin, oxy và nước để tạo ra dung
dịch phát quang. Enzym được biết đến với những ứng dụng rất rộng rãi
trong hóa sinh và sinh học phân tử. Như phương pháp phát quang sinh
học sử dụng hệ thống enzym – cơ chất.
Luciferase chiết suất từ tự nhiên chưa đáp ứng được nhu cầu vì vậy
việc tạo Luciferase từ vi khuẩn là hướng đi đầy triển vọng. Do đó chúng
tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu tách chiết và tinh sạch enzym luciferase từ vi khuẩn
tái tổ hợp E. Coli MC 1061 (pT 0031)”
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu được quy trình tách chiết và tinh sạch luciferase từ vi
khuẩn tái tổ hợp E. Coli MC 1061 và xác định đặc tính làm nền tảng
cho ứng dụng.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu
- Tách tinh sạch thu chế phẩm luciferase
- Xác định một số đặc tính của luciferase
1.4. Ý nghĩa của đề tài
Tách chiết và tinh sạch được enzym luciferase có ý nghĩa trong việc
chế tạo test phát hiện nhanh dựa trên phương pháp phát quang sinh học sử
dụng hệ thống enzym – cơ chất.


2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cơ sở khoa học
2.1.1. Tổng quan về luciferase

2.1.1.1. Đặc điểm, phân loại luciferase
2.1.1.2. Cấu tạo, tính chất và ứng dụng của luciferase
2.1.1.3. Luciferase từ đom đóm (Photinus pyralis)
2.1.1.4. Luciferase từ chủng vi khuẩn tái tổ hợp E.coli MC 1061 (pT
0031)
2.1.1.5. Các phương pháp tách và tinh sạch luciferase
a. Tách luciferase bằng phương pháp kết tủa phân đoạn kết hợp với ly
tâm, thẩm tích
b. Tinh sạch luciferase bằng các phương pháp sắc ký
2.1.2. Phản ứng quang sinh học và các ứng dụng
2.1.2.1. Những kiểu phát quang chính
a. Phát sáng theo từng nhịp (nhịp điệu)
b. Phát sáng liên tục trong suốt đời sống của sinh vật
c. Phát quang do cảm ứng
2.1.2.2. Cơ chế của quá trình phát sáng
2.1.2.3 Vai trò của phát quang sinh học trong tự nhiên
2.1.2.4. Ứng dụng của phát quang sinh học
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước


3

PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Chủng vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031) mang plasmid pT
0031 có gen mã hoá cho khả năng sản xuất luciferase.

3.1.2. Môi trường sử dụng
- Môi trường LB chứa kháng sinh
- Môi trường Mac Conkey
3.1.3. Dung dịch và đệm sử dụng
Bảng 3.1.Danh sách các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm
1
2
3
4
5

Dung dịch Folin gốc 1N
Dung dịch A
Dung dịch B1
Dung dịch B2
Dung dịch C

10
11
12
13
14

6

15

7

Đệm điện di protein

(biến tính)
Đệm của gel tách

8

Đệm của gel cô

17

9

Dung dịch nhuộm
protein: (250 ml)

18

16

Dung dịch rửa
Dung dịch I
Dung dịch II
Dung dịch III
Dung dịch (1): Đệm Tricin –
NaOH 50 mM, pH 7,8
Dung dịch (2): Dung dịch ATP 40
Mm
Dung dịch (3): Dung dịch Dluciferin 4 mM
Dung dịch (4): MgSO4
0,1 M
Dung dịch (5): Dung dịch đệm

cho luciferase

3.1.4. Thiết bị nghiên cứu
Box cấy an toàn cấp 2 Model: LCB 1801V (Daihan - Hàn Quốc),
Máy đo cường độ sáng cầm tay Lumitester PD-20 (Kikoman - Nhật Bản),
Máy đo quang ABOATOX (Phần Lan), Tủ ấm nuôi cấy vi sinh IC 402
(YAMOTO - Nhật Bản), Máy nuôi lắc ổn nhiệt KS 4000 (KIA - Đức), Hệ


4
thống máy điện di protein và phân tích ảnh (Biorad - Mỹ), Cân phân tích
BL 150S (Thụy Sỹ), Nồi hấp khử trùng HV-110 (HIRAYAMA - Nhật
Bản), Cột sắc ký His-trap columns (Armesham), Cột sắc ký XK 9/16
(Armesham)…
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
3.2.1. Địa điểm: Viện Hóa Học - Môi Trường Quân Sự
3.2.2. Thời gian: Từ ngày 18/03/2013 - / /2013
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Tăng sinh chủng vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031)
3.3.1.1. Hoạt hoá chủng vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031)
3.3.1.2. Đánh giá tính ổn định và xác định khả năng phát triển của chủng
vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031) trên các môi trường khác nhau.
3.3.1.3. Khả năng tổng hợp luciferase trên các môi trường khác nhau
3.3.2. Tách và tinh sạch luciferase từ E.coli MC 1061 (pT 0031)
3.3.2.1. Tách luciferase từ sinh khối chủng vi khuẩn E. coli MC 1061
(pT 0031)
3.3.2.2. Tinh sạch luciferase bằng sắc ký lọc gel kết hợp sắc ký trao đổi
ion
3.3.2.3. Tinh sạch luciferase bằng sắc ký trao đổi ion kết hợp sắc ký ái lực
3.3.3. Ảnh hưởng một số yếu tố đến hoạt độ luciferase

3.3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
3.3.3.2. Nhiệt độ tối ưu cho phản ứng
3.3.3.3. pH phản ứng tối ưu
3.3.3.4.Độ bền nhiệt độ
3.3.3.5. Ảnh hưởng của một số chất hoạt động bề mặt
3.3.3.6. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ
3.3.3.7. Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính luciferase
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Nuôi cấy vi sinh vật


5
Chủng vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031) do phòng thí nghiệm
Sinh học, Viện Hóa học – Vật liệu cung cấp dưới dạng đông khô. Hoạt
hóa E. coli MC 1061 (pT 0031) bằng cách đưa 01 lọ vi khuẩn vào 4 ml
dung dịch axit casamino 0,5% ở nhiệt độ 300C trong 18 giờ. Tiến hành
nuôi cấy trên môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycine 50 mg/l trong
24 giờ. Sau đó cấy chuyển sang môi trường LB đặc, ủ 370C trong 48 giờ.
3.4.2. Kết tủa phân đoạn thu luciferase bằng muối (NH4)2SO4
Sau khi nuôi cấy chủng vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031), tiến
hành tách luciferase bằng phương pháp kết tủa bằng muối (NH 4)2SO4 với
nồng độ thích hợp.
3.4.3. Tinh sạch luciferase
Phân đoạn có hoạt độ enzym cao nhất được tiếp tục tinh sạch bằng
phương pháp sắc ký phù hợp.
3.4.3.1. Sắc ký lọc gel kếp hợp trao đổi ion
3.4.3.2. Sắc ký trao đổi ion kết hợp ái lực
3.4.4. Các phương pháp kiểm tra luciferase
3.4.4.1. Xác định hoạt tính luciferase
Hoạt tính của luciferase (RLU) được xác định theo công thức:

Hoạt độ theo thể tích (RLU/ml) = (Es – E0)xdf
0,1ml
Hoạt độ riêng (RLU/mg) = RLU/mlx1/C
Trong đó:
+ df: tỷ lệ pha loãng của mẫu
+ C: nồng độ protein trong mẫu
3.4.4.2. Đánh giá độ sạch của luciferase
Độ sạch của enzym qua các công đoạn tinh sạch được đánh giá
bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE
3.4.4.3. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry


6
Protein tổng số thu được qua các bước của quá trình tách và tinh
sạch enzym được xác định theo phương pháp Lowry sử dụng tinh thể
Albumin huyết thanh bò (BSA) để xây dựng đường chuẩn.
3.4.5. Xử lý số liệu thực nghiệm
Các số liệu thu được được xử lý bằng các hàm toán học và phần mềm
chuyên dụng.


7

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Sinh trưởng của vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031)
4.1.1. Nuôi cấy
Chủng vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031) được hoạt hóa và nuôi
cấy tăng sinh trên môi trường LB lỏng, tiếp tục cấy chuyển sang môi
trường LB đặc.
Tiến hành xác định một số đặc điểm sinh hóa và hình thái chủng vi

khuẩn vừa phân lập được
Khả năng phát triển trên môi trường có bổ sung một số loại kháng
sinh cũng là một dấu chuẩn chứng tỏ chủng vi khuẩn phân lập được chính
là E. coli MC 1061 (pT 0031). Sử dụng phương pháp cấy vạch trên môi
trường LB bổ sung Kanamycine, Chloramphenicol, Ampicillin và hỗn
hợp cả 3 loại kháng sinh trên. Đối chứng là vi khuẩn E. coli thường,
Bacillus subtilis.
Một đặc điểm nữa để nhận biết chủng vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT
0031) là khả năng sinh luciferase khi có As5+, với các nồng độ As5+ khác
nhau được đưa vào môi trường nuôi cấy tiến hành thu nhận dịch sinh khối
của E.coli MC 1061 (pT 0031), đưa vào phản ứng xác định hoạt độ
luciferase, tiến hành làm thí nghiệm song song với một số chủng vi sinh
khác.
4.1.2. Đánh giá tính ổn định và xác định khả năng phát triển của chủng vi
khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031) trên các môi trường khác nhau
Tiến hành thí nghiệm cấy chuyển liên tiếp giống sau 48 giờ nuôi
cấy trên môi trường thạch đĩa trên hai môi trường LB và MacConkey có
và không có Kanamycine 50mg/l.


8
4.2. Kh nng tng hp luciferase trờn cỏc mụi trng khỏc nhau
Tin hnh nuụi lc E.coli MC 1061 (pT 0031) trong iu kin 180
vũng/phỳt 370C trong hai mụi trng LB v MacConkey, ly dch sinh
khi cú OD600 t 0,5 n 2,5, tin hnh phõn tớch hot tớnh luciferase.
4.3. Nghiờn cu tỏch chit, tinh sch luciferase ti E.coli MC 1061
(pT 0031)
4.3.1. Tỏch chit luciferase t sinh khi chng vi khun E. coli MC 1061
(pT 0031)
Thu nhn luciferase t dch sinh khi chng E. coli MC 1061 (pT

0031) bng phng phỏp kt ta phõn on bng mui (NH 4)2SO4 kt
hp vi phng phỏp thm tớch thu nhn luciferase t dch sinh khi
tỏch luciferase.
4.2.2. Tinh sch luciferase bng sc ký lc gel kt hp sc ký trao i
ion
Sau khi thu c dch enzym qua cỏc bc ó trỡnh by trờn, tin
hnh chy sc ký lc gel v sc ký trao i ion tinh sch luciferase.
4.2.3. Tinh sch luciferase bng sc ký trao i ion kt hp sc ký ỏi
lc
Sn phm ca quỏ trỡnh thm tớch s dng chy sc ký trao i
ion v sc ký ỏi lc vi gel Chelating Sepharose.
4.3. Nghiên cứu ảnh hởng của một số yếu tố đến hoạt độ và độ bền
của luciferase tái tổ hợp
4.3.1. nh hng ca nng c cht
4.3.2. Nhit ti u cho phn ng
4.3.3. pH phn ng ti u
4.3.4. bn nhit
4.3.5. nh hng ca mt s cht hot ng b mt
4.3.6. nh hng ca dung mụi hu c
4.3.7. nh hng ca mt s ion kim loi n hot tớnh luciferase


9

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
5.2. Đề nghị


10

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Thái Nguyên, ngày....tháng....năm 2013
Giáo viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện