Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzyme Cholinesterase từ huyết thanh ngựa

1
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Cholinesterase đã được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỷ 20 từ

những nghiên cứu tác động của este choline lên các mô khác nhau.
Cholinesterase tập trung nhiều ở các mô thần kinh, trong máu của động vật có
xương sống, chức năng chính của Cholinesterase là thủy phân liên kết của các
hợp chất choline như axetylcholine tiết ra trong quá trình truyền xung thần kinh,
thiếu giai đoạn này thì chức năng của hệ thần kinh sẽ bị tê liệt.

Do đó được

ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm chức
năng, kit phát hiện nhanh dư lượng thuốc trừ sâu trong nông nghiệp, môi trường
v.v… Hiện nay chiết suất cholinesterase từ tự nhiên vẫn là chủ yếu.
Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài : “ Nghiên cứu thu nhận và
tinh sạch enzyme Cholinesterase từ huyết thanh ngựa”.
1.2.

Mục tiêu: Thu nhận và tinh sạch enzyme Cholinesterase từ huyết thanh
ngựa.

1.3.

Mục đích nghiên cứu:
Nghiên cứu quy trình tách chiết và làm sạch enzyme ChE từ nguồn

nguyên liệu trong nước, xác lập quy luật ảnh hưởng của một số yếu tố như: nồng

độ cơ chất, pH, nhiệt độ, chất hoạt hóa và chất ức chế đến phản ứng xúc tác
enzyme ChE.
1.4.

Ý nghĩa đề tài
Ý nghĩa khoa học: làm thuốc thử sinh hóa để chế tạo các kít phát hiện dư

lượng thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm và một số hợp chất phosphor hữu
cơ trong phân tích môi trường.


2
Ý nghĩa thực tiễn: Giúp kiểm tra nhanh dư lược thuốc bảo vệ thực vật
trong thực phẩm tiêu dùng và phân tích môi trường.

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


3
1.1.

Cơ sở khoa học cholinesterase

1.1.1.

Tổng quan về enzyme cholinesterase

1.1.1.1. Định nghĩa
1.1.1.2. Cấu trúc của cholinesterase
 Cấu trúc protein

• Cấu trúc bậc 1
• Cấu trúc bậc 2
• Cấu trúc bậc 3
• Cấu trúc bậc 4


Trung tâm hoạt động của enzyme Cholinesterase

1.1.1.3. Tính chất xúc tác của Cholinesterase
1.1.1.4. Động học enzyme như là sự hiểu biết cỏ chế xúc tác của
Cholinesterase
1.1.2. Phân loại cholinesterase
1.1.3. Ứng dụng của cholinesterase
1.1.4. Các phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme cholinesterase
1.1.4.1. Thu nhận huyết thanh ngựa
1.1.4.2. Phương pháp tủa muối
1.1.4.3. Phương pháp thẩm tích
1.1.4.4. Phương pháp sắc ký


4
 Sắc ký lọc gel
 Sắc ký trao đổi ion
1.2. Tình hình nghiên cứu cholinesterase trong và ngoài nước
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

5
NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu là huyết thanh ngựa.
3.1.2. Hóa chất
- Choline chloride, 2,6-diclorophenolindopheno, tinh thể albumin (sigma
Aldrich- USA), butyrylthiocholine iodide, màng thẩm tích xelophan (ICN
biomedical- USA), DEAE sepharose fast flow (Amersham Biosciences- Đức).
- Muối amonisunfat, Nacl…và các hóa chất khác có độ tinh khiết cao.
3.1.3. Thiết bị nghiên cứu.
STT

Thiết bị

1

Máy quang phổ tử ngoại- khả biến

Hãng sản xuất
Jasco- V530, Nhật

2

Máy ly tâm lạnh

Hettich- Đức

3

Máy đông khô

Thermo Savant- Mỹ

4

Tủ ấm thường

Jeio Tech- Hàn Quốc

5

Máy đo pH

Hanna

6

Máy điện di

Hoefer- Mỹ

7

Hệ thống phân tích ảnh

Biorad- Italia

3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
3.2.1. Địa điểm: Viện Hóa Học Môi Trường Quân Sự

6
282 Lạc Long Quân- Tây Hồ- Hà Nội
3.2.2. Thời gian tiến hành: Từ ngày 18/03/2013 - / /2013
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp tách Cholinesterase từ huyết thanh ngựa
3.3.2. Tinh sạch Cholinesterase bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion sử
dụng nhựa trao đổi là DEAE sepharose fast
3.3.3. Nghiên cứu một số tính chất của Cholinesterase
3.3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.3.4.1. Tách ChE bằng phương pháp kết tủa phân đoạn muối (sử dụng
muối (NH4)2SO4
Sử dụng muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau để tách enzyme
cholinesterase từ huyết thanh ngựa. Kết quả được trình bày ở phần tiếp theo của
báo cáo.
3.3.4.2. Tinh sạch ChE bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion trong các điều
kiện pH khác nhau
Dựa trên khả năng tích điện của phân tử protein, tùy thuộc và pH dung
dịch mà phân tử protein tích điện âm hay dương. Do vậy, người ta tạo ra loại
nhựa trao đổi ion mang điện tích âm hoặc dương để bắt giữ các phân tử protein
mong muốn, các phân tử protein khác cùng điện tích với nhựa sẽ chạy qua cột
ngay lập tức. Sử dụng dung dịch rửa giải thích hợp (thường là các loại muối, phổ
biến là NaCl) phân tử protein mong muốn sẽ được đẩy ra khỏi cột, tiến hành thu
phân đoạn sẽ xác định được các phân đoạn có protein mong muốn. Ta có thể rửa
giải nhiều lần bằng các dung dịch muối khác nhau (sắc ký lần 2, lần 3) để có thể
thu được protein mong muốn với độ sạch cao.


7

3.3.4.3. Xác định hoạt độ ChE sử dụng phương pháp pH – met theo quy
trình H.O.Michel
Xác định hoạt độ ChE sử dụng phương pháp pH – met. Sử dụng công
thức tính sau:
∆pH
 pH 1 − pH 2

 t 2 − t1 − b F = h

pH1 và pH2: giá trị pH ban đầu và pH cuối
t1: thời gian thêm cơ chất vào
t2: thời gian tương ứng xác định pH2
h: thời gian
b: hệ số điều chỉnh mức độ thủy phân tương ứng pH2
F: hệ số tương ứng khi xác định đại lượng pH/h.
3.3.4.4. Phương pháp xác định protein tổng số theo lowry
Hàm lượng protein tổng số trong ChE và trong các bước của quá trình
tách và tinh sạch được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ở OD 280 và
phương pháp của lowry với tinh thể albumin trong huyết thanh bò làm đường
chuẩn.

3.3.4.5. Phương pháp xác định hoạt độ Cholinesterase theo tiêu chuẩn
ukraina
Cholinesterase phân hủy cơ chất butyrylcholin iodua thành axit butyric và
choline iodua. Axit butyric tạo thành làm giảm pH của dung dịch phản ứng với


8
chị thị màu là phenol đỏ sẽ làm màu của dung dịch chuyển sang màu gia cam
giống với màu của dung dịch chuẩn. Tính thời gian chuyển màu sẽ xác định

được hoạt độ cholinesterase.
3.3.4.6. Phương pháp điện di protein
Chuẩn bị gel chạy điện di ChE được tiến hành theo phương pháp của
Main và cộng sự.
3.3.4.7. Phương pháp thống kê toán học.

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phương pháp tách Cholinesterase từ huyết thanh ngựa


9
Tách ChE từ huyết thanh ngựa bằng phương pháp kết tủa phân đoạn sử
dụng muối amonisunphat gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Hòa tan 100g, 120g, 140g, 160g, 180g, 200g muối
(NH4)2SO4 vào trong 1 lít dung dịch huyết thanh ngựa.
Giai đoạn 2: Dung dịch thu được từ giai đoạn 1 tiếp tục được bổ xung
(NH4)2SO4 vào bằng cách: chuẩn bị dung dịch bão hòa (NH 4)2SO4 ở nhiệt độ
phòng, sau đó đưa vào dung dịch 1 với tỷ lệ 20g, 40g, 60g, 80g, 100g khuấy
đều.
Giai đoạn 3: Dung dịch thu được ở giai đoạn 2 tiếp tục được bổ xung
(NH4)2SO4 với tỷ lệ 40g, 60g, 80g, 100g, 120g/ lít dịch, khuấy đều, để lắng nhiệt
độ phòng.
4.2. Tinh sạch Cholinesterase bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion sử dụng
nhựa trao đổi là DEAE sepharose fast
Sử dụng gel DEAE với các điều kiện pH và rửa giải khác nhau, giai đoạn
này gồm 2 bước:
Bước 1: Chạy sắc ký ở pH 4 ÷ 4,5 bằng đệm axetat.
Bước 2: Chạy sắc kí ở pH 8 ÷ 8,5 bằng đệm photphat.
4.3. Nghiên cứu một số tính chất của Cholinesterase
4.3.1. Ảnh hưởng của thời gian ly tâm và vận tốc ly tâm.

4.3.2. Ảnh hưởng của pH.
4.3.3. Xác định độ pH tối ưu.
4.3.4. Xác định nhiệt độ thích hợp.
4.3.5. Xác định đệm thích hợp nhất sử dụng trong quá trình chạy sắc kí.


10
4.3.6. Nghiên cứu điều kiện nâng cao họa độ của ChE khi chạy sắc kí.

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận


11

5.2. Đề nghị

TÀI LIỆU THAM KHẢO


12

Thái nguyên, ngày…tháng….năm 2013
Giáo viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

Trần Lê Nam