luận án ngành huyết học ỨNG DỤNG kỹ THUẬT KHUẾCH đại GIEN KHẢO sát các tổ hợp GIEN THƯỜNG gặp TRONG BỆNH lý BẠCH cầu cấp tt

28

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

PHAN NGUYỄN THANH VÂN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHUẾCH ĐẠI GIEN
KHẢO SÁT CÁC TỔ HỢP GIEN THƯỜNG GẶP
TRONG BỆNH LÝ BẠCH CẦU CẤP

Chuyên ngành: Huyết học
Mã số: 62.72.25.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2013


27

2

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ

Cơng trình được hồn thành tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH
1.

Người hướng dẫn khoa học:
- 1.Thư
việnTS.
Quố
c gia Việ
t nam
PGS.
Nguyễn
Tấn
Bỉnh
- 2.Thư
việnBửu
Khoa
học tổng hợp TP Hồ Chí Minh
PGS.
Mật
Phản biện 1: PGS. TS. Nguyễn Duy Thăng
Bệnh viện Trung ương Huế
Phản biện 2: TS. Phan Bích Liên
Bệnh viện Chợ Rẫy
Phản biện 3: PGS. TS. Nguyễn Hà Thanh
Viện Huyết học Truyền máu Trung ương

Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp
trường họp tại ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH
Vào hồi giờ , ngày tháng năm 2013

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt nam
- Thư viện Khoa học tổng hợp TP. Hồ Chí Minh
- Thư viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh

8.

Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2006). “Triển khai
kỹ thuật FISH và RT-PCR nhằm phát hiện bất thường nhiễm sắc thể
và gen trong bệnh lý huyết học tại bệnh viện Truyền máu Huyết học
thành phố Hồ Chí Minh”. Tạp Chí Y Học Thực Hành, 545: 73-79.
Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2007). “Ứng dụng
kỹ thuật FISH và RT-PCR trong chẩn đoán và điều trị các bệnh lý
huyết học tại bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí
Minh”. Tạp Chí Y Học Việt Nam, 331: 1-12.
Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2008). “Kỹ thuật di
truyền học tế bào và sinh học phân tử trong chẩn đoán, tiên lượng và
điều trị các bệnh lý huyết học”. Tạp Chí Y Học Việt Nam, 344: 1323.
Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Thị Kim Định, Phan Thị Xinh
(2010). “Khảo sát bộ 4 tổ hợp gen thường gặp trong bạch cầu cấp
dòng lympho tại BV Truyền Máu - Huyết Học TP. HCM”. Tạp chí Y

học Việt nam, 373: 180-185.
Phan Nguyễn Thanh Vân, Phan Thị Xinh, Trần Thị Trúc Thanh,
Nguyễn Tấn Bỉnh (2011). “Những bất thường nhiễm sắc thể và gien
trong bệnh bạch cầu cấp dịng tủy”. Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh,
15 (4): 64-71.
Phan Nguyễn Thanh Vân, Phan Thị Xinh, Trần Thị Trúc Thanh,
Nguyễn Tấn Bỉnh (2011). “Những bất thường nhiễm sắc thể và gien
trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho”. Tạp chí Y học TP. Hồ Chí
Minh, 15 (4): 72-78.
Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh, Nguyễn Thị Kim
Định, Phan Thị Xinh (2011). “Xác định 4 tổ hợp gien TEL/AML1,
BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 trong bạch cầu cấp dòng lympho
tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP. Hồ Chí Minh”. Tạp chí Y
học TP. Hồ Chí Minh, 15 (4): 493-497.
Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh, Nguyễn Thị Kim
Định, Phan Thị Xinh (2011). “Xác định 4 tổ hợp gien AML1/ETO,
PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 trong bạch cầu cấp dòng tủy
tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh”.
Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, 15 (4): 498-502.


26

3
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

KIẾN NGHỊ
1. Kỹ thuật RT-PCR phát hiện 4 tổ hợp gien thường gặp
trong BCCDT hay BCCDL một cách nhanh chóng, có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao, góp phần cho hướng chẩn đốn chính xác các thể

bệnh BCCDT, giúp phân nhóm tiên lượng chính xác góp phần
nâng cao chất lượng và hiệu quả điều trị. Kỹ thuật đơn giản nên có
thể dễ dàng triển khai trong những phòng xét nghiệm sinh học
phân tử của chuyên ngành Huyết học.
2. Trong trường hợp chưa thể phân nhóm tiên lượng, chúng
ta nên dùng khảo sát tiếp theo bằng kỹ thuật giải trình tự gien và
phân tích nhiễm sắc thể. Chúng ta cần phối hợp kỹ thuật PCR và
phân tích nhiễm sắc thể để đánh giá được kiểu hình bất thường
gien và nhiễm sắc thể đầy đủ, góp phần phân nhóm tiên lượng. Kỹ
thuật giải trình tự thì phức tạp hơn, kỹ thuật cao, để xác định các
đột biến gien FLT3, c-kit, NPM1, CEBPA … giúp phân nhóm tiên
lượng cho nhóm khơng có tổ hợp gien và bất thường nhiễm sắc
thể.
3. Chúng ta cần tiến hành khảo sát với số lượng mẫu lớn hơn
và xây dựng mẫu kiểm soát chất lượng (QC-Quality control) để
tiến đến hoàn thiện kỹ thuật trên hai tổ hợp gien minor BCR/ABL
và TEL/AML1. Hơn nữa, cần tiếp tục tiến hành xây dựng và triển
khai kỹ thuật RQ-PCR trên tổ hợp gien major BCR/ABL và các tổ
hợp gien thường gặp cịn lại trong bệnh BCCDL và BCCDT. Từ
đó, chúng ta đưa kỹ thuật RQ-PCR thành công cụ vàng trong theo
dõi tồn lưu ác tính đối với những bất thường về tổ hợp gien đã
được xác định có ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh.
4. Với mục tiêu cao hơn nữa là nâng kỹ thuật RQ-PCR của
chúng ta ngang tầm thế giới, chúng ta cần tiến hành chuẩn hóa
một cách nghiêm ngặt để có thể xác định được hệ số qui đổi ra
chuẩn quốc tế. Để thực hiện được điều đó, cần đầu tư thêm về
trang thiết bị, máy móc và đào tạo nhân sự bài bản, chuyên sâu
hơn nữa.

1. Đặt vấn đề

Bệnh bạch cầu cấp (BCC) là bệnh lý ác tính của hệ tạo
máu được đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong
máu và tủy xương. BCC được chia thành 2 nhóm chính là BCC
dịng tủy (BCCDT) và BCC dịng lympho (BCCDL). Trong mỗi
nhóm được chia thành nhiều thể khác nhau dựa trên phân loại
FAB, bao gồm 8 thể BCCDT và 3 thể BCCDL. Trong những năm
gần đây nhờ ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy xác định các dấu
ấn bề mặt tế bào giúp phân loại dưới nhóm, tuy nhiên BCC vẫn
khơng đồng nhất về mặt đáp ứng điều trị. Từ năm 1973, nhờ phát
triển của phương pháp băng nhiễm sắc thể (NST) và các kỹ thuật
di truyền học phân tử như kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang
(FISH), PCR, giải trình tự chuỗi DNA… nên các bất thường NST
và gien trong BCCDT và BCCDL được phát hiện và nghiên cứu
trong mối liên hệ với đáp ứng điều trị.
Tại Việt Nam, nhiều nhà khoa học đã thực hiện khá nhiều
nghiên cứu về ung thư, từ dịch tễ cho đến điều trị. Tuy nhiên, việc
nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền trong phân tích các bất
thường NST trong chẩn đốn và điều trị bệnh lý bạch cầu cấp còn
rất hạn chế. Từ tháng 3 năm 2006, Bệnh viện Truyền Máu Huyết
Học thành phố Hồ Chí Minh (BV. TMHH TP. HCM) đã áp dụng
thường qui các kỹ thuật sinh học phân tử FISH và RT-PCR trong
chẩn đoán, tiên lượng và đặc biệt là theo dõi đáp ứng điều trị,
đánh giá bệnh tồn lưu ở mức độ phân tử ở bệnh lý bệnh BCMDT,
BCCDT và BCCDL. Trong năm 2006, 123 bệnh nhân bệnh bạch
cầu được phân tích bằng kỹ thuật FISH để phát hiện các chuyển
đoạn t(9;22), t(15;17) và t(8;21) và bằng kỹ thuật RT-PCR để phát
hiện các tổ hợp gien BCR/ABL, PML/RARA và AML1/ETO tại
Bệnh viện. Trong 2 năm, từ 2008 đến 2010, Bệnh viện phối hợp
với Đại học Y dược TP. HCM triển khai đề tài cấp Nhà nước
chuẩn hóa các kỹ thuật di truyền phân tử trong bệnh lý huyết học.

4

25

Việc ứng dụng sinh học phân tử (kỹ thuật RT-PCR,
Multiplex PCR, PCR định lượng gien) cho kết quả nhanh chóng
hơn so với các kỹ thuật di truyền như nhiễm sắc thể đồ hay FISH,
nên đáp ứng kịp thời với nhu cầu chẩn đốn bệnh và chọn lựa
phác đồ thích hợp. Kỹ thuật có độ nhạy cao, nên rất thích hợp để
theo dõi điều trị bệnh và đánh giá nguy cơ tái phát bệnh. Bên cạnh
đó, chúng ta có thể phát hiện nhiều bất thường cùng một lúc, thay
vì tốn nhiều thời gian và chi phí cho việc khảo sát từng bất thường
như trong kỹ thuật FISH, nên phân nhóm tiên lượng bệnh sớm.
Chính vì vậy, chúng tơi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu
tổng quát như sau: "Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gien khảo sát
các tổ hợp gien thường gặp trong bệnh lý bạch cầu cấp, góp phần
phân loại nhóm tiên lượng bệnh và theo dõi điều trị, tại Bệnh viện
Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh, từ ngày 01 tháng
10 năm 2009 đến 31 tháng 7 năm 2011". Để đạt được kết quả trên,
chúng tôi cần phải thực hiện các mục tiêu chuyên biệt sau:

dõi hiệu quả điều trị, chúng ta nên sử dụng kỹ thuật RQ-PCR như
một xét nghiệm thường qui ở các khoa huyết học

1. Xác định tỷ lệ của các tổ hợp gien thường gặp lúc mới
chẩn đốn trong nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng tủy.
2. Xác định tỷ lệ của các tổ hợp gien thường gặp lúc mới
chẩn đốn trong nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lympho.

3. Triển khai kỹ thuật PCR định lượng theo dõi điều trị.
2. Tính cấp thiết của đề tài
Cùng với tính đa dạng về hình thái lâm sàng, nhóm bệnh
bạch cầu cấp có thể do rất nhiều cơ chế phân tử gây bệnh khác
nhau. Trên thế giới, việc đánh giá các bất thường nhiễm sắc thể và
gien bằng kỹ thuật sinh học phân tử được coi là tiêu chuẩn bắt
buộc cho việc phân nhóm tiên lượng và hướng dẫn điều trị bệnh
nhân bạch cầu cấp. Tại Việt nam, đây là vấn đề còn rất mới và cần
được nghiên cứu ứng dụng. Ứng dụng kỹ thuật PCR giúp cho việc
xác định nhanh các tổ hợp gien trong khoảng 1/3 trường hợp BCC
lúc chẩn đoán và sử dụng tổ hợp gien đó như là dấu ấn để theo dõi
quá trình điều trị là vấn đề hết sức quan trọng và cần thiết giúp
phân nhóm tiên lượng, lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp và đánh
giá đáp ứng điều trị, góp phần nâng cao tỉ lệ lui bệnh, kéo dài thời

KẾT LUẬN
Qua khảo sát 341 bệnh nhân được chẩn đoán bệnh bạch
cầu cấp, bao gồm 162 BN bạch cầu cấp dòng tủy và 179 BN bạch
cầu cấp dòng lympho tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.
HCM, từ ngày 01/10/2009 đến ngày 31/07/2011, chúng tơi có
những kết luận sau:
1. Nhóm bệnh BCCDT có 19 BN biểu hiện AML1/ETO
(11,7%), 11 BN biểu hiện PML/RARA (6,8%), 7 BN biểu hiện
CBFB/MYH11 (4,3%), và 4 BN biểu hiện MLL/AF9 (2,5%).
2. Nhóm bệnh BCCDL có 17 BN biểu hiện TEL/AML1
(9,5%), 16 BN biểu hiện BCR/ABL (8,9%), 5 BN biểu hiện
MLL/AF4 (2,8%), và 8 BN biểu hiện E2A/PBX1 (4,5%).
3. Chúng tôi cũng đã thiết lập được các qui trình RT-PCR
trong chẩn đốn các tổ hợp gien thường gặp trong BCCDT
(AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9), và BCCDL

(TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF9 và E2A/PBX1); cũng như triển
khai RQ-PCR để định lượng số bản sao của những tổ hợp gien để
theo dõi đáp ứng chính xác hơn trong q trình điều trị.
Chẩn đoán
bạch cầu cấp

BCCDT
BCCDT

BCCDL

RT-PCR
4 tổ hợp gien

RT-PCR
4 tổ hợp gien
Dương tính

Định lượng
gien

Dương tính


24

5

nhau nên mang tính chủ quan cao, đơi khi khơng phản ánh đúng tỉ
lệ tồn lưu tế bào ác tính.

gian sống và tiết kiệm chi phí điều trị cho bệnh nhân mắc bệnh
BCC tại Việt nam.

Đáng chú ý là ca 1615, ở lần gửi mẫu đầu thứ ba (1615-4),
lúc này bệnh nhân đã được điều trị hoàn tất với Hyper CVAD +
Imatinib. Khi khảo sát bằng kỹ thuật FISH và RT-PCR đều cho
kết quả âm tính, cịn khảo sát bằng kỹ thuật RQ-PCR cho thấy tỉ lệ
minor BCR/ABL vẫn còn 0,26%. Điều này có hai khả năng: thứ
nhất là RQ-PCR cho kết quả dương tính giả, thứ hai là độ nhạy
của kỹ thuật FISH không đủ để phát hiện lượng tế bào tồn lưu q
thấp vì khơng nhìn thấy băng. Khi so sánh với kết quả dấu ấn
miễn dịch được thực hiện bằng kỹ thuật dòng chảy tế bào ở cùng
thời điểm (mẫu cũng được gửi ngày 07/01/2011) cho thấy vẫn cịn
tồn lưu tế bào ác tính nhưng tỉ lệ rất thấp, trong đó kiểu hình
CD7+CD22+ chiếm 0,015%. Điều đó cho thấy kết quả RQ-PCR
phù hợp với kết quả dấu ấn miễn dịch. Và nếu kết quả này đúng
thì đồng nghĩa với việc tiềm ẩn nguy cơ tái phát cao. Thật vậy,
đến lần gửi mẫu tiếp theo ngày 06/06/2011 thì kết quả khảo sát tổ
hợp gien minor BCR/ABL bằng kỹ thuật RT-PCR là dương tính và
bệnh nhân được chẩn đốn BCCDL tái phát tủy lần 2.

3. Những đóng góp mới của luận án

Tóm lại, chúng tơi đã bước đầu triển khai thành công kỹ
thuật RQ-PCR trên tổ hợp gien minor BCR/ABL và TEL/AML1.
Kết quả định lượng tồn lưu tế bào ác tính bằng kỹ thuật RQ-PCR
được thực hiện song song mẫu thử, mẫu chuẩn và chứng nội tại
đảm bảo tính khái quát, khách quan, độ tin cậy và độ nhạy cao.
Hơn nữa, kết quả được hiển thị dưới dạng hàm log giúp dễ dàng

theo dõi mức độ lui bệnh về mặt di truyền học tế bào. Vì vậy, qua
những điều trên có thể khẳng định được độ tin cậy và độ nhạy của
kỹ thuật RQ-PCR mà chúng tôi đã triển khai. Khơng giống như kỹ
thuật RT-PCR chỉ mang tính định tính, kỹ thuật RQ-PCR đã phản
ánh được kết quả tồn lưu tế bào ác tính qua các giai đoạn điều trị
trên những bệnh nhân được khảo sát. Điều này đặc biệt có ý nghĩa
trong việc theo dõi hiệu quả điều trị.
Trên cơ sở của kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy
rằng sau khi phát hiện tổ hợp gien bằng kỹ thuật RT-PCR, để theo

Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt nam được thực hiện
trên mẫu lớn, gồm 341 bệnh nhân, để khảo sát các tổ hợp gien
trong hai nhóm bạch cầu cấp dịng tủy và dịng lympho. Ý nghĩa
nổi bật của cơng trình nghiên cứu là việc xây dựng thành cơng kỹ
thuật PCR định lượng có ý nghĩa theo dõi thay đổi về số lượng
của các tổ hợp gien trong quá trình điều trị. Việc triển khai ứng
dụng các kỹ thuật mới này sẽ có ý nghĩa thực tiễn lớn trong công
tác điều trị bệnh nhân.
4. Bố cục luận án
Luận án có 106 trang, bao gồm: đặt vấn đề 3 trang, tổng
quan tài liệu 31 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 18
trang, kết quả 31 trang, bàn luận 21 trang, kết luận 1 trang và kiến
nghị 1 trang. Có 53 bảng, 2 sơ đồ, 8 biểu đồ, 12 hình và 150 tài
liệu tham khảo (tiếng Việt 3, tiếng Anh 147).
Chương 1: Tổng quan tài liệu
1.1. Di truyền phân tử và ý nghĩa trong BCCDT
1.1.1. Chuyển đoạn t(8;21)(q22;q22)
Chuyển đoạn t(8;21)(q22;q22) được mô tả lần đầu tiên
vào năm 1973. Đây là chuyển đoạn rất thường gặp trong bệnh
BCCDT thể M2 (theo FAB) tạo ra tổ hợp gien AML1/ETO. Gien

AML1 bình thường mã hóa protein có vai trị trong hoạt hóa phiên
mã làm tế bào phân chia và biệt hóa. Khi xuất hiện chuyển đoạn,
protein hình thành từ tổ hợp gien AML1/ETO khơng những khơng
có chức năng của protein AML1 mà cịn ức chế protein AML1
bình thường, dẫn đến tế bào bị ung thư. Chuyển đoạn t(8;21) có
tiên lượng tốt ở người lớn bệnh BCCDT, tỷ lệ đạt lui bệnh cao với
thời gian lui bệnh kéo dài nếu trong điều trị củng cố sử dụng liều
cao Cytarabine. Khác với người lớn, trẻ em có chuyển đoạn


6
t(8;21) đáp ứng trung bình với hóa trị liệu và có thời gian sống
ngắn hơn.
1.1.2. Chuyển đoạn t(15;17)(q22;q11)
Chuyển đoạn t(15;17)(q22;q11) và tổ hợp gien
PML/RARα là chuyển đoạn đặc hiệu trong BCCDT, thể M3
(APL), được gợi ý bằng sự hiện diện của nhiều hạt lớn tiền tủy
bào kết hợp với đông máu nội mạch lan tỏa, nhưng cũng có phân
nhóm với ít hạt li ti. Tổ hợp gien PML/RARA được sử dụng như
một chỉ điểm cho việc phát hiện những tế bào APL tại thời điểm
chẩn đoán cũng như theo dõi trong suốt quá trình điều trị. Bình
thường, protein sản phẩm của gien RARα có chức năng hoạt hóa
q trình phiên mã của các gien có vai trị giúp tế bào trưởng
thành. Cấu trúc của protein này có phần gắn vào deoxyribonucleic
acid (DNA) và một phần tương tác với dẫn chất của acid retinoic.
Trong trường hợp chuyển đoạn t(15;17), tổ hợp gien
PML/RARα mã hóa protein mới, protein mới này khơng những
khơng hoạt hóa phiên mã mà cịn ức chế chức năng của RARα
bình thường do đó tế bào khơng tổng hợp được protein, quá trình
trưởng thành tế bào dừng lại ở giai đoạn tiền tủy bào. Theo y văn,

để hoạt động ức chế phiên mã, protein PML/RARα phải gắn với
một phức chất khác gồm chất đồng ức chế nhân (NcoR: Nuclear
CoRepressor) và enzym histone de-acetylase. Hiện tượng gắn hai
phức này sẽ bị ly giải với sự có mặt của dẫn chất acid retinoic và
khi ly giải thì protein PML/RARα khơng cịn tác dụng. Lợi dụng
đặc tính này, người ta dùng ATRA (All Trans Retinoic Acid) để
điều trị bệnh. Những chiến lược điều trị APL mới tập trung vào
giảm thiểu liệu pháp hóa trị, dùng kết hợp ATRA và Arsenic
trioxide (nhắm vào đích là gien PML) như là liệu pháp ban đầu
cho những bệnh nhân không thể đáp ứng với anthracycline hoặc
những người lớn tuổi.
1.1.3. Đảo đoạn nhiễm sắc thể 16
Đảo đoạn nhiễm sắc thể 16, inv(16)(p13;q22) đã được Le
Beau mô tả trong bệnh BCCDT vào năm 1983; ngoài ra, một bất
thường liên hệ khác cũng được mô tả là chuyển đoạn

23
4.4. Triển khai kỹ thuật PCR định lượng theo dõi điều trị
4.4.1. Điều kiện xây dựng đường chuẩn
Chúng tôi đã xác định được nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu là
600C chung cho phản ứng PCR khuếch đại chứng nội tại - gien
ABL, tổ hợp gien minor BCR/ABL và TEL/AML1 để thu nhận gien
đích phục vụ cho q trình xây dựng đường chuẩn.
Ngoài ra, điều kiện cho phản ứng PCR định lượng cũng
được xây dựng chung cho cả gien ABL, tổ hợp gien minor
BCR/ABL và TEL/AML1. Nhờ đó, trong cùng một đợt RQ-PCR có
thể xác định cùng lúc tổ hợp gien minor BCR/ABL và TEL/AML1.
Điều này đặc biệt ý nghĩa vì giúp tiết kiệm rất nhiều thời gian, hóa
chất, cơng sức và giúp đơn giản hóa qui trình.
Ngồi ra, điều kiện cho phản ứng PCR định lượng cũng

được xây dựng chung cho cả gien ABL, tổ hợp gien minor
BCR/ABL và TEL/AML1. Nhờ đó, trong cùng một đợt RQ-PCR có
thể xác định cùng lúc tổ hợp gien minor BCR/ABL và TEL/AML1.
Điều này đặc biệt ý nghĩa vì giúp tiết kiệm rất nhiều thời gian, hóa
chất, cơng sức và giúp đơn giản hóa qui trình.
Đường chuẩn của chứng nội tại và mẫu chuẩn của tổ hợp
gien minor BCR/ABL và TEL/AML1 với độ tuyến tính và hiệu suất
phản ứng rất cao.
4.4.2. Kết quả theo dõi đáp ứng điều trị bằng phương pháp
RQ-PCR
Nhìn chung, tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính khi khảo sát
bằng kỹ thuật RQ-PCR luôn cao hơn so với kỹ thuật FISH và
thậm chí có những ca cho kết quả khác biệt âm dương.
Cụ thể, ca 1598-2, 1874-3 có kết quả RQ-PCR dương tính
(phù hợp với kết quả RT-PCR) nhưng kết quả FISH lại âm tính.
Điều này có thể được lý giải là do kỹ thuật FISH chỉ phân tích 200
tế bào nên độ nhạy khơng cao, dễ bỏ sót khi tế bào dương tính q
ít. Ngồi ra, tùy vùng đọc mà sẽ cho ra tỉ lệ tế bào dương khác


22
4.3. Theo dõi điều trị bằng kỹ thuật RT-PCR
Số lượng bệnh nhân tham gia vào giai đoạn đánh giá tổ
hợp gien sau điều trị là 36 người, chiếm hơn 10% so với lúc mới
chẩn đoán (341 người). Trong 36 bệnh nhân BCCDT và BCCDL
được theo dõi sau điều trị bằng RT-PCR, có đến hai phần ba là trẻ
em (24/36 tổng số), bao gồm 3 nhóm bệnh: BCCDL-B, BCCDL-T,
BCCDT. BCCDL-B có số lượng đông nhất 61% (22/36 tổng số)
và 91% trong số đó là trẻ em dưới 15 tuổi (20/22 BCCDL). Tương
tự, có 2,7% bệnh nhân thuộc nhóm BCCDL T (1/36 tổng số) và là

trẻ em dưới 15 tuổi. Tuy nhiên, trong 36,1% bệnh nhân BCCDT
(13/36 tổng số) có 76,9% trên 15 tuổi (10/13 trường hợp).
Tỉ lệ trẻ em tham gia giai đoạn 2 nhiều hơn người lớn có
thể giải thích: do bệnh BCCDL tập trung vào nhóm trẻ em nhiều
hơn, khả năng chữa khỏi cao hơn theo nghiên cứu của tác giả Võ
Thị Thanh Trúc là 97,6%, tác giả Ching-Hon Pui là 98%; đa số trẻ
em đều được bảo hiểm y tế chi trả từ 80 - 100% kinh phí khám
chữa bệnh, chi phí thực hiện các xét nghiệm chẩn đốn và theo dõi
bệnh nên có điều kiện theo đuổi điều trị lâu dài.
Trong nghiên cứu, sau đợt hóa trị liệu tấn cơng, trong tổng
số 49 trường hợp BCCDT có biểu hiện gien lúc chẩn đoán, 13
trường hợp được theo dõi bằng sinh học phân tử, và 7 trường hợp
(53,9%) vẫn biểu hiện gien bất thường mặc dù lui bệnh hồn tồn
sau điều trị tấn cơng. Trong tổng số 52 trường hợp BCCDL có
biểu hiện gien lúc chẩn đốn, 23 trường hợp được theo dõi bằng
sinh học phân tử, và 8 (34,9%) trường hợp vẫn biểu hiện gien bất
thường mặc dù lui bệnh hồn tồn sau điều trị tấn cơng.
Điều này phù hợp với quan điểm chung của các nhà khoa
học trên thế giới, vào giai đoạn lui bệnh hoàn tồn dựa vào hình
thái học, bệnh nhân BCC vẫn cịn tồn lưu khoảng 1010 tế bào ác
tính trong tủy xương. Bằng kỹ thuật RT-PCR, chúng ta có thể phát
hiện được tồn lưu tế bào ác tính qua việc biểu hiện các kiểu hình
gien bất thường.

7
t(16;16)(p13;q32). Bất thường này xảy ra chủ yếu (khoảng 50%)
trên bệnh nhân BCC dịng tủy-monơ bào có kèm tăng bạch cầu ái
toan (BCCDT-M4Eo). Những bệnh nhân BCCDT có
inv(16)/t(16;16) có tiên lượng tốt với tỷ lệ đạt lui bệnh cao và thời
gian sống kéo dài (hơn 50% bệnh nhân). Sự chuyển đoạn xảy ra ít

hơn 10% ở bệnh nhân lớn hơn 60 tuổi bệnh BCCDT mới.
1.1.4. Chuyển đoạn t(9;11)(p22;q23)
Gien MLL tổ hợp với một trong 60 gien đồng hành khác
nhau tạo thành những chuyển đoạn NST trong những bệnh bạch
cầu cấp khác nhau, hình thành nên những protein tổ hợp MLL
phức tạp. Trong số những chuyển đoạn liên quan đến bất thường
NST 11 thì chuyển đoạn t(9;11)(p21-22;q23) chiếm tỉ lệ cao nhất
trong bệnh BCCDT, đặc biệt là trong bệnh BCCDT thứ phát đã
được điều trị với những chất ức chế men topoisomerase II; hiếm
gặp trong bệnh BCCDL. Tổ hợp gien MLL/AF9 đã được chứng
minh là có vai trò rất quan trọng trong sự phát triển của tế bào gốc
và sự hình thành ung thư do ức chế sự biệt hóa của những tế bào
đầu nguồn hệ tạo máu. Nhìn chung, những bệnh nhân BCCDT có
mang tổ hợp gien MLL/AF9 được xếp vào nhóm có tiên lượng
trung bình.
1.2. Di truyền phân tử và ý nghĩa trong BCCDL
1.2.1. Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22)
Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22) được Romana nhận dạng
đầu tiên bằng kỹ thuật FISH vào năm 1994. Đến năm 1995, Golub
đã chứng minh tổ hợp gien trong chuyển đoạn này là TEL/AML1.
Chuyển đoạn này không dễ được phát hiện bằng kỹ thuật phân
tích NST vì kích thước NST thay đổi khơng đáng kể. Những
nghiên cứu khác nhau sau đó đã chứng minh rằng đây là chuyển
đoạn thường gặp nhất ở bệnh BCCDL trẻ em, và chiếm khoảng
25% trường hợp BCCDL trẻ em. Phần lớn những bệnh nhân
dương tính nằm trong độ tuổi từ 1 đến 12 tuổi ở thời điểm chẩn
đoán, và thường gặp nhất là độ tuổi từ 2 đến 5 tuổi; tất cả đều thể
hiện dấu ấn miễn dịch thuộc dòng tế bào precursor-B, đặc biệt là

8

21

BCCDL thể common và BCCDL thể pre-B, hiếm gặp hơn ở dòng
tế bào BCCDL thể pro-B.

được bệnh nhân BCCDL. Căn cứ vào kết quả xác định gien, nhóm
tiên lượng tốt (TEL/AML1) chiếm tỉ lệ 9,5%, nhóm cịn lại chiếm
tỉ lệ khá cao 90,5%. Tuy nhiên, nhóm này khơng thể được xếp loại
là nhóm tiên lượng khơng tốt vì chúng ta chưa loại trừ được các
trường hợp đa bội trong nhóm này. Với 90,5% số bệnh nhân còn
lại mang những bất thường NST khác như đa bội, thiểu bội, mất
đoạn, thêm đoạn hoặc chuyển vị NST khác hiếm gặp hơn thì phải
cần kết quả NST đồ. Mỗi kỹ thuật có một ưu điểm riêng mà kỹ
thuật khác không thể thay thế được. Kỹ thuật RT-PCR không thể
được sử dụng để khảo sát riêng lẻ mà phải bổ sung với kỹ thuật
NST đồ.

Cả gien TEL và gien AML1 đều mã hóa cho những yếu tố
điều hòa phiên mã nhân. Tổ hợp gien này phá vỡ chức năng bình
thường của gien TEL và/ hoặc tạo ra một yếu tố ức chế phiên mã,
làm suy giảm biểu hiện của gien AML1. Tiên lượng nhóm bệnh
nhân này tốt và độc lập với các yếu tố nguy cơ chuẩn lâm sàng
như tuổi và số lượng bạch cầu. Kết quả điều trị tốt với tỷ lệ sống
khỏi bệnh đến 90%. Tổ hợp gien TEL/AML1 có tần suất xuất hiện
cao trong bệnh BCCDL precursor-B đã thúc đẩy nhiều nhóm
nghiên cứu phát triển kỹ thuật RT-PCR định lượng nhằm vào tổ
hợp gien này để theo dõi tồn lưu tế bào ác tính.
1.2.2. Chuyển đoạn t(9;22)(q34;q11)

Khoảng 20-30% bệnh nhân BCCDL người lớn có mang
NST Ph với sự tạo thành tổ hợp gien BCR/ABL mã hóa cho
protein BCR/ABL có trọng lượng phân tử 190 kDa gọi là P190
BCR/ABL. Tỷ lệ này thậm chí lên đến 50% ở nhóm bệnh nhân
trên 50 tuổi. BCR/ABL fusion protein dẫn đến sự kích hoạt
tyrosine kinase mà đóng vai trị trung tâm trong sự tiến triển bệnh
BCCDL và BCMDT mang Ph+ . Phát hiện này giúp cải thiện
đáng kể tiên lượng cho bệnh nhân nếu được điều trị thêm bằng
thuốc ức chế đặc hiệu hoạt tính ABL như imatinib. Cũng như
trong BCMDT, kháng imatinib do sự xuất hiện thêm đột biến tại
vùng gắn imatinib của BCR/ABL cũng thường gặp trên lâm sàng
sau một thời gian điều trị. Các thuốc ức chế ABL thế hệ mới như
dasatinib, nilotinib hay bosutinib có thể là giải pháp thay thế hiệu
quả khi có kháng imatinib.
1.2.3. Chuyển đoạn t(4;11)(q21;q23)
Những nghiên cứu phân tử chỉ ra rằng t(4;11)(q21;q23)
liên quan đến gien MLL nằm trên NST 11 và gien AF4 nằm trên
NST 4. Bình thường gien MLL mã hóa cho protein có khả năng
gắn kết DNA và có vai trị quan trọng cho hoạt động phiên mã các
gien liên quan đến quá trình biệt hóa. Trong chuyển đoạn t(4;11),
gien này bị chuyển tới gắn với gien AF4 ở nhiễm sắc thể số 4, làm

Kỹ thuật Multiplex PCR đã giúp phát hiện những tổ hợp
gien khác ngoài 4 tổ hợp gien trên STIL/TAL1, FUS/ERG,
ETV6/MN1.... Trong đó tổ hợp gien STIL/TAL1 rất thường gặp
trong BCCDL-T. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện được
2 ca dương tính với tổ hợp gien STIL/TAL1 trong 33 ca BCCDL-T,
chiếm tỉ lệ 6,06%, với độ tuổi lần lượt là 10 và 14 tuổi. Kết quả
này phù hợp với kết quả của những nghiên cứu khác trên thế giới
cho thấy tổ hợp gien STIL/TAL1 hiện diện trong khoảng 5-25%

BN BCCDL-T trẻ em. Cho đến nay, ý nghĩa tiên lượng của tổ hợp
gien STIL/TAL1 vẫn chưa được hiểu rõ. Tuy nhiên, tổ hợp gien
này hiện đang được dùng như là một gien đích để theo dõi điều trị
rất thành cơng. Kết quả nghiên cứu của Mansur MB và cộng sự
cho thấy khi BN có mang đột biến gien NOTCH1 đồng thời
dương tính với tổ hợp gien STIL/TAL1 sẽ có tiên lượng xấu.
Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy rằng: sau khi
chẩn đoán xác định BCCDT hay BCCDL, chúng ta nên sử dụng
RT-PCR trong xác định các tổ hợp gien thường gặp trong
BCCDT (AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9), và
BCCDL (TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF9 và E2A/PBX1). Xét
nghiệm này nên được thực hiện thường qui ở các bệnh viện
chuyên khoa huyết học, là cơ sở để phân nhóm tiên lượng và lựa
chọn phác đồ điều trị thích hợp.


20

9

kê (p < 0,0001). Điều này phù hợp với quần thể nghiên cứu, vì tủy
đồ và dấu ấn miễn dịch tế bào phù hợp chặt chẽ với nhau trong
chẩn đoán các phân nhóm từ M0 đến M7, với Kappa = 0,751.

mất tính bình thường của gien MLL và sản phẩm protein của nó
mất khả năng gắn kết DNA làm cho tế bào khơng biệt hóa được.

Mặc dù với số mẫu khảo sát trong từng nhóm bệnh chưa
nhiều, nhưng chúng tơi cũng đã xác định được có liên hệ giữa
hình thái học, dấu ấn miễn dịch và các đột biến NST. Cho đến nay,

các bất thường về NST liên quan chặt chẽ với bệnh lý ác tính hệ
tạo máu và là chỉ định rất quan trọng trong việc chẩn đoán và tiên
lượng bệnh.
4.2.2. Nhóm bệnh bạch cầu cấp dịng lympho
Từ 01/10/2009 đến 31/07/2011, khảo sát 179 bệnh nhân
(BN) BCCDL mới chẩn đốn bằng kỹ thuật RT-PCR, chúng tơi
phát hiện 17 BN biểu hiện TEL/AML1 (9,5%), 16 BN biểu hiện
BCR/ABL (8,9%), 5 BN biểu hiện MLL/AF4 (2,8%), và 8 BN biểu
hiện E2A/PBX1 (4,5%). Tỉ lệ của 3 tổ hợp gien E2A/PBX1,
MLL/AF4, BCR/ABL tương đương với các nghiên cứu khác; riêng
tỉ lệ TEL/AML1 9,5% (17/179) khá khác biệt. Nếu xét trong nhóm
BCCDL dưới 15 tuổi và BCCDL-B thì tỷ lệ BN dương tính với
TEL/AML1 lần lượt là 11,9% (16/134) và 11,6% (17/146). Đây là
tỷ lệ khá thấp so với tần xuất thường được báo cáo của TEL/AML1
trên BN BCCDL trẻ em là 20-25%. Tuy nhiên, khi so sánh với
một nghiên cứu tương tự của tác giả Elia L.; thì kết quả của chúng
tơi phù hợp (11,6% so với 11,4%). Cụ thể, tác giả sử dụng phương
pháp Multiplex RT-PCR khảo sát trên 170 BN BCCDL (70 BN
trẻ em và 100 BN người lớn) đã phát hiện 67/170 (39%) BN có
mang đột biến gien. Trong đó, ở nhóm BCCDL trẻ em thì
TEL/AML1 chiếm tỷ lệ 11,4% (8/70). Vì vậy, để có thể lý giải cho
sự khác biệt lớn về tỷ lệ TEL/AML1 dương tính so với tần suất
thường được báo cáo trên thế giới thì cần có những nghiên cứu
sâu hơn trên quần thể người Việt Nam với cỡ mẫu lớn hơn tập
trung vào nhóm BN BCCDL trẻ em.
Trong nghiên cứu này, chỉ với kỹ thuật RT-PCR, chúng
tôi đã phát hiện được 46 bệnh nhân có mang 4 kiểu tổ hợp gien
thường gặp trên, chiếm tỷ lệ 25,7% giúp phân nhóm tiên lượng

Tổ hợp gien MLL/AF4 được xác định như là một yếu tố

bất lợi ở bệnh bạch cầu nhũ nhi bởi nhiều nhóm nghiên cứu.
Chuyển đoạn này gắn liền với tiên lượng xấu ở người lớn, nhưng
dường như tiên lượng được cải thiện khi dùng Ara-C liều cao
trong giai đoạn tấn công ở bệnh BCCDL người lớn. Ở những ca
trẻ em, có một vài ý kiến cho rằng nhóm tuổi khác nhau sẽ có tiên
lượng khác nhau. Bên cạnh đó, theo Young và Godley, bệnh nhân
BCCDL có chuyển đoạn t(4;11) được tiên lượng xấu với tỷ lệ đáp
ứng điều trị ban đầu cao nhưng thời gian lui bệnh ngắn dưới 1
năm.
1.2.4. Chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13)
Năm 1984, Williams đã mô tả chuyển đoạn liên quan
nhiễm sắc thể 1 và 19 là t(1;19)(q23;p13) ở 5% bệnh BCCDL tế
bào pre-B, là một chỉ điểm cho những trường hợp có nguy cơ cao
tái phát tại hệ thần kinh trung ương. Chuyển vị t(1;19) được tìm
thấy trong khoảng 5-6% bệnh nhân BCCDL trẻ em và khoảng 3%
bệnh nhân BCCDL người lớn. Tổ hợp gien E2A/PBX1 mã hóa cho
yếu tố hoạt hóa phiên mã liên tục (chimeric), cịn được gọi là
oncoprotein (protein gây ung thư) với vùng hoạt hóa phiên mã ở
đầu N của gien E2A gắn với vùng homeobox gắn kết DNA đầu C
của gien PBX1. Từ đó làm tế bào tăng sinh q mức khơng kiểm
sốt được. Hoạt động biến dạng của những protein này đã được
chứng minh cả trong ống nghiệm (in vitro), lẫn trong tế bào sống
(in vivo). Bệnh nhân BCCDL có tổ hợp gien này tiên lượng xấu
và đáp ứng kém với hóa trị liệu.
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả loạt ca triển khai kỹ
thuật mới
2.2. Đối tượng nghiên cứu

10
2.2.1. Dân số
2.2.1.1. Dân số nghiên cứu: Bệnh nhân được chẩn đoán bệnh
bạch cầu cấp tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ
Chí Minh.
2.2.1.2. Dân số mục tiêu: Bệnh nhân được chẩn đoán bệnh bạch
cầu cấp tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí
Minh hội đủ tiêu chuẩn chọn mẫu, thuộc mẫu được chọn trong
thời gian nghiên cứu từ ngày 01 tháng 10 năm 2009 đến 31 tháng
07 năm 2011.
2.2.2. Tiêu chuẩn chọn mẫu
2.2.2.1. Tiêu chuẩn nhận vào nghiên cứu: Đối tượng trong dân
số mục tiêu sẽ được nhận vào nghiên cứu khi hội đủ các điều kiện
sau:
♦ Vào thời điểm chẩn đoán: Bệnh nhân mới được chẩn
đốn xác định BCC dịng tủy hay lympho và được tiến hành khảo
sát tổ hợp gien lần 1.
♦ Theo dõi điều trị: Tiến hành khảo sát tổ hợp gien trên các
bệnh nhân có biểu hiện dương tính lúc chẩn đoán.
2.2.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ: Đối tượng hội đủ tiêu chuẩn nhận
vào nghiên cứu nếu có một trong các yếu tố sau sẽ bị loại ra khỏi
nghiên cứu:
♦ Bệnh nhân hoặc thân nhân khơng đồng ý tham gia chương
trình.
♦ Bệnh nhân cũ, đã hoặc đang điều trị khi chưa tiến hành
xác định gien.
♦ Mẫu không đạt chất lượng.
2.2.3. Cỡ mẫu: toàn bộ
Từ ngày 01/10/2009 đến ngày 31/07/2011, 341 bệnh bạch
cầu cấp (162 BCCDT và 179 BCCDL) đã được chọn vào nhóm

nghiên cứu.

19
chuyển đoạn thường gặp trong bệnh BCCDT, kết quả là tạo thành
tổ hợp gien MLL/AF9. Khi khảo sát những bất thường thường gặp
trong bệnh BCCDT bằng kỹ thuật RT-PCR, chúng tôi ghi nhận tổ
hợp gien MLL/AF9 chiếm tỉ lệ 2,5%. Kết quả này tương đương so
với tỉ lệ khoảng 2,1% so với báo cáo của tác giả Mrozek K và
cộng sự. Chúng tôi nhận thấy trong 4 BN dương tính với tổ hợp
gien MLL/AF9 thì có đến 3 BN (75%) có độ tuổi dưới 15. Ngồi
ra, có đến 3 trong số 4 ca (75%) dương tính với tổ hợp gien
MLL/AF9 thuộc thể M5. Những kết quả này hoàn toàn phù hợp so
với kết quả nghiên cứu của tác giả Swansbury GJ. và cộng sự cho
thấy mặc dù những BN dương tính với tổ hợp gien MLL/AF9 gặp
ở mọi lứa tuổi nhưng có hơn 50% BN là dưới 15 tuổi và có 75%
BN dương tính với MLL/AF9 thuộc thể M5.
Ngoài ra, kỹ thuật Multiplex PCR đã giúp phát hiện thêm
những tổ hợp gien khác ngoài 4 tổ hợp gien trên. Trong đó phần
lớn những bất thường liên quan đến gien MLL. Do đó, trong tương
lai cần khảo sát những đột biến liên quan đến gien này nhằm hỗ
trợ cho việc phân nhóm tiên lượng. Đáng chú ý là phát hiện 01 ca
BCCDT-M7 có biểu hiện BCR/ABL mà bình thường tổ hợp gien
này sẽ khơng được khảo sát trong nhóm bệnh BCCDT do có tần
xuất rất thấp. Theo nhóm nghiên cứu SWOG/ECOG thì BN
BCCDT mang tổ hợp gien này được xếp vào nhóm tiên lượng xấu.
Tuy nhiên, kỹ thuật Multiplex PCR địi hỏi tốn nhiều thời gian và
cơng sức khi phải thực hiện qua hai giai đoạn, mỗi giai đoạn hai
bước PCR với rất nhiều cặp mồi.
Trong nghiên cứu của chúng tơi, có mối liên quan giữa
chẩn đốn tủy đồ và tổ hợp gien (P < 0,0001), cụ thể liên quan có

ý nghĩa thống kê (P < 0,05) giữa chẩn đoán BCCDT thể M2 và
gien AML1/ETO, thể M3 và gien PML/RARA. Nói cách khác, tổ
hợp gien PML/RARA thường gặp ở BCCDT thể M3 và không gặp
ở BCCDT thể M2 cũng như các thể khác; trong khi đó tổ hợp gien
AML1/ETO thường gặp ở BCCDT thể M2, phù hợp với kết quả
của tác giả Rowe D. và cộng sự. Điều này góp phần cho hướng
chẩn đốn chính xác các thể bệnh BCCDT. Tương tự như vậy,
dấu ấn miễn dịch tế bào và tổ hợp gien liên quan có ý nghĩa thống


18
tự so với tác giả C. H. Pui. Trong những trường hợp khơng có sự
thống nhất giữa hai kỹ thuật xét nghiệm, chúng tôi cho rằng dấu
ấn miễn dịch tế bào có kết luận đáng tin cậy hơn vì phương pháp
phân tích khách quan, phản ánh trung thực sự dương tính của các
dấu ấn đặc trưng của cùng một dịng, kết hợp với sự âm tính của
các dấu ấn thuộc các dịng khác. Ngồi ra, kết quả dấu ấn miễn
dịch tế bào ít phụ thuộc vào người đọc khác nhau.
4.2. Các tổ hợp gien lúc mới chẩn đoán
Từ ngày 01/10/2009 đến ngày 31/07/2011, 341 bệnh nhân
mắc bệnh bạch cầu cấp đã được chọn vào nhóm nghiên cứu để xác
định các bất thường gien, bao gồm nhóm BCCDT (162 BN, chiếm
tỉ lệ 47,5%) và nhóm BCCDL (179 BN, chiếm tỉ lệ 52,5%). Các
kết quả được trình bày như sau theo nhóm bệnh lý: BCCDT và
BCCDL.

11
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Các bước tiến hành: được mơ tả trong sơ đồ 2.1
Chẩn đốn

BCC

BCCDT
RT-PCR

BCCDL
Âm tính

Âm tính
Multiplex
PCR

4 tổ hợp
gien

Trong nghiên cứu này, chỉ với kỹ thuật RT-PCR, chúng
tôi đã phát hiện được 41 bệnh nhân có mang 4 kiểu tổ hợp gien
thường gặp trên, chiếm tỷ lệ 25,3% giúp phân nhóm tiên lượng
được bệnh nhân BCCDT. Trong đó, nhóm tiên lượng tốt
(AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11) chiếm tỉ lệ 22,8%, tỉ lệ
này tương đương với nghiên cứu của United Kingdom Medical
Research Council (MRC-10). Nhóm cịn lại chiếm tỉ lệ 77,2% có
biểu hiện MLL/AF9 hay khơng biểu hiện tổ hợp gien nào trong số
4 tổ hợp gien khảo sát, tuy nhiên chúng ta chưa thể loại trừ bất
thường nhiễm sắc thể (NST) khác nên khơng xếp vào nhóm tiên
lượng trung bình được.
Trong số những chuyển đoạn liên quan đến NST 11q23 thì
t(9;11) là một trong những chuyển đoạn chiếm tỉ lệ cao và là

4 tổ hợp

gien

Dương tính

4.2.1. Nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng tủy
Từ 01/10/2009 đến 31/07/2011, khảo sát 162 bệnh nhân
(BN) BCCDT mới chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR, chúng tôi
phát hiện 19 BN biểu hiện AML1/ETO (11,7%), 11 BN biểu hiện
PML/RARA (6,8%), 7 BN biểu hiện CBFB/MYH11 (4,3%), và 4
BN biểu hiện MLL/AF9 (2,5%).

RT-PCR

Dương
tính

Định lượng
gien

Dương
tính

Sơ đồ 2.1. Các bước tiến hành xác định gien
2.3.2. Mô tả kỹ thuật: Các mẫu được thực hiện qua các bước sau
♦ Lấy mẫu, vận chuyển mẫu và chuẩn bị mẫu
♦ Ly trích RNA
♦ Tổng hợp cDNA
♦ Phản ứng khuếch đại gien
Kiểm tra chất lượng cDNA
Khảo sát 4 tổ hợp gien trong BCCDT

Khảo sát 4 tổ hợp gien trong BCCDL
♦ Multiplex PCR
Giai đoạn Master PCR


12
Giai đoạn Split – out PCR
♦ PCR định lượng gien (RQ-PCR)
Xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị mẫu chứng nội tại
Phản ứng PCR định lượng (RQ-PCR)
2.4. Phân tích số liệu
♦ Sử dụng phần mềm vi tính Excell và MedCalc 11.6 for
Windows để nhập, xử lý và phân tích số liệu.
♦ Kết quả trình bày dưới dạng bảng tần số. Kết quả xử lý
thống kê trình bày dưới dạng trung vị, tỷ lệ.
♦ Đánh giá sự tương quan bằng phép kiểm Chi bình
phương; giá trị p < 0,05 được xem là có ý nghĩa thống kê. Đối với
các bảng có số liệu < 5, sử dụng phép kiểm Fisher’s exact.
♦ Đánh giá sự phù hợp giữa 2 kỹ thuật chẩn đoán tủy đồ và
dấu ấn miễn dịch tế bào bằng độ phù hợp Kappa.
Chương 3: Kết quả nghiên cứu
3.1. Đặc điểm chung của quần thể nghiên cứu
Từ ngày 01/10/2009 đến ngày 31/07/2011, 341 bệnh nhân
mắc bệnh bạch cầu cấp đã được chọn vào nhóm nghiên cứu để xác
định các bất thường gien, bao gồm nhóm BCCDT (162 BN, chiếm
tỉ lệ 47,5%) và nhóm BCCDL (179 BN, chiếm tỉ lệ 52,5%). Trong
số này, có 36 BN được theo dõi bằng sinh học phân tử. Các kết
quả được trình bày như sau theo nhóm bệnh lý
3.1.1. Nhóm bệnh bạch cầu cấp dịng tủy

162 bệnh nhân BCCDT, chiếm tỉ lệ 47,5% trên tổng số
bạch cầu cấp, đã được xác định 4 tổ hợp gien AML1/ETO,
PML/RARA, CBFB/MYH11 và MLL/AF9.

17
phân biệt được dòng B và T như kỹ thuật dấu ấn miễn dịch tế bào.
Trong khi dựa vào dấu ấn miễn dịch tế bào, chúng ta có thể phân
thành 4 nhóm khác nhau: BCCDT, BCCDL-B, BCCDL-T và
BCC biphenotype. Điều này rất cần thiết cho các bác sĩ điều trị
trong việc chẩn đoán, chọn lựa phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh.
Với bệnh BCCDT, cả hai phương pháp dấu ấn miễn dịch
tế bào và tủy đồ đều có khả năng phân loại dưới nhóm từ M0 đến
M7. Tỉ lệ phù hợp giữa hai phương pháp là: 3 trường hợp M0; 3
trường hợp M1; 81 trường hợp M2; 22 trường hợp M3; 14 trường
hợp M4; 3 trường hợp M5 và 2 trường hợp M7. Tủy đồ và dấu ấn
miễn dịch tế bào có phù hợp chặt chẽ với nhau trong chẩn đốn
các phân nhóm từ M0 đến M7, với Kappa = 0,751. Đặc biệt trong
đó, trường hợp phân nhóm M3 được chẩn đoán xác định dựa vào
nhiều xét nghiệm khác nhau: tủy đồ, PCR và dấu ấn miễn dịch tế
bào. Tiêu chuẩn xác định bằng dấu ấn miễn dịch tế bào thường
căn cứ vào HLA.DR âm tính (HLA.DR-). Tuy nhiên, ngày nay,
yếu tố quyết định chính xác BCCDT phân nhóm M3 lại là phức
hợp PML/RARA (dựa vào PCR).
Ở BCCDL, tủy đồ phân BCCDL thành 3 nhóm L1, L2, L3
dựa vào các tiêu chuẩn phân loại về hình thái. Chẩn đốn tủy đồ
gồm 2 nhóm chính: L1 (2,2%) và L2 (97,8%); khác với nghiên
cứu của tác giả C. H. Pui có tỉ lệ L1 cao nhất. Có sự khác biệt trên
có thể do phân loại hình thái học theo FAB thường dựa vào sự chủ
quan của người đọc tủy đồ và do khơng có một tiêu chuẩn rõ ràng
để phân biệt L1 và L2. Song phân biệt L1 và L2 khơng có ý nghĩa

nhiều trong việc tiên lượng cũng như điều trị. Trong nghiên cứu
của chúng tơi, khơng có mối liên quan giữa hình thái tế bào và các
đột biến NST, điều này phù hợp các tác giả C. H. Pui.
Trong khi đó, kỹ thuật dấu ấn miễn dịch tế bào có thể
nhận diện được bản chất tế bào thuộc dịng B hay T, ngồi ra cịn
xác định được giai đoạn trưởng thành của tế bào. Ở nghiên cứu
này, sự phân bố dòng tế bào theo dấu ấn miễn dịch tế bào tập
trung ở dòng lympho B (81,6%), bao gồm các thể BCCDL
Precursor B, Pro B, common B và B. Tỷ lệ bệnh nhân có dấu ấn
miễn dịch tế bào là dòng B chiếm tỷ lệ cao nhất và tỷ lệ này tương


16
Chương 4: Bàn luận
4.1. Đặc điểm chung của quần thể nghiên cứu
Từ ngày 01/10/2009 đến ngày 31/07/2011, 341 bệnh nhân
mắc bệnh bạch cầu cấp thỏa mãn tiêu chuẩn chọn vào nghiên cứu
và tiêu chuẩn loại trừ, đã được chọn vào nhóm nghiên cứu để xác
định các bất thường gien.
4.1.1. Phân nhóm bạch cầu cấp theo tuổi và giới tính
Trong nghiên cứu này, 341 bệnh nhân được chia làm 3
nhóm bệnh: 42,8% là BCCDL-B; 47,5% là BCCDT; 9,6% là
BCCDL-T. Điều này phù hợp với nhận định chung về dịch tễ học
đã được ghi vào y văn của thế giới. Nhằm đánh giá biểu hiện tổ
hợp gien của từng nhóm bệnh, chúng tơi đã loại nhóm BCC
biphenotype ra khỏi nghiên cứu, như đã mô tả trong phần Phương
pháp nghiên cứu.
Mẫu nghiên cứu có tuổi thấp nhất là 10 tháng tuổi và cao
nhất là 84 tuổi, do đó có thể thấy tuổi nào cũng có thể mắc bệnh
BCC. Tuổi trung vị của BCCDT là 35,5 tuổi, BCCDL là 8 tuổi; và

nhóm tuổi mắc bệnh BCCDT cao nhất là trên 15 tuổi (chiếm
77,8% nhóm bệnh BCCDT) trong khi nhóm tuổi mắc bệnh
BCCDL cao nhất là dưới 15 tuổi (chiếm 74,9% nhóm bệnh
BCCDL). Đối với nhóm BCCDL B và T, trẻ em nhiều hơn người
lớn với tỉ lệ khoảng 3:1. Ngược lại, trong nhóm BCCDT, người
lớn gặp nhiều hơn trẻ em với tỉ lệ khoảng 4:1 và nhận định này
phù hợp với các báo cáo thống kê trong nước và thế giới từ trước
đến nay.
4.1.2. So sánh kết quả phân nhóm bạch cầu cấp dựa vào dấu
ấn miễn dịch tế bào và tủy đồ:
Khảo sát tủy đồ và dấu ấn miễn dịch tế bào được thực hiện
độc lập, cùng lúc cho kết quả chẩn đoán và phân loại dưới nhóm.
Theo phân loại hình thái học, chỉ ghi nhận có hai nhóm: BCCDL
(52,5%) và BCCDT (47,5%). Tủy đồ có hạn chế là khơng thể

13
Tuổi của bệnh nhân đa phần trên 15 tuổi (77,8%). Tuổi
trung vị là 35,5 tuổi, giá trị bách phân thứ 25 (25%) là 16 và giá
trị bách phân thứ 75 (75%) là 46. Trong đó, tuổi trung vị của giới
nam là 39, của giới nữ là 31,5. Tỉ lệ nam (51,9%) và nữ (48,1%)
gần như tương đồng nhau trong nhóm bệnh BCCDT.
Kết quả tủy đồ chiếm đa số là M2 (61,1%); kế tiếp, M3
(14,2%), M4 (12,3%); khá tương đồng với kết quả dấu ấn miễn
dịch tế bào là M2 (62,5%); kế tiếp, M3 (14,2%), M4 (11,7%).
Khảo sát tủy đồ và dấu ấn miễn dịch được làm độc lập, cùng lúc
cho kết quả chẩn đoán bệnh gần giống nhau dựa vào tỉ lệ tế bào
non hiện diện trong tủy. Tỉ lệ phù hợp giữa hai phương pháp là: 3
trường hợp M0; 3 trường hợp M1; 81 trường hợp M2; 22 trường
hợp M3; 14 trường hợp M4; 3 trường hợp M5 và 2 trường hợp
M7. Tủy đồ và dấu ấn miễn dịch tế bào có phù hợp chặt chẽ với

nhau trong chẩn đoán các phân nhóm từ M0 đến M7, với Kappa =
0,751.
3.1.2. Nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lympho
179 bệnh nhân BCCDL, chiếm tỉ lệ 52,5% trên tổng số
bạch cầu cấp, đã được xác định 4 tổ hợp gien E2A/PBX1,
MLL/AF4, BCR/ABL, và TEL/AML1.
Tuổi của bệnh nhân đa phần dưới 15 tuổi (74,9%). Tuổi
trung vị là 8 tuổi, giá trị bách phân thứ 25 (25%) là 4 và giá trị
bách phân thứ 75 (75%) là 15,5. Trong đó, tuổi trung vị của giới
nam là 6, của giới nữ là 9. Tỉ lệ nam (55,9%) cao hơn nữ (44,1%).
Tủy đồ phân BCCDL thành 3 nhóm L1, L2, L3 dựa vào
các tiêu chuẩn phân loại về hình thái. Kết quả 97,8% trường hợp
BCCDL có hình thái thuộc nhóm L2, 2,2% cịn lại thuộc nhóm L1.
Trong khi đó, kỹ thuật dấu ấn miễn dịch tế bào có thể nhận diện
được bản chất tế bào thuộc dòng B hay T, ngồi ra cịn xác định
được giai đoạn trưởng thành của tế bào. Ở nghiên cứu này, sự
phân bố dòng tế bào theo dấu ấn miễn dịch tế bào tập trung ở
dòng lympho B (81,6%), bao gồm các thể BCCDL Precursor B,
Pro B, common B và B.


14
3.2. Các tổ hợp gien lúc mới chẩn đoán
Sau đây là các tổ hợp gien trong từng loại bệnh BCC qua
khảo sát bằng kỹ thuật RT-PCR và Multiplex PCR lúc mới chẩn
đốn và phân nhóm tiên lượng
3.2.1. Nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng tủy
Qua khảo sát 162 bệnh nhân (BN) BCCDT, 19 BN biểu
hiện AML1/ETO (11,7%), 11 BN biểu hiện PML/RARA (6,8%), 7
BN biểu hiện CBFB/MYH11 (4,3%), và 4 BN biểu hiện MLL/AF9

(2,5%). Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (AML1/ETO, PML/RARA,
CBFB/MYH11) chiếm tỉ lệ 22,8%, nhóm cịn lại chiếm tỉ lệ 77,2%.
121 trường hợp không biểu hiện gien qua khảo sát bằng
RT-PCR được thực hiện Multiplex PCR, kết quả có tất cả 8
trường hợp được phát hiện thêm tổ hợp gien, cịn lại đều âm tính.
Đa số các trường hợp liên quan đến gien MLL (11q23), 1 trường
hợp BCR/ABL1 b3a2: 472 bp, phù hợp với kết quả kiểm tra lại
bằng kỹ thuật FISH.
Chẩn đốn tủy đồ có liên quan với tổ hợp gien. Khảo sát
cụ thể mối liên quan giữa các thể BCCDT và từng tổ hợp gien,
chúng tôi phát hiện rằng sự liên quan có ý nghĩa thống kê (p <
0,05) giữa chẩn đoán BCCDT thể M2 và gien AML1/ETO,thể M3
và gien PML/RARA. Tương tự như vậy, dấu ấn miễn dịch tế bào
và tổ hợp gien liên quan có ý nghĩa thống kê (p < 0,0001).
3.2.2. Nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lympho
Qua khảo sát 179 bệnh nhân (BN) BCCDL, 17 BN biểu
hiện TEL/AML1 (9,5%), 16 BN biểu hiện BCR/ABL (8,9%), 5 BN
biểu hiện MLL/AF4 (2,8%), và 8 BN biểu hiện E2A/PBX1 (4,5%).
Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (TEL/AML1) chiếm tỉ lệ 9,5%,
nhóm cịn lại chiếm tỉ lệ khá cao 90,5%.
133 trường hợp không biểu hiện gien qua khảo sát bằng
RT-PCR được thực hiện Multiplex PCR, kết quả có tất cả 6
trường hợp được phát hiện thêm tổ hợp gien, cịn lại đều âm tính.

15
Đặc biệt, chúng tơi phát hiện 2 các trường hợp biểu hiện gien
STIL/TAL1.
Sự tương quan giữa tuổi và tổ hợp gien có ý nghĩa thống
kê với p = 0,011. Khảo sát nhóm tuổi và tổ hợp gien BCR/ABL
tương quan có ý nghĩa thống kê với p = 0,0015. Sự tương quan

khơng có ý nghĩa thống kê giữa giới tính và tổ hợp gien (p =
0,0686); tuy nhiên, giữa giới tính và tổ hợp gien BCR/ABL có ý
nghĩa thống kê (p = 0,0192).
3.3. Theo dõi điều trị bằng kỹ thuật RT-PCR
Số lượng bệnh nhân tham gia vào giai đoạn đánh giá tổ
hợp gien sau điều trị là 36 người, chiếm hơn 10% so với lúc mới
chẩn đốn (341 người).
Trong tổng số 49 trường hợp BCCDT có biểu hiện gien
lúc chẩn đoán, 13 trường hợp được theo dõi bằng sinh học phân tử,
và 7 trường hợp (53,9%) vẫn biểu hiện gien bất thường mặc dù lui
bệnh hoàn tồn sau điều trị tấn cơng.
Trong tổng số 52 trường hợp BCCDL có biểu hiện gien
lúc chẩn đốn, 23 trường hợp được theo dõi bằng sinh học phân tử,
và 8 trường hợp (34,8%) vẫn biểu hiện gien bất thường mặc dù lui
bệnh hồn tồn sau điều trị tấn cơng.
3.4. Triển khai kỹ thuật PCR định lượng theo dõi điều trị
3.4.1. Điều kiện xây dựng đường chuẩn
Chúng tôi đã xây dựng thành công đường chuẩn cho
chứng nội tại (gien ABL), và mẫu chuẩn của tổ hợp gien minor
BCR/ABL, TEL/AML1.
3.4.2. Kết quả theo dõi đáp ứng điều trị bằng phương pháp
RQ-PCR
Với điều kiện PCR định lượng được thiết lập, chúng tôi
khảo sát mức độ biểu hiện tổ hợp gien minor BCR/ABL,
TEL/AML1 qua các giai đoạn điều trị của 04 bệnh nhân được chẩn
đoán BCCDL-B thỏa mãn điều kiện chọn mẫu.