Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp chất mang thuốc nanopolymer polyamidoamin (PAMAM) biến tính bằng các tác nhân hướng đích (axit folic, peptit, kháng thể )
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (10.89 MB, 179 trang )
BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG
THUỐC NANO POLYAMIDOAMINE (PAMAM)
BIẾN TÍNH CÓ KHẢ NĂNG HƢỚNG ĐÍCH ĐẾN
TẾ BÀO UNG THƢ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2016
BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG
THUỐC NANO POLYAMIDOAMINE (PAMAM)
BIẾN TÍNH CÓ KHẢ NĂNG HƢỚNG ĐÍCH ĐẾN
TẾ BÀO UNG THƢ
Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số chuyên ngành: 62 44 01 14
Phản biện độc lập 1:
Phản biện độc lập 2:
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS NGUYỄN CỬU KHOA
2. GS.TS NGUYỄN CÔNG HÀO
LỜI CAM ĐOAN
Công trình đƣợc thực hiện tại phòng Hóa dƣợc – Viện Khoa học Vật liệu ứng
dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và đƣợc sự hƣớng dẫn
khoa học của PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa và GS.TS Nguyễn Công Hào. Các nội dung
nghiên cứu, kết quả trong luận án này là trung thực, đƣợc hoàn thành dựa trên các kết
quả nghiên cứu của tôi và các kết quả này chƣa đƣợc dùng cho bất kỳ luận văn cùng
cấp nào.
Tác giả luận án
Nguyễn Thị Bích Trâm
i
LỜI CÁM ƠN
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa và GS.TS Nguyễn Công
Hào đã định hƣớng khoa học, giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Xin gởi đến Thầy những lời biết ơn chân thành nhất.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của TS. Trần Ngọc Quyển và những anh chị trong Viện
Khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Viện Công nghệ Hóa
học trong suốt thời gian tôi thực hiện luận án.
Sau cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên,
giúp đỡ cho tôi hoàn thành luận án này.
ii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ..........................................................................................4
1.1
GIỚI THIỆU DENDRIMER .............................................................................4
1.1.1
Khái niệm về dendrimer ..............................................................................4
1.1.2
Tính chất của dendrimer..............................................................................6
1.1.3
Các phƣơng pháp tổng hợp .......................................................................11
1.1.4
Ứng dụng dendrimer PAMAM làm chất mang thuốc chống ung thƣ
hƣớng đích .............................................................................................................15
1.2
BIẾN TÍNH BỀ MẶT DENDRIMER PAMAM .............................................19
1.2.1
Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân tƣơng hợp sinh học ..................20
1.2.2
Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân hƣớng đích ...............................20
1.3
NHỮNG NGHIÊN CỨU TRƢỚC ĐÂY ........................................................22
1.3.1
Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với các tác nhân alkyl hóa
…………………………………………………………………………...22
1.3.2
Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với các tác nhân hƣớng
đích – acid folic .....................................................................................................25
1.4
PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ CỦA
DENDRIMER VÀ DẪN XUẤT ...............................................................................28
1.4.1
Xác định khối lƣợng phân tử dendrimer và dẫn xuất dựa vào phổ MALDI-
TOF-MS (WtMALD) ................................................................................................ 28
1.4.2
Xác định khối lƣợng phân tử polymer dựa vào phổ 1H-NMR ..................30
1.4.3
Một số phƣơng pháp khác định khối lƣợng phân tử dendrimer và dẫn xuất .......30
CHƢƠNG 2 - NGHIÊN CỨU ......................................................................................32
2.1 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................................32
iii
2.1.1
Nội dung nghiên cứu .................................................................................32
2.1.2
Phƣơng pháp nghiên cứu ...........................................................................34
2.2
THỰC NGHIỆM .............................................................................................48
2.2.1
Hóa chất.....................................................................................................48
2.2.2
Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................49
2.2.3
Thực nghiệm .............................................................................................50
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................72
3.1
TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN G3.0 ..........72
3.1.1
Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-MNR ..........72
3.1.2
Xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối
lƣợng MS ...............................................................................................................79
3.1.3
Xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR
…………………………………………………………………………...80
3.2
BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM VỚI TÁC NHÂN ALKYL ................84
3.2.1
Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride .............................84
3.2.2
Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic ..........................91
3.2.3
Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol ......................................95
3.2.4
Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine ................................ 99
3.3
BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM G3.0 VỚI TÁC NHÂN HƢỚNG ĐÍCH
– ACID FOLIC ........................................................................................................105
3.4.1
Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hƣớng đích - acid folic
105
3.4.2
Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hexanoyl chloride và tác nhân
hƣớng đích - acid folic.........................................................................................108
3.4
KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO .........................................................112
3.5
KẾT QUẢ THÂM NHẬP TẾ BÀO ..............................................................113
iv
3.6
XÁC ĐỊNH KÍCH THƢỚC NANO CỦA DENDRIMER G3.0 VÀ MỘT SỐ
DẪN XUẤT ............................................................................................................116
3.7
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG MANG VÀ NHẢ THUỐC .................................117
3.7.1
Khảo sát khả năng mang (nang hóa) thuốc chống ung thƣ 5-fluorouracil
………………………………………………………………………….117
3.7.2
Khảo sát khả năng nhả thuốc ..................................................................119
KẾT LUẬN .................................................................................................................120
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................122
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ............123
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................
PHỤ LỤC ..........................................................................................................................
v
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Đánh giá khối lƣợng phân tử PAMAM và dẫn xuất dựa vào MALDI-TOF-MS [77]
.......................................................................................................................................29
Bảng 1.2: Khối lƣợng phân tử tính toán theo lý thuyết (WtLT) của các dendrimer
PAMAM từ G-0.5 – G3.0 [1, 98] ................................................................................31
Bảng 2.1: Tỉ lệ proton ở 2 vị trí (e), (a) trên phân tử dendrimer (LT)của các dendrimer
PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 ..........................................................................................42
Bảng 2.2: Tỉ lệ proton ở 2 vị trí (j), (a) trên phân tử dẫn xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 (LT)
.......................................................................................................................................44
Bảng 2.3 Một số thông số vật lý của hóa chất ..............................................................48
Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0
.......................................................................................................................................78
Bảng 3.2: Khối lƣợng phân tử các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 trên cơ sở
khối phổ MS ..................................................................................................................79
Bảng 3.3: Tỉ lệ diện tích các tín hiệu proton ở 2 vị trí (a), (e) thể hiện trên phổ 1HMNR (NMR) của các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 ..................................80
Bảng 3.4: Khối lƣợng phân tử các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 trên cơ sở
phổ 1H-NMR và MS ......................................................................................................82
Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm khảo sát biến tính dendrimer PAMAM
G3.0 với decanoyl chloride theo thời gian ....................................................................85
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride
theo thời gian .................................................................................................................87
Bảng 3.7: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride
.......................................................................................................................................89
Bảng 3.8: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với các tác nhân acyl chloride
.......................................................................................................................................90
Bảng 3.9: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0- acid carboxylic
.......................................................................................................................................92
Bảng 3.10: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với các acid carboxylic .......93
Bảng 3.11 Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol
.......................................................................................................................................96
Bảng 3.12: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcoholhol .....................97
Bảng 3.13: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính
dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine ..............................................................100
Bảng 3.14: Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G2.5
với dodecylamine.........................................................................................................101
Bảng 3.15: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G2.5
với alkylamine .............................................................................................................103
vi
Bảng 3.16: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine ...................104
Bảng 3.17: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm G3.0-FA .........................................106
Bảng 3.18: Dữ liệu phổ 1H-NMR của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA ...110
vii
DANH MỤC CÔNG THỨC
Công thức 2.1: Công thức tính khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM dựa trên phổ 1H-NMR
.......................................................................................................................................41
Công thức 2.2: Công thức tính độ chuyển hóa của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0
thông qua phổ 1H-NMR .................................................................................................44
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cấu trúc phân tử dendrimer [2] ......................................................................4
Hình 1.2: Các thế hệ dendrimer [4] ................................................................................5
Hình 1.3: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi là EDA thế hệ chẵn .............................5
Hình 1.4: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi là hexane diamine thế hệ lẻ .................6
Hình 1.5: Các dạng phân bố dendrimer trong dung dịch [8] ..........................................7
Hình 1.6: Kích thƣớc của dendrimer và kích thƣớc các vật chất trong cơ thể [8] .........8
Hình 1.7: Các hình thức mang thuốc của dendrimer [9] ................................................9
Hình 1.8: Cấu trúc thành vách tế bào Eukaryotic [15] .................................................11
Hình 1.9: Phƣơng pháp tổng hợp từ trong ra ngoài [16] ..............................................12
Hình 1.10: Phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong [16] .........................................12
Hình 1.11: Phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong hai bƣớc ..................................13
Hình 1.12: Phƣơng pháp tổng hợp tăng lũy thừa hai [16] ............................................14
Hình 1.13: Phƣơng pháp tổng hợp trực giao [16].........................................................14
Hình 1.14: Phƣơng pháp tổng hợp với monomer siêu nhóm chức [16] .......................15
Hình 1.15: Nồng độ thuốc trong huyết tƣơng ứng với phƣơng pháp sử dụng thuốc: Tiêm
qua tĩnh mạch (a); Uống trực tiếp (b); Thuốc nhả chậm từ chất mang (c) [33] .................16
Hình 1.16: Sự hƣớng đích thụ động theo cơ chế EPR [15] ..........................................17
Hình 1.17: Dendrimer mang thuốc đƣợc gắn các tác nhân hƣớng đích đến tế bào ung thƣ [37]
.......................................................................................................................................18
Hình 1.18: Quá trình nhập bào của chất mang-thuốc vào tế bào [15] .........................19
Hình 1.19: Thành phần cấu trúc của acid folic .............................................................21
Hình 1.20: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM với nhóm alkyl bề mặt [25] .............24
Hình 1.21: Cấu trúc hóa học của các dẫn xuất: (a) amino/hexyl dendrimer PAMAM G4.0; (b)
hydroxyl/hexyl dendrimer PAMAM G4.0; (c) glucosamine/hexyl dendrimer PAMAM G4.0 [73]
.......................................................................................................................................25
Hình 1.22: Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất dendrimer PAMAM (G5.0-FITC-Folate)Ac [76]
.......................................................................................................................................25
Hình 1.23: Cấu trúc hóa học của dendrime PAMAM G4.0-FA-PEG4000 [47] ..........27
Hình 1.24: Sơ đồ phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G5-Ac(96)-FA-PhiPhiLux G1D2 [78] 28
Hình 2.1: Phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM G3.0 ...............................................43
Hình 2. 2: Phổ 1H-NMR của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10 .......................46
Hình 3.1: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G-0.5 ..............73
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G0.0 ...............73
Hình 3.3: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G0.5 ...............74
Hình 3.4: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G1.0 ...............75
Hình 3.5: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G1.5 ...............75
Hình 3.6: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G2.0 ...............76
Hình 3.7: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G2.5 ...............77
Hình 3.8: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G3.0 ...............78
ix
Hình 3.9: Cấu trúc sản phẩm G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z ...................................84
Hình 3.10: Phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-C10-36h (G3.0-C10)
.......................................................................................................................................87
Hình 3.11: Cấu trúc sản phẩm G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z .................................91
Hình 3.12: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alcohol ................................ 95
Hình 3.13: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-alkylamine ..........................99
Hình 3.14: Cấu trúc sản phẩm dendrimer PAMAM G 3.0-FA ..................................105
Hình 3.15: Phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-FA ....................106
Hình 3.16: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G 3.0-C6-FA ..............................109
Hình 3.17: Phổ của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA ................................109
Hình 3.18: Kết quả phân tích bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu ........................114
Hình 3.19: Kết quả TEM của Dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất dendrimer
PAMAM G3.0-C6 .......................................................................................................116
Hình 3.20: Kết quả TEM của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA và G3.0-C6-FA
.....................................................................................................................................116
Hình 3.21: Sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dendrimer PAMAM G3.0.....118
Hình 3.22: Sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dẫn xuất dendrimer PAMAM
G3.0-C6-FA .................................................................................................................118
x
DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1: Kết quả khảo sát thời gian biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride
.......................................................................................................................................88
Đồ thị 3. 2: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acetyl chloride (G3.0-C2),
hexanoyl chloride (G3.0-C6), decanoyl chloride (G3.0-C10), myristoyl chloride (G3.0-C14)
.......................................................................................................................................91
Đồ thị 3.3 Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid acetic (G3.0-C2-EDC), acid
hexanoic (G3.0-C6-EDC), acid decanoic (G3.0-C10-EDC), acid myristic (G3.0-C14-EDC)..95
Đồ thị 3.4: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với etanol (G3.0-C2-NPC),
hexanol (G3.0-C6-NPC), octanol (G3.0-C8-NPC), dodecanol (G3.0-C12-NPC) ........98
Đồ thị 3.5: Kết quả khảo sát biến tính PAMAM G2.5 với dodecylamine theo nhiệt độ
.....................................................................................................................................102
Đồ thị 3.6: Kết quả biến tính PAMAM G2.5 với alkylamine ....................................104
Đồ thị 3.7: Kết quả thử độc tế bào của PAMAM G3.0; PAMAM G3.0-C2 và
PAMAM G3.0-C14 trên tế bào MCF-7 ......................................................................112
Đồ thị 3.8: Đồ thị biểu hiện lƣợng thuốc đƣợc giải phóng của G3-C6-FA/5FU và 5-FU tự do
.....................................................................................................................................119
xi
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tổng hợp dendrimer PAMAM lõi etylendiamin từ thế hệ G-0.5 đến G3.0
.......................................................................................................................................35
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride ......................37
Sơ đồ 2.3: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic ..................37
Sơ đồ 2.4: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol ...............................38
Sơ đồ 2.5: Các biến đổi không mong muốn của chất hoạt hóa NPC [34] ....................38
Sơ đồ 2.6: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine .........................39
Sơ đồ 2.7: Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA .............................39
Sơ đồ 2.8: Các sản phẩm không mong muốn của phản ứng biến tính dendrimer
PAMAM G3.0 với acid folic .........................................................................................40
Sơ đồ 2.9: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5...........................................51
Sơ đồ 2.10: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0 ..........................................52
Sơ đồ 2.11: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5 ..........................................53
Sơ đồ 2.12: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G2.5 ..........................................55
Sơ đồ 2.13: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G3.0 ..........................................56
Sơ đồ 2.14: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride ..............57
Sơ đồ 2.15: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic ..........60
Sơ đồ 2.16: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol .......................62
Sơ đồ 2.17: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với amine .........................64
Sơ đồ 2.18: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với FA ..............................66
Sơ đồ 2.19: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hecxanoyl chloride và FA
.......................................................................................................................................67
Sơ đồ 2.20: Quy trình nang hóa thuốc 5-FU của dendrimer PAMAM ........................69
Sơ đồ 2.21: Quy trình nhả thuốc 5-FU của dendrimer-5FU .........................................70
xii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Ac
Acetyl
ADN
Acid Deoxyribonucleic
BDA
Butylene Diamine
PBS
Phosphate buffer saline
DAPI
4',6-diamidino-2-phenylindole
DCC
Dicyclohexylcarbodiimide
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DMF
Dimethyleformamide
DMSO
Dimethyl Sulfoxide
EDA
Ethylendiamine
EDC
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
EGFR
Epidermal Growth Factor Receptor
EPR
Enhanced Permeability And Retention Effect
5-FU
5-Flurouracil
FA
Acid folic
FAR
Folate Receptor
FITC
Fluorescein Isothiocyanate
FRET
Fluorescence Resonance Energy Transfer
G
Thế hệ (Generation)
GPC
Gel Permeation Chromatography
1
Proton Nuclear Magnetic Resonance
H-NMR
H
Hiệu suất phản ứng
HER-2
Human Epidermal Growth Factor Receptor
HPLC
High-Performance Liquid Chromatography
LC-MS
Liquid chromatography-mass spectrometry
MA
Methyl acrylate
MPEG
Methoxy polyethylen glycol
MS
Mass Spectroscopy
MRI
Magnetic Resonance Imaging
xiii
NHS
N-Hydroxysuccinimide
NMR
Nuclear Magnetic Resonance
NPC
p-Nitrophenyl chloroformate
PAMAM
Polyamidoamine
PEG
Polyethylene Glycol
PEG 4000
Polyethylene glycol 4000
TEA
Triethylamine
RGD
Arg-Gly-Asp
xiv
MỞ ĐẦU
Ung thƣ là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Sự
tiến bộ của khoa học đã mang đến kết quả ngày một tốt hơn đối với căn bệnh ung thƣ.
Với mục đích điều trị hiệu quả, các nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc điều trị
ngay tại các tế bào ung thƣ và giảm thiểu sự nguy hại đối với các tế bào lành của cơ
thể, y học gọi phƣơng pháp này là điều trị hƣớng đích (Targeted Therapy). Phƣơng
pháp điều trị hƣớng đích mở ra một hƣớng mới trong quá trình điều trị ung thƣ.
Phƣơng pháp này liên quan đến việc sử dụng những loại dƣợc phẩm có khả năng tấn
công một cách đặc biệt đối với các tế bào ung thƣ [1-4]. Khả năng phân biệt tế bào ung
thƣ và tế bào bình thƣờng giúp cho phƣơng pháp điều trị hƣớng đích trở thành một
phƣơng pháp điều trị đƣợc lựa chọn ngày nay.
Các dendrimer đƣợc quan tâm sử dụng nhƣ chất mang thuốc hƣớng đích trong
điều trị ung thƣ. Dendrimer là một loại nano polymer có nhiều đặc điểm nổi bật phù
hợp với vai trò một chất mang với cấu trúc phân tử dạng hình cầu, nhánh bên trong có
nhiều không gian trống, có nhiều nhóm thế hoạt động ở bề mặt. Tuy nhiên, những
nhóm chức hoạt động ở bề mặt dendrimer lại tƣơng tác hóa - sinh học với các tế bào
trong cơ thể do đó chúng gây độc cho tế bào. Nhằm khắc phục những hạn chế trên và
để cải thiện một số tính chất hỗ trợ cho việc mang thuốc đúng nơi và hiệu quả thì bề
mặt dendrimer đƣợc biến tính bằng một trong các tác nhân tƣơng hợp sinh học nhƣ
ankyl, PEG (Polyethylene Glycol), … kết hợp tác nhân hƣớng đích nhƣ acid folic,
peptide RGD (Arg-Gly-Asp), Anti-EGFR (epidermal growth factor receptor) và kháng
thể Anti-HER-2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor), biotin, ... thông qua các
liên kết hóa học [3, 5-12].
Chính vì những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (PAMAM) biến tính có khả năng
hướng đích đến tế bào ung thư”.
1
Mục tiêu của luận án
Tổng hợp các thế hệ dendrimer PAMAM và biến tính bề mặt dendrimer
PAMAM bằng các tác nhân alkyl hóa và tác nhân hƣớng đích (acid folic) nhằm mục
đích xây dựng hệ chất nano mang thuốc chống ung thƣ có tính tƣơng hợp sinh học và
phân phối thuốc đến đúng vị trí tế bào ung thƣ.
Để đạt đƣợc những mục tiêu trên, luận án đã thực hiện các nội dung sau
1. Tổng hợp dendrimer PAMAM (từ thế hệ G-0.5 đến G3.0).
2. Xác định thành phần cấu trúc và khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM
tổng hợp đƣợc.
3. Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân alkyl (acyl chloride,
alcohol, acid carboxylic, alkylamine).
4. Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM G3.0 hay dendrimer PAMAM G3.0-alkyl
với tác nhân hƣớng đích (acid folic).
5. Xác định thành phần cấu trúc, độ chuyển hóa, khối lƣợng phân tử, số nhóm
alkyl chuyển hóa dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 biến tính.
6. Khảo sát độc tính tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và một số dẫn xuất của
dendrimer PAMAM G3.0.
7. Khảo sát kích thƣớc nano của dendrimer PAMAM G3.0 và một số dẫn xuất
dendrimer PAMAM G3.0.
8. Khảo sát khả năng hƣớng đích của hệ chất mang thuốc chống ung thƣ.
9. Khảo sát khả năng mang và nhả thuốc của hệ dendrimer PAMAM G3.0-thuốc.
2
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy một số kết luận có ý nghĩa khoa học
và thực tiễn sau:
-
Đề tài có giá trị trong việc nghiên cứu các hợp chất mang thuốc chống ung thƣ
hƣớng đích, đó là những hợp chất chuyển thuốc chống ung thƣ đến đúng vị trí
tế bào ung thƣ. Đây là vấn đề đang đƣợc xã hội quan tâm hiện nay.
-
Phát hiện mới về phổ 1H-NMR trong việc đánh giá khối lƣợng phân tử
dendrimer có ý nghĩa quan trọng trong việc vận dụng, đánh giá quá trình tổng
hợp chuyển hóa các hợp chất, thuốc, ...
3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1 GIỚI THIỆU DENDRIMER
1.1.1 Khái niệm về dendrimer
Khái niệm dendrimer đƣợc Donald A. Tomalia và cộng sự [13] đƣa ra đầu tiên
vào năm 1985. Dendrimer bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có nghĩa là nhánh
cây. Dendrimer là một nanopolymer có dạng hình cầu, cấu trúc nhánh, có nhiều tính
chất ƣu việt hơn so với polymer mạch thẳng.
Hình 1.1: Cấu trúc phân tử dendrimer [14]
Phân tử dendrimer đƣợc cấu tạo ba phần gồm: lõi (còn gọi là nhân hoặc core), các
nhánh bên trong và các nhóm bề mặt bên ngoài. Các nhánh bên trong đƣợc lặp đi lặp
lại có nhiệm vụ liên kết các nhóm bên ngoài với lõi. Các nhóm bên ngoài còn đƣợc gọi
là các nhóm bề mặt hoạt động (hình 1.1)[14-16].
Dendrimer có các đơn vị nhánh liên tiếp lặp đi lặp lại hƣớng ra ngoài từ điểm nút
khởi đầu. Một dendrimer có hai điểm nút khi đi từ trung tâm đến ngoại vi đƣợc gọi là
dendrimer thế hệ thứ 2 (ký hiệu là G2.0) [14].
4
Hình 1.2: Các thế hệ dendrimer [14]
Dendrimer polyamidoamine (PAMAM) là một dendrimer điển hình, với lõi là
ammonia (NH3) hoặc alkyldiamine nhƣ: ethylene diamine (EDA), butylene diamine
(BDA), hexane diamine, … Cấu trúc nhánh đƣợc xây dựng bởi sự sắp xếp luân phiên
của các phân tử ethylene diamine và methyl acrylate (MA). Dendrimer PAMAM với
các nhóm bề mặt là các nhóm amine –NH2 ta có PAMAM thế hệ nguyên, còn gọi là
thế hệ chẵn, dendrimer PAMAM với các nhóm bề mặt là các nhóm carboxylate –
COOCH3 ta có dendrimer PAMAM thế hệ bán nguyên, còn gọi là thế hệ lẻ [17-19].
Hình 1.3: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi là EDA thế hệ chẵn [18]
5
Hình 1.4: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi là hexane diamine thế hệ lẻ [18]
1.1.2 Tính chất của dendrimer
1.1.2.1 Dendrimer có hình dạng, kích thước xác định
Kích thƣớc và khối lƣợng phân tử dendrimer có thể điều chỉnh trong suốt quá
trình tổng hợp, thể hiện tính đơn phân tán. Chỉ số phân tán của dendrimer gần nhƣ
bằng 1.
D
-
MW
Mn
D: Đƣợc gọi là chỉ số phân tán, đặc trƣng cho độ phân tán của một mẫu
polymer.
-
Mn: Khối lƣợng phân tử trung bình số.
-
Mw: Khối lƣợng phân tử trung bình khối.
-
Mw > Mn: mẫu polymer đa phân tán. Khi D càng lớn thì mẫu polymer
càng phân tán.
Trong dung dịch các dendrimer thƣờng tồn tại ở các dạng sau:
6
-
Dạng monomer, dimer, trimer (hình 1.5a).
-
Kết thành chùm có hình dạng méo mó (hình 1.5b).
-
Kết thành một chuỗi thẳng dài (hình 1.5c) có kích thƣớc khoảng vài chục đến
vài trăm nanometer.
Hình 1.5: Các dạng phân bố dendrimer trong dung dịch [20]
Trong quá trình hòa tan trong dung môi thì các dendrimer tồn tại dƣới dạng hình
cầu, giống nhƣ một trái banh bị nén chặt nên ít hoặc không bị biến dạng. Điều này làm
cho độ nhớt của dendrimer trong dung dịch giảm rất nhiều so với polymer mạch thẳng.
Khi khối lƣợng phân tử dendrimer tăng, độ nhớt có thể đạt đến mức cực đại ở thế hệ
thứ tƣ và sau đó giảm xuống. Trong khi đó, với các polymer thẳng thì độ nhớt sẽ tăng
tỷ lệ với khối lƣợng phân tử [20].
Ngoài ra, các thế hệ dendrimer có kích thƣớc chuẩn rất phù hợp với các vật chất
trong cơ thể, do đó dendrimer rất đƣợc chú trọng trong y học hiện nay.
7
Hình 1.6: Kích thƣớc của dendrimer và kích thƣớc các vật chất trong cơ thể [20]
1.1.2.2 Khả năng hòa tan của dendrimer
Tính tan của dendrimer do lõi và cả nhóm trên bề mặt quyết định. Dendrimer có
các nhóm bên ngoài và lõi là các nhóm ái nƣớc thì có khả năng tan đƣợc trong nƣớc,
trong khi các dendrimer có các nhóm bên ngoài và lõi là các nhóm kỵ nƣớc thì chúng
không có khả năng tan trong nƣớc mà ngƣợc lại, chúng tan đƣợc trong các dung môi
có tính dầu. Độ dài của lõi liên quan đến hình dạng và tính ái dầu của dendrimer, nếu
số nhóm -CH2- trong phân tử lõi càng nhiều sẽ làm tăng tính ái dầu [20].
1.1.2.3 Tính mang vác
Cấu trúc phân tử cho thấy trong phân tử dendrimer có nhiều khoảng trống nên
chúng đƣợc sử dụng nhƣ một chất mang. Các chất chúng có thể mang là thuốc trị
bệnh, các đoạn ADN, các enzyme, các hormone, các xúc tác kim loại. Đặc biệt các
dendrimer rất thích hợp cho việc mang thuốc vì chúng có độ chọn lọc và tính bền vững
cao khi kết hợp với thuốc [21].
8
Hình 1.7: Các hình thức mang thuốc của dendrimer [21]
Một trong những ý tƣởng để giải quyết vấn đề này là đƣa thuốc trực tiếp vào vị
trí cần phát huy tác dụng (cơ quan, tế bào hoặc các thành phần của tế bào), tạo ra một
loại thuốc có tính chọn lọc cao vào một cơ quan nào đó trong cơ thể. Thuốc sẽ phát
huy tác dụng khi đƣợc hấp thu qua màng tế bào. Có nhiều con đƣờng để thuốc hấp thu
qua màng tế bào nhƣ khuếch tán trực tiếp qua lớp lipide, khuếch tán qua các lỗ xuyên
qua lớp lipide, khuếch tán qua màng nhờ chất mang hay sự ẩm bào. Đối với các loại
thuốc gây độc tế bào nhƣ thuốc trị ung thƣ thì đƣợc hấp thu qua màng tế bào nhờ một
hệ vận chuyển thuốc, do đó việc ra đời của chất mang thuốc là một liệu pháp mới
trong điều trị ung thƣ. Các chất mang thuốc có tác dụng nhƣ một giá đỡ cho thuốc,
giúp thuốc tránh khỏi sự đào thải bởi các các cơ chế bảo vệ của cơ thể (chuyển hóa ở
gan, thải trừ qua thận, phân huỷ bởi các enzyme trong máu, tấn công của bạch cầu và
hệ thống miễn dịch....). Các chất mang còn giúp phân tử thuốc đến đƣợc đích tác dụng
mong muốn. Tiêu chí quan trọng nhất đối với các chất mang đó là tính tƣơng hợp sinh
học. Chất mang thuốc có tác dụng nhƣ một tiền dƣợc (prodrug) giúp giảm độc tính của
thuốc, thu hẹp phạm vi phân bố của các thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ
của thuốc và giảm lƣợng thuốc điều trị [5, 21, 22].
1.1.2.4 Tính đa hóa trị
Tính đa hóa trị của dendrimer do các nhóm bên ngoài quyết định, các nhóm bên
ngoài càng nhiều thì hóa trị dendrimer càng tăng. Nhờ vào tính đa hóa trị, các
dendrimer có thể mang đƣợc nhiều nhóm bên ngoài. Dendrimer với nhiều nhóm chức
trên bề mặt có khả năng tƣơng tác với các phối tử đặc trƣng, giúp các nhà nghiên cứu
thiết kế xây dựng các hệ chất mang đa chức năng ứng dụng trong y học [1, 23].
9
