Các phương pháp phân tích và định tính Clostridium Perfringens

MƠN KĨ THUẬT PHÂN TÍCH VSV

Đề tài:

CÁC PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH & ĐỊNH TÍNH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

Tp. HCM, ngày 04 tháng 11 năm 2015

GVHD: THS. TRẦN QUỐC HUY - SVTH: NHÓM 6


NHĨM 6
STT

HỌ VÀ TÊN

MSSV

1

TRẦN THỊ HẰNG

2008120153

2

TRẦN HỒI TÂM

2008120179

3

ĐÀM THỊ ĐÀO

2008120156

4

PHẠM THỊ DIỆU

2008120176

5

MẠC THỊ MỸ NỮ

2008120127

6

NGUYỄN THỊ VIỆT PHƯƠNG

2008120142

7

NGUYỄN THỪA NGỌC CHÂU

2008120150

8

NGUYỄN THỊ TRƯỜNG AN

2008120163


NỘI DUNG

II

IIII

Tổng quan

PP truyền thồng
(đếm khuẩn lạc)
PP Không truyền thống

IIIIII

IIVV

(PCR, RT – PCR,…)

Tài liệu tham khảo


I. TỔNG QUAN

- Gây bệnh qua thực phẩm: ăn trực tiếp bào tử VK hoặc
độc tố nguồn gốc từ VK

- Độc tố đa dạng: sinh bào tử, ko sinh bào tử, ko di động,
Vi khuẩn

hiếu khí, kị khí tùy ý,… nội/ ngoại độc tố

VD: Clostridium botulinum



độc tố botulin (thịt)

VD: Vibrio cholerae
độc tố cholera (cholera toxin)

4
4


I. TỔNG QUAN (TT)
Gram (+), hình que, kị khí, sinh bào tử, đa số di động

- Thủy
Hiệngiải
diệnsaccharide
trong đất và protein  nhận năng lượng
-

Gây bệnh cho người – động vật, hư hỏng thực phẩm.

-

Thủy
giải saccharide:
Lênmàu
menđen,
polysaccharide
 acid
Khử
sulphite
sulphur 
mùi khó chịu

-

acetic, butyric, rượu

Điển hình: C. botulinum, C. perfringens, C. novyi, C.
septicum, C. Sordellii,…
Thủy giải protein & chuyển hóa Ko hồn tồn acid amin

1.1.
Clostridium

 mùi khó chịu


1.1.1. Sơ lược Clostridium perfringens

C. perfringens

Có: Đất, nước,
chất thải, đường
tiêu hóa

Gây nhiễm độc
máu, viêm ruột
tiêu chảy, ngộ
độc cho người

o
PT: 12 -50 C; PT
o ;
chậm: 20 C PT
cực nhanh: 43 –
o
47 C

pH 5 – 8; thời

Kị khí ko B.buộc;

gian thế hệ: 8-10
p; sống MT khắc
nghiệt

6 kiểu k.nguyên
A-F (A ngộ độc)

C. perfingens

Hệ thống phân loại

Hình thái sinh lý

-

Khuẩn lạc C. perfringes:
Giới: Bacteria
+ Trịn, nhẵn bóng;
Ngành: Firmicutes

- Trực khuẩn thẳng, hai đầu hơi trịn,

khíđộc
tuyệttốđối.
+ Bao
bởi 1 vịng bên trong dung huyết hồn tồnkị(do
theta) và một vịng
Lớp:
Clostridia
- Bắt màu Gram +; có vỏ kết nang;
Bộ: Clostridiales
bên ngồi khơng dung huyết hồn tồn (do độc tố alpha).  Hiện tượng dung
- ko lông roi, ko di động;
Họ: Clostridiaceae

huyết beta trên môi trường nuôi cấy có bổ sung máu động vật.
- Ssản: phân đơi tb
Chi: Clostridium
Loài: C. perfringens


C. perfringens

C. perfringens

C. perfringens

Dung huyết
Beta


Các type độc
tố và khả
năng gây
bệnh
C. perfringens


Phương pháp truyền thốngphương pháp đếm khuẩn lạc
Nguyên tắc

Mật độ vi khuẩn Clostridium xác định bằng cách sử dụng môi trường chứa ferri
o
ammonium citrate và disodium sulphite, ủ ở 37 C trong 1-2 ngày. Trên môi trường này
các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphide(S2-) và ion sắt

(Fe2+) có trong mơi trường.


Phương pháp truyền thốngphương pháp đếm khuẩn lạc

Dụng cụ, thiết bị

•

Dụng cụ chuẩn bị mẫu (Thìa, cối xay, dao kéo…)

•

Máy dập mẫu.

•

Đĩa petri, pipet.

•

Ống nghiệm.

•

Máy đếm khuẩn lạc (Nếu có).


Phương pháp truyền thống-phương pháp đếm khuẩn lạc

Hóa chất, mơi trường

•
•
•

Pepton đệm Buffered Peptone water (BPW).
Iron Sulphite Aga (ISA)
Perfringgens Selective Agar (hay Shahidi Ferguson Perfringens, SFP)


Quy trình


Đồng nhất mẫu.

10 g

90 ml (hoặc 225 ml)

(hoặc 25 g)

nước pepton đệm

Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu


Pha loãng mẫu theo dãy thập phân

Cấy mẫu vào mơi trường
Trong đĩa petri

•

Lấy 1ml dung dịch mẫu + 15ml mơi trường

Trong ống nghiệm

•

cho vào đĩa petri và lắc đều.

•

Sau khi mơi trường đơng thì bổ sung thêm

vào ống nghiệm và trộn đều.

•

2-3ml mơi trường.

•

Ủ ở 37 độ C trong 24-48h

Lấy 1ml dịch mẫu + 12ml môi trường cho

Sau khi mơi trường đơng thì bổ sung thêm

2-3ml mơi trường.

•

Ủ ở 37 độ C trong 24-48h


Đếm số khuẩn lạc hình thành

•

Đếm những khuẩn lạc có màu đen.

•

Chọn những đĩa có số khuẩn lạc từ 20-200 để đếm và tính tốn kết quả.

•

Tính tốn kết quả.


Tính tốn kết quả

••

Theo cơng thức:
A (CFU/g hay CFU/ml) =

Trong đó: N: Tổng số khuẩn lạc đếm được

•

v: Thể tích cấy vào mỗi đĩa/ ống nghiệm

•

ni: Số đĩa/ ống nghiệm có số khuẩn lạc được chọn (Độ pha lỗng thích hợp để số lượng khuẩn lạc
nằm trong khoảng 25 – 250)

•

fi: Độ pha lỗng tương đương


Ưu và nhược điểm của
phương pháp truyền thống

Ưu điểm

Cho phép xác định

Định lượng chọn lọc

số tế bào sống

VSV

Định lượng VSV có
mật độ thấp trong

mẫu


Ưu và nhược điểm của
phương pháp truyền thống

Dễ sai số

Không thu
Tốn thời
gian

Nhược
điểm

được kết
quả tổng số
VSV

Chậm thu
kết quả


PHƯƠNG PHÁP KHÔNG TRUYỀN THỐNG

Phương pháp phát hiện gene
16S RNA bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng Multiplex PCR

+ 16S ribosome RNA (16S rRNA) là một thành phần của tiểu đơn vị 30S của ribosome vi
khuẩn.
+ Chiều dài khoảng 1542 nucleotide.
Cấu trúc bậc 2

Chức
năng:
của 16S
RNA
+ Cấu trúc
+ Ổn định chính xác sự bắt cặp của codon - anticodon tại vị trí A


•

Phương pháp tạo dịng invitro, khơng cần sự hiện diện của tế bào.

•

Có thể khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà khơng qua tạo dịng.

•

Q trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt.

•

DNA polymerase khi tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khn cần có mồi chun biệt.

•

Nguyên tắc

DNA mẫu
Enzyme

Thiết bị và dụng cụ
cho phản ứng

Các điều kiện của phản ứng

Số chu kỳ của
phản ứng PCR

Mồi - primer
Deoxynucleotide
triphotphate


•
•

Các giai đọan phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì (cycle) nối tiếp nhau.

MỖI CHU KÌ GỒM 3 BƯỚC

1-Biến tính

2-Lai

3-Kéo dài

Các giai đoạn của phản ứng PCR