ÁP DỤNG KỸ THUẬT QF – PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH HỘI CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH HỘI CHỨNG DOWN

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Luận văn tốt nghiệp Bác Sỹ Nội Trú

ÁP DỤNG KỸ THUẬT QF – PCR ĐỂ
CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH HỘI
CHỨNG DOWN
Người hướng dẫn: Ts. Bs Hoàng Thị Ngọc Lan
Học viên:

Vũ Thị Huyền

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

ĐẶT VẤN ĐỀ



Dị tật bẩm sinh đang là vấn đề quan tâm lớn của toàn xã hội.



HC Down: 120 – 150/100000 (Who 1972) – gánh nặng về
kinh tế và tâm lý cho gia đình xã hội.



Sàng lọc và chẩn đoán phát hiện sớm DTBS: Siêu âm, Sàng

lọc ở huyết thanh mẹ, nuôi cấy NST, FISH.



QF – PCR: khuếch đại STR – xác định số lượng alen trên điện
di – xác định bất thường số lượng NST.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

MỤC TIÊU

1.

Ứng dụng kỹ thuật QF – PCR để chẩn đoán
trước sinh hội chứng Down.

2.

Đánh giá giá trị của kỹ thuật QF – PCR trong
chẩn đoán trước sinh hội chứng Down.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

TỔNG QUAN

Kỹ thuật di truyền tế bào

Kỹ thuật FISH

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Kỹ thuật QF – PCR
- STR:

- Nguyên tắc kỹ thuật QF - PCR

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

CÁCH ĐỌC KẾT QUẢ TỶ LỆ ĐỈNH
Tỷ lệ đỉnh (peak) STR

Kết quả

0,8 – 1,4 : 1

Bình thường

≤ 0,6 : 1 hoặc ≥ 1,8 : 1

Lệch bội NST

1,6 : 1 đối với các alen ≥ 20bp

Bình thường

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

NST
củủa
mẹẹ

NST
củủa
cha

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

A
1:1:1 :TRISOMI

2:1:TRISOMI

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Chọc hút ối ở các thai phụ có tuổi thai ≥ 16 tuần có các tiêu chuẩn:


Kết quả sàng lọc Triple test hoặc Double test nguy cơ cao DS.



Và (hoặc) có hình ảnh siêu âm bất thường.



Và (hoặc) có tiền sử sinh con DS, sinh con dị tật.



Và được sự đồng ý của thai phụ.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệuPHƯƠNG
chia sẻ tại:
wWw.SinhHoc.edu.vn
PHÁP
NGHIÊN CỨU
Mẫu dịch ối

1ml để tách ADN

9 - 10ml nuôi cấy tế bào bằng phương
pháp cấy hở

Tách chiết ADN
Thu hoạch sau 9 - 12 ngày nuôi cấy
Đo độ tinh sạch của ADN
Nhuộm băng G
Kỹ thuật QF - PCR
Điện di mao quản trên máy đọc trình tự tự động ABI
3130 (3100) XL
Đối chiếu
kết quả

Phân tích dữ liệu bằng phần mềm Genemapper ID 3.2

Phân tích KARYOTYP

Kết luận về di truyền cho thai

Đánh giá giá trị của
QF - PCR

Tư vấn di truyền

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu
chia sẻ tại:
QUY
TRÌNH
KỸwWw.SinhHoc.edu.vn
THUẬT QF - PCR
Bệnh viện Phụ sản Trung Ương

Học viện Quân Y và trung tâm Gen-Protein

Mẫu nghiên cứu
Quy trình
1.Tách chiết
và đo độ
tinh sạch
ADN
2.Kỹ thuật
QF-PCR

Sử dụng phương pháp tách

bằng Chelex
Thành phần phản ứng theo
bảng 2.1 với tổng thể tích là 5,5
µl.

Tổng
số
84

84

Thành
công

Quy trình

Tổng
số

Thành
công

84

Sử dụng phương pháp
tách bằng
Phenol/Chloroform

06

06

84

Thành phần phản ứng theo
bảng 2.1 với tổng thể tích
là 5,5 µl

06

06

84

-Thành phần cho 1 mẫu
điện di với tổng thể tích
10,75µl.
-Biến tính
-Chọn GeneScan 500 LIZ
Size
-Máy đọc trình tự tự động
là ABI 3100 XL ứng dụng
Fragment POP4, mao
quản 36.

06

06

3.Điện di

sản phẩm
PCR trên
máy đọc
trình tự

-Thành phần cho 1 mẫu điện di
với tổng thể tích 22,3µl.
-Biến tính
-Chọn GeneScan 500 LIZ Size
-Máy đọc trình tự tự động là
ABI 3130 XL ứng dụng
Fragment POP7, mao quản 36.

4.Phân tích
kết quả

Bằng phần mềm chuyên dụng Genmapper ID 3.2.

84

Mẫu nghiên cứu

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Bộ kit Aneufast
Primer gắn huỳnh quang
dNTP

Buffer
Taq DNA

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
S1

S2

AMXY 11

SRY 10

MXY

M21

M18

M13

SRY

D21S1411

D18S386

D16S631

DXYS267

X22

AMXY

D21S1437

D18S391

D13S634

D21S1414

DXYS218

HPRT

D21S1412

D18S858

D13S742

D21S1446

HPRT

SBMA

D21S1008

D18S499

D13S628

D21S1442

D21S1411

DXS6803

D13S797

D21S1435

DXS6809

D13S631

D13S634

DXS8377

D13S305

D13S258

D18S535

D18S386

D18S391

D18S390

D18S976

D18S1002

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


TàiQUẢ
liệu chia
sẻ tại:
wWw.SinhHoc.edu.vn
KẾT
SÀNG
LỌC
THAI H/C DOWN


Phân
loại

Tuổi mẹ
(90 trường hợp)

Huyết thanh mẹ (68
trường hợp)

Siêu âm
(90 trường hợp)

Huyết thanh mẹ + Siêu âm
(68 trường hợp)

< 35

Nguy cơ
cao DS

Nguy cơ
thấp DS

Bất
thường

Bình
thường

HT và
SÂ (+)

HT +
và SÂ
(±)

HT và
SÂ (-)

43

47

58

10

48

42

38

24

6

DS

17

9

24

2

22

4

20

6

0

Tỷ lệ
sinh
con
DS

17/43=
39,5%

24/58=
41,4%

22/48=

45,8%

Tỷ lệ
phát
hiện
DS

17/26=
65,4%

24/26=
92,3%

22/26=
84,6%

Nguy
cơ

≥ 35

Số
lượng

20/38=5
2,6%

26/26=100%

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN
Phương pháp tách ADN
bằng Chelex
(84 mẫu)

Nồng độ và độ tinh
sạch

28,2ng/µl
OD260nm/280nm = 1,52

Thấp

Phương pháp tách ADN
bằng Phenol/Chloroform
(06 mẫu)

132,5ng/µl
OD260nm/280nm = 1,98

Thời gian

Nhanh ( 30 phút)

Chậm (1 – 2 giờ)

Giá thành

Thấp

Cao

Kỹ thuật

Đơn giản, nhanh

Phức tạp

Không độc

Độc

100%

100%

Mức độ ảnh hưởng
Thành công

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Cao


Tài
liệuQUẢ

chia sẻKỸ
tại:THUẬT
wWw.SinhHoc.edu.vn
KẾT
QF - PCR
Bệnh viện
Học viện Quân
Phụ sản
Y và trung tâm
Trung Ương
Gen-Protein

Đặc điểm

Tỷ lệ (%)

Số mẫu

Số mẫu

HC Down

24

2

3 NST 18

3

1

3 NST 13

1

1

X

1

0

XXY

1

1

XYY

1

0

Bình thường

53

1

54/90 = 60 %

Tổng

84

6

100 %

3 NST 21

Bất thường khác
(10/90 = 11,1 %)

26/90 = 28,9 %

10/90 = 11,1 %

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Kết quả
QF-PCR của thai
có 2 NST 21

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Phù hợp với kết quả di
truyền tế bào

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Kết quả
QF-PCR của thai
có 3 NST 21

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Phù hợp với kết quả di
truyền tế bào

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

MỨC ĐỘ PHÁT HIỆN CÁC ALEN CỦA NST 21
Marker

D21S1442

D21S1414

D21S1446

D21S1411

D21S1435

Không lên
đỉnh

2

6

3

1

1

1 đỉnh

13

5

13

6

9

1:1

47

52

48

56

51

2:1

2

1

0

1

3

1:1:1

0

0

0

0

0

Không lên
đỉnh

1

1

1

0

0

1 đỉnh

3

1

2

2

1

1:1

5

3

3

4

5

2:1

10

9

14

12

10

1:1:1

7

12

6

8

10

Tỷ lệ phát hiện DS (%)

17/26 (65,4%)

21/26 (80,8%)

20/26 (76,9
%)

20/26 (76,9 %)

20/26 (76,9
%)

Tỷ lệ phát hiện chung (%)

64/90 (71,1%)

73/90 (81,1%)

68/90 (75,6
%)

76/90 (84,4 %)

71/90 (78,9%)

Mẫu không
mắc DS
(64)

Mẫu mắc
DS (26)

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tài liệu
chia
tại:QF
wWw.SinhHoc.edu.vn
Độ chính
xác của
kỹsẻ
thuật

- PCR với kỹ thuật DT TB
Kết quả QF –
PCR
(90 mẫu)

Số mẫu (n)

Kiểu NST

Số
mẫu
(n)

Tỷ lệ
thai
(%)

26

28,9

3 NST 18

4

4,44

3 NST 13

2

X
XYY

3 NST 21

Bất thường
khác
Đặc
biệt
Bình thường

Kết quả di truyền tế bào
(90 mẫu)

47,
XY,
+21

47,
XX,
+21

46,XX,t
(21q;21q)

Nghi
ngờ DS
chuyển
đoạn

14

10

1

1

Tỷ lệ
thai
(%)

Độ
chính
xác
(%)

28,9

100

4

4,44

100

2,22

2

2,22

100

1

1,11

1

1,11

100

1

1,11

1

1,11

100

XXY

2

2,22

1

1,11

XX/XY

0

0

1

1,11

46,XX

30

60

30

60

24
Tài46,XY
liệu chia24sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

50

100


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Kết quả
QF-PCR của thai
có karyotype nghi
DS chuyển đoạn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn