Nghiên cứu tái sinh giống sa nhân tím (amomum longilgulare t l wu) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ HỒNG NHUNG

Tên đề tài

NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG SA NHÂN TÍM
(Amomum longilgulare T.L.Wu) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2010 - 2014

Thái Nguyên, năm 2014


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ HỒNG NHUNG

Tên đề tài

NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG SA NHÂN TÍM
(Amomum longilgulare T.L.Wu) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
L ớp
Khoa

: K42 - CNSH

Khoá học

: 2010 - 2014

: CNSH – CNTP

Giáo viên hướng dẫn : 1. PGS.TS. Ngô Xuân Bình
2. ThS. Đào Duy Hưng

Thái Nguyên, năm 2014

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đề tài em đã được sự tạo điều kiện, quan
tâm giúp đỡ của các thầy cô giáo, bạn bè và gia đình, trong thời gian qua
em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình tại phòng thí nghiệm
nuôi cấy mô của Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện Khoa học Sự sống, Đại
học Nông lâm Thái Nguyên.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Ngô Xuân Bình, trưởng khoa
Công nghệ sinh học - Công nghệ Thực Phẩm, cùng toàn thể các thầy cô trong
khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ thực phẩm đã giảng dạy và chỉ bảo
cho em rất nhiều trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Tình, giảng viên
khoa CNSH - CNTP, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, chỉ ra những sai
lầm giúp em hoàn thành tốt khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Đào Duy Hưng cùng các thầy cô,
anh chị tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của Bộ môn Công nghệ Tế bào,
Viện Khoa học Sự sống, Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã tận tình giúp
đỡ và hướng dẫn giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp đại học này.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động
viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học
tập và nghiên cứu.
Do trình độ và điều kiện thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề tài
không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của các
thầy cô và các bạn để đề tài hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái nguyên, ngày 30 tháng 5 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Lê Thị Hồng Nhung

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

BA

: 6-Benzylaminopurine

CT

: Công thức

CV

: Coefficient of Variation

Đ/C

: Đối chứng

IAA

: Indol axetic acid

Kinetin

: 6-Furfurylaminopurine

LSD

: Least Significant Difference Test

MS

: Murashige and Skoog’s

NAA

: α - Naphlene axetic acid

TN

: Thí nghiệm

2,4-D

: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid


MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ........................................................................................................ 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................... 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 3
2.1. Giới thiệu về cây Sa Nhân Tím ................................................................... 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại............................................................................ 3
2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Sa Nhân Tím .......................................... 3

2.1.3. Công dụng Sa Nhân Tím .......................................................................... 6
2.1.4. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sa Nhân Tím trên thế giới và ở
Việt Nam ............................................................................................................ 7
2.1.4.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống Sa Nhân Tím bằng nuôi cấy mô trên
thế giới ................................................................................................................ 7
2.1.4.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống Sa Nhân Tím bằng nuôi cấy mô ở
Việt Nam ............................................................................................................ 8
2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ................. 8
2.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................... 8
2.2.2. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào .................................................... 9
2.2.3. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào ........................................................ 9
2.2.4. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................... 11
2.2.5. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................ 12
2.2.6. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................... 16
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................. 18


3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 18
3.2. Địa điểm, thời gian và điều kiện nghiên cứu ............................................ 18
3.3. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 18
3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 19
3.5. Xử lý số liệu .............................................................................................. 25
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 26
4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng một số chất khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu
Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) ............................................... 26
4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2
(5%) đến khả năng vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare
T.L.Wu) ............................................................................................................ 26
4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch

HgCl2 (0,1%) đến khả năng vô trùng mẫu mẫu Sa Nhân Tím (Amomum
longilgulare T.L.Wu) ....................................................................................... 28
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến
khả năng tái sinh của chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) .... 31
4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi
Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) ............................................... 31
4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Sa
Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) .................................................... 33
4.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả
tái sinh chồi Sa Nhân tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) ............................ 35
4.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả
tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) ............................ 37
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 39
5.1. Kết luận ..................................................................................................... 39
5.2. Kiến nghị ................................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 40


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung
dịch H2O2 (5%) đến khả năng vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum
longilgulare T.L.Wu) ( sau 20 ngày nuôi cấy) ............................................... 26
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 (0,1%)
đến khả năng vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu)
(sau 20 ngày nuôi cấy) ................................................................................... 28
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh
chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) . 31
Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi
Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) ........ 33
Bảng 4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu

quả tái sinh chồi Sa nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày
nuôi cấy) .......................................................................................................... 35
Bảng 4.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu
quả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) .................... 37
(sau 45 ngày nuôi cấy) .................................................................................... 37


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 4.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 (5%)
đến khả năng vô trùng mẫu mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare
T.L.Wu) (sau 20 ngày nuôi cấy) ..................................................................... 27
Hình 4.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl20,1% đến
khả năng vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) sau 20
ngày nuôi cấy .................................................................................................. 29
Hình 4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi Sa
Nhân Tím (Amomum Longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) ............ 32
Hình 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi
Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) .......... 34
Hình 4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu
quả tái sinh chồi cây Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45
ngày nuôi cấy) ................................................................................................. 36
Hình 4.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu
quả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày
nuôi cấy) .......................................................................................................... 38


1

PHẦN 1

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sa Nhân Tím (Amomum longiligulare T.L.Wu), thuộc chi Sa Nhân
(Amomum), họ gừng (Zingiberaceae) [11]. Sa Nhân Tím là cây thuốc quý, có
trong danh mục thực vật rừng quý hiếm ban hành kèm theo nghị định số 18 HĐBT ngày 17/01/1992 [8].
Trong y học cổ truyền, quả Sa Nhân được sử dụng làm thuốc, nhằm kích
thích tiêu hóa, chữa ăn uống không tiêu, bị nôn mửa, đau dạ dày, đau bụng, kiết lỵ,
sảy thai, bệnh cao huyết áp, cao cholesterol máu [11], [15]. Quả Sa Nhân tím chứa
tinh dầu có tác dụng kháng khuẩn và nấm [17], [23], [28]. Sa Nhân Tím còn
được dùng làm gia vị, hương liệu sản xuất xà phòng thơm...Chính vì thế, đây
không chỉ là cây dược liệu quý mà còn được dùng nhiều trong nước và được
xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới.
Rừng tự nhiên đang bị tàn phá nghiêm trọng. Cây dược liệu bị khai thác
tự do nên diện tích và sản lượng ngày càng suy giảm. Cây Sa Nhân đang bị
khai thác tự do nên ngày càng bị thu hẹp về diện tích, giống Sa Nhân Tím
cũng bị mất dần và thoái hóa. Nếu không kịp thời trồng mới và tác động
những biện pháp tích cực thì những nguồn gen cây trồng có giá trị cao cũng
dần bị mất. Trong khi đó nhu cầu sử dụng thuốc đông dược để chăm sóc và
bảo vệ sức khỏe ngày càng cao. Vấn đề phát triển cây dược liệu, khắc phục
những khó khăn trên cần được giải quyết.
Nhân giống Sa Nhân bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ tạo ra được
một sản lượng lớn cây giống sạch bệnh phục vụ cho sản xuất, khắc phục được
những khó khăn trong việc bảo tồn nguồn gen, cung cấp cây giống, giúp cho
người dân chủ động được mùa vụ không phải mất diện tích trồng cũng như
chi phí lưu trữ giống.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu tái sinh giống Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu)
bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào’’.

2

1.2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu thành công tái sinh cây Sa Nhân Tím (Amomum
longilgulare T.L.Wu) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
1.3. Yêu cầu
Xác định được ảnh hưởng một số chất khử trùng (HgCl2, H2O2) đến khả
năng vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu).
Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng (BAP,
IBA, IAA, Kinetin) đến khả năng tái sinh của chồi Sa Nhân Tím (Amomum
longilgulare T.L.Wu).
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu tái sinh giống Sa Nhân Tím bằng phương pháp
nuôi cây mô. Từ đó, đánh giá được tác động của một số chất kích thích sinh
trưởng trong nhân giống Sa Nhân Tím.
Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và
sản xuất giống Sa Nhân Tím có năng suất cao.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu thành công tái sinh cây Sa Nhân Tím bằng phương
pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm bảo tồn nguồn gen cây dược liệu và cung cấp
giống với số lượng lớn, chất lượng đảm bảo, đồng thời giữ được đặc tính di
truyền của cây chon lọc.


3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây Sa Nhân Tím

2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Sa Nhân Tím phân bố chủ yếu ở vùng có khí hậu nhiệt đới, đặc biệt là
khu vực nhiệt đới Đông Nam và Nam Á. Sa Nhân Tím có vùng phân bố từ
đảo Hải Nam Trung Quốc đến vùng Trung Lào và Việt Nam. Ở Việt Nam Sa
Nhân Tím tập trung nhiều nhất ở các tỉnh Tây Nguyên, Quảng Ngãi, Phú Thọ,
Hòa Bình, Lào Cai…với khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm, hai mùa mưa và
khô khá rõ rệt thì Sa Nhân Tím sinh trưởng phát triển tốt và ra hoa kết quả nhiều.
Sa Nhân Tím có tên khoa học là Amomum longiligulare T.L.Wu thuộc:
Giới (regnum)

: Plantae

Ngành (Phylum)

: Tracheophyta

Lớp (Class)

: Liliospida

Bộ (ordo)

: Zingerberales

Họ (Family)

: Zingiberaceae

Chi (genus)

: Amomum

Loài (species)

: Longiligulare [27].

2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Sa Nhân Tím
2.1.2.1. Đặc điểm hình thái của cây Sa Nhân Tím
Cây Sa Nhân Tím thuộc loại cây thảo, sống lâu năm, cao 1,5 – 2,5m,
thân rễ mảnh mọc bò lan trên mặt đất. Lá mọc so le thành 2 dãy, hình mác,
dài 23 - 30cm, rộng 5- 6cm, không lông, lưỡi bẹ cao 2 - 4,5cm.
Cụm hoa bông, mọc từ thân rễ và từ gốc, cuống cụm hoa đài dài 3 –
6cm, gồm nhiều đốt, có vảy màu nâu. Có 5 – 8 hoa trên một cụm, màu trắng.
Lá bắc ngoài hình bầu dục, màu nâu, dài 2,0 – 2,5 cm, rộng 0,8 cm, mép
nguyên, lá bắc trong dạng ống, màu nâu hạt, dài 1,5 cm, đầu chia thành hai


4

thùy nông. Đài hoa dạng ống, dài 1,5 cm hoặc hơn, màu trắng hồng, đầu xẻ 3
thùy. Tràng hoa hình ống, dài 1,6 – 1,7 cm, mặt ngoài có lông thưa, gồm 3
thùy, thùy giữa dài 1,6 cm, rộng 0,4 cm, lớn hơn 2 thùy bên. Cánh môi hình
thìa, dài 1,7 -1,8 cm, rộng 2,0 – 2,2 cm, đầu cánh môi thường cuộn ra phía
sau. Bộ nhị dạng bản, dài 0,6 -0,7 cm, rộng 0,3 cm, nhẵn, bao phấn hai ô. Bầu
hình trứng thuôn, dài 0,4 -0,5 cm, vòi nhụy mảnh dài 2,0 – 2,5 cm. Đầu nhụy
dạng phễu.
Quả dạng nang, hình trứng hay hình cầu, dài 1,3 – 1,6 cm, đường kính
1,2 -1,3cm; chia thành ba múi nông; vỏ ngoài có gai ngắn, dày; màu tím nâu;
khi già gai ngắn bớt và chuyển sang màu tím đen. Hạt hình đa cạnh, màu nâu
đen, cắn vỡ có vị cay, mùi thơm của tinh dầu [3], [6].

2.1.2.2. Đặc điểm sinh thái của cây Sa Nhân Tím
Sa Nhân Tím là cây nhiệt đới, là cây chịu bóng, thích râm mát, sống
dưới ánh sáng tán xạ, độ ánh sáng tốt nhất là 50%, nếu quá râm thì cây Sa
Nhân Tím mọc rậm rạp, ít ra hoa kết quả, thậm chí không ra hoa kết quả. Sa
Nhân Tím mọc hoang dại trong rừng, vì độ khép tán của rừng quá lớn nên
cây ít ra hoa kết quả. Còn cây mọc ở rìa rừng, ánh sáng chiếu xuống tương
đối nhiều, cây tuy thấp nhưng đậu quả rất nhiều. Dưới ánh sáng trực xạ, cây
sinh trưởng kém, lá bị vàng úa.
Sa Nhân Tím sinh trưởng phát triển gần như quanh năm nhưng mạnh
nhất vào mùa mưa ẩm. Sa Nhân Tím ra hoa quả đều hàng năm. Tái sinh tự
nhiên chủ yếu bằng hạt và bằng cách mọc chồi từ thân rễ. Sa Nhân Tím là
cây có biên độ sinh thái rộng, dễ trồng và có thể trồng được ở nhiều vùng
sinh thái khác nhau, từ vùng núi thấp đến trung du và cả đồng bằng [15].
Sa Nhân Tím mọc ở các vùng miền khác nhau thì thích hợp với từng
loại đất khác nhau. Ở các tỉnh phía nam nhìn chung là ở trên loại đất nâu đỏ
phát triển trên bazan có mùn tích tụ ở chân núi (Sơn Hòa – Phú Yên, K’
Bang – Gia Lai...). Đặc điểm chung của loại đất này là có tầng đất mặt sâu,
tỷ lệ hạt sét cao, tơi xốp, dễ thấm nước. Hàm lượng mùn và lân tổng số khá
cao, nhưng kali lại thấp.


5

Sa Nhân Tím trồng ở Chân Mộng – Đoan Hùng – Phú Thọ, Tân Lạc –
Hòa Bình, Đại Từ - Thái Nguyên và nhiều nơi khác có loại đất thuộc nhóm
feralit vàng – đỏ hay đỏ vàng. Nhưng loại đất này thường nghèo về chất dinh
dưỡng, hàm lượng mùn, kali, lân tổng số thấp hơn so với đất nâu – đỏ hay đỏ
- nâu trên bazan.
Ngoài ra, Sa Nhân Tím đem trồng thí nghiệm trên đất phù sa sông
Hồng vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường và ra hoa kết quả nhiều.

Điều đó chứng minh, Sa Nhân Tím cũng có khả năng thích nghi cao đối với
một số loại đất có quá trình lập địa khác nhau [15].
2.1.2.3. Đặc điểm sinh lý của cây Sa Nhân Tím
- Nhu cầu nước và độ ẩm
Nước và độ ẩm không khí là một nhân tố sinh thái quan trọng đối với
quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Sa Nhân Tím. Nhờ có nước, rễ Sa
Nhân Tím mới hấp thụ được các chất hữu cơ và chất khoáng hòa tan trong
nước để thực hiện quá trình đồng hóa. Nhu cầu nước đối với Sa Nhân Tím khi
mới trồng là rất quan trọng. Nước tưới sẽ làm cho đất ẩm, duy trì cho các
nhánh Sa Nhân Tím luôn được tươi, tạo điều kiện ra rễ và mọc chồi. Sau khi
Sa Nhân Tím đã mọc và cho đến suốt quá trình sinh trưởng về sau, mặc dù
không cần tưới nhưng do hệ thống rễ chùm phát triển rất mạnh nên có khả
năng hút được nhiều nước ngầm trong đất.
Tuy nhiên, Sa Nhân Tím không chịu được ngập úng lâu ngày. Vào thời kỳ
ra hoa, nếu gặp trời mưa sẽ ảnh hưởng tới khả năng thụ phấn và tỷ lệ kết quả.
- Nhu cầu ánh sáng
Ánh sáng đối với Sa Nhân Tím cũng là một nhân tố sinh thái cần và đủ.
Có ánh sáng cây mới thực hiện được quá trình quang hợp và đồng hóa. Trong
môi trường tự nhiên, Sa Nhân Tím thường mọc xen dưới tán cây bụi và cây
gỗ, với độ tàn che từ 10 – 60%, thậm chí có chỗ tới nơi 70%. Ở độ tàn che
trên 40% cây sinh trưởng mạnh về chiều cao.


6

- Nhu cầu về dinh dưỡng khoáng
Cây Sa Nhân Tím mọc tự nhiên cũng như trồng đều cần các chất hữu
cơ và chất khoáng để cho cây sinh trưởng và phát triển. Những chất này là do
lớp thảm mục và các sản phẩm thứ cấp từ động vật rừng cung cấp.
Sa Nhân là cây trồng lấy quả, bởi vậy trong quá trình chăm sóc cần chú

ý cung cấp thêm các chất hữu cơ, chất khoáng trong đó không thể thiếu phân
lân [15].
2.1.3. Công dụng Sa Nhân Tím
2.1.3.1. Bộ phận dùng và tiêu chuẩn chất lượng
Sa Nhân là loại dược liệu có giá trị sử dụng rất cao, các bộ phận của
cây điều được sử dụng cho những mục đích nhất định.
Một số bài thuốc sử dụng từ Sa Nhân:
+ Thai nghén hay nôn: Sa Nhân 4g, rễ gai 8g, ích mẫu 6g, hương phụ
4g, mầm cây mía 10g. Tất cả rửa sạch thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400ml nước
còn 100ml, uống làm hai lần. 5 ngày một liệu trình, tái khám lại.
+ Hỗ trợ viêm loét dạ dày mạn tính: Sa Nhân 6g; dạ dày lợn 1 cái, dạ
dày rửa sạch, thái chỉ, cùng với Sa Nhân nấu thành món canh; ăn dạ dày và
uống nước canh. Dùng 10 ngày một liệu trình.
Ngoài ra, hạt Sa Nhân còn được dùng làm gia vị. Tinh dầu Sa Nhân
dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm [3], [6], [7].
- Bộ phận dùng:
Là quả già đã phơi hay sấy khô, bóc ra lấy nguyên khối hạt. Hạt rời ra
cũng được sử dụng
- Tiêu chuẩn chất lượng:
Theo dược điển Việt Nam III (2002) [9], hạt khô còn nguyên cả khối,
hình trứng, màu nâu đen. Hàm lượng tinh dầu trong hạt đạt tỷ lệ trên 1,5%.


7

- Thành phần hóa học
Trong Sa Nhân có 2-3 % tinh dầu. Thành phần chủ yếu của tinh dầu là
d.bocneola (19%), dcampho (33%), axetat bocnyla (26,5%), dlimonen(7%),
camphen (7%), phelandren (2,3%), parametoxyetylinamat (1%), pinen (1,8%),
linalola, nerolidola… Năm 1958, hệ dược viện y học Bắc Kinh có nghiên cứu thấy

loài Sa Nhân Amomum villosom Lour có saporin với tỷ lệ 0,69% [11].
2.1.3.2. Giá trị
- Giá trị kinh tế
Sa Nhân là loại dược liệu có giá trị sử dụng trong nước và xuất khẩu
cao. Việt nam cũng thu được lượng rất lớn quả Sa Nhân vào mỗi năm. Giá thu
mua Sa Nhân tại chỗ trung bình từ 30.000 đồng đến 40.000 đồng/kg quả khô.
Giá xuất khẩu 90.000 đồng đến 120.000đồng/kg khô (7/năm 2006) [15].
2.1.4. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sa Nhân Tím trên thế giới và
ở Việt Nam
2.1.4.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống Sa Nhân Tím bằng nuôi cấy mô trên
thế giới
Trên thế giới có một số công trình nghiên cứu nhân giống in vitro chi
Sa Nhân (Amomum). Sajina và đồng tác giả (1997) bước đầu đã xây dựng quy
trình nhân giống Amomum subulatum Roxb, đây là loài có giá trị quan trọng
nhất ở Bengal - Ấn Độ [32].
Rao và đồng tác giả (2003) đã nuôi cấy in vitro Amomum Longiligulare
T. L. Wu kết quả thu được số chồi chỉ đạt 3,7 chồi/mẫu [31]. Một số loài có
giá trị khác thuộc chi Sa Nhân là Amomum villosum lour cũng đã được Ping
(2004), Hong và Na (2005) nhân giống in vitro từ chồi rễ [26], [29]. Amomum
krervanh Pierre ex Gagnep là cây dược liệu phổ biến ở Thái Lan và
Campuchia đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu nhân giống in vitro từ
chồi nách [30], [33]. Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire đã được Hongdong
(2006) nuôi in vitro và nhân nhanh từ chồi đỉnh [25].


8

2.1.4.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống Sa Nhân Tím bằng nuôi cấy mô ở
Việt Nam
Ở Việt Nam có các công trình công bố kết quả nghiên cứu nuôi cấy in

vitro cây Sa Nhân như Đỗ Năng Vịnh và cs (2006) đã nghiên cứu áp dụng
công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong nhân nhanh Sa Nhân. Kết quả trên
vẫn còn hạn chế [19].
Đặng Ngọc phúc và cs (2011) đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây Sa
Nhân Tím thu được thời gian khử trùng 12 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất,
đạt 91,11% đối với đỉnh sinh trưởng. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS
bổ sung riêng lẻ chất kích thích sinh trưởng BAP, Kinetin. Sau 8 tuần nuôi
cấy, khả năng tái sinh chồi tốt nhất đạt được trên môi trường bổ sung BAP 1,0
mg/l (1,36 chồi/đỉnh sinh trưởng; 1,40 chồi/ đỉnh sinh trưởng bổ đôi; 1,04
chồi/ đoạn thân). Kế tiếp Đoạn thân in vitro được cấy lên môi trường nhân
nhanh bổ xung riêng lẻ hay kết hợp các chất kích thích sinh trưởng BAP,
Kinetin và NAA. Chồi in vitro được cảm ứng rễ trên môi trường MS bổ sung
NAA hay IBA. Rễ được cảm ứng tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,5
mg/l NAA (18,42 rễ/chồi). Cây con in vitro được huấn luyện thích nghi và
trồng ở vườn ươm với tỷ lệ sống sót 93,14% [12].
2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống thông qua các cơ quan dinh
dưỡng (thân, lá, vỏ, củ…) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành,
mắt ghép và nuôi cấy mô in vitro. Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành
trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh
củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của ống
nghiệm [1].
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy
in vitro các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi
trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô
dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh


9

khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen
quý….[10].
2.2.2. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào
Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của
tế bào thực vật. Năm 1902, Nhà Sinh Lý thực vật học người Đức Haberlandt,
đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng.
Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có
khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận
thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá
trình phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh
vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh.
Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển
thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham.Unio) đã thành công khi thực
hiện tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế
bào. Thành công trên tạo ra Công nghệ Sinh học ứng dụng trồng nhân giống
vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu [21].
Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân
hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của hệ
gen (genome) của thực vật đó. Kiểu hình là kết quả tương tác giữa kiểu gen
và môi trường. Do đó, khi gặp điều kiện thuân lợi cơ quan, mô, tế bào đều
có thể phát triển thành một cơ thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di
truyền giống như cây mẹ [2].
2.2.3. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy
nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp
tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào
phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào

10

phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu
cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [5].
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể
biểu thị như sau:
Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên
biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp
cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và
phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự
phân hóa tế bào.
Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh

tế bào dãn

tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt
hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá
thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính
trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra
theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của
mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn

được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể
thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào
hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen
của tế bào [5].


11

2.2.4. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, yếu tố quyết định cho sự
phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.
2.2.4.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
Điều kiện vô trùng
Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo
điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm.
Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro.
Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các
chất hoá học, đèn tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa
quyết định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất
khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao.
Thông thường hay sử dụng một số hoá chất như: HgCl2 0,1%, cồn 70%, H2O2
5%…để khử trùng.
Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ
- Ánh sáng
Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố
như: Thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời
gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian
chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12 – 18 h/ngày.Cường độ ánh
sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.

Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh
trưởng của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi.
Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000-7000 lux,
ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô
thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh
sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng
lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí


12

nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000-2500 lux
người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40 cm.
- Nhiệt độ
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh
hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc
vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn
chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là
25±20C.
2.2.5.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần
thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường
của cây.
Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự
thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một loại vật
liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt
đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối
tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp.
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy
thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng

cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất
phổ biến như MS, LS, WPM.
Tuy có nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều
gồm một số thành phần cơ bản sau [2], [1]:
+ Các muối khoáng đa lượng và vi lượng.
+ Nguồn cacbon.
+ Các vitamin và amino acid.
+ Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường.
+ Các chất điều hoà sinh trưởng.


13

Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
Đối với cây trồng, các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan
trọng. Ví dụ Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca cấu tạo màng tế bào,
nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino acid và protein. Ngoài ra,
các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzym
cần thiết cho hoạt động sống của tế bào.
Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi
cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzym.
Các ion của các muối hoà tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi
trường trong tế bào, duy trì điện thế hoá của thực vật. Các yếu tố như: K, Ca
rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào.
Nguồn cacbon
Đường là thành phần dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu trong bất
kỳ môi trường dinh dưỡng nào. Nó được sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp
năng lượng trong nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu
của môi trường [20].
Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường

saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccarose
nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật.
Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời
gian để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyển
sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [4].
Các vitamin và axit amin
Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy
invitro ở các loài khác nhau là khác nhau.
Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại
vitamin cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có thể sinh
trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại
vitamin và amino acid. Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin


14

quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic (B3) và
pyridoxin (B6) cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm
tăng cường sức sống cho mô.
Các chất bổ sung
- Nước dừa
Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van
Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs,1941) [34]. Sau đó tác dụng tích cực
của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được nhiều tác
giả ghi nhận. Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất
khoáng và chất kích thích sinh trưởng [2]. Nước dừa đã được sử dụng để kích
thích phân hoá và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Nước dừa thường được
lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Thông thường nước dừa
thường được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để
khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Protein trong nước dừa không gây ảnh

hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng sẽ dẫn đến kết tủa
dung dịch khi bảo quản lạnh. Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới bình
rồi gạn bỏ phần cặn. Nước dừa thường sử dụng với hàm lượng 5-20% thể tích
môi trường, kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi [18].
- Dịch chiết nấm men
Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào.
Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô
tế bào động vật với hàm lượng thích hợp.
Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thuỷ phân casein hydrolyase (0,1-1%)
hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100g/l (xanh) nhằm tăng
cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy.
- Agarose
Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm
rắn hoá môi trường. Hàm lượng agar sử dụng thường là 0,6-1% đây là loại
tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường
hoặc bị chết vì thiếu O2 nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh.


15

- pH môi trường
Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác nhau nhưng
pH của môi trường thường là 5,6-6,0.
Nếu pH của môi trường thấp hơn 5 hay cao hơn 6 đều có ảnh hưởng
đến trạng thái của môi trường nuôi cấy và sự hòa tan các chất dinh dưỡng.
Các chất điều tiết sinh trưởng
Các chất điều tiết sinh trưởng gồm chất kích thích và ức chế. Trong
nhân giống cây trồng, người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng để
kích thích sự phát sinh cơ quan.
- Auxin

Auxin có tác dụng sinh lý rất nhiều mặt lên các quá trình sinh trưởng của
tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn.
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là Indol axetic acid
(IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự
hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là napthyl axetic acid
(NAA) và 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4 D). Các chất này cũng đóng
vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ.
NAA được Went và Thimann (1937) phát hiện, chất này có tác dụng tăng hô
hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến
trao đổi chất của nitơ [14], tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong
môi trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên
IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ. Kết quả
nghiên cứu của Butenko (1964) cho thấy NAA tác động ở mức độ phân tử
trong tế bào theo ba cơ chế đó là cơ chế thứ nhất: NAA gắn với phân tử
enzym và kích thích enzym hoạt động. Sarkissian đã phát hiện tác dụng của
auxin kích thích hoạt tính của ATPase, cơ chế thứ hai: Auxin tác động vào
gen và các enzym phân giải acid nucleic, cơ chế thứ ba: Auxin tác động
thông qua sự thay đổi tính thẩm thấu của màng. Dùng phương pháp đánh
dấu phân tử có thể thấy NAA dính kết vào màng tế bào làm cho màng hoạt
động như một bơm proton và bơm ra ngoài ion H+ làm màng tế bào mềm và


16

kéo dài ra, do đó tế bào lớn lên và sinh trưởng. Trong tế bào, NAA có tác
dụng lên sự tổng hợp acid nucleic. Còn 2,4D được sử dụng có hiệu quả với
mục đích tạo mô sẹo ở thục vật và không dùng trong môi trường tái sinh cơ
quan [20], [24].
- Cytokinin
Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân

chia tế bào. Các cytokinin thường gặp là Kinetine, BAP. Kinetine được Skoog
phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất acid nucleic. Kinetine thực chất là một
dẫn xuất của bazơ nitơ adenine. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có
hoạt tính mạnh hơn nhiều Kinetine. Kinetine và BAP cùng có tác dụng kích
thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm
hạn chế sự già hoá của tế bào. Ngoài ra, các chất này có tác dụng lên quá trình
trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein và làm tăng cường
hoạt tính của một số enzym. Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử
trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein
làm yếu mối liên kết của histon với DNA, tạo điều kiện cho sự tổng hợp DNA.
2.2.6. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.6.1. Giai đoạn chuẩn bị
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in
vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô
trùng để đưa vào nuôi cấy.
Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm
thấp, tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh.
Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời
gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là:
Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ. Chọn đúng phương
pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ mẫu sống cao, môi trường thích hợp sẽ đạt tốc
độ nhân nhanh cao [2].


17

2.2.6.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy
Giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của mô
nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển bằng các chất kích thích sinh trưởng
(tỷ lệ Auxin/Cytokinin), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm

men…vào môi trường kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp
nhằm tạo ra hệ số nhân cao nhất. Tuổi mẫu đem vào nuôi cấy cần được chú ý,
thường các mô non chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã
chuyển hoá.
2.2.6.3.Giai đoạn nhân nhanh chồi
Giai đoạn này là giai đoạn tạo ra hệ số nhân cao nhất. Được coi là then
chốt của quá trình. Điều khiển quá trình này bằng cách bổ xung vào môi
trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng, các chất bổ xung khác như:
nước dừa, dịch chiết nấm men,... kết hợp với yếu tố nhiệt độ và ánh sáng.
2.2.6.4. Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi
trường ra rễ. Thường sau 2-3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành
cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các
chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, là nhóm hoocmon thực vật quan
trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
2.2.6.5. Chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và quyết định khả năng ứng
dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai
đoạn chuyển cây con từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng, do
đó cần phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ
lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong sản xuất.