Nghiên cứu khả năng kháng nấm men saccharomyces cerevisiae và pichia của nano bạc

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MA TRẦN THU HƯỜNG

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MEN
Saccharomyces cerevisiae VÀ Pichia CỦA NANO BẠC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khoá học

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH - CNTP
: 2010 - 2014

Thái Nguyên, năm 2014


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MA TRẦN THU HƯỜNG
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MEN
Saccharomyces cerevisiae VÀ Pichia CỦA NANO BẠC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khoá học
Giảng viên hướng dẫn

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH - CNTP
: 2010 - 2014
: Th.S Lương Hùng Tiến
: Th.S Nguyễn Thị Đoàn
Khoa CNSH - CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2014


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu trường Đại học
Nông lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học – Công
nghệ Thực phẩm, cùng tất cả các thầy cô giáo đã tận tâm dạy dỗ, truyền đạt
những kiến thức khoa học và những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt
thời gian học tập rèn luyện tại trường.
Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn thầy giáo ThS. Lương Hùng Tiến và
cô giáo ThS. Nguyễn Thị Đoàn đã tạo điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn
và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn các thầy cô làm việc tại phòng thí nghiệm Vi sinh khoa

Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm cùng gia đình và bạn bè đã hết
lòng quan tâm hỗ trợ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện tốt
khóa luận này.
Dù đã cố gắng nhiều, xong bài khóa luận không thể tránh khỏi những
thiếu sót và hạn chế. Kính mong nhận được sự chia sẻ và những ý kiến đóng
góp quý báu của thầy cô giáo và các bạn.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn tất cả!
Thái Nguyên, tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Ma Trần Thu Hường


DANH MỤC VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Kí hiệu

Tên đầy đủ

CFU

Colony Forming Unit

S. cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

h

Giờ

DI

Deion

MIC

Minimal Inhibitory Concentration

ppm

Part per million (phần triệu)

VSV

Vi sinh vật

PVP

Polyvinyl pyrrolidon

SEM

Scanning Electron Microscopy

Nxb

Nhà xuất bản

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men được lạnh
đông khô [20]. ................................................................................................. 17
Bảng 2.2: Các thành phần hóa học trong nấm men đông khô [20]................. 18
Bảng 3.4: Nồng độ dung dịch nano bạc pha loãng đối kháng ........................ 31
Bảng 4.1: Một số đặc điểm của nấm men nghiên cứu .................................... 34
Bảng 4.2: Phương pháp xác định hoạt tính kháng nấm men .......................... 35
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng............................ 37
kháng nấm men ............................................................................................... 37
Bảng 4.4: Nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men .............. 38


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Ion bạc vô hiệu hóa enzyme chuyển hóa oxy của vi khuẩn ............. 9
Hình 2.2: Saccharomyces cerevisiae .............................................................. 17
Hình 2.3: Nấm men Pichia.............................................................................. 20
Hình 4.1: Xác định khả năng kháng nấm men của nano bạc .......................... 35
bằng các phương pháp khác nhau ................................................................... 35
Hình 4.2: Hình ảnh đối kháng của nano bạc với nấm men trên đĩa thạch ...... 37
Hình 4.3: Khả năng kháng nấm men S. cerevisiae của nano bạc ................... 39
Hình 4.4: Khả năng kháng nấm men Pichia của nano bạc ............................. 40


MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
1.3. Yêu cầu nghiên cứu .................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................... 3

1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4
2.1. Tổng quan về nano bạc .............................................................................. 4
2.1.1. Giới thiệu về công nghệ nano ................................................................. 4
2.1.2. Giới thiệu về bạc kim loại ....................................................................... 6
2.1.3. Giới thiệu về hạt nano bạc ...................................................................... 7
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng kháng khuẩn của nano bạc ........... 10
2.1.6. Các phương pháp chế tạo hạt nano bạc ................................................. 10
2.1.7. Ứng dụng của nano bạc trong cuộc sống .............................................. 12
2.2. Tổng quan về nấm men ............................................................................ 13
2.2.1. Khái quát chung về nấm men ................................................................ 13
2.2.2. Nấm men S. cerevisiae .......................................................................... 17
2.2.3. Nấm men Pichia .................................................................................... 20
2.2.4. Một số chất có hoạt tính kháng nấm men ............................................. 22
2.3. Tình hình nghiên cứu về nano bạc trong và ngoài nước .......................... 24
2.3.1. Tình hình nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của nano bạc
trên thế giới ..................................................................................................... 24
2.3.2. Tình hình nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của nano bạc
tại Việt Nam .................................................................................................... 25


PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... 27
3.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 27
3.1.1. Chủng nấm men .................................................................................... 27
3.1.2. Hóa chất, môi trường ............................................................................ 27
3.1.3. Dụng cụ, thiết bị .................................................................................... 27
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 28
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 28
3.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 28

3.4.1. Phương pháp xác định đặc điểm của VSV nghiên cứu......................... 28
3.4.2. Phương pháp xác định khả năng kháng nấm men của nano bạc .......... 29
3.4.3.

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men .. 32

3.4.4. Theo dõi khả năng kháng nấm men của dung dịch nano bạc
theo thời gian ................................................................................................... 33
3.4.5. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật .............................................. 33
3.4.6.

Phương pháp tính toán và xử lý số liệu ............................................. 33

PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 34
4.1. Một số đặc điểm của VSV nghiên cứu .................................................... 34
4.2. Lựa chọn phương pháp xác định khả năng kháng nấm men của nano bạc ....... 34
4.3. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men ......... 36
4.4. Xác định khả năng kháng nấm men của nano bạc theo thời gian ............ 38
4.4.1. Khả năng kháng S. cerevisiae của nano bạc theo thời gian .................. 38
4.3.2. Khả năng kháng nấm men Pichia của nano bạc theo thời gian ............ 39
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 42
5.1. Kết luận .................................................................................................... 42
5.1. Đề nghị ..................................................................................................... 42


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Bạc đã được biết đến là một chất kháng khuẩn, kháng nấm và các loài vi
sinh vật có hại. Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng bạc làm các dụng cụ
chứa đồ ăn, nước uống để tránh gây độc và trị bệnh. Trong chiến tranh thế
giới thứ nhất, người ta thậm chí còn sử dụng các sản phẩm từ bạc để điều trị
nhiễm trùng trước khi thuốc kháng sinh ra đời. Qua thời gian những đặc tính
quý giá của bạc đã được con người khai thác và sử dụng để tạo ra nhiều sản
phẩm hữu ích. Ngày nay những thuộc tính quý của kim loại này được thể hiện
tối đa khi chúng được chế tạo bằng công nghệ nano, tạo ra các hạt nano bạc.
Điều này làm tăng đáng kể ứng dụng của bạc đối với đời sống con người [7].
Những năm gần đây việc nghiên cứu hạt nano rất được quan tâm bởi
những tính chất đặc biệt và lý thú của nó. Trong số các loại hạt nano được
nghiên cứu, ứng dụng thì hạt nano bạc đã gây được sự chú ý đặc biệt bởi tính
chất kháng khuẩn vượt trội. Ở kích thước nano, bạc thể hiện những tính chất
vật lý, hóa học, sinh học khác biệt và vô cùng quý giá, đặc biệt là tính kháng
vi sinh vật. Nano bạc không gây phản ứng phụ, không gây độc cho người và
vật nuôi khi nhiễm lượng nano bạc bằng nồng độ diệt khuẩn ( khoảng nồng độ
< 100ppm) [30]. Đã có nhiều nghiên cứu xác nhận bạc dưới bất kỳ dạng nào,
dù là dạng keo, dạng ion hoặc dạng hạt nano kim loại, đều thể hiện khả năng
kháng khuẩn [23]. Kích thước, hình dạng hạt, nồng độ và sự phân bố là các
yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến tính kháng khuẩn của keo nano bạc.
Ngoài các nghiên cứu đã chỉ ra khả năng kháng vi khuẩn của nano bạc,
nano bạc cũng được coi là một loại thuốc diệt nấm tác dụng nhanh chóng,
hiệu quả chống lại một loạt các loại nấm thông thường bao gồm các chi như
Aspergillus, Candida, Saccharomyces và Pichia. Các cơ chế chính xác về tác


2

động của các hạt nano bạc đối với các loại nấm men vẫn không rõ ràng,
nhưng có thể coi cơ chế tác động của chúng đối với nấm men tương tự như

tác dụng của chất kháng sinh đã được nghiên cứu [15].
Saccharomyces cerevisiae và Pichia là hai loại nấm men thường gặp
trong thực phẩm. Ngoài những lợi ích đã biết, hai chủng nấm men trên còn là
một trong các tác nhân gây hư hỏng thực phẩm, cần loại bỏ trong một số quy
trình chế biến.. Nấm men Saccharomyces có thể làm hỏng nước ép trái cây,
lên men chua các loại thực phẩm có nguồn gốc từ đường, sữa. Rượu vang
thành phẩm có Pichia phát triển tạo màng trên bề mặt và làm vang bị đục, các
thành phần trong vang sẽ bị biến đổi [10]. Mặt khác, hai chủng nấm men được
sử dụng trong nghiên cứu là các chủng phân lập từ thực vật bản địa, chưa từng
được nghiên cứu và đánh giá về sự tác động của nano bạc.
Chính vì vậy, để bổ sung cơ sở dữ liệu về hạt nano bạc, phục vụ sản xuất
chế phẩm kháng vi sinh vật từ nano bạc, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài
“Nghiên cứu khả năng kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae và
Pichia của nano bạc”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Xác định được khả năng kháng nấm men S. cerevisiae và Pichia của
nano bạc.
1.3. Yêu cầu nghiên cứu
- Lựa chọn được phương pháp thích hợp để xác định khả năng kháng
nấm men S. cerevisiae và Pichia của nano bạc.
- Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men S.
cerevisiae và Pichia.
- Đánh giá được khả năng kháng nấm men S. cerevisiae và Pichia của
nano bạc theo thời gian.


3

1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học

- Đánh giá khả năng kháng nấm men S. cerevisiae và Pichia của nano bạc.
- Đưa ra nồng độ tối thiểu của dung dịch nano bạc để ức chế S.
cerevisiae và Pichia.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Ứng dụng sử dụng nano bạc trong việc chế tạo vật liệu kháng khuẩn,
bảo quản thực phẩm.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nano bạc
2.1.1. Giới thiệu về công nghệ nano
2.1.1.1. Công nghệ nano
Công nghệ nano là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân
tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều
khiển hình dáng, kích thước trên quy mô nanomét (nm, 1 nm = 10-9 m) [13].
Ở kích thước nano, vật liệu sẽ có những tính năng đặc biệt mà vật liệu truyền
thống không có được - đó là do sự thu nhỏ kích thước và việc tăng diện tích
bề mặt tiếp xúc.
Trong công nghệ nano thì hạt nano là một vật liệu quan trọng. Những
năm gần đây việc nghiên cứu hạt nano rất được quan tâm bởi những tính chất
đặc biệt và lý thú của nó.
2.1.1.2. Vật liệu nano và phân loại
Vật liệu nano là vật liệu trong đó ít nhất một chiều có kích thước cỡ
nanomét. Đây là đối tượng nghiên cứu của khoa học nano và công nghệ nano,
nó liên kết hai lĩnh vực trên với nhau. Tính chất của vật liệu nano bắt nguồn
từ kích thước của chúng, vào cỡ nanômét, đạt tới kích thước tới hạn của nhiều
tính chất hóa lý của vật liệu thông thường. Kích thước của vật liệu nano trải

một khoảng từ vài nm đến vài trăm nm phụ thuộc vào bản chất vật liệu và tính
chất cần nghiên cứu.
Có rất nhiều cách phân loại vật liệu nano. Sau đây là một cách phân loại
dựa vào hình dáng vật liệu [6]:
- Vật liệu không chiều là vật liệu mà ba chiều đều có kích thước nano, ví
dụ: chấm lượng tử...


5

- Vật liệu một chiều là vật liệu trong đó hai chiều có kích thước nano, ví
dụ: dây nano,ống nano,…
- Vật liệu hai chiều là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano, ví
dụ: màng mỏng,…(Chiều ở đây có nghĩa là chiều chuyển động không bị hạn
chế bởi kích thước của phần tử tải điện).
Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano trong đó chỉ có một phần của
vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có các phần không chiều, một
chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau.
2.1.1.3. Cơ sở khoa học của công nghệ nano
Công nghệ nano dựa trên ba cơ sở khoa học chính [23]:
- Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển đến tính chất lượng tử:
Khác với vật liệu khối, khi ở kích thước nano thì các tính chất lượng tử
được thể hiện rất rõ ràng. Vì vậy khi nghiên cứu vật liệu nano chúng ta cần
tính tới các thăng giáng ngẫu nhiên. Càng ở kích thước nhỏ thì các tính chất
lượng tử càng thể hiện một cách rõ ràng hơn. Ví dụ một chấm lượng tử có thể
được coi như một đại nguyên tử, nó có các mức năng lượng giống như một
nguyên tử.
- Hiệu ứng bề mặt:
Cùng một khối lượng nhưng khi ở kích thước nano chúng có diện tích bề
mặt lớn hơn rất nhiều so với khi chúng ở dạng khối. Điều này, có ý nghĩa rất

quan trọng trong các ứng dụng của vật liệu nano có liên quan tới khả năng
tiếp xúc bề mặt của vật liệu, như trong các ứng dụng vật liệu nano làm chất
diệt khuẩn. Đây là một tính chất quan trọng làm nên sự khác biệt của vật liệu
có kích thước nanomet so với vật liệu ở dạng khối [2].
- Kích thước tới hạn:
Kích thước tới hạn là kích thước mà ở đó vật giữ nguyên các tính chất về
vật lý, hóa học khi ở dạng khối. Nếu kích thước vật liệu mà nhỏ hơn kích


6

thước này thì tính chất của nó hoàn toàn bị thay đổi. Nếu ta giảm kích thước
của vật liệu đến kích cỡ nhỏ hơn bước sóng của vùng ánh sáng thấy được
(400-700 nm), theo Mie hiện tượng "cộng hưởng plasmon bề mặt" xảy ra và
ánh sáng quan sát được sẽ thay đổi phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng xảy ra
hiện tượng cộng hưởng. Hay như tính dẫn điện của vật liệu khi tới kích thước
tới hạn thì không tuân theo định luật Ohm nữa. Mà lúc này điện trở của chúng
sẽ tuân theo các quy tắc lượng tử. Mỗi vật liệu đều có những kích thước tới
hạn khác nhau và bản thân trong một vật liệu cũng có nhiều kích thước tới
hạn ứng với các tính chất khác nhau của chúng. Bởi vậy khi nghiên cứu vật
liệu nano chúng ta cần xác định rõ tính chất sẽ nghiên cứu là gì. Chính nhờ
những tính chất lý thú của vật liệu ở kích thước tới hạn nên công nghệ nano
có ý nghĩa quan trọng và thu hút được sự chú ý đặc biệt của các nhà nghiên cứu.
2.1.2. Giới thiệu về bạc kim loại
- Tính chất vật lý:
+ Bạc là kim loại chuyển tiếp, màu trắng, sáng, dễ dàng dát mỏng, có
tính dẫn điện và dẫn nhiệt cao nhất và điện trở thấp nhất trong các kim loại.
+ Nhiệt độ nóng chảy là 961,93ºC [29].
- Tính chất hóa học:
+ Bạc có kí hiệu là Ag, số nguyên tử 47 thuộc phân nhóm IB trong bảng

tuần hoàn các nguyên tố hóa học, bạc có khối lượng phân tử là 107,868 (đơn vị C).
+ Cấu hình electron của bạc: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1, có số oxi
hóa là +1 và +2, phổ biến nhất là trạng thái oxi hóa +1.
+ Bạc không tan trong nước, môi trường kiềm nhưng có khả năng tan
trong một số axit mạnh như axit nitric, sunfuric đặc nóng,...
Ngày nay những thuộc tính quý của kim loại này được thể hiện tối đa
khi chúng được chế tạo bằng công nghệ nano.


7

2.1.3. Giới thiệu về hạt nano bạc
2.1.3.1. Giới thiệu chung
Trong số các loại hạt nano được nghiên cứu, ứng dụng thì hạt nano bạc
đã gây được sự chú ý đặc biệt bởi tính chất kháng khuẩn vượt trội. Ở kích
thước nano, bạc thể hiện những tính chất vật lý, hóa học, sinh học khác biệt
và vô cùng quý giá, đặc biệt là tính kháng khuẩn. Ở dạng phân tán với kích
thước nanomet thì khả năng diệt khuẩn của bạc được tăng lên gấp bội nhờ
diện tích bề mặt riêng (m2/g) tăng nhanh. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi ở kích
thước nano (từ 1 – 100 nm), hoạt tính sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng
50000 lần so với bạc dạng khối, như vậy 1g bạc nano có thể sát khuẩn cho
hàng trăm m2 chất nền [8].
Quá trình hình thành hạt nano bạc được giải thích như sau [7]:
- Đầu tiên, bức xạ UV kích thích các ion [Ag(NH3)2]+ hoạt động. Khi đó
các phân tử đường glucose nhường điện tử cho Ag+ và tạo ra hạt nhân nguyên
tử bạc Ag0
[Ag(NH3)2]+ + RCHOH
nAg0

hν

Ag0 + 2NH3 + H+ + RCOH
(Agn)0

- Tiếp theo, các ion Ag+ ở trong dung dịch hấp phụ lên trên bề mặt
nguyên tử bạc và tạo ra một lớp điện tích dương. Các điện tích dương Ag+ sẽ
hút các ion RCOO- mang điện tích âm trái dấu và tạo ra lớp bảo vệ thứ nhất.
Do nhóm carboxyl của ion oleate hướng về phía bề mặt của bạc nên đầu kị
nước được hướng ra phía ngoài. Khi đó các ion oleate ở trong dung dịch tiếp
tục gắn kết với lớp bảo vệ đầu và hình thành lớp bảo vệ thứ hai với đầu ưa
nước hướng ra ngoài. Chính cấu trúc này khiến các hạt nano bạc phân tán đều
trong nước và không bị kết đám [17].


8

2.1.3.2 Tính chất lý học của hạt nano bạc
- Tính chất quang:
+ Phổ hấp thụ của hạt nano bạc: phổ hấp thụ của hạt nano bạc phụ thuộc
vào kích thước của hạt nano bạc. Khi kích thước hạt tăng thì cường độ đỉnh
tăng và dịch về phía bước sóng dài. Kích thước hạt nano bạc phụ thuộc vào
các yếu tố trong quá trình chế tạo hạt nano bạc. Với cùng một điều kiện,
phương pháp chế tạo khác nhau thì đỉnh hấp thụ của hạt nano bạc cũng khác nhau.
+ Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt: Tính chất quang học của hạt
nano bạc trong thủy tinh làm cho các sản phẩm từ thủy tinh có các màu sắc
khác nhau. Các hiện tượng đó bắt nguồn từ hiện tượng cộng hưởng Plasmon
bề mặt (surface plasmon resonance) là hiện tượng khi hạt ở kích thước nano,
các điện tử tự do trong hạt nano bạc tương tác với trường điện từ ngoài dẫn
đến sự hình thành các dao động đồng pha với một tần số cộng hưởng nhất
định. Các hạt nano bạc sẽ hấp thụ mạnh photon tới ở đúng tần số cộng hưởng

này [6].
- Tính chất điện: Bạc là một kim loại dẫn điện tốt nhất trong các kim
loại. Bạc có mật độ điện tử tự do cao nên điện trở của bạc rất nhỏ.
- Tính chất nhiệt: Nhiệt độ nóng chảy Tm của vật liệu phụ thuộc vào
mức độ liên kết giữa các nguyên tử trong mạng tinh thể. Trong tinh thể, mỗi
một nguyên tử có một số các nguyên tử lân cận có liên kết mạnh gọi là số
phối vị. Các nguyên tử trên bề mặt vật liệu sẽ có số phối vị nhỏ hơn số phối vị
của các nguyên tử ở bên trong nên chúng có thể dễ dàng tái sắp xếp để có thể
ở trạng thái khác hơn. Như vậy, khi kích thước của hạt nano giảm, nhiệt độ
nóng chảy sẽ giảm [6].
- Hiệu ứng bề mặt: Khi hạt bạc có kích thước nanomet, các số nguyên
tử nằm trên bề mặt sẽ chiếm tỉ phần đáng kể so với tổng số nguyên tử. Chính
vì vậy các hiệu ứng có liên quan đến bề mặt, gọi tắt là hiệu ứng bề mặt sẽ trở


9

nên quan trọng làm cho tính chất của vật liệu có kích thước nm khác biệt so
với vật liệu bạc ở dạng khối. Sự tăng cường khả năng diệt khuẩn bạc là một ví
dụ của hiệu ứng bề mặt [6].
2.1.4. Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc
Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của ion
Ag+. Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican – thành phần cấu
tạo nên thành tế bào vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên
trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Sau đó sẽ đi vào bên trong tế bào vi
khuẩn tác động lên S và P, chìa khóa cho khả năng diệt khuẩn của nó [18, 26].
Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng hoạt động của
vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Do động vật không có thành tế bào, vì vậy
chúng ta không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này.
Vì S và P xuất hiện nhiều trong màng tế bào nên khi hạt nano bạc tương

tác với S chứa trong protein bên trong hoặc bên ngoài màng tế bào thì có thể
biến đổi chức năng của tế bào. Đồng thời các hạt bạc có kích thước nhỏ chui
vào trong tế bào, kết hợp với các enzyme hay DNA có chứa nhóm
sunfuahydrin – SH hoặc phosphate gây bất hoạt enzyme hay DNA dẫn đến
gây chết tế bào [24].

Hình 2.1: Ion bạc vô hiệu hóa enzyme chuyển hóa oxy của vi khuẩn


10

2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng kháng khuẩn của nano bạc
Kích thước, hình dạng hạt, nồng độ và sự phân bố là các yếu tố ảnh
hưởng trực tiếp đến tính kháng khuẩn của keo nano bạc.
- Kích thước: Kích thước hạt nano bạc là yếu tố quan trọng quyết định
khả năng diệt khuẩn của chúng. Hạt nano bạc có kích thước càng nhỏ thì khả
năng diệt khuẩn của chúng càng mạnh, vì khi ở kích thước càng nhỏ thì tỉ số
giữa diện tích bề mặt và thể tích càng lớn và hạt cũng có thể dễ dàng tương
tác với vi khuẩn hơn. Tuy nhiên các hạt có kích thước nhỏ lại có khuynh
hướng liên kết với nhau trong quá trình lưu trữ tạo thành các hạt lớn hơn gây
ảnh hưởng tới khả năng diệt khuẩn và bảo quản keo nano bạc [5].
- Hình dạng hạt: Các hạt nano bạc thường có dạng hình khối, số lượng
các mặt hình khối cho thấy khả năng tác dụng với vi khuẩn ở mức độ cao hay
thấp. Số lượng mặt càng nhiều thì khả năng diệt khuẩn càng cao [2]. Các hạt
nano bạc có thể có rất nhiều hình dạng khác nhau như hình que, hình cầu,
hình tam giác,... Các hạt nano bạc có hình tam giác cụt có tính sát khuẩn cao
hơn các hạt hình cầu và các hạt hình que có tính kháng khuẩn thấp nhất [5].
- Nồng độ và sự phân bố: Dung dịch nano bạc có nồng độ càng cao và sự
phân bố đều thì khả năng diệt khuẩn càng tốt. Tuy nhiên khi nồng độ quá cao,
do năng lượng bề mặt hạt nano lớn, nên các hạt nano bạc sẽ va chạm vào nhau

và phá vỡ cấu trúc nano. Vì vậy chúng ta cũng cần tìm nồng độ thích hợp để
các hạt phân bố đồng đều, và tránh kết tủa [5].
2.1.6. Các phương pháp chế tạo hạt nano bạc
Có 2 phương pháp điều chế hạt nano bạc kim loại: phương pháp từ dưới
lên và phương pháp từ trên xuống. Phương pháp từ dưới lên “bottom-up” là
phương pháp tạo hạt nano từ các nguyên tử hoặc ion kết hợp lại với nhau
[15]. Phương pháp từ trên xuống “top-down” là phương pháp tạo các hạt
nano từ vật liệu khối ban đầu. Đối với hạt nano bạc, người ta thường điều chế


11

bằng phương pháp từ dưới lên. Nguyên tắc là khử ion Ag+ thành Ag. Các ion
này sau đó liên kết với nhau tạo thành hạt nano và các hạt nano này sẽ được
bọc bởi các chất ổn định như PVP, PVE, chitosan... Các phương pháp từ trên
xuống ít được sử dụng vì nano bạc chế tạo bằng phương pháp này thường có
kích thước hạt lớn và không đồng đều.
Các phương pháp chế tạo hạt nano bạc thường sử dụng:
- Phương pháp ăn mòn laze: Phương pháp này sử dụng chùm tia laze
với bước sóng ngắn bắn lên vật liệu khối đặt trong dung dịch có chứa chất
hoạt hóa bề mặt. Các hạt nano được tạo thành với kích thước khoảng 10 nm
và được bao phủ bởi chất hoạt hóa bề mặt.
- Phương pháp khử hóa học: Phương pháp này sử dụng các tác nhân
hóa học để khử ion kim loại thành kim loại. Để các hạt phân tán tốt trong
dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người ta sử dụng phương pháp tĩnh
điện để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích và đẩy nhau hoặc dùng
phương pháp bao bọc bằng chất hoạt hóa bề mặt. Các hạt nano tạo thành bằng
phương pháp này có kích thước từ 10 nm đến 100 nm.
- Phương pháp khử vật lý: Phương khử vật lí dùng các tác nhân vật lí
như điện tử, sóng điện từ năng lượng cao như tia gamm, tia tử ngoại, tia laser

khử ion kim loại thành kim loại. Dưới tác dụng của các tác nhân vật lí, có
nhiều quá trình biến đổi của dung môi và các phụ gia trong dung môi để sinh
ra các gốc hóa học có tác dụng khử ion thành kim loại.
- Phương pháp khử hóa lý: Đây là phương pháp trung gian giữa hóa
học và vật lí. Nguyên lí là dùng phương pháp điện phân kết hợp với siêu âm
để tạo hạt nano. Phương pháp điện phân thông thường chỉ có thể tạo được
màng mỏng kim loại. Trước khi xảy ra sự hình thành màng, các nguyên tử
kim loại sau khi được điện hóa sẽ tạo các hạt nano bám lên điện cực âm. Lúc


12

này người ta tác dụng một xung siêu âm đồng bộ với xung điện phân thì hạt
nano kim loại sẽ rời khỏi điện cực và đi vào dung dịch.
- Phương pháp khử sinh học: Dùng vi khuẩn là tác nhân khử ion kim
loại. Phương pháp này đơn giản, thân thiện với môi trường và có thể tạo hạt
với số lượng lớn.
2.1.7. Ứng dụng của nano bạc trong cuộc sống
Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để
làm chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩm
chứa hạt nano bạc như:
- Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng bằng nhựa có pha thêm
hạt nano bạc có tác dụng khử trùng. Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả năng
diệt 99.9% vi khuẩn.
- Đồ may mặc: hạt nano bạc được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và
khử mùi. Khẩu trang nano bạc: Được thiết kế với 3 - 4 lớp gồm 2 lớp vải, một
lớp vật liệu tẩm nano bạc và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trang này có khả
năng diệt khuẩn, diệt virus, lọc không khí rất tốt. Lớp vải tẩm nano bạc có
chức năng diệt vi khuẩn, virus, nấm bị giữ lại trên khẩu trang đồng thời có tác
dụng khử mùi.

- Màng hô hấp: Đó là một tấm màng mỏng có thể cho khí và hơi nước
qua nhưng không thể cho chất lỏng đi qua, có vô số những lỗ khí nhỏ tồn tại
trong tấm film. Các hạt nano bạc gần đây đã được kết hợp với film polyolefin
với đặc tính kháng khuẩn rất tốt.
- Sơn kháng khuẩn: Bột nano bạc được trộn với sơn và phủ lên các phím
điện thoại di động, tường nhà và các bề mặt cần được bảo vệ. Với khả năng
kháng khuẩn tuyệt vời nano bạc sẽ giữ cho bề mặt không bị nhiễm khuẩn
cũng như tiêu diệt nấm mốc làm tăng tính thẩm mỹ và tuổi thọ công trình.


13

- Thiết bị điện tử: Các nhà khoa học cũng đang nghiên cứu ứng dụng
nano bạc để sản xuất linh kiện điện tử phục vụ nhu cầu ngày càng cao của
người tiêu dùng. Các thiết bị điện tử ứng dụng công nghệ nano sẽ có kích
thước nhỏ gọn hơn nhưng lại có tốc độ xử lý và tuổi thọ cao hơn các thiết bị
sử dụng các công nghệ truyền thống.
2.2. Tổng quan về nấm men
2.2.1. Khái quát chung về nấm men
Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sống
riêng lẻ hoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính chủ yếu
bằng hình thức nảy chồi [11].
Hình dạng và kích thước nấm men thay đổi phụ thuộc vào từng loại nấm
men, điều kiện nuôi cấy và nhiều yếu tố khác. Do đó nấm men có hình thái đa
dạng như: hình trứng, hình bầu dục (S. cerevisiae), hình tròn (Candida utilis),
hình ống dài (Pichia), hình quả dưa chuột (Saccharomyces pastorianus), hình
bình, hình tam giác (Trigonopsis) và một số hình đặc biệt khác. Hình dạng
nấm men không ổn định, nó còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại
cảnh. Ví dụ, Saccharomyces thường có hình bầu dục trong môi trường nuôi
cấy giàu dinh dưỡng. Trong điều kiện yếm khí thường có hình tròn, trong điều

kiện hiếu khí tế bào có hình dài hơn.
So với các vi sinh khác ( đối với vi khuẩn chẳng hạn) tế bào nấm men có
kích thước tương đối lớn: đường kính khoảng 7 µm, chiều dài 8 – 12 µm (1
µm = 10-6 m). Với kích thước này ta có thể ước tính bề mặt của tế bào nấm
men trong một lít dịch lên men vào khoảng 102 và do vậy cường độ trao đổi
chất của tế bào nấm men với môi trường xung quanh là vô cùng to lớn. Khối
lượng nấm men là 500 kg so với trâu bò cùng khối lượng thig một ngày đêm
nấm men tổng hợp được 50 tấn protein, còn trâu bò chỉ tổng hợp được 0,5 kg
(như vậy gấp 5 ngàn lần) [10]. Trọng lượng riêng của tế bào nấm men không


14

khác mấy so với tế bào vi khuẩn (ở nấm men chỉ số này là 1,055 – 1,060, ở vi
khuẩn: 1,050 – 1,112) [10].
Muốn quan sát và đo kích thước tế bào nấm men người ta thường nhuộm
màu tiêu bản nấm men bằng dung dịch lugol, hoặc bằng các thuốc nhuộm
thông thường như fucsin, xanh methylen, rồi dùng thước đo vật kính và thước
đo thị kính để quan sát.
Tế bào nấm men cơ bản giống thực vật, so với vi khuẩn tế bào nấm men
tiến hóa hơn về mặt cấu trúc. Nấm men là sinh vật có nhân thật, cấu tạo tế bào
có màng tế bào, nguyên sinh chất, nhân, ty thể, ribisome, không bào, một số
thể vùi (glycogen, lipit,...).
Trong thành phần hóa học của tế bào nấm men: nước chiếm 75% khối
lượng. Thành phần sinh khối khô là:
Chất vô cơ

5 – 10%

Cacbon

25 – 50%

Nitơ

4,8 – 12 %

Protein (N × 5,25)

30 – 75

Lipid

2–5

Chất khô của tế bào nấm men gồm 23 – 28% là chất hữu cơ và 5 – 7%
chất tro [10].
Nấm men là sinh vật tự dưỡng, chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ như
là nguồn năng lượng chính và không cần ánh sáng mặt trời. Nguồn cacbon
chính được nhận chủ yếu từ các hexose như glucose và fructose hoặc từ
disaccharide như saccarose và maltose. Một vài loài có thể chuyển hóa đường
pentose, cồn và các acid hữu cơ. Nấm men phát triển tốt nhất trên môi trường
pH trung tính hoặc hơi chua. Nhiệt độ phát triển của nấm men cũng hoàn toàn
khác nhau. Leucosporidium frigidum phát triển ở -2 - 20ºC, Saccharomyces
telluris phát triển từ 5 – 35ºC, Candida slooffi ở 28 – 45ºC,… Các tế bào có


15

thể sống trong điều kiện đóng băng ở điều kiện nhất định, khả năng sống sót

giảm theo thời gian đóng băng.
Nấm men là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi, chúng hô hấp như một cơ thể
hiếu khí bậc cao, khi môi trường hết oxi phân tử chúng chuyển sang hô hấp kị
khí gọi là quá trình lên men. Khi phản ứng lên men bắt đầu phát triển, tốc độ
sinh sản của tế bào nấm men bị kìm hãm và đến một giai đoạn nhất định hầu
như không còn nữa.
Ở nấm men có 3 hình thức sinh sản:
- Sinh sản sinh dưỡng: là hình thức sinh sản đơn giản và thường gặp nhất
của nấm men. Có 2 hình thức sinh sản sinh dưỡng: nảy chồi và hình thức
phân đôi ngang tế bào như vi khuẩn. Ở hình thức nảy chồi, từ một cực của tế
bào mẹ nảy chồi thành một tế bào con, sau đó hình thành vách ngăn ngang
giữa hai tế bào. Tế bào còn cố thể tách khỏi tế bào mẹ hoặc có thể dính với tế
bào mẹ và lại tiếp tục nảy chồi làm cho nấm men có hình dạng giống như cây
xương rồng tai nhỏ.
- Sinh sản đơn tính: Ở một số nấm men thuộc ngành Nấm đảm, có thể
sinh ra dạng bào tử có cuống nhỏ hoặc bào tử bắn. Bào tử có cuống nhỏ
thường gặp ở các chi nấm men Fellomyces, Kockovaella và Sterigmatomyces,
khi đó chồi sinh ra trên một nhánh nhỏ và tách ra khi nhánh bị gẫy. Bào tử
bắn được sinh ra trên một nhánh nhỏ và tách ra khi nhánh bị gẫy. Bào tử bắn
được sinh ra trên một gai nhọn của tế bào nấm men và bị bắn ra phía đối diện
khi thành thục. Bào tử bắn là đặc điểm của nấm men thuộc các chi
Bensingtonia, Bullera, Sporobolomyces,…Một số nấm men còn hình thành
các bào tử đốt, hình thành các vách ngăn ở đầu các nấm men dạng sợi, sau đó
tách ra thành các bào tử đốt, thường gặp ở các chi nấm men Galactomyces,
Dipodascus và Trichosporon.


16

- Sinh sản hữu tính: Nấm men không sinh ra các cơ quan sinh dục mà

chúng sinh ra hai tế bào dinh dưỡng có nhiệm vụ giống như các giao tử. Hai
tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành hợp tử. Hợp tử phân chia thành
các bào tử nằm trong nang, nang chín bào tử được phát tán ra ngoài. Nếu 2 tế
bào nấm men có hình thái kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau thì được
gọi là tiếp hợp đẳng giao. Nếu 2 tế bào nấm men khác nhau thì gọi là tiếp hợp
dị giao.
Nấm men có thể coi là đại diện tiêu biểu trong vai trò tổng hợp protein từ
vi sinh vật, đó là các protein đơn bào (SCP – Single Cell Protein). Nấm men
bắt đầu được sử dụng để tổng hợp một số protein có phân tử lớn mà trước đây
vẫn được sản xuất từ mô tế bào của người hoặc động vật, ví dụ nấm men
Pichia pastoris dùng để sản xuất protein là tác nhân chống gây khối u tương
tự như TNF, Streptokinaza, kháng nguyên bề mặt, hoocmôn sinh trưởng loại
IL 2, Interferongama [4].
Nấm men phân bố rộng trong tự nhiên: đất, nước, không khí, thực
phẩm,... Nó có vai trò quan trọng trong chuyển hóa vật chất, nhiều loại được
sử dụng rộng rãi để nấu rượu, bia, cồn, glyxerin, làm nở bột mì, tạo hương vị
nước chấm, sản xuất một số dược phẩm. Nấm men sinh sản nhanh chóng,
sinh khối giàu protein, chứa nhiều vitamin nên được sử dụng rộng rãi trong
ngành công nghiệp sản xuất thức ăn bổ sung dinh dưỡng [11]. Tuy nhiên bên
cạnh những nấm men có ích cũng còn một số loại nấm men gây bệnh cho
người, gia súc như nấm men Candida albicus,... và rất dễ nhiễm vào các sản
phẩm lương thực và thực phẩm làm hỏng hoặc biến đổi chất lượng sản phẩm
như Torulopsis, Zygosaccharomyces, Rhodotorula... [1, 9, 11].


17

2.2.2. Nấm men S. cerevisiae
Phân loại khoa học:
- Giới: Fungi

- Ngành: Ascomycota
- Phân ngành: Saccharomycotina
- Lớp: Saccharomycetes
- Bộ: Saccharomycetales
- Họ: Saccharomycetaceae
- Chi: Saccharomysces
- Loài: Saccharomysces cerevisiae
Hình 2.2: Saccharomyces cerevisiae
(Nguồn: ScienceNews)
Tế bào S. cerevisiae có dạng hình trứng, bầu dục, gần tròn, kích thước
trung bình 3-6 × 5-12µm, sinh sản bằng hình thức nảy chồi không theo qui
luật, có thể xuất hiện từng cái một, từng đôi hoặc một chuỗi hoặc tạo bào tử.
Khuẩn lạc có màu trắng nhạt, rìa tròn, lồi lên, bề mặt sáng lấp lánh,
đường kính 1 – 2mm vào ngày thứ ba [3]. Các thành phần cấu trúc và hóa học
của tế bào được minh họa theo bảng 2.1 và bảng 2.2.
Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men được
lạnh đông khô [20].
Thành phần trong cấu trúc
Phần trăm khối lượng khô
Độ ẩm

2 – 5%

Protein

42 – 46%

Cacbohydrate

30 – 37%

Acid nucleic

6 – 8%

Lipid

4 – 5%

Chất khoáng

7 – 8%