Nghiến cứu biến nạp gen ZmNAC vào một số dòng ngô thông qua vi khuẩn grobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN TIẾN NAM

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN ZmNAC VÀO MỘT SỐ
DÒNG NGÔ THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm

Khóa học

: 2010 - 2014

Thái Nguyên - 2014


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN TIẾN NAM

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN ZmNAC VÀO MỘT SỐ
DÒNG NGÔ THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm

Khóa học

: 2010 - 2014

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng
(Viện Di truyền Nông nghiệp)

2. T.S. Nguyễn Văn Duy
(Khoa CNSH-CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên)

Thái Nguyên - 2014


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện để tài nghiên cứu khóa luận tốt nghiệp tại
Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ
phía gia đình và nhà trường, đặc biệt là PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng và các anh chị
cán bộ, nhân viên làm việc tại Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng
– Giám đốc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật đã tạo điều
kiện giúp đỡ tôi thực tập và hoàn thành đề tài này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Thầy giáo Nguyễn Văn Duy hiện đang
công tác tại Khoa Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Thực Phẩm, trường Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên, thầy luôn động viên và chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành đề
tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn K.S Trần Duy Hưng đã tận tình hướng dẫn cũng
như tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành khóa luận trong suốt thời gian
thực tập tại phòng thí nghiệm
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới gia đình và bạn bè
những người đã luôn động viên, giúp đỡ và là điểm tựa vững chắc cho tôi trong quá
trình thực hiện đề tài.
Do trình độ và thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên không thể tránh khỏi
những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp của các thầy cô và các bạn để
đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái nguyên, 25 tháng 5 năm 2014

Sinh viên thực tập

Nguyễn Tiến Nam


DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
AS

:

Acetosyrinegone (3,5-dimethoxy-4-hydroxy Actophenone)

A.tumefaciens :

Agrobacteriumtumefaciens

CTAB

:

Cetyltrimethyl ammonium bromide

cs

:

cộng sự

DNA

:

Deoxyribonucleic acid

FAO

:

Food and Agriculture Organization

EDTA

:

Ethylene diamine tetra acetate

NAC

:

NAM-no apical meristem, ATAF-Arabidopsis transcription
activation factor, CUC-cup-shaped cotyledon

PCR

:

Polymerase Chain Reaction

PPT

:

Phosphinothricin

Ti-plasmid

:

Tumor Icluding Plasmid

T-DNA

:

Transfer-DNA

Vir

:

Virulence (vùng gây độc)


MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU....................................................................................................1

1.1 Đặt vấn đề................................................................................................ 1
1.2 Mục đích và yêu cầu nghiên cứu............................................................. 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài .................................................................................... 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................3

2.1 Nguồn gốc, vai trò và vị trí của cây ngô trong hệ thống cây trồng ........ 3
2.1.1 Nguồn gốc và phân loại ................................................................... 3
2.1.2. Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế ............................................. 3
2.2 Đặc điểm sinh học cây ngô ..................................................................... 4
2.2.1 Rễ ngô .............................................................................................. 4
2.2.2 Thân ngô........................................................................................... 5
2.2.3 Lá ngô, hạt ngô................................................................................. 5
2.2.4 Sinh trưởng và phát triển của ngô .................................................... 7
2.3 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam .................................. 7
2.3.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới ................................................ 7
2.3.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam ................................................. 8
2.4 Các phương pháp chuyển gen ở thực vật ................................................ 8
2.4.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp................................................... 8
2.4.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp ................................................ 10
2.4.3 Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây
chuyển gen bằng sinh học phân tử ................................................. 15
2.5 Giới thiệu về gen NAC.......................................................................... 17
2.5.1 Nghiên cứu gen NAC ở trên cây Arabidopsis ............................... 18
2.5.2 Nghiên cứu gen NAC trên cây ngô ................................................ 19
2.6 Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn của cây ngô ........................... 20
PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........21

3.1 Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu ......................................... 21
3.1.1 Đối tượng (vật liệu) nghiên cứu ..................................................... 21
3.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .................................................... 21
3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................. 22

3.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 22
3.3 Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 22
3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá và xử lý kết quả .... 27
3.4.1 Nghiên cứu biến nạp gen ZmNAC vào các dòng ngô CM8, VH1, C8H9.... 27
3.4.2 Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá ................................................... 28
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................29

4.1. Kết quả nghiên cứu biến nạp gen ZmNAC vào các dòng ngô thông
qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .......................................... 29
4.1.1 Kết quả theo dõi và đánh giá khả năng sống sót của phôi non sau
giai đoạn nuôi phục hồi REM........................................................ 29
4.1.2 Kết quả theo dõi và đánh giá khả năng tạo mô sẹo (callus) của
các dòng ngô trong môi trường chọn lọc ECM ............................. 30
4.1.3 Kết quả theo dõi và đánh giá khả năng tái sinh chồi của các
dòng ngô trong môi trường chọn lọc SeM .................................... 31
4.2. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen ZmNAC trong các dòng ngô
chuyển gen .......................................................................................... 32
4.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các dòng ngô chuyển gen .... 32
4.2.2 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen bar trong các dòng ngô chuyển gen ......35
4.2.3 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen ZmNAC trong các dòng ngô
chuyển gen .................................................................................... 36
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................38

5.1 Kết luận ................................................................................................. 38
5.2 Kiến nghị ............................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................39


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1. Thành phần hóa học các bộ phận của hạt......................................... 6
Bảng 2.2. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới những năm gần đây ................ 7
Bảng 2.3. Tình hình sản xuất ngô của các nước đứng đầu thế giới.................. 8
Bảng 2.4. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam những năm gần đây ................ 8
Bảng 3.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 21
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen ZmNAC
trong các dòng ngô chuyển gen ..................................................... 26
Bảng 4.1. Kết quả theo dõi và đánh giá khả năng sống sót của phôi non
sau giai đoạn nuôi phục hồi REM ................................................. 29
Bảng 4.2. Kết quả theo dõi, đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tạo chồi của
mẫu trong môi trường chọn lọc ..................................................... 30
Bảng 4.3. Kết quả theo dõi và đánh giá khả năng tái sinh chồi của mẫu
trong môi trường chọn lọc ............................................................. 31
Bảng 4.4. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các dòng ngô chuyển gen
bằng đo quang phổ nanodrop ........................................................ 34
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen ZmNAC trong các dòng ngô
chuyển gen..................................................................................... 36


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Hình ảnh rễ mầm cây ngô ................................................................. 4
Hình 2.2. Lá ngô .............................................................................................. 5
Hình 2.3. Hạt ngô bổ đôi................................................................................... 6
Hình 2.4. Cấu trúc Ti-plasmid ........................................................................ 12
Hình 2.5. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể .......................................................... 14
Hình 2.6. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp ........................................................ 15
Hình 3.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình biến nạp gen vào ngô (Zea mays L) ......... 23

Hình 4.1. Hình ảnh phôi non sống sót sau lây nhiễm của các dòng ngô ........ 30
Hình 4.2. Hình ảnh tạo mô sẹo của mẫu thuộc các dòng CM8, VH1, C8H9. 31
Hình 4.3. Hình ảnh tái sinh chồi của các dòng ngô ........................................ 32
Hình 4.4. Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng ngô chuyển gen ......... 33
Hình 4.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi bar trong
các dòng ngô chuyển gen ............................................................... 35
Hình 4.6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen ZmNAC
trong các dòng ngô chuyển gen...................................................... 37


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây lương thực quan trọng nhất trên thế
giới. So với lúa mì và lúa gạo thì ngô đứng thứ ba về diện tích, thứ hai về năng suất
nhưng thứ nhất về sản lượng. Với giá trị kinh tế cao và khả năng thích ứng rộng,
cây ngô đã được trồng ở hầu hết các vùng trên thế giới. Năm 2012, diện tích trồng
ngô trên thế giới đạt 174,64 triệu ha với tổng sản lượng đạt 838 triệu tấn. Trong đó
Mỹ là nước có diện tích lớn nhất với 35,5 triệu ha, sản lượng đạt 274 triệu tấn [26].
Nhu cầu ngô của thế giới được dự báo sẽ tăng lên 50% với 852 triệu tấn vào năm
2020 và có thể vượt qua cả gạo và lúa mì [20].
Tại Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa, là đối tượng
chủ lực trong công cuộc xóa đói giảm nghèo, đặc biệt ở các tỉnh vùng núi. Năm 2012,
diện tích gieo trồng ngô của cả nước đạt gần 1,2 triệu ha với sản lượng 4,6 triệu tấn,
năng suất đạt 40,09 tạ/ha. Tuy nhiên hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu ngô với
lượng khá lớn, 1,614 triệu tấn năm 2012 với trị giá hơn 500 triệu USD [14]. Theo
chiến lược của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đến năm 2020, sản lượng
ngô của Việt Nam cần đạt 8 - 9 triệu tấn/năm để đảm bảo cung cấp đủ nhu cầu trong
nước và từng bước tham gia xuất khẩu. Hiện nay việc chọn tạo giống ngô cho năng

suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu được các điều kiện ngoại cảnh khắc nghiệt là một
vấn đề đáng quan tâm và được đặt ra hàng đầu. Bên cạnh các phương pháp chọn lọc
truyền thống, với sự phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học đã tạo ra các thực vật
chuyển gen nói chung, các dòng ngô chuyển gen nói riêng mang các đặc tính quý mà
các phương pháp truyền thống không tạo ra được. Kĩ thuật chuyển gen vào cây ngô
đã được nghiên cứu và trở thành công cụ quan trọng từ những năm 90. Cây ngô
chuyển gen đầu tiên được thương mại hóa vào năm 1996, đến năm 2012 diện tích
trồng ngô biến đổi gen đạt 55,1 triệu ha chiếm 31,6% tổng diện tích trồng ngô trên
toàn thế giới. Hai phương pháp thường được áp dụng vào chuyển gen ở cây ngô là
chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gene và chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Chuyển gen thông qua vi khuẩn có ưu điểm dễ tiến
hành, tần số biến nạp cao và có tính ổn định qua các thế hệ sau, tiết kiệm chi phí vì
vậy nó được tiến hành hầu hết ở các phòng thí nghiệm [25].


2
Hạn là một trong những yếu tố bất thuận chính làm giảm sinh khối thân, lá và
năng suất của ngô trên thế giới cũng như ở Việt Nam, nhất là những vùng trồng ngô
dựa vào nước tự nhiên. Theo Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam diện tích trồng
ngô phụ thuộc vào nước mưa chiếm khoảng 70%, diện tích chủ động được nước
tưới chiếm khoảng gần 30%. Ở nước ta lượng mưa hàng năm phổ biến từ 1700 2000 mm đủ cho nhu cầu phát triển của cây ngô, tuy nhiên lượng mưa tập trung
theo mùa nên về mùa khô cây ngô không đủ nước để phát triển. Vì vậy cần tập
trung nghiên cứu để tạo ra các giống ngô có khả năng chống chịu hạn và cho năng
suất cao [1].
1.2 Mục đích và yêu cầu nghiên cứu
1.2.1 Mục đích
- Biến nạp gen ZmNAC vào một số dòng ngô chọn lọc thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
- Kiểm tra sự có mặt của gen ZmNAC trong các dòng ngô chuyển gen bằng
phương pháp PCR

1.2.2 Yêu cầu
Biến nạp gen thành công ZmNAC vào một số dòng ngô chọn lọc thông qua vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens
1.3 Ý nghĩa của đề tài
1.3.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần hoàn thiện quy trình chuyển gen vào
các dòng ngô và cây trồng. Phục vụ cho các công trình nghiên cứu khoa học về cây
trồng chuyển gen.
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Qua kết quả nghiên cứu của đề tài đưa ra quy trình hoàn thiện chuyển gen của
một số dòng ngô nói riêng và cây trồng nông nghiệp nói chung. Bước đầu phục vụ
cho sản xuất các dòng ngô có đặc tính ưu việt đặc biệt là khả năng chống chịu hạn
góp phần làm tăng năng suất và chất lượng cây trồng.


3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Nguồn gốc, vai trò và vị trí của cây ngô trong hệ thống cây trồng
2.1.1 Nguồn gốc và phân loại
Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L. thuộc chi Maydeae, họ Hòa thảo
Gramineae, có bộ nhiễm sắc thể 2n = 20. Kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng
cây ngô có nguồn gốc ở Trung Mỹ, trung tâm phát sinh là Mexico [19]. Trải qua
hàng triệu năm phát triển, dưới tác động của chọn lọc tự nhiên và nhân tạo đã hình
thành 8 loài phụ, phân bố ở 4 vùng sinh thái: ôn đới, nhiệt đới thấp, nhiệt đới cao và
cận nhiệt đới.
Dựa vào hạt có mày hay không có mày, hình thái bên ngoài và cấu trúc nội
nhũ của hạt, ngô được phân thành các loài phụ: ngô bọc, ngô đá, ngô răng ngựa, ngô
đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nếp, ngô đường bột, ngô bán răng ngựa. Từ các loài
phụ căn cứ vào màu sắc hạt và màu sắc lõi ngô để phân thành các thứ. Đây là cách

phân loại theo đặc điểm thực vật học, ngoài ra ngô còn được phân loại theo sinh thái
học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm [8].
2.1.2. Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế
Cây ngô luôn thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học vì có nhiều đặc
tính quý như sinh trưởng và phát triển nhanh, năng suất cao và khả năng thích ứng
rộng. Sản phẩm từ ngô đã và đang góp phần nuôi sống 1/3 dân số thế giới. Toàn thế
giới đã sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực. Đặc biệt là nhiều nước Châu
Phi, Châu Mỹ, v.v... ngô làm lương thực chính (khoảng 85% sản lượng ngô). Hạt
ngô chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, hàm lượng tinh bột trung bình khoảng 69,2%
(trong khi đó hàm lượng tinh bột trong gạo 62,4%; lúa mì 63,8%); protein 10,6%;
lipit 4,3%; chất xơ 2% và nhiều loại vitamin quan trọng cho sự sống. Chính vì thành
phần dinh dưỡng phong phú và đầy đủ này mà ngô đã được dùng rất nhiều trong
thành phần thức ăn bổ sung, giúp tái tạo và tăng cường năng lượng [10].
Cùng với những tác dụng trên, có đến 70% ngô được sử dụng để chế biến thức
ăn chăn nuôi, nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp chế biến thực phẩm
(đường, rượu, bia, đồ uống giải khát); sản xuất xăng sinh học; công nghệ y dược,
ngô dùng để sản xuất glucose, peniciline, ngô non còn được dùng để tinh chế
vitamin và nhiều ứng dụng khác.


4
2.2 Đặc điểm sinh học cây ngô
Ngô (Zea mays L.) là cây nông nghiệp một lá mầm thuộc chi Zea, họ hòa thảo
(Poaceae hay còn gọi là Gramineae). Các giống ngô ở Việt Nam có những đặc
điểm như chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, chống chịu sâu bệnh và thích ứng
với điều kiện ngoại cảnh khác nhau. Song cây ngô đều có những dặc điểm chung về
hình thái, giải phẫu. Các bộ phận của cây ngô bao gồm: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ,
bắp ngô) và hạt.
2.2.1 Rễ ngô
Ngô có hệ rễ tiêu biểu cho bộ rễ cây hòa thảo. Tuy nhiên ngô có bộ rễ phát

triển rất mạnh, nên có khả năng hút nước rất khỏe, hơn nhiều loài cây trồng khác.
Hệ rễ của cây ngô hoàn chỉnh chia thành 3 nhóm: rễ mầm, rễ đốt, rễ chân kiềng. Rễ
mầm mọc từ trụ lá mầm, chức năng chính của rễ này là hút nước, thức ăn khi cây
còn non. Rễ đốt mọc vòng quanh các đốt thấp của thân. Đây là loại rễ quyết định
quá trình sinh trưởng phát triển của cây ngô, nó giúp cây hút nước và các chất dinh
dưỡng suốt đời sống của cây. Rễ chân kiềng mọc quanh các đốt thấp sát mặt đất. Rễ
này giúp cây chống đỡ và bám chặt vào đất, chúng cũng tham gia hút nước và thức
ăn. Số lượng rễ, số lông rễ và độ dài rễ khác nhau ở mỗi giống. Đây là một chỉ tiêu
quan trọng để đánh giá khả năng chịu hạn của cây [8].

Hình 2.1. Hình ảnh rễ mầm cây ngô (Theo Viện khoa học Việt Nam,
/>

5
2.2.2 Thân ngô
Thân ngô đặc, đường kính từ 2 - 4cm, cao từ 1,8 - 2 m. Thân ngô trưởng thành
bao gồm nhiều lóng nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ. Thân ngô ngoài
nhiệm vụ giúp cây đứng vững, là bộ phận dự trữ và vận chuyển chất hữu cơ, ngoài
ra còn có khả năng quang hợp để tổng hợp chất hữu cơ. Lá ngô mọc từ mắt trên đốt
và mọc đối xứng xen kẽ nhau. Các bộ phận của lá bao gồm: bẹ lá, phiến lá, thìa lá.
Theo hình thái và vị trí trên thân, lá ngô được chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân,
lá bẹ, lá bi. Số lá, độ lớn của lá phụ thuộc vào giống, điều kiện thời tiết, kỹ thuật
canh tác, mùa vụ, số lá ngô thường biến động từ 15 - 20 lá. Đặc điểm nổi bật là lá
ngô có rất nhiều khí khổng. Trung bình một lá ngô có từ 2 - 6 triệu khí khổng, trên
1mm2 lá có từ 500 - 900 khí khổng. Cơ chế đóng mở của lỗ khí khổng liên quan
chặt chẽ tới điều kiện hạn hán [8].
2.2.3 Lá ngô, hạt ngô
Lá ngô là cơ quan làm nhiệm vụ quang hợp, đồng thời làm nhiệm vụ trao đổi
khí, hô hấp, dự trữ dinh dưỡng… Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc. Cơ
quan sinh sản đực (bông cờ) và cái (bắp) tuy cùng nằm trên một cây song ở những

vị trí khác nhau. Hoa đực nằm ở đỉnh cây. Hoa cái phát sinh từ mầm nách lá trên
thân, số mầm nách nhiều nhưng chỉ có từ 1 - 3 mầm nách trên cùng phát triển thành
bắp. Số bắp trên cây phụ thuộc vào giống, vùng sinh thái, mật độ và phân bón [8].

Hình 2.2. Lá ngô (Theo Viện khoa học Việt Nam,
/>

6
Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơrôn, phôi, nội
nhũ và chân hạt. Vỏ hạt bao xung quanh hạt là một màng nhẵn. Lớp alơrôn nằm
dưới vỏ hạt. Nội nhũ là phần chính của hạt chứa 70 - 78% khối lượng hạt với giá trị
dinh dưỡng khá cao so với các loại hạt ngũ cốc khác. Phôi ngô có: ngù (phần ngăn
cách giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm. Trong
bốn phần này thì lá mầm thường phát triển rõ rệt nhất. Phôi ngô lớn chiếm 8 - 15%
trọng lượng hạt. Màu sắc hạt phụ thuộc đặc tính di truyền của giống và chủng loại,
vì vậy hạt ngô có nhiều màu sắc khác nhau như: trắng, vàng, tím, da cam, đỏ…Mỗi
bắp ngô có từ 200 - 1000 hạt phụ thuộc vào giống, điều kiện ngoại cảnh, sinh thái,
trung bình mỗi bắp có từ 500 - 600 hạt [8].
Bảng 2.1. Thành phần hóa học các bộ phận của hạt
Chất đạm

Chất béo

Tro

Tinh bột

(%)

(%)

(%)

(%)

Vỏ hạt

3,21

1,17

4,12

8,36

Tầng alơron

16,67

12,21

9,56

7,15

Nội nhũ

59,98

3,59

11,77

79,52

Phôi

20,14

82,43

74,55

9,97

Tổng số

100,00

100,00

100,00

100,00

Các phần của hạt

Hình 2.3. Hạt ngô bổ đôi (Theo Viện khoa học Việt Nam
/>

7
2.2.4 Sinh trưởng và phát triển của ngô
Quá trình sinh trưởng, phát triển của cây ngô được chia thành hai giai đoạn:
giai đoạn sinh dưỡng và giai đoạn sinh thực. Giai đoạn sinh dưỡng được tính từ khi
gieo đến trỗ cờ. Giai đoạn sinh thực được tính từ trỗ cờ đến chín hoàn toàn. Căn cứ
vào đặc điểm quá trình sinh trưởng phát triển có thể chia ra các giai đoạn sinh
trưởng phát triển quan trọng sau đây: giai đoạn hạt nảy mầm và mọc; giai đoạn từ
mọc đến 3 lá; giai đoạn từ 3lá đến 7 lá; giai đoạn từ 7 lá đến trổ cờ; giai đoạn từ trỗ
cờ đến tung phấn, phun râu; giai đoạn từ thụ phấn đến chín. Trong từng giai đoạn
cây ngô yêu cầu các điều kiện khác nhau và mỗi giai đoạn đều có ảnh hưởng khác
nhau đến các yếu tố tạo thành năng suất và chất lượng hạt ngô [8].
2.3 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam
2.3.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới
Trên thế giới, ngô là một trong những cây ngũ cốc quan trọng, nuôi sống gần
1/3 dân số thế giới. Diện tích đứng thứ 3 sau lúa mì và lúa nước, sản lượng thứ hai
và năng suất cao nhất trong các cây ngũ cốc. Năm 1961, diện tích ngô toàn thế giới
đạt 105,5 triệu ha, năng suất 19,4 tạ/ha, sản lượng 205 triệu tấn, đến năm 2010, diện
tích trồng ngô thế giới đạt khoảng 161,90 triệu ha, năng suất bình quân 52,15 tạ/ha,
sản lượng 844,44 triệu tấn. Trong đó Mỹ, Trung Quốc, Braxin, Ấn Độ là những
nước đứng đầu về diện tích và sản lượng [17].
Bảng 2.2. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới những năm gần đây [17]
Diện tích

Sản lượng

Năng suất

(Triệu ha)

(Triệu tấn)

(Tạ/ha)

2008

161,20

827,48

51,33

2009

158,84

819,70

51,60

2010

161,90

844,40

52,15

2011

172,04

888,00

52,61

2012

177,37

872,06

50,16

Năm


8
Bảng 2.3. Tình hình sản xuất ngô của các nước đứng đầu thế giới [17]
Năm 2011
Quốc
gia

Diện tích

Năm 2012

Sản lượng Năng suất Diện tích Sản lượng Năng suất

(Triệu ha) (Triệu tấn)

(Tạ/ha)

(Triệu ha) (Triệu tấn) (Tạ/ha)

Mỹ

33,98

313,94

92,36

35,35

273,83

77,44

China

33,55

192,90

57,48

34,96

208,23

59,55

Brazil

13,21

55,66

42,10

14,19

71,07

50,05

Ấn Độ

8,71

21,76

24,98

8,40

21,06

25,07

Mexio

6,06

17,63

29,05

6.92

22,06

31,87

2.3.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam
Sản xuất ngô cả nước qua các năm không ngừng tăng về diện tích, năng suất,
sản lượng: năm 2001 tổng diện tích ngô là 730.000 ha, đến năm 2005 đã tăng trên 1
triệu ha; năm 2010, diện tích ngô cả nước 1126,9 nghìn ha, năng suất 40,9 tạ/ha, sản
lượng trên 4,6 triệu tấn. Tuy vậy, cho đến nay sản xuất ngô ở nước ta phát triển
chưa tương xứng với tiềm năng, chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước,
hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu từ trên dưới 1 triệu tấn ngô hạt [14].
Bảng 2.4. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam những năm gần đây [14]
Năm

Diện tích
(Nghìn ha)

Năng suất
(Tấn/ha)

Sản lượng
(Tạ/ha)

2007

1069,1

3,93

4303,2

2008

1.140,2

4.01

4573,1

2009

1.089,2

4.01

4371,7

2010

1.126,9

4.09

4606,8

2011

1.117,2

42,9

4799,3

2.4 Các phương pháp chuyển gen ở thực vật
2.4.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp
- Chuyển gen bằng súng bắn gen: Kỹ thuật bắn gen dựa trên gia tốc của các
hạt bọc DNA về phía tế bào thực vật. Nhờ có gia tốc lớn mà các hạt DNA có thể
đâm xuyên qua thành tế bào và màng tế bào. Bên trong tế bào, DNA được phân tách
từ các hạt nhỏ và tổng hợp ở trong hệ gen thực vật. Ưu điểm của súng bắn gen là có


9
thể loại bỏ các tác nhân sinh học không thích hợp, đặc biệt là với những loại mẫu
không thích hợp với chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium. Phương pháp này
cho phép chuyển trực tiếp gen quan tâm vào mô phân sinh đỉnh của thực vật. Tuy
nhiên, phương pháp này yêu cầu phải có dụng cụ, máy móc chuyên dụng có thể
phân chia chính xác các hạt DNA sâu trong mô phân sinh đích [30]. Klein (1987) là
người đầu tiên tiến hành chuyển gen vào tế bào biểu bì của cây Hành bằng kỹ thuật
bắn gen. Năm 1998, Phan Tố Phượng và cs đã thành công trong việc chuyển gen
Xa21 vào giống lúa Việt Nam bằng chính phương pháp này. Năm 2008, Bùi Lan

Anh và cộng sự cũng thành công trong việc xây dựng quy trình chuyển gen bar vào
cây khoai mì bằng phương pháp bắn gen [2].
- Chuyển gen bằng xung điện: Kỹ thuật này áp dụng cho phương pháp chuyển
gen vào tế bào trần. Người ta chuẩn bị huyền phù tế bào trần và plasmid tái tổ hợp
mang gen mong muốn và gen chọn lọc. Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao
khoảng 200V-600V/cm trong khoảng thời gian ngắn 4- 5‰s. Kết quả làm cho
màng tế bào trần xuất hiện những lỗ thủng tạm thời có đường kính khoảng 300 ηm
mà qua đó các DNA tái tổ hợp ở bên ngoài có thể xâm nhập vào bên trong tế bào.
Sử dụng xung điện cho hiệu quả biến nạp khá cao đối với tế bào động vật. Fromm
và cộng sự (1985) [18], lần đầu tiên cho rằng có thể cải tiến phương pháp này để
biến nạp gen vào thực vật. Năm 1985, nhóm tác giả đã sử dụng kỹ thuật xung điện
để chuyển gen vào tế bào trần của cây ngô và họ đã thu được cây ngô chuyển gen
bền vững bằng phương pháp này [18].
- Chuyển gen bằng PEG (Polyetylenglycol): Phương pháp chuyển gen nhờ
PEG thường được sử dụng chuyển gen vào tế bào trần. Ở nồng độ cao, PEG làm
cho DNA không ở trạng thái hoà tan nữa mà dính trên màng sinh chất. Sau đó, bằng
cách loại bỏ PEG và xử lý Ca2+ hoặc ở độ pH cao, DNA biến nạp sẽ được chuyển
nạp vào tế bào trần. Đã có rất nhiều kết quả chuyển được gen mong muốn vào cây
trồng bằng phương pháp này như: tại Viện Di Truyền Nông nghiệp, nhóm nghiên
cứu của Đặng Trọng Lương đã chuyển thành công gen tổng hợp insulin vào cây lúa
mì và gen cryIA(c) vào cây bắp cải. Tại Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí
Minh cũng đã tạo ra cây thuốc lá, đậu xanh, cải bông, cải xanh và cà tím nhờ
chuyển gen bằng A. tumerfaciens chủng EHA105 [2]. Hiện nay có rất nhiều kỹ
thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào song kỹ thuật chuyển gen bằng vi khuẩn A.
tumerfaciens vẫn được ứng dụng rộng rãi.


10
2.4.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp
2.4.2.1 Chuyển gen thông qua virus

Virus được sử dụng nhiều làm vectơ chuyển gen trong cây trồng do rất dễ xâm
nhập và lây lan trong cơ thể thực vật. Mặt khác trong cấu tạo của virus cũng có sự
có mặt của acid nucleic làm cơ sở cho việc gắn các gen cần chuyển vào. Tuy nhiên,
để trở thành vectơ chuyển gen thì virus cần có những tiêu chuẩn sau:
+ Genome của virus là DNA chứ không phải là RNA
+ Có thể di chuyển từ tế bào này qua tế bào khác thông qua các lỗ trên thành
tế bào.
+ Có khả năng tải được các đoạn DNA gắn vào.
+ Có phổ ký rộng.
+ Không gây hại hoặc gây hại rất nhỏ.
Tuy nhiên hiện nay việc chuyển gen nhờ virus rất ít được sử dụng. Do về
nguyên tắc virus không truyền qua hạt cho nên việc nhân giống cây chuyển gen nhờ
virut phải được tiến hành bằng phương pháp vô tính. Điều này không phải được
thực hiện ở tất cả các loài cây. Vì vậy đây chính là nhược điểm lớn của phương
pháp chuyển gen nhờ virus [7].
2.4.2.2 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di
động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium
[16]. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5 - 11 lông roi.
Vi khuẩn này phát triển tối ưu ở nhiệt độ 29oC trong môi trường có bổ sung một
chút mangan và succinate như là nguồn cacbon duy nhất. Agrobacterium
tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây bằng cách tạo khối u trên cây hai lá mầm
do nó có khả năng chuyển DNA vào tế bào cây [22]. Khi rễ cây xuất hiện vết
thương, tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thương và xâm nhập vào cây qua
vết thương đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó có
mang gen tạo khối u và được biết đến với tên gọi là pTi. Plasmid Ti cũng mang các


11
gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn không

mang pTi được xem như là vi khuẩn không độc và không có khả năng gây bệnh
khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ mầu trắng, ban đầu được tìm thấy ở
gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do các tế bào
ngoại biên chết đi. Các khối u có thể mềm và xốp, có thể bị vỡ vụn khi chạm vào,
nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ hoặc nhiều mấu. Các khối u có
đường kính đến 30 cm nhưng phổ biến là 5-10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở
nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường. Khi xâm
nhiễm vào cây, một phần gen trên pTi sẽ gắn vào nhiễm sắc thể của cây làm cho các
tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử
dụng chất này như một nguồn cacbon cho các hoạt động biến dưỡng [36]. Bộ nhiễm
sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích thước là 2,6 Mb.
Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thước 200-800 kbp [23], chính
plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập.
Plasmid này có tên gọi là plasmid Ti, hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên
plasmid này [16].
Ti – Plasmid
Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng vào công nghệ gen thực vật ở
hai dạng vector cis (liên hợp) và trans (nhị thể). Đây là hai dạng vector rất thuận lợi
để tái tổ hợp gen ngoại lai và chuyển vào tế bào thực vật. Dạng cis chỉ sử dụng Tiplasmid và tế bào vật chủ là Agrobacterium tumefaciens mà không có sự tham gia
của plasmid và vi khuẩn khác. Vùng T- ADN của Ti-plasmid được thiết kế lại để
gắn những gen ngoại lai mong muốn, các phần còn lại của Ti-plasmid vẫn được giữ
nguyên. Agrobacterium tumefaciens được dùng làm tế bào vật chủ để nhân lên
nhiều bản sao của Ti-plasmid và chuyển gen [23].


12

Hình 2.4. Cấu trúc Ti-plasmid
T – ADN
T-ADN được nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn ADN có kích thước 25 kb

trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp Auxin, Cytokinin, Opine và các gen
gây khối u (oncogenes). Trong Ti-plasmid, vị trí của T- ADN được giới hạn bằng
RB và LB. Ngoài T- ADN, trên Ti-plasmid còn có các vùng ADN mã hóa cho việc
tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho
việc tiêu hóa opine (opine catabolism) [5].
Cơ chế lây nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Các tế bào thực vật bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hóa học dẫn dụ vi
khuẩn như: acetosyringone, hydroxyl-acetosyringone…Dưới tác dụng của các hợp
chất này, Agrobacterium tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và
chuyển T- ADN vào tế bào thực vật [12], [24]. Quá trình này được sự trợ giúp đặc
biệt của các gen vir và RB, LB. Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng,
giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện [21].
Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề
mặt rễ cây. Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc
sử dụng chất dinh dưỡng do mô rễ tạo ra. Nhưng vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây
khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân. Yêu cầu về vết thương cho việc xâm
nhiễm có thể dễ dàng được chứng minh bằng các thí nghiệm. Trong điều kiện tự


13
nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thương nhờ các dấu hiệu hoá học.
Điều này có được là do đáp ứng giải phóng đường và các thành phần phổ biến khác
trong rễ. Tuy nhiên, chủng vi khuẩn có mang pTi sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng
xác định các hợp chất vết thương (hợp chất phenolic) như acetosyringone. Chất này
có tác dụng rất mạnh mặc dù ở nồng độ thấp (10-7 M). Bởi vậy, một trong những
chức năng của pTi là mã hoá cho các thụ thể (receptor) nhận biết các chất hoá học.
Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận
biết ra các vùng bị tổn thương. Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến
trình xâm nhiễm. Ở nồng độ cao (10-5 - 10-4 M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên
pTi [16]. Các gen vir được kích hoạt tốt nhất ở nhiệt độ 25-27oC. Tuy nhiên, hầu hết

các chủng Agrobacterium hoạt động ổn định ở nhiệt độ 18-20oC [23].
Chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens có ưu điểm dễ tiến hành, tần số
biến nạp cao và có tính ổn định qua các thế hệ sau, tiết kiệm chi phí vì vậy nó được
tiến hành hầu hết ở các phòng thí nghiệm, tuy nhiên chủ yếu được áp dụng ở cây hai
lá mầm đối với cây một lá mầm còn hạn chế [25]. Đã có nhiều công trình nghiên
cứu về phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens vào các đối
tượng cây trồng như ngô, đậu tương cà chua…Trương Thu Hằng (2013) đã sử dụng
phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens để chọn lọc các dòng ngô chuyển
gen kháng sâu và đã chuyển gen thành công gen CryIAc vào dòng ngô HR9 nhập
nội [6]. Lê Tấn Đức và cs (2012) cũng đã sử dụng phương pháp này để biến nạp gen
kháng sâu CryIAb vào cây cà chua với mục đích hy vọng sự biểu hiện của gen
CryIAb sẽ góp làm giảm tác hại của sâu hại cà chua [4].
2.4.2.3 Hệ thống vector chuyển gen
- Hệ thống vector nhị thể
Trên cơ sở phát hiện vùng vir không cần nằm trên cùng một plasmid với vùng
T-ADN mà vẫn điều khiển được sự chuyển và xâm nhập của T-ADN vào thực vật.
Người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector nhị thể trong đó vùng TADN và vùng vir nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong cùng một chủng A.
tumefaciens [3] .


14

Hình 2.5. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể
Có hai vectơ được sử dụng trong hệ thống vector nhị thể đó là vector chuyển
gen và vector bổ trợ. Hai cấu trúc này được đưa vào Agrobacterrium tumefaciens, khi
các gen trên vector bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn TADN trên vector chuyển gen dẫn đến chuyển đoạn T-ADN sang tế bào thực vật.
Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị sao chép có thể không bền vững trong
E.coli khi cả hai vùng này hoạt động. Tuy nhiên, vectơ nhị thể có một số ưu điểm
sau:
+ Không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid.

+ Kích thước vector khá nhỏ.
Nhờ vậy, hiệu quả chuyển gen giữa E.coli với Agrobacterrium tăng lên. Hiện
nay, vector nhị thể được sử dụng rộng rãi với rất nhiều loại được thiết kế phù hợp
với yêu cầu của quá trình chuyển gen [3].
- Hệ thống vector liên hợp
Vector liên hợp được xây dựng dựa trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương
đồng nằm trên plasmid vi khuẩn (như vector của E.coli) với cùng T- DNA trên Tiplasmid của Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, người ta giữ lại vùng Vir, loại
bỏ vùng mã hóa chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong
Ti-plasmid.
Có 3 loại vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp:
(a) Ti-plasmid: các gen gây khối u đã bị thay bởi gen kháng kháng sinh hoặc


15
một đoạn trình tự của vector pBR322 (hệ thống vector pGV).
(b) Vector trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thước nhỏ và được bổ
trợ chức năng không ưu việt của Ti-plasmid. Chúng được nhân lên trong E.coli và
chuyển sang Agrobacterium tumefaciens nhờ quá trình tiếp hợp. Do không thể sao
chép trong A.tumefaciens nên chúng mang những đoạn tương đồng với T- DNA.
(c) Vector trợ giúp: tồn tại trong E.coli, có kích thước nhỏ, chứa các gen di
động (mob) và gen chuyển (tra) giúp cho quá trình tiếp hợp và chuyển vào
Agrobacterium tumefaciens [3].

Hình 2.6. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp
2.4.3 Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen
bằng sinh học phân tử
Có 2 phương pháp khá phổ biến để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong
cây chuyển gen đó là phương pháp Southern blot và PCR.
2.4.3.1 Phương pháp PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary B Mullis phát hiện ra năm

1983. Đây là phương pháp trong ống nghiệm để tổng hợp các trình tự DNA đặc
hiệu nhờ enzyme, sử dụng hai mồi oligonucleotide để khuếch đại vùng DNA quan
tâm nằm giữa hai mồi bằng cách lặp lại nhiều chu kỳ với các bước biến tính 2 mạch
DNA khuôn, bắt cặp các mồi và kéo dài các sợi. Kỹ thuật PCR đơn giản dễ thực
hiện với hầu hết các phòng thí nghiệm được trang bị máy PCR. Trong phân tích cây


16
chuyển gen, gen chuyển đã được biết trình tự vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi đặc
hiệu cho gen đó và tách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khuôn là có
thể tiến hành PCR. Sử dụng plasmid mang gen chuyển làm đối chứng, nếu sản
phẩm PCR khi điện di có kích thước đúng như dự kiến và bằng với đối chứng thì
mẫu phân tích được coi là dương tính. Tuy nhiên, PCR dương tính không đồng
nghĩa với chuyển gen thành công vì có nhiều cách để giải thích sự có mặt của DNA
trong mẫu phân tích: (1) Vi khuẩn A. tumefaciens mang gen chuyển có thể còn tồn
tại trong khối mô hay trong các gian bào của mẫu phân tích. Hiện tượng này xuất
hiện ở nhiều loại đối tượng và được gọi là dương tính giả. Nếu mẫu phân tích của
thực vật đã qua nhân giống hữu tính tức đã qua một vài thế hệ thì hiện tượng này
được loại trừ. (2) Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất (có thể biến mất qua
sinh sản hữu tính). (3) Gen chuyển không hoạt động, tức không được phiên mã và
biểu hiện ra protein có chức năng sinh học. Chính vì những lý do trên mà kết quả
PCR mới chỉ có giá trị định hướng ban đầu khi phân tích cây chuyển gen [6].
Tuy nhiên, kỹ thuật PCR lại tỏ ra hữu dụng đối với việc phân tích phát hiện
các mẫu lương thực phực phẩm biến đổi gen (genetic modify origanism-GMO). Để
phục vụ việc xác định GMO, PCR còn được phát triển còn thành kỹ thuật multiplex
PCR (MPCR). Với việc sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi nhận biết các gen khác
nhau (promoter, terminator, gen chọn lọc, gen đích…) trong một phản ứng, MPCR
cho phép phát hiện đồng thời nhiều trình tự đích nếu mẫu có mang các gen đó.
Thông thường các cặp mồi được sử dụng trong multiplex PCR là mồi P35S, TNOS,
NPT-II, GUS, EPSPS. Nếu kết quả dương tính với bất cứ cặp mồi nào thì mẫu cần

xác định rất có thể đã được chuyển gen [6].
Đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR để kiểm tra sự có mặt
của các gen mong muốn trên đối tượng nghiên cứu. Trương Thu Hằng (2013) đã sử
dụng phương pháp PCR để kiểm tra sự có mặt của gen cryIAc vào dòng ngô nhập
nội HR9 [6]. Lê Tấn Đức và cs (2012) để kiểm tra sự có mặt của gen kháng sâu
cryIAb trên cây cà chua cũng tiến hành phương pháp PCR để kiểm tra [4].
2.4.3.2 Phương pháp Southern blot (xác định số copy trong cây chuyển gen)
Southern blot là một trong những phương pháp trung tâm của Sinh học phân
tử. Nó còn có tên gọi khác là Southern blotting, phương pháp lai Southern hay


17
phương pháp lai DNA. Nguyên tắc của Southern blot là màng lai nitrocellulose có
khả năng tiếp nhận DNA đã được biết từ lâu và đã được sử dụng trong các nghiên
cứu lai axit nucleic khác nhau vào những thập niên 1950 và 1960. Vào thời kỳ này
DNA cố định không được phân đoạn, chỉ đơn giản bao gồm DNA tổng số được gắn
trên màng lai nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel vào đầu
thập niên 1970 đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể
được phân tách dựa trên cơ sở kích thước của chúng. Từ đó bước phát triển tiếp
theo của phương pháp là chuyển các đoạn DNA phân tách từ gel lên màng lai
nitrocellulose. Phương pháp này được E.M.Southern mô tả tại Ðại học Edingburgh
vào năm 1975. Phương pháp Southern blot đơn giản và hiệu quả. Mặc dù đã được
cải tiến nhưng phương pháp đang được sử dụng ở nhiều phòng thí nghiệm sinh học
phân tử sai khác không đáng kể so với phương pháp ban đầu. Southern blot bao
gồm các bước cơ bản sau:
- Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.
- Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose.
- Làm biến tính DNA.
- Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai.
- Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu.

Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung (giữa DNA trên màng lai với mẫu dò).
- Ðịnh vị các phân tử lai DNA-mẫu dò.
Phương pháp Southern blot được thiết kế để xác định sự hiện diện, kích
thước, số lượng bản sao, tính đồng dạng của DNA trong một phức hợp [4].
2.5 Giới thiệu về gen NAC
Stress phi sinh học như hạn hán và độ mặn cao ảnh hưởng xấu đến sự sinh
trưởng, phát triển và năng suất của thực vật. Trong những năm gần đây, nhiều tiến bộ
đã được thực hiện theo hướng xác định tiềm năng các gen liên quan đến khả năng
tăng sức chịu đựng của thực vật đối với các stress phi sinh học từ môi trường [11].
Nhân tố phiên mã NAC (bắt nguồn từ ba chữ NAM-no apical meristem,
ATAF-Arabidopsis transcription activation factor, CUC-cup-shaped cotyledon) là