Nghiên cứu chuyển gen Chitinase - glucanase kháng nấm vào cây cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens pdf

T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

1
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Chitinase - glucanase
KHÁNG NẤM VÀO CÂY CÀ CHUA THÔNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens
Bùi Th Lan Hương
1
, Nguyn Th Trưng
4
, Vũ Duy Thanh
2
,
Nguyn Th Kim Lý
2
, Nguyn c Doanh
2
, Phan T Phưng
2
,
Nguyn Hng Minh
3
, Lê Th Ánh Hng
2


SUMMARY
Study of antifungal genetransformation on tomato
Tomato is a major vegetable crop that has tremendous popularity over the last century. It is grown
in almost every country of the world. Development of protocols for in vitro selection can provide
new advances for the production of stress tolerant cultivars.

Research objective is to develop transgenic plants from selected Vietnamese tomato cultivars
carrying and expressing a chitinase gene under a constitutive promoter.
The hypothesis is that the transgenic tomato plants expressing this gene will have enhanced
resistance to economically important fungal diseases, which are a problem for warm and humid
climatic conditions.
Research results presented concerning study on the regeneration capacity of tomato varieties
P375 after Agrobacterium mediated transformation. The experimental data show low generation
capacity after transformation in P375 variety in both cotyledon (4,32) and hypocotyls (2,63).
In this result we obtained two tomato lines confirmed the presence of Chitin’s gene with 788 bp.
The primers were used in this investigation are:
CHIF. 5’ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3’;
CHIR.5’GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’
Further testing including tests of the field growth. Plant is necessary to identify individual
transformed lines with resistance.
Keywords: Callus, Cotyledon, Hypocotyls, genotype, ELISA, , Cytokine, Auxin.
I. T VN 
Chuyn gen là phương pháp gây bin d di
truyn có nh hưng  cây trng (Rosen và
cs., 2003; Veluthambi và cs., 2003; Sung Hun
Park và cs., 2003) ã và ang ưc áp dng
rng rãi trong nhng năm gn ây. Trong
nghiên cu to ra cây chuyn gen kháng bnh,
các nhà khoa hc ã phát hin ưc gen
Chitinase trong cây trng có kh năng hn ch
s phát trin các loi nm gây bnh cây như
Fusarium, Botrytis cinerea, Rhizoctonia, hn
ch s phát trin ca nm Verticillium dahliae
chng 1 và 2 (Z.K. Punja, 2001; Schlumbaum,
A. và cs., 1986) và mt s bnh nm khác. S
kt hp gia các gen Chitinase và Glucanase

còn to ra cây chuyn gen có kh năng kháng
bnh cao hơn vi ph rng hơn so vi nhng
cây trng ưc chuyn tng gen ơn l
(Jongedyk e và cs., 1995; Zu và cs., 1994;
Lawrence và cs., 2000).
Ni dung trình bày dưi ây là mt s
kt qu nghiên cu bưc u v chuyn gen
vào ging cà chua P375 thông qua chng vi
khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA 105
có cha plasmid pCAMBIA 1300 mang gen
kháng nm Chitinase (ngun tách t u
Pysium), ưc tin hành ti Phòng Bnh phân
t thc vt; Vin Di truyn N ông nghip.
Ghi chú:
1
Viện Môi trường ông nghiệp, Hà ội,
2
Viện Di truyền ông nghiệp,

3
Trường Đại học ông nghiệp Hà ội,
4
Trường Trung cấp ông nghiệp, Hà ội
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

2
II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CU
1. Vật liệu nghiên cứu
- Các ging cà chua P375 ưc la

chn là ging có kh năng cho tái sinh cao,
ã ưc kim tra bnh bng k thut
ELISA. Các mu ưc s dng trong thí
nghim này là các b phn tr lá mm
(hypocotyl) và lá mm (cotyledone) ca các
cây cà chua ưc nuôi cy trong in vitro.
- Vector mang gen kháng nm
Chitinase ưc cung cp t IN RA- Pháp.
Cu trúc vector:

Hình 1. Cu trúc vector mang gen kháng nm Chitinase
- Chng vi khuNn Agrobacterium
tumefaciens EHA105 có cha plasmid
pCAMBIA 1300 CHI-GLUC, mang 2 gen
kháng nm: Chitinase, Glucanase và gen
kháng Hygomicine (hpt). Gen hpt có
promoter 35S, còn gen Chitinase - Glucanase
có promoter A9, c 2 promoter này u hot
ng rt mnh  genome thc vt,
- Gen kháng nm Chitinase ưc tách
t Phaseolus vulgaris cv Saxa (ngun
N CBI-Genbank).
2. Phương pháp nghiên cứu
- N uôi cy mu phc v cho bin np: Lá
mm và tr lá mm ưc ct nh, t vào ĩa
petri ã ưc kh trùng có cha môi trưng
dinh dưng MS, thành phn gm các nguyên
t a lưng và vi lưng ca MS, vitamins
MS, 20 g/l ưng sucrose, 0,6% agar, pH: 5,8
có b sung 2 mg/l BA + 0,2 mg/l IAA, t

trong phòng ti trong 36, 48 và 60 gi. Sau
ó mu ly ra dùng vào bin np gen.
- Chuyn gen gián tip qua
Agrobacterium tumefaciens: Theo quy trình
ca Swapan K. Datta và cs., 1997.
- ánh giá hiu xut chuyn gen: Xác
nh s mu sng sót, s cây tái sinh thu
ưc, s cây tái sinh ưc chuyn gen.
- S liu thí nghim x lý bng phương
pháp Duncan's.
III. KT QU VÀ THO LUN
1. ghiên cứu khả năng tái sinh của
giống cà chua
Nhng kt qu nghiên cu ca ca
các nhà khoa hc (Shahin và cs.,1986;
Chyi và Phillips, 1987; Mc. Cormick,
1991; Van Roekel và cs., 1993; Shen và
cs., 1998; Krasnyanski và cs., 2001) cho
thy, kh năng tái sinh ca cây cà chua
liên quan n kiu gen ca ging, b
phn s dng  nuôi cy, tui ca cây,
các t hp và nng  các cht kích thích
sinh trưng, iu kin nuôi cy v.v
Trong iu kin nuôi cy in vitro, s
“óng, m” và hot hoá gen vi mt cơ
ch còn chưa rõ hoc thích hp, hoc
không thích hp s dn n s tái sinh
cây vi t l cao hoc thp  các ging
cà chua khác nhau.
Trong thí nghim, chúng tôi s dng

ging cà chua (P375) có các c tính nông
hc tt  ánh giá kh năng tái sinh ca
tr lá mm và lá mm, nhm tìm ưc b
phn có kh năng tái sinh cao làm vt liu
nuôi cy chuyn np gen kháng nm gây
bnh cây (bng 1).
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

3
Bảng 1. Khả năng tái sinh các mẫu trụ lá mầm và lá mầm của giống P375
(L. esculentum Mill)
Giống cà
chua
Khả năng tạo callus (%) Khả năng tái sinh chồi (%) Khả năng tái sinh/mẫu
Trụ lá mầm Lá mầm Trụ lá mầm Lá mầm Trụ lá mầm Lá mầm
P375 83,3ac 93,3ab 37,7b 78.1 a 4,5c 4,2b
Ghi chú: a, b, c ch s khác nhau không áng k. Các giá tr trung bình,  lch chuNn ưc thc hin theo
chương trình ca Ducan vi  tin cy p ≤ 0,05.
Kt qu cho thy, trong cùng mt môi
trưng tái sinh chi, vi mô t bào t lá
mm, ging cà chua P375 cho t l tái sinh
chi t 78,1%, tr lá mm ch t 37,7%.
Nhng kt qu này tương t vi nghiên cu
ca các tác gi McComick et al., 1986;
Zhang et al., 1999; Peres et al., 2001;
Moghaieb et al., 2004; Pravda et al., 2005;
Gorinova et al., 2005. Theo các tác gi trên
thì kh năng này có th còn ph thuc vào
phn ng ca genotype i vi s nuôi cy
mô - là kt qu ca quá trình óng m và

hot hoá gen thông qua tác nhân trung gian
là các cht kích thích sinh trưng như BAP,
NAA và mt s yu t ngoi cnh khác.
2. ghiên cứu chuyển gen kháng bệnh
nấm Chitinase vào cà chua P375
a. Kết quả biến nạp gen Chitinase
Tin hành bin np gen Chitinase có
kh năng kháng nm gây bnh cây vào
ging cà chua P375 bng phương pháp gián
tip thông qua vi khuNn Agrobacterium
tumefaciens (theo quy trình ca Swapan K.
Datta và cs., 1997). Ct nh các mu cy 
to vt thương, nhim vi khuNn vào mu.
Quá trình chuyn np gen Chitinase vào t
bào cà chua ưc thc hin thông qua vi
khuÈn Agrobacterium tumefaciens ưc
nhim vào các t bào b thương ang phân
chia mnh trong môi trưng giàu auxin. Khi
vi khuNn Agrobacterium tumefaciens tip
xúc vi t bào b thương chúng tit ra cht
transzeatin  giúp quá trình bin np trong
t bào thc vt và quá trình bin np gen
ưc thc hin. Sau khi bin np, mu ưc
chuyn sang môi trưng cng MS1 có b
sung ng thi 2 loi kháng sinh Cefotaxim
và Hygromicin. Cefotaxim nhm hn ch s
phát trin tr li ca vi khuNn, trong ó
kháng sinh Hygromicin là kháng sinh ch
th  chn lc các t bào và các mô ã
ưc bin np.

b. ghiên cứu khả năng tái sinh của
cây cà chua biến đổi gen
Căn c vào tính cht tác ng lên các
callus ca 2 loi kháng sinh ã ưc b
sung vào môi trưng nuôi cy (250 mg/l
Cefotaxime) và (50 mg/l Hygromicin).
Tin hành theo dõi kh năng tái sinh cây
ca mô t bào trên môi trưng to callus
(MS1), sau thi gian nuôi cy 15 - 20 ngày,
tính kháng vi kháng sinh Hygromicin
ưc bt u biu hin. Trên nhng callus
ưc bin np xut hin mu xanh và phát
trin trên môi trưng, ngưc li nhng
callus không ưc bin np, kh năng phát
trin hu như b ình tr, các t bào ti b
mt tip xúc vi môi trưng ã có xu
hưng i mu, có nhng mu ã i sang
mu thm. Hin tưng này biu hin  các
mô t bào chưa mang gen ngoi lai hpt,
trên môi trưng nuôi cy cha
Hygromycin, các mô t bào b kháng sinh
này c ch quá trình sinh tng hp protein
làm mt kh năng xanh hóa ca mu. 
các mu không thc hin ưc s chuyn
np gen, mô phát trin kém, mt kh năng
duy trì màu xanh ban u, úa dn en li
và b cht.
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

4

T kt qu thí nghim cũng có th thy
rng, các kháng sinh có nh hưng c ch
khá rõ n sinh trưng và phát trin cũng
như làm gim kh năng phát sinh cơ quan
ca t bào và mô, ngoài ra ôi khi cũng còn
gây ra nhng bin d soma làm gim tc 
phát trin và sc sng ca mô.
c. ghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ
vi khun và thời gian đồng nuôi cấy đến
hiệu quả biến nạp
Nhng nghiên cu ca Fillatti và cs.,
(1997) ã xác nh nng  vi khuNn và
thi gian tin nuôi cy có nh hưng ln
n hiu qu bin np i vi cây cà
chua. Cơ ch ca quá trình này ưc thc
hin trên cơ s vi khuNn Agrobacterium
tumefaciens khi nhim vào các t bào
ang phân chia mnh trên môi trưng
nuôi cy, vi khuNn Agrobacterium
tumefaciens tit ra cht transzeatin giúp
cho quá trình bin np gen ưc thc
hin. Các tác gi như Sung. Park (2003);
Pravda et al., 2005; Gorinova et al., 2005
cho rng nng  vi khuNn o  bưc sóng
600 nm vi OD = 0,2 - 0,6 và thi gian x
lý trong vòng 36 - 60 ting cho hiu qu
chuyn gen vào cà chua là cao nht.
Thí nghim bin np gen vào ging cà
chua P375 ưc chúng tôi tin hành vi
nng  vi khuNn  dng huyn phù ưc

pha loãng vi 3 t l khác nhau: 1:10;
1:15 và 1:20.
Thí nghim vi nng  t bào vi
khuNn thp (1:20), hiu qu bin np hu
như t ưc không áng k, có th vi
nng  này, do lưng t bào vi khuNn thp,
lưng transzeatin ưc tit ra quá ít, hn
ch n kh năng bin np.  thí nghim s
dng lưng t bào vi khuNn cao hơn (nng
 1:10), s lưng mu sng sót thu ưc
sau x lý cũng b gim áng k, trong
trưng hp này, có th lưng transzeatin
ưc tit ra li quá ln, gây ra nh hưng
không có li i vi s phân chia t bào,
cũng dn n làm gim hiu qu bin np.
Khi s dng lưng t bào vi khuNn vi
nng  1:15 (tương ương nng  vi
khuNn o  bưc sóng 600 nm = 0,3) ã cho
hiu qu bin np cao hơn 2 nng  trên.
V thi gian x lý, vi thi gian

x lý trong
48 gi cho hiu qu bin np cao nht
(bng 2). Kt qu này ca chúng tôi phù
hp vi kt qu ca Sung Park (2003) và
Gorinova et al., 2005 “Thi gian x lý ít
hoc nhiu hơn 48 gi, hiu qu bin np
kém”. c bit, nu kéo dài thi gian x lý
lên quá 48 gi s xut hin các vt hoi t
trên các mu cy và mu s cht.

Bảng 2. Hiệu quả biến nạp gen với các nồng độ vi khun
và thời gian đồng nuôi cấy khác nhau ở cà chua P375
Mẫu thí nghiệm và công thức
Số lượng
mẫu thí
nghiệm
Số mẫu tái sinh
Tổng số
mẫu tái
sinh
Hiệu suất biến
nạp (%)
Bộ phận lấy
mẫu
Nồng độ vi
khuẩn
36 giờ 48 giờ 60 giờ
Cuống lá mầm
1: 10

300 1 1 - 2 chết
1: 15 266 1 5 1 7 2,63
1: 20 333 2 2 - 4 1,20
Lá mầm
1: 10

300 1 2 - 3 1,00
1: 15 301 3 9 1 13 4,32
1: 20 265 2 3 1 6 2,24
Cộng 1 765 35

S liu bng 2 cho thy, kh năng tái
sinh sau bin np ca cà chua ph thuc
vào nng  vi khuNn, thi gian ng nuôi
cy và loi mu cy.
Các chi ã phát trin ưc cy chuyn
sang môi trưng MS3 MS + 2 mg/l kinetin
+ 1 mg/l IAA + 25 g/l sucrose + 5 g/l agar +
các loi kháng sinh tương ng)  to cây
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

5
hoàn chnh. Thí nghim thu ưc 16 cây
hoàn chnh, trong quá trình cy chuyn còn
li 12 cây hoàn chnh, kho mnh và ưc
kim tra s có mt ca gen chuyn.
3. Kiểm tra sự có mặt của gen được chuyển
a. Kiểm tra kiểu hình
Phương pháp thưng ưc áp dng là
cho cây tái sinh to r trong môi trưng dinh
dưng có cha 50 mg/l kháng sinh chn lc
(Joao và Brơn, 1993; Vidya và cs., 2000;
Faino và cs., 2004). Do r cây rt mn cm
vi kháng sinh, nu r cây phát trin kho
mnh iu ó chng t cây có cha gen
ưc chuyn (Draper và cs., 1988). Thí
nghim ca chúng tôi cũng áp dng theo
phương pháp này  xác nh nhng cây có
kh năng ã ưc chuyn gen gm nhng

cây có b r phát trin, cây kho mnh.
b. Kiểm tra kiểu gen
Tin hành phân tích v phân t i vi
s biu hin ca gen, PCR (Shen, 1998;
Bhat và Srinivasan, 2002), bng các
enzyme c trưng HindIII, Pstl  xác nh
các vùng có trng lung phân t tương ng
vi gen Chitinase. Phn ng PCR ưc
hoàn thành trong 50 µl ca mi mt hn
hp phn ng chuNn vi enzym Taq ADN
polimeraza, các nucleotid và vi cp mi
c trưng ca gen Chitinase.
CHIF. 5’ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3’
CHIR.5’GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’

Kt qu in di cho thy trong 12 cây
cà chua to ưc trên môi trưng chn lc
ch có 2 cây biu hin có mt gen
Chitinase, gen chuyn ưc khuych i
tương ng 788 bp. (hình 2).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (-)

Hình 1. Kt qu kim tra s có mt ca gen Chitinase
trong các cây ưc chuyn gen
788 bp
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
6
IV. KT LUN
1. Kết luận
Kt qu bưc u nghiên cu s dng vi khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA

105 có cha plasmid PCAMBIA 1300  chuyn gen vào cà chua ã thu ưc 2 cây cà
chua P375 mang gen kháng nm gây bnh cây Chitinase. Nghiên cu các yu t nh
hưng n hiu sut chuyn gen  cây cà chua rút ra ưc mt s nhn xét tương t mt
s kt nghiên cu ã ưc thc hin  nưc ngoài. Hiu sut chuyn gen  cà chua ph
thuc vào các yu t: Kiu gen ca tng ging; cơ quan t ưc la chn  nuôi cy tái
sinh và chuyn gen; nng  vi khuNn và thi gian ng nuôi cy; s dng loi kháng
sinh chn lc
2. Đề nghị
Tip tc nghiên cu hoàn thin quy trình chuyn gen kháng nm gây bnh cây vào
ging cà chua P375. ánh giá c tính cây cà chua mang gen ưc chuyn trong iu kin
cách ly nhm chn to ưc ging cà chua có nhng c tính tt và có kh năng kháng
nm gây bnh cây phc v sn xut.
TÀI LIU THAM KHO
1 Chyi Y-S, Phillips GC., 1987. High efficiency Agrobacterium - mediated
transformation of Lycopersicon based on conditions favorable for regeneration. Plant
cell Rep.
2 Lê Thị Ánh Hồng, 2000. Cơ s khoa hc công ngh chuyn gen  thc vt. Nhà xut
bn Nông nghip, 2000.
3 guyễn Đức Thành, 2000. Nuôi cy mô t bào thc vt - nghiên cu và ng dng.
NXB. Nông nghip.
4 Hu W, Philips GC., 2001. A combination of overgrowth- control and antibiotics
improves Agrobacterium tumerfaciens - mediated transformation efficiency for
cultivated tomato
(L. esculentum). In vitro cell Bio-Plant.
5 Park et al., 2003. Efficinet genotype-independent Agrobacterium - mediated tomato
transformation. J.Plant Physiol. 160: 1253-1257.
6 Frary A, Earle ED., 1996. An examination of factor affecting the efficiency of
Agrobacterium - mediated transformation of tomato. Plant Cell Rep.
gười phản biện: guyễn Văn Vấn