Tách dòng và xác định trình tự gene glta mã hóa cho enzyme citrate synthase từ vi khuẩn e coli

1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG

Tên đề tài:
TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GENE gltA MÃ HOÁ CHO
ENZYME CITRATE SYNTHASE TỪ VI KHUẨN Escherichia coli

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khoá học

: Chính quy
: Công nghệ Sinh học
: CNSH - CNTP
: 2010 - 2014

Thái Nguyên, năm 2014


2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG

Tên đề tài:
TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GENE gltA MÃ HOÁ CHO
ENZYME CITRATE SYNTHASE TỪ VI KHUẨN Escherichia coli

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành
: Công nghệ Sinh học
Lớp
: K42 - CNSH
Khoa
: CNSH - CNTP
Khoá học
: 2010 - 2014
Giảng viên hướng dẫn: TS. Dương Văn Cường

Thái Nguyên, năm 2014


3

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa luận tốt
nghiệp này tôi đã nhận được sự quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ rất tận tình của thầy
cô và bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn:
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Dương Văn Cường giảng viên

Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên, kĩ sư Ma Thị Trang cán bộ tại Bộ môn Sinh học Phân tử và Công
nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên người đã tận tình chỉ
bảo, trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện để tài cũng
như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống – Đại học
Thái Nguyên, ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
– Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các cán bộ, anh chị làm việc tại Bộ môn
Sinh học Phân tử và Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái
Nguyên đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn
động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập,
nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên,ngày 02 tháng 6 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Hường


4

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Danh sách vùng trồng và diện tích vanillin chủ yếu trên thế giới ................6
Bảng 2: Thành phần và tính chất dược liệu của vanillin..........................................12
Bảng 3: Danh sách quốc gia sản xuất và sản lượng vanillin .....................................14
Bảng 4: Tiền chất và vi sinh vật chủ yếu để tổng hợp vanillin vanillin từ axit ferulic
trong chu trình TCA và con đường Glyoxylate ........................................................25
Bảng 5: Cặp mồi sử dụng nhân gene gltA .................................................................31

Bảng 6: Các thành phần của vector pTZ57R/T.........................................................34
Bảng 7: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài .................................................35
Bảng 8: Thành phần phản ứng PCR ..........................................................................40
Bảng 9: Thành phần phản ứng gắn nối .....................................................................43
Bảng 10: Thành phần phản ứng cắt với NcoI............................................................45
Bảng 11: Thành phần phản ứng cắt với SacI và HindIII ..........................................45


5

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Hình dạng và đặc điểm ba loài hoa Vanilla ...................................................4
Hình 2: Loài ong địa phương Melapona và loài chim giúp thụ phấn hoa ..................7
Hình 3 : Qúa trình thụ phấn nhân tạo cho hoa Vanilla planifolia ...............................7
Hình 4: Các con đường trao đổi chất sinh tổng hợp vanillin ....................................21
Hình 5: Con đường sản xuất vanillin từ axit ferulic nhờ gene fcs và ech ................24
Hình 6: Sơ đồ biểu diễn tái chế của coenzym A (CoA) từ acetyl-CoA trong sản xuất
Hình 7: Cấu trúc vector tách dòng ............................................................................33
Hình 8: Quy trình tách dòng và xác định trình tự gene gltA từ vi khuẩn E. coli ................37
Hình 9: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ..............................................................40
Hình 10: Hình ảnh tách chiết DNA tổng số của E. coli ............................................47
Hình 11: Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng PCR .......................................48
Hình 12: Sản phẩm PCR trước và sau khi tinh sạch .................................................49
Hình 13: Kết quả biến nạp vi khuẩn đối chứng ........................................................49
Hình 14: Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào E. coli DH5α khả biến ....50
Hình 15: Kết quả điện di plasmid của các dòng khuẩn lạc đã chọn .........................50
Hình 16: Sản phẩm PCR plasmid của các dòng khuẩn lạc .......................................51
Hình 17: Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme NcoI ......................................52
Hình 18: Kết quả cắt kiểm tra đồng thời bằng hai enzyme SacI và HindIII...............53
Hình 19: Kết quả so sánh trình tự gene của 3 dòng ..................................................55

Hình 20: Kết quả giải trình tự gene hiển thị trên máy tính của dòng 1.....................56
Hình 21: Trình tự nucleotide của gene gltA đã tách dòng ........................................57
Hình 22: Kết quả dịch mã của gene gltA ..................................................................58
Hình 23: Kết quả so sánh trình tự gene gltA đã tách dòng với trình tự gene đã được
công bố trên ngân hàng gene .....................................................................................60


6

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
Amp

Ampicillin

Bp

Base pair – cặp base nitơ

BLAST

Basic Local Aligenment Search Tool

cDNA

Complementary DNA - DNA bổ sung

CoA

Coenzyme Acetoacetyl

DNA

Deoxyribonucleic axit

dNTP

Deoxynucleotide Triphotphate

E. coli

Escherichia coli

Et al.

Cộng sự

IPTG

Isopropyl Thiogalactoside

Kb

Kilo base –kilo base nitơ

LB

Lauria Broth

S. cerevisiae

Saccharamyces cerevisiae

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

V. planifolia

Vanilla planifolia

PCR

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng
chuỗi trùng hợp

TAE

Tris- acetate- EDTA

TE

Tris- EDTA

X -gal

5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside


7

MỤC LỤC

PHẦN 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................1
1.1.Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu của đề tài ...............................................................................................2
1.3. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................3
1.4.1. Ý nghĩa khoa học ..............................................................................................3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4
2.1. Nguồn gốc thực vật của vanilla ............................................................................4
2.2. Đặc điểm thực vật loài Vanilla planifolia ............................................................6
2.3. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của vanillin .........................................................8
2.4. Hoạt tính sinh học và tác dụng của vanillin .........................................................8
2.4.1. Hoạt tính sinh học của vanillin .........................................................................8
2.4.2. Tác dụng của vanillin ......................................................................................11
2.5. Các phương pháp sản xuất vanillin ....................................................................13
2.5.1. Vanillin chiết suất từ tự nhiên ........................................................................13
2.5.2. Vanillin tổng hợp hóa học ...............................................................................14
2.5.3. Vanillin tổng hợp sinh học ..............................................................................16
2.5.3.1. Phương pháp sử dụng enzyme .....................................................................16
2.5.3.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào .................................................................17
2.5.3.3. Ứng dụng công nghệ sinh học tổng hợp vanillin .........................................18
2.6. Vi khuẩn E. coli và gene gltA trong sinh tổng hợp vanillin ...............................23
2.6.1. Vi khuẩn E. coli...............................................................................................23
2.6.2. Vai trò của gene gltA trong sinh tổng hợp vanillin. ........................................24
2.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ........................................................26
2.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................26
2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ......................................................................28
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............30

3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................30


8

3.1.1. Vi khuẩn ..........................................................................................................30
3.1.2. Hóa chất ..........................................................................................................30
3.1.3. Vật liệu ............................................................................................................31
3.1.3.1. Mồi phản ứng PCR.......................................................................................31
3.1.3.2. Vector tách dòng ..........................................................................................32
3.1.4. Thiết bị ............................................................................................................35
3.2. Địa điểm và thời gian thực tập ...........................................................................35
3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................36
3.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................37
3.4.1. Quy trình tách dòng và xác định trình tự gene gltA từ vi khuẩn E.coli ..........37
3.4.2. Phương pháp nuôi phục hồi vi khuẩn từ chủng gốc và phương pháp chuẩn bị
tế bào khả biến ..........................................................................................................38
3.4.3. Phương pháp thu cặn tế bào vi khuẩn .............................................................38
3.4.4. Phương pháp tách chiết DNA tổng số.............................................................38
3.4.5. Phương pháp PCR ...........................................................................................39
3.4.6. Điện di .............................................................................................................40
3.4.7. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng thu nhận lại DNA từ gel ................................41
3.4.8. Phản ứng gắn nối trình tự gene đã khuếch đại vào vetor tách dòng pTZ57R/T
...................................................................................................................................42
3.4.9. Phương pháp biến nạp DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α khả
biến bằng sốc nhiệt. ...................................................................................................43
3.4.10. Phương pháp tách chiết DNA plasmid..........................................................44
3.4.11. Phương pháp cắt kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp với enzyme cắt
giới hạn .....................................................................................................................45
3.4.12. Phương pháp xác định trình tự nucleotide ....................................................46

3.4.13. Phương pháp so sánh trình tự gene gltA đã tách dòng với các trình tự đã
công bố trên ngân hàng gene thế giới. ......................................................................46
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................47
4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn E. coli ..........................................47
4.2. Kết quả nhân gene gltA từ vi khuẩn E. coli DH5α bằng phương pháp PCR. ...............47
4.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR từ gel điện di..................................................48
4.4. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối ...................................................................49


9

4.5. Kết quả chọn lọc dòng vi khuẩn.........................................................................50
4.5.1. Kết quả sàng lọc dòng bằng điện di so sánh kích thước plasmid ...................50
4.5.2. Kết quả chọn lọc dòng bằng PCR ...................................................................51
4.5.3. Kết quả chọn lọc dòng plasmid bằng lập bản đồ giới hạn ..............................52
4.5.3.1. Kết quả cắt kiểm tra độc lập bằng enzyme NcoI..........................................52
4.5.3.2. Kết quả cắt kiểm tra đồng thời bằng hai enzyme SacI và HindIII ...............53
4.6. Kết quả giải trình tự gene ................................................................................... 54
4.6.1. Kết quả so sánh trình tự gene giữa các dòng giải trình tự............................... 54
4.6.2. Kết quả phân tích các thành phần thiết yếu của gene theo thiết kế insilico ...56
4.6.3. Kết quả dịch mã của gene gltA........................................................................58
...................................................................................................................................58
4.6.4. Kết quả so sánh trình tự gene đã xác định với trình tự gene đã công bố trên ngân
hàng gene....................................................................................................................58
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................61
5.1. Kết luận ..............................................................................................................61
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62

1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde) là một trong những hợp chất
thơm quan trọng nhất được sử dụng nhiều trong các ngành thực phẩm, mĩ phẩm, dược
phẩm (Ranadive 1994)…Sản lượng tiêu thụ ước tính trên toàn thế giới hàng năm trên
12.000 tấn (Lee, Yoon et al. 2009). Vanillin tự nhiên, chiết xuất từ quả của loài lan có
tên khoa học Vanilla planifolia chỉ đáp ứng được khoảng 1% nhu cầu thương mại, còn
lại chủ yếu là vanillin tổng hợp hóa học nhân tạo (Li and Rosazza 2000). Trên thực tế,
giá thành của 1 kg vanillin tự nhiên dao động trong khoảng 1200 – 4000 USD, trong
khi đó giá của 1 kg vanillin nhân tạo chỉ khoảng 15 USD (Lomascolo, Stentelaire et al.
1999). Tuy nhiên, theo quy định của Mỹ và châu Âu thì vanillin tổng hợp hóa học
không được coi như tương đương với vanillin tự nhiên (Muheim and Lerch 1999). Do
đó mà vanillin không thể được cung cấp bằng cách chiết xuất từ quả vanilla tự nhiên
hay tổng hợp hóa học, sản xuất vanillin ứng dụng công nghệ sinh học đã được nghiên
cứu như là một quá trình thay thế (Krings and Berger 1998).
Ứng dụng công nghệ sinh học để tổng hợp sản phẩm vanillin tự nhiên thay
thế đang được sự quan tâm ngày càng tăng trong những năm gần đây (LesageMeessen, Stentelaire et al. 1999). Hơn nữa, quá trình sản xuất vanillin sinh học cho
chi phí rẻ hơn do tận dụng được các phế phụ phẩm sẵn có rẻ tiền, tạo ra các sản
phẩm phụ không mong muốn ít hơn và chủ yếu là được thực hiện điều kiện phản
ứng nhẹ nhàng, ít nguy hiểm, sử dụng ít năng lượng hơn và ít gây ô nhiễm môi
trường (Dal Bello 2013). Nghiên cứu sinh tổng hợp vanillin sử dụng các vi sinh vật
và enzyme chuyển hóa tiền chất như glucose, ligin, isoeugenol, eugenol, axit
ferulic… được thực hiện và công bố (Lomascolo, Stentelaire et al. 1999). Trong đó
biến đổi sinh học để tạo vanillin từ axit ferulic được chú ý quan tâm và nghiên cứu.
Một số vi sinh vật, chẳng hạn như chủng Amycolatopsis sp. HR167 (Achterholt,
Priefert et al. 2000), Bacillus subtilis (Peng, Misawa et al. 2003), Pseudomonas
putida (Plaggenborg, Overhage et al. 2003), Delftia acidovorans (Plaggenborg,

Steinbuchel et al. 2001), Sphingomonas (Masai, Harada et al. 2002), Streptomyces
setonii (Muheim and Lerch 1999)… đã được dùng để sản xuất vanillin từ axit
ferulic. Tuy nhiên, vanillin được sản xuất từ các sinh vật trên cho năng suất thấp


2

hoặc sản phẩm tạo thành nhanh chóng bị chuyển đổi sang các sản phẩm khác hoặc
bị vi sinh vật sử dụng như một nguồn carbon cung cấp năng lượng cho các vi sinh
vật phát triển. Các nghiên cứu gần đây cho thấy E. coli là một hứa hẹn tiềm năng sản
xuất vanillin bởi vì nó có một quá trình lên men phát triển tốt và không có con đường suy
thoái vanillin (Priefert, Rabenhorst et al. 2001). E. coli là một loài vi khuẩn lành tính,
đặc điểm di truyền cũng như quy trình lên men đã được nghiên cứu kĩ.
Quá trình tổng hợp vanillin từ axit ferulic ở trong vi khuẩn E. coli nhờ enzyme
feruloyl –CoA synthetase (mã hóa bởi gene fcs) và enoyl –CoA hydratase/ aldolase (mã
hóa bởi gene ech). Đồng thời, các acetyl –CoA được tạo ra trong quá trình sản xuất
vanillin từ axit ferulic có thể được chuyển đổi thành CoA bởi gene gltA mã hóa enzyme
citrate synthase. Như vậy sự khuếch đại của gltA trong E. coli sẽ làm tăng chuyển đổi của
acetyl –CoA , mà có thể mang lại sự tăng cường sản xuất vanillin qua feruloyl –CoA.
Ở Việt Nam, việc trồng trọt, tách chiết và sản xuất vanillin còn là một thách
thức lớn, để đáp ứng nhu cầu sử dụng chủ yếu phải nhập khẩu vanillin từ nước
ngoài với số lượng lớn và giá thành cao đã gây khó khăn cho sản xuất và phát triển
kinh tế. Tuy nhiên với sự phát triển của công nghệ sinh học và khoa học kĩ thuật
hiện nay hoàn toàn có thể chủ động nghiên cứu và sản xuất vanillin thay thế từ con
đường sinh tổng hợp mới. Việc phân lập và tách dòng các gene mã hóa cho các
enzyme trong con đường sinh tổng hợp vanillin là cơ sở cho các nghiên cứu về các
hợp chất thơm nói chung và cung cấp vật liệu nhằm tạo ra chủng vi sinh vật có khả
năng sản xuất vanillin có năng suất cao nói riêng. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn
trên, tôi thực hiện đề tài: “Tách dòng và xác định trình tự gene gltA mã hóa cho
enzyme citrate synthase từ vi khuẩn E. coli” nhằm mục đích cung cấp vật liệu

cho các nghiên cứu tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất vanillin, trước
mắt là tạo chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng sản xuất vanillin.
1.2. Mục tiêu của đề tài
- Tách dòng gene gltA của vi khuẩn E. coli DH5α
- Xác định trình tự gene gltA đã tách dòng và so sánh với trình tự trên ngân
hàng gene (Gene bank).
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Nắm được các nguyên lí, kĩ thuật và các phương pháp thực hiện trong quá
trình tách dòng gene.


3

- Giải được trình tự gene đã tách dòng, phân tích và so sánh được với trình tự
trên ngân hàng gene đã công bố.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã được học và tham
gia nghiên cứu khoa học, cách xử lí và phân tích số liệu, cách trình bày một báo cáo
khoa học. Quan trọng hơn là việc phân lập và tách dòng thành công gene gltA là cơ
sở cho các nghiên cứu tổng quát có liên quan về sản xuất vanillin sau này.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm của quá trình tách dòng gene gltA sẽ cung cấp vật liệu và là cơ sở
cho các nghiên cứu nhằm đưa các gene mã hóa cho các enzyme tổng hợp vanillin
vào vi sinh vật, tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sản xuất vanillin
cao đáp ứng nhu cầu thị trường và hạ mức giá thành của sản phẩm.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nguồn gốc thực vật của vanilla
Vanilla là một loài phong lan leo nhiêt đới thuộc họ Orchidaceae. Họ này bao
gồm 788 chi và 18500 loài, là một trong những họ lớn nhất của thực vật có hoa trên thế
giới, chi chính của nó chứa hơn 110 loài (Mabberley, 1997). Trong tổng số 110 loài,
chỉ có 3 loài có giá trị kinh tế đó là Vanilla planifolia, Vanilla pompona và Vanilla
tahitensis. Tuy nhiên, Vanilla planifolia là loài có tiềm năng kinh tế lớn nhất bởi nó là
nguồn gốc chính của mùi hương vanillin - hương vị chủ yếu được sử dụng rộng rãi
trong ngành công nghiệp, thực phẩm, mĩ phẩm và nước hoa.

Hình 1: Hình dạng và đặc điểm ba loài hoa Vanilla
Lịch sử phát hiện của vanillin bắt đầu ở Trung Mỹ trong năm 1300. Ở
Mexico người Aztec đã sử dụng chúng trong các đồ uống của họ được gọi là


5

“Tlixochitl” – được coi như là tổ tiên của chocolate. Năm 1520, người Tây Ban Nha
đã mang nó đến châu Âu và từ đó nó trở nên phổ biến và được yêu thích hơn. Loài
cây này đã được giới thiệu đến Blandford và trồng thành công bởi Charles Greville
tại Paddington ở Anh vào năm 1807. Sau đó, Greville cung cấp cành hom đến Paris
Antwerp, Bogor, Java để trồng. Cây vanilla đã được đưa tới Reunion và từ Reunion
đến Mauritius năm 1827. Vanilla được phát hiện ở Cộng hòa Malagasy vào năm
1840. Mặc dù cây ra hoa, nhưng không đậu quả nếu không được côn trùng thụ phấn
tự nhiên. Ngoài ra, hoa của lan vanilla rất chóng tàn, hoa nở chỉ kéo dài trong vòng
24 giờ, nên việc thụ phấn gặp rất nhiều khó khăn.
Đến năm 1841, Edmond Albius một cựu nô lệ tại Reunion đã tìm ra một
phương pháp thụ phấn nhân tạo bằng cách sử dụng gậy tre vót nhọn để lấy phấn
hoa, tách môi hoa đưa phấn vào tiếp xúc với bầu noãn. Phương pháp thủ công này

hiện vẫn được áp dụng tại những đồn điền trồng vanilla ở nhiều nơi trên thế giới.
Vào năm 1890, vanilla đã được trồng phổ biến ở Mauritius, Reunion, Seychelles,
Madagascar, Tahiti, Jamaica và một số nước nhiệt đới khác (Cunningham,1920);
(Ranadive 1994); (Reineccius,1994).
Kĩ thuật trồng vanilla đã được giới thiệu năm 1846 ở Java bởi Teysmann, tại
Seychelles năm 1866, ở Tahiti vào năm 1848 bởi Hamelin, ở quần đảo Comoro vào
năm 1893, ở Tây Ấn và Guadelope vào năm 1938. Hiện nay, vanilla được trồng
nhiều tại những đồn điền ở Châu Phi như Reunion, Mauritius, Madagascar,
Seychelles, Tanzania; ở Châu Á như Java, Indonesia; ở Nam Mỹ như Brazil; ở
các đảo trong khu vực Caribbea như Jamaica.


6

Bảng 1: Danh sách vùng trồng và diện tích vanillin chủ yếu trên thế giới
Đơn vị tính: hecta
Năm

Năm

Năm

Năm

Năm

Năm

2003

2004

2005

2006

2007

2008

Madagascar

25750

25880

26050

26220

63764

63764

Indonesia

8539

8903

9216

9216

9216

9216

China

1200

1200

1200

1200

1300

1400

Mexico

1046

6567

826

575

681

582

Tonga

290

290

290

268

255

NA

Uganda

100

140

140

136

138

138

Comoros

700

700

650

700

700

700

400

450

450

460

470

NA

Reunion

350

351

290

290

290

290

Malawi

80

80

80

80

80

80

Keynia

40

40

40

40

40

40

Guadeloupe

40

40

40

40

40

40

Zimbabwe

45

45

45

30

23

23

Địa điểm

French
Polynesia

(Nguồn FAO năm 2009)
2.2. Đặc điểm thực vật loài Vanilla planifolia
Vanilla planifolia loài cây thuộc loại dây leo, thân mọng, mọc bám nhờ rễ
cuốn vào cây chống, đường kính thân 1 - 2 cm, có thể mọc dài đến 10 - 15 m, màu
lục xậm, chia thành những đốt, khoảng cách giữa 2 đốt từ 5 - 15 cm. Rễ dài, màu
trắng nhạt, khí sinh, đường kính chừng 2 mm, mọc đối diện với lá. Lá phẳng, mọng,
mọc cách, hình thuôn - mũi giáo, dài 8 - 25 cm x 2-8 cm, mũi lá tuy nhọn nhưng
cùn, phiến có nhiều gân song song nổi rõ, cuống ngắn. Hoa lớn có mùi thơm, màu
xanh hoặc vàng nhạt, đường kính khoảng 10 cm, rất chóng tàn. Cuống hoa rất ngắn.
Bầu noãn hình trụ cong, dài khoảng 4 - 7 cm, rộng 1 - 1,5 cm. Hai cánh hoa phía
trên dạng tương tự như cánh đài, cánh hoa phía dưới biến dạng thành cánh môi hình
loa kèn. Quả dạng nang, hình trụ dài 10 - 25 cm, đường kính 5 - 15 mm, khi khô có
mùi thơm, chứa nhiều hạt li ti nhỏ cỡ 0.3 mm, hạt được phóng thích khi quả nứt làm
đôi. Hoa thường chỉ trổ hoa mỗi năm một đợt, tại Mexico trong các tháng 4 - 5 và

7

các đảo Châu Phi như Madagascar, Reunion vào các tháng 11 đến tháng giêng năm
sau. Tại Mexico và Trung Mỹ, Vanilla planifolia được thụ phấn tự nhiên do loài ong
điạ phương Melapona và cũng có thể do loài chim hút mật hummingbird đặc biệt trong
vùng. Tỷ lệ thụ phấn tự nhiên chỉ khoảng 1 % (Ranadive et al. 1994).

Hình 2: Loài ong địa phương Melapona và loài chim giúp thụ phấn hoa

Hình 3 : Qúa trình thụ phấn nhân tạo cho hoa Vanilla planifolia


8

2.3. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của vanillin
C8 H 8 O 3

Công thức cấu tạo

Cấu trúc phân tử

Trọng lượng phân tử

152,1473 g/mol
4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde
vanillic aldehyde
4-hydroxy-m-anisaldehyde

Tên gọi khác

methylprotocatechuic aldehyde
3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde
hydroxy-4-methoxy-3-benzaldehyde

Tính chất vật lí

-

Tinh thể màu trắng hoặc hơi vàng, có hương thơm

-

Nóng chảy ở 81oC

-

Áp suất hơi nước là 0,33Pa

-

Nồng độ bão hòa không khí 0,00029 %

-

Độ hòa tan trong nước ở 25oC là 18 mg/m3

2.4. Hoạt tính sinh học và tác dụng của vanillin
2.4.1. Hoạt tính sinh học của vanillin
- Hoạt tính chống ung thư và đột biến gene

Bức xạ tia cực tím có tác động mạnh tới sinh vật trên trái đất từ vi khuẩn đến
con người, có khả năng gây đột biến DNA, lão hóa tế bào. Có 3 loại thành phần
bước sóng tia cực tím khác nhau: UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm) và UVC
(200–280 nm). Trong đó, bức xạ UVB gây tổn thương lớn nhất tới DNA là tác
nhân gây đột biến, gây ung thư các tế bào biểu bì nghiêm trọng khi tế bào tiếp xúc
trực tiếp (Lee, Yoon et al. 2009).


9

Nghiên cứu ban đầu chỉ ra vanillin có hoạt tính chống đột biến trong tế bào
V79 và chống ung thư trong tế bào của chuột (Imanishi, Sasaki et al. 1990). Nghiên
cứu trong ống nghiệm (in vitro) ghi nhận khi có vanillin ở nồng độ không gây độc
hại cho tế bào, có khả năng ngăn chặn sự xâm nhập và di chuyển của tế bào ung
thư, đồng thời ức chế hoạt tính của men MMP-9 do tế bào ung thư bài tiết ra.
Vanillin đã được chứng minh làm giảm số lượng các khối u đại tràng trong mô
chuột thử nghiệm (Akagi, Hirose et al. 1995), tăng cường sửa chữa đột biến và có
chức năng như một chất chống tế bào HT -29 gây ung thư đại tràng ở người (Ho,
Yazan et al. 2009).
Theo báo cáo nghiên cứu của (Sasaki, Ohta et al. 1990); (Keshava, Keshava
et al. 1998) đã chỉ ra rằng việc bổ sung vanillin ở các hàm lượng nhất định có khả
năng ngăn chặn những sai lệch nhiễm sắc thể do tia cực tím và tia X gây ra (van den
Heuvel, Fraaije et al.). Vanillin ức chế đột biến ở locus CD59 trên nhiễm sắc thể 11
của người (Gustafson, Franz et al. 2000) và hoạt động như một chất ức chế protein
kinase (DNA-PK), đóng vai trò sửa chữa sai hỏng DNA (Durant and Karran 2003).
Bromovanin, một dẫn xuất của vanillin có thể được sử dụng trong việc phát triển
các phương pháp điều trị ung thư mới.
- Hoạt tính chống oxy hóa
(Kumar, Priyadarsini et al. 2003) vanilin có hoạt chất chống oxy hóa và hoạt
tính loại bỏ các gốc tự do gây hại cho tế bào thần kinh, khả năng giảm một số thiệt

hại của quá trình oxy hóa xảy ra trong não của bệnh nhân bị bệnh Alzheimer's và
đặc biệt là ngăn chặn sự hình thành của một hợp chất gọi là peroxynitrite (PON).
Peroxynitrite đóng một vai trò trong các bệnh thoái hóa khác của não như bệnh
Parkinson, vanillin cũng ngăn chặn phản ứng oxy hóa dihydrorho damine 123. Mặc
dù nghiên cứu trong lĩnh vực này vẫn còn trong giai đoạn thực nghiệm, nhưng nó có
thể hứa hẹn trong tương lai cho con người đối phó với các bệnh suy nhược thần
kinh. Năm 2004, Fladby và Fizgerald ghi nhận vanilla có thể giúp chẩn đoán bệnh
Alzheimer's do người bệnh thường không ngửi được mùi.


10

- Hoạt tính chống bệnh thiếu máu hồng cầu hình lưỡi liềm
Thiếu máu hồng cầu hình liềm là một căn bệnh di truyền nghiêm trọng liên
quan đến máu. Bình thường các hồng cầu có dạng hình đĩa, tròn di chuyển một cách
dễ dàng qua các mạch máu. Ở người bị bệnh thiếu máu hồng cầu liềm thì các tế bào
hồng cầu chứa hemoglobin hình dạng bất thường (dạng S) làm các tế bào có hình
dạng lưỡi liềm. Các tế bào hình liềm di chuyển qua các mạch máu khó khăn và có
khuynh hướng đóng cục lại gây tắc nghẽn mạch máu. Nguyên nhân là do sự thay
thế A thành T ở giữa bộ ba mã hóa thứ 6 trên ADN quy định tổng hợp protein βhemoglobin dẫn đến bộ ba mã hóa axit amin glutamic thành axit amin valin làm
biến đổi HbA thành HbS.
Vanillin được chứng minh có hiệu quả chống thiếu máu hồng cầu hình lưỡi
liềm thông qua liên kết cộng hóa trị của nhóm aldehyde với hemoglobin trong các tế
bào máu, làm thay đổi các thuộc tính của HbS (Abraham, Mehanna et al. 1991).
Tuy nhiên, vanillin được cung cấp qua đường miệng không có tác dụng điều trị vì
nó nhanh chóng bị phân hủy trong đường tiêu hóa. Để khắc phục vấn đề này, một
vanillin dược phẩm MX-1520 đã được tổng hợp, tác dụng sinh học của loại thuốc
này qua nghiên cứu cho thấy cao hơn 30 lần so với vanillin tự nhiên, hiệu quả giảm
thiếu máu hồng cầu hình liềm gấp 5 lần so với vanillin tự nhiên (Zhang, Li et al. 2004)
- Vanillin giúp cải thiện tình trạng hô hấp của trẻ sinh non.

Trung tâm nghiên cứu y học quốc gia của trường đại học ở Strasbourg (Pháp)
qua các nghiên cứu đã nêu nhận xét: hương vani có thể giúp cải thiện đáng kể khả
năng hô hấp của các trẻ sinh non. Chứng ngừng thở nhất thời là một trong những rối
loạn đáng ngại nhất của trẻ sinh thiếu tháng. Thử nghiệm trên 14 trẻ sinh non mắc
chứng ngừng thở nhất thời bằng cách đặt trong lồng kính được xông hương vani
nhiều giờ, kết quả làm giảm đến 45% ở những trường hợp nặng nhất.
- Hoạt tính quan trọng khác
Nghiên cứu khoa học của (Sun, Sacalis et al. 2001) đã tìm thấy các chiết xuất
alcoholic từ lá và cành của Vanilli fragrans được tách phân đoạn với ethyl acetate,
butanol và nước cho thấy có hoạt tính sinh học là khả năng gây độc hại với ấu trùng
muỗi. Các loại dầu dễ bay hơi chiết xuất bằng cách chưng cất hơi nước từ bốn loài
thực vật là củ nghệ (Curcuma longa), chanh (Citrus hystrix), sả (Cymbopogon
winterianus) và húng quế lông (Ocimum americanum) với việc bổ sung 5% vanillin


11

được đánh giá có hiệu quả tốt chống lại các loài muỗi Aedes aegypti, Anopheles
dirus và Culex quinquefasciatus trong điều kiện phòng kéo dài trong 8 giờ. Dầu
chiết xuất từ chanh và 5% vanillin cho hiệu quả đến 3 giờ. Nghiên cứu cũng chỉ
ra hiệu quả của thuốc chống muỗi phổ biến bằng hóa chất DEET (N, N-diethyl3-methylbenzamide) hiện nay cũng chỉ chống muỗi trong 8 giờ với Aedes
aegypti và Culex quinquefasciatus, trong 6 giờ chống lại Anopheles dirusb
(Tawatsin, Wratten et al. 2001).
Hoạt tính quan trọng khác của vanillin là chống đau răng, chống độc cho
gan, chống viêm, kháng virus, giảm đau, thuốc gây mê, thuốc sát trùng, giảm
căng thẳng, thuốc lợi tiểu, nhuận tràng (Sinha, Verma et al. 2007)
2.4.2. Tác dụng của vanillin
- Vanillin trong công nghệ thực phẩm và mĩ phẩm
Vanillin là hương vị được dùng khá phổ biến trong công nghiệp thực phẩm
(như đồ uống nước giải khát, bánh kẹo, kem, bánh ngọt ...) trong mĩ phẩm (như xà

phòng, nước hoa, sữa tắm, phấn thơm…). Trong thực phẩm vanillin đã được công
nhận có khả năng kháng khuẩn và chống quá trình oxy hóa (Burri, Graf et al. 1989).
Vanillin và đồng phân của nó điều khiển trực tiếp hoạt động chống lại các vi sinh
vật gây hư hỏng thực phẩm (Fitzgerald, Stratford et al. 2005). Vanillin được dùng
để ức chế sự phát triển của các loại nấm mốc, nấm men khác nhau trong hệ thống
nước ép hoa quả, thạch trái cây (López-Malo, Alzamora et al. 1995);(Cerrutti,
ALZAMORA et al. 1997); (LÓPez-Malo, Alzamora et al. 1998) và nước giải khát
(Fitzgerald, Stratford et al. 2004). Hoạt tính kháng nấm của vanillin chống lại nấm
men Candida albicans và Cryptococcus neoformans đã được Boonchird and Flegel
nghiên cứu. Trong đó vị trí trên vòng benzene được xem là cấu trúc quan trọng nhất
có hoạt tính kháng nấm (Fitzgerald, Stratford et al. 2005). Vai trò của vanillin như
một tác nhân kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Escherichia coli, Lactobacillus
plantarum và Listeria innocua (Fitzgerald et al. 2004). Dẫn xuất của vanillin đã
được đánh giá khả năng là tác nhân chống lại một số chủng vi khuẩn gram dương và
gram âm như Pseudoalcaligenes Pseudomona, Proteus vulgaris, Citrobacter
freundii, Enterobacter aerogenes, Staphylococcus subfava và Bacillus megaterium
(Vaghasiya, Nair et al. 2004).


12

- Vanillin trong công nghệ dược phẩm
Vanillin là một nguyên liệu quan trọng trong ngành công nghiệp dược phẩm
để sản xuất thuốc như aldomet, dopamine, papaverine, L- DOPA và chất chống tạo
bọt. Vanillin tổng hợp được sử dụng để sản xuất một số sản phẩm gia dụng, chất
khử mùi, nước hoa xịt phòng, chất đánh bóng sàn nhà và thuốc diệt cỏ (Converti,
Aliakbarian et al. 2010).
Các thành phần có trong vanillin có trách nhiệm về tính chất dược liệu trên
được hiển thị theo bảng sau:
Bảng 2: Thành phần và tính chất dược liệu của vanillin (Anuradha, Shyamala

et al. 2013)
Hoạt tính sinh học của vanillin

Thành phần chịu trách nhiệm

Chống đau răng

Annisyl alcohol, catechin, axit ferulic

Chống ung thư (Antitumour)

Benzyldehyde, catechol, axit salicylic,
syringaldehyde, axit vanillic, catechin, axit
ferulic, cinnamic, ethyl ester, p-cresol

Chống bệnh thiếu máu (Antiedemic)
Chống bướu cổ (Antiestrogenic)
Kháng nội độc tố (Antihaepatotoxic)

Catechin, coumarin, syringaldehyde
Axit ferulic
Catechin, axit ferulic, axit protoatechic

Chống viêm (Anti- inflammatory)

Catechin, axit ferulic, n-hentriacontane,
syringaldehyde, umbelliferone, axit vanillic

Chống cảm cúm (Antilipoperoxidant)
Chống đột biến (Antimutagenic)

Chống ung thư (Antineoplastic)

Catechin
Anisaldehyde, axit ferulic, vanillin
Axit ferulic

Chống oxy hóa (Antioxidant )

Catechin, catechol, axit ferulic, axit
protocatechuic, axit salicylic,
syringaldehyde, axit vanillic, vanillin

Antiperoxidant

axit protocatechuic

Chất gây mê (Anesthetic )

Benzaldehyde, benzyl-alcohol

Kích thích hệ thống miễn dịch
(Immunostimulant)

Belzaldehyde, catechin, axit ferulic

Ngăn chặn độc hại cho gan
(Hepatoprotective )

Catechin, axit ferulic

13

2.5. Các phương pháp sản xuất vanillin
2.5.1. Vanillin chiết suất từ tự nhiên
Vanillin là một trong những hương liệu được ưa chuộng, sử dụng rộng rãi
nhất trên thế giới được chiết xuất chủ yếu từ 3 loài hoa phong lan Vanilla
Planifolia, Vanilla tahitiensis và Vanilla pompon.
Sau 2 - 3 năm trồng vanilla bắt đầu ra hoa, việc thu hái, chế biến vanilla bắt
đầu từ 6 - 9 tháng sau khi hoa thụ phấn cho quả xanh và bắt đầu chín. Ở giai đoạn
quả xanh vanillin không có mùi vị đặc trưng (Walton, Mayer et al. 2003). Do đó
vanillin phải trải qua quá trình xử lí và chế biến để thay đổi tính chất vật lí và hoạt
tính sinh hóa tạo thuộc tính mong muốn (Ranadive 1994). Bên trong quả, hàng ngàn
hạt nhỏ li ti nằm ủ trong vách pha trộn với hỗn hợp đường, chất béo, acid amin và
hỗn hợp phenolic. Lúc này các enzyme bắt đầu hoạt động, phóng thích các hợp chất
phenolic và các hợp chất này di chuyển ra gần lớp vỏ bên ngoài.
Giai đoạn đầu của quy trình chế biến là “làm chết quả (killing)” để quả
ngưng sử dụng đường và acid amin, đồng thời “gây thương tổn” cho tế bào quả để
phóng thích các hợp chất phenolic. Hai mục đích này được thực hiện bằng cách
phơi quả dưới nắng gắt hay nhúng quả nhanh vào nước nóng hoặc hấp quả bằng hơi
nước. Tế bào vỏ quả bị hư hại tạo sự hoạt động cho các enzyme polyphenoloxidase,
làm vỏ chuyển từ màu xanh sang nâu. Sau đó là giai đoạn quả được phơi nắng vào
ban ngày đến thật nóng rồi bọc vải hoặc chăn vào ban đêm để toát mồ hôi
(sweating). Giai đoạn này kéo dài nhiều ngày (có nơi như Madagascar từ 7-10 ngày)
để tạo sự phóng thích vanillin và các hợp chất phenolic khỏi sự kết nối với các phân
tử đường. Sức nóng và tia nắng làm giảm độ ẩm của quả, ngăn chặn sự hoạt động
của vi khuẩn bên ngoài vỏ, đồng thời tạo sắc tố và mùi thơm do phản ứng giữa
đường và acid amin bên trong quả. Từ 3 - 5 kg quả tươi, sẽ thu được 1 kg quả chế
biến. Trong giai đoạn sau cùng của việc chế biến, quả được phân loại, làm khô
trong vài tuần, lưu trữ và ủ để hương vị gia tăng. Toàn bộ thời gian chế biến có thể

kéo dài khoảng 4 - 5 tháng với vanilla Bourbon và 6 - 7 tháng với vanilla Mexico
(Anuradha, Shyamala et al. 2013). Điều này lí giải tại sao sản xuất vanillin tự nhiên
là rất tốn kém. Các quả khô thu được sau đó có thể được sử dụng trực tiếp hoặc tiếp
tục chiết tách vanillin ở dạng khác nhau. Việc chiết tách vanillin tự nhiên này phải tuân
thủ các điều kiện kĩ thuật nghiêm ngặt đòi hỏi yêu cầu cao.


14

Bảng 3: Danh sách quốc gia sản xuất và sản lượng vanillin
Đơn vị tính: tấn
Năm
2003

Năm
2004

Năm
2005

Năm
2006

Năm
2007

Năm
2008

Indonesia

2198

2731

2375

2387

2399

2399

Madagascar

920

880

525

510

1240

1240

China

4100

4150

4252

4354

5089

1200

Mexico

299

189

240

177

251

306

Tonga

130

130

130

139

144

146

Comoros

140

140

110

60

65

60

French
Polynesia

30

35

31

43

50

53

Reunion
Malawi

34
20

32
20

31
20

31
20

23
20

23
20

Portugal

Kenya

10
8

10
8

10
8

10
8

10
8

10
8

Zimbabwe
Guadeloupe

10
8

10
8

10

8

10
8

10
8

10
8

Địa điểm

( Nguồn FAO, 2009)
2.5.2. Vanillin tổng hợp hóa học
Vanillin chiết xuất từ tự nhiên chỉ đáp ứng được 1 % nhu cầu thị trường do
đó các nhà hóa học đã tìm cách tổng hợp vanillin từ những nguồn nguyên liệu khác
để thay thế. Vanillin tổng hợp hóa học với mục đích tạo được hợp chất mong muốn,
chi phí thấp và có thể điều khiển quá trình tổng hợp theo yêu cầu của con người, sản
phẩm của quá trình này chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp nước hoa, mĩ
phẩm và dược phẩm.
Theo (Taber, Patel et al. 2007) có thể tổng hợp vanillin với lượng nhỏ từ 4hydroxybenzaldehyde theo sơ đồ chuyển hóa sau:


15

Vanillin đầu tiên được phân lập như một chất tinh khiết vào năm 1858 bởi
nhà khoa học người Anh Theodore Gobley.
Năm 1874, hai nhà hóa học Đức Ferdinand Tiemann và Wilheim Haarmann
đã tìm ra cấu trúc hóa học của vanillin và tổng hợp được vanillin từ coniferin, một

glucoside của isoeugenol lấy từ vỏ thông (Li and Frost 1998). Sản lượng vanillin
thu được khoảng 350g/kg nhựa thông, quá trình này rất tốn kém, sản phẩm vanillin
thu được bị lẫn tạp nhiều. Do đó, ngày nay phương pháp này không được áp dụng
để sản xuất vanillin thương mại.
Năm 1878, Karl Reimer nghiên cứu tổng hợp vanillin từ guaiacol. Trong đó
guaiacol phản ứng với axit glyoxylic bằng cách thay thế ái lực điện tử của vòng thơm
tạo acid vanillyl sau đó được chuyển đổi 4-hydroxy-3-methoxyphenylglyoxylic axit
để tạo vanillin bởi phản ứng oxy hóa khử carboxyl.

Từ cuối thế kỷ 19, vanillin bán tổng hợp từ eugenol đã được bán trên thị
trường. Phương pháp này sử dụng thành phần chính là eugenol được tinh chết từ
dầu đinh hương (Hocking 1997).


16

Vanillin tổng hợp hóa học có nhiều công dụng trong công nghiệp thực phẩm để
tạo thêm hương vị, công nghiệp mỹ phẩm (nước hoa, kem dưỡng da, che mùi vị khó
chịu trong dược phẩm, đồng thời làm chất trung gian trong việc tổng hợp nhiều hóa
chất khác (khoảng 13 % tổng sản lượng vanillin được sử dụng làm nguyên liệu để tạo
những hóa chất khác). Ngoài ra vanillin còn dùng làm “phẩm màu” trên các tấm mỏng
dùng trong phương pháp sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography= TLC).
2.5.3. Vanillin tổng hợp sinh học
2.5.3.1. Phương pháp sử dụng enzyme
Phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học sử dụng các enzyme có chứa βglucosidase xúc tác quá trình thủy phân của vanillin từ glucovanillin và axit
glucovanillic được xem như một quá trình thay thế cho quá trình tách chiết thông
thường (Dignum, Kerler et al. 2002); (Ruiz-Teran, Perez-Amador et al. 2001).
Enzyme cũng có thể được sử dụng để tạo vanillin từ các nguyên liệu thực vật có
nguồn gốc khác thông qua biến đổi sinh học. Ví dụ, (KAMODA, HABU et al.
1989) đã nghiên cứu việc sử dụng các lignostilbene –α, β –dioxygenase phân lập từ

Pseudomonas sp. TMY1009 xúc tác giải phóng oxy hóa của vanillin từ stilbenes,
chất thường thấy trong vỏ cây gỗ. Enzyme lipoxygenase của đậu tương cũng được
sử dụng để sản xuất vanillin từ các este của rượu conifer. Nghiên cứu của (van den
Heuvel, Fraaije et al. 2001) đã sử dụng penicillium flavoenzyme, vanillyl alcohol
oxidase để chuyển đổi sinh học vanillylaminen (có thể đạt được bởi quá trình thủy
phân của capsaicin) và creosol (một thành phần lớn của creosote thu được từ gỗ
hoặc sưởi ấm nhựa than đá) để hình thành vanilin. Như vậy, mặc dù vanillin tạo ra
có số lượng thấp nhưng cách tiếp cận sản xuất vanillin sử dụng enzyme có thể chấp
nhận được (Walton, Mayer et al. 2003).