Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng bacillus subtilis trong điều kiện in vitro nhằm tạo chế phẩm ứng dụng trong chăn nuôi

ĐạI HọC THáI NGUYÊN
TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM
------------------------

nguyễn thị nõn

Tên đề tài:
T

Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng

Bacillus subtilis trong điều kiện in vitro nhằm tạo
chế phẩm ứng dụng trong chăn nuôi

khóa luận TốT NGHIệP đại học

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2010 - 2014

Thái Nguyên, 2014

ĐạI HọC THáI NGUYÊN
TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM
------------------------

nguyễn thị nõn

Tên đề tài:
T

Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng

Bacillus subtilis trong điều kiện in vitro nhằm tạo
chế phẩm ứng dụng trong chăn nuôi

khóa luận TốT NGHIệP đại học
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Lớp

: 42 - CNSH

Khoá học

: 2010 - 2014

Giảng viên hớng dẫn : 1. GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên
Viện Khoa học Sự sống - Trờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
2. TS. Nguyễn Văn Duy
Khoa CNSH - CNTP, Trờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2014


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận, tôi nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ
của mọi người.
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu trường
Đại học Nông Lâm, cùng toàn thể các thầy cô giáo Viện Khoa học Sự sống cũng
như các thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm đã tận
tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Quang Tuyên,
chị Đỗ Bích Duệ, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện khoa học Sự sống và thầy
Nguyễn Văn Duy, giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực
phẩm, trường Đại học Nông Lâm đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng
dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên lớp 42 CNSH, cùng toàn
thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi.
Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè,
những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh

thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời
gian học tập và thực hiện khóa luận vừa qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 10 tháng 6 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thị Nõn


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 21
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu............................................ 21
Bảng 3.3: Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 22
Bảng 3.4: Thành phần môi trường MPA dạng thạch ...................................... 22
Bảng 3.5: Thành phần môi trường MPA dịch thể........................................... 22
Bảng 4.1: Kết quả xác định khả năng chống chịu của các chủng Bacillus
subtilis trong môi trường pH axít thấp và pH kiềm ........................................ 27
Bảng 4.2: Kết quả xác định khả năng chống chịu của các chủng Bacillus
subtilis trong môi trường muối mật ................................................................ 30
Bảng 4.3: Khả năng chống chịu axit dạ dày và muối mật của các chủng
Bacillus subtilis trong môi trường dịch dạ dày mô phỏng .............................. 32
Bảng 4.4. Khả năng chống chịu muối của chủng Bacillus subtilis ................. 33
Bảng 4.5: Khả năng ức chế các chủng vi khuẩn kiểm định của bốn chủng vi
khuẩn Bacillus subtilis .................................................................................... 35
Bảng 4.6: Kết quả xác định tính đối kháng giữa 4 chủng ............................... 37
Bảng 4.7: Khả năng kháng chất kháng sinh của vi khuẩn .............................. 38


DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 2.1: Hình thái Bacillus subtilis ............................................................... 12
Hình 4.1: Khả năng chống chịu của các chủng Bacillus subtilis trong môi
trường pH axit và pH kiềm (CFU/ml)............................................................. 28
Hình 4.2: Khả năng chống chịu của các chủng Bacillus subtilis trong môi
trường muối mật (CFU/ml) ............................................................................. 30
Hình 4.3: Khả năng chống chịu axit dạ dày và muối mật của các chủng
Bacillus subtilis trong môi trường dịch dạ dày mô phỏng .............................. 32
Hình 4.4: Khả năng ức chế các chủng vi khuẩn kiểm định ............................ 36
Hình 4.5: Khả năng đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis........................... 37
Hình 4.6 : Khả năng kháng kháng sinh của chủng MBS2 .............................. 38


DANH MỤC VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
Từ và
thuật ngữ
viết tắt

Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

FAO

Food and Agriculture Organization – Tổ chức
Lương thực và Nông nghiệp

SCAN

Scientific committee for anilmal nutrition – Ủy
ban khoa học về dinh dưỡng động vật

MPA

Malt-Peptone-Agar

WHO

World Health Organization – Tổ chức y tế Thế
giới

VSV

Vi sinh vật

CFU

Colony form unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc

KL

Khuẩn lạc

SKK

Sinh khối khô

cs

Cộng sự

MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................... 2
1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung về probiotic .................................................................... 3
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu probiotic .................................................................. 3
2.1.2. Định nghĩa Probiotic ............................................................................... 4
2.1.3. Vai trò của Probiotic ............................................................................... 4
2.1.4. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật tới sức khỏe vật nuôi... 5
2.2. Cơ chế tác động của Probiotic ................................................................... 7
2.2.1. Probiotic sản sinh các chất ức chế .......................................................... 8
2.2.2. Cạnh tranh hóa chất/năng lượng với những vi khuẩn khác .................... 8
2.2.3. Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại ...................................... 8
2.2.4. Tăng cường đáp ứng miễn dịch............................................................... 9
2.2.5. Một số tác động khác .............................................................................. 9
2.3. Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotic ..................................................... 9
2.4. Các vi sinh vật probiotic .......................................................................... 10
2.5. Tính an toàn của probiotic trên động vật ................................................. 11
2.6. Vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................................ 12
2.6.1. Đặc điểm chủng Bacillus subtilis .......................................................... 12
2.6.2. Một số đặc tính probiotic của Bacillus subtilis ..................................... 16


2.7. Tình hình nghiên cứu đặc tính probiotic của Bacillus subtilis trên thế giới
và ở Việt Nam ................................................................................................. 17

2.7.1. Trên thế giới .......................................................................................... 17
2.7.2. Ở Việt Nam ........................................................................................... 18
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
3.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 21
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành ............................................................... 21
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng ..................................................................... 21
3.3.1. Hóa chất................................................................................................. 21
3.3.2. Các thiết bị nghiên cứu ......................................................................... 21
3.3.3. Các dụng cụ nghiên cứu ........................................................................ 22
3.4. Môi trường sử dụng .................................................................................. 22
3.5. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 23
3.5.1. Nghiên cứu khả năng tồn tại và phát triển của Bacillus subtilis trong
môi trường có pH axít thấp và pH kiềm ......................................................... 23
3.5.2. Khả năng tồn tại và phát triển của Bacillus subtilis trong môi trường có
muối mật .......................................................................................................... 23
3.5.3. Thử nghiệm khả năng chống chịu axit dạ dày và muối mật của Bacillus
subtilis trong môi trường dịch dạ dày mô phỏng ............................................ 23
3.5.4. Ảnh hưởng của NaCl đến sinh trưởng của Bacillus subtilis ................. 23
3.5.5. Nghiên cứu khả năng Bacillus subtilis ức chế các chủng vi sinh vật
kiểm định ......................................................................................................... 23
3.5.6. Kiểm tra tính đối kháng giữa các chủng Bacillus subtilis .................... 23
3.5.7. Khả năng kháng các loại kháng sinh của các chủng Bacillus subtilis .. 23
3.6. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 23
3.6.1. Phương pháp hoạt hóa giống................................................................. 23
3.6.2. Phương pháp đếm số lượng tế bào vi khuẩn [9] ................................... 23


3.6.3. Các phương pháp lựa chọn chủng Bacillus subtilis có hoạt tính
probiotic .......................................................................................................... 24
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 27

4.1. Kết quả xác định khả năng chống chịu của các chủng Bacillus subtilis
trong môi trường pH axít thấp và pH kiềm ..................................................... 27
4.2. Kết quả xác định khả năng chống chịu muối mật của các chủng Bacillus
subtilis ............................................................................................................. 29
4.3. Kết quả xác định khả năng chống chịu axit dạ dày và muối mật trong môi
trường dịch dạ dày mô phỏng của các chủng Bacillus subtilis ....................... 32
4.4. Ảnh hưởng của NaCl đến phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis ........ 33
4.5. Đánh giá khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định của vi khuẩn Bacillus
subtilis ............................................................................................................. 34
4.6. Kết quả xác định tính kháng giữa các chủng Bacillus subtilis ................ 36
4.7. Kết quả xác định khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Bacillus
subtilis. ............................................................................................................ 38
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................... 40
5.1. Kết luận .................................................................................................... 40
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 41


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Probiotic là thức ăn bổ sung vi khuẩn sống có lợi mà ảnh hưởng đến
động vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột của mình
[28]. Yêu cầu của probiotic là các vi sinh vật sống, khi đưa vào đường tiêu
hóa chúng phải còn sống và có khả năng sinh trưởng, phát triển trong đường
tiêu hóa. Một loại vi sinh vật có lợi, sẽ được coi là “ứng cử viên” cho việc chế
tạo các chế phẩm probiotic khi chúng đáp ứng được một trong các tiêu chí cơ
bản đó là (i) khả năng sống sót trong môi trường dịch dạ dày; (ii) Có khả năng
chống chịu với muối mật trong ruột non; (iii) Có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe

vật nuôi [40].
Các vi khuẩn probiotic đã được chứng minh có thể tạo ra nhiều lợi ích
cho con người và vật nuôi như tăng cường khả năng đề kháng với bệnh nhiễm
trùng, ngăn ngừa các bệnh đường ruột, chống nhiễm trùng đường tiết liệu và
sinh dục, giảm nguy cơ ung thư ruột và tăng khả năng đề kháng với các hóa
liệu pháp chống ung thư, và ngăn chặn việc sinh trưởng của hệ vi sinh vật có
hại hay điều chỉnh trạng thái miễn dịch ở mô niêm mạc khoang miệng. Chiếm
thành phần đông đảo nhất trong số các probiotics là các vi khuẩn thuộc chi
Bifidobacterium và Lactobacillus . Ngoài ra, các đại diện của chi Bacillus hay
các chủng Escherichia coli cũng được sử dụng làm probiotics [30]. Các loài
Bacillus đã được sử dụng như probiotics cách đây ít nhất 55 năm vì chế phẩm
Enterogermina® đã được đăng ký từ năm 1958 ở Italia. Trong số vi khuẩn chi
Bacillus từng được sử dụng làm probiotics, các loài đã được nghiên cứu sâu
rộng nhất là Bacillus subtilis,Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus
coagulans và Bacillus licheniformis [32].
Hiện nay, trên thị trường nước ta có một số sản phẩm probiotic sử dụng
trong chăn nuôi, tuy nhiên giá thành còn cao. Hơn nữa các nhà khoa học cho
rằng tác dụng của probiotic đối với vật nuôi còn phụ thuộc vào hệ vi sinh vật
của vật nuôi bản địa. Do đó, việc nghiên cứu tạo chế phẩm probiotic từ vi sinh
vật bản địa sẽ có tác dụng giảm giá thành sản phẩm, tăng hiệu quả đối với vật
nuôi ở nước ta.


2
Xuất phát từ thực tiễn, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu một
số đặc tính của các chủng Bacillus subtilis trong điều kiện in vitro nhằm
tạo chế phẩm ứng dụng trong chăn nuôi”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát được sự tồn tại và phát triển của các chủng Bacillus subtilis
trong các điều kiện bất lợi in vitro. Trên cơ sở đó chọn lựa ra các chủng mang

đặc tính probiotic để tạo chế phẩm sau này.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Bổ sung thêm các chủng Bacillus subtilis vào danh sách các vi sinh vật
dùng tạo chế phẩm ứng dụng trong chăn nuôi. Đồng thời là nguồn tài liệu cho
các nghiên cứu tiếp theo.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Là cơ sở để phục vụ chế tạo probiotic bổ sung vào thức ăn chăn nuôi.


3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về Probiotic
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu probiotic
Việc sử dụng probiotic đã được biết đến từ lâu, nhưng việc nghiên cứu
hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotic mới thực sự phát triển từ
những năm 80 của thể kỷ 20. Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã
quan sát và thấy rằng phân của những trẻ em mắc bệnh tiêu chảy có những vi
khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh [4].
Sau đó, năm 1907, Elie Metchnikoff – người Nga, đạt giải Nobel – đã
chứng minh rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ
vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những
người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thì có thể lên tới 115
tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên
men, điều này được ông báo cáo trong sách “kéo dài cuộc sống”[4].
Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề
xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp
theo về probiotic [28].
Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota đã phân lập được

các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [29]. Cùng năm
đó, các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillusacidophilus có
khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên. Nhiều nhà khoa học đại học
Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định
trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và
các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được.
Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa
được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái
niệm chung probiotic được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản
phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những
năm của thập niên 80 [29].


4
2.1.2. Định nghĩa Probiotic
“ Probiotic – chất trợ sinh – là các vi sinh vật sống khi đưa vào ruột với
một lượng thích hợp sẽ có lợi cho sức khỏe” (FAO/WHO, 2002) [27]. Trái với
Antibiotics, “Probiotic” là các chất do vi khuẩn tiết ra có tác dụng kích thích sự
phát triển các vi khuẩn khác (Kollath, 1953, là người đầu tiên đưa ra từ này).
Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là vì sự sống. Thuật ngữ
probiotic được Parker định nghĩa lần đầu tiên vào năm 1974 chỉ “những sinh
vật và các chất giúp cân bằng hệ sinh vật đường ruột”. Nhưng 1989, Fuller đã
định nghĩa lại Probiotic: “là những vi sinh vật sống khi bổ sung vào thức ăn
chúng có tác động tốt đến sức khoẻ của động vật chủ bằng cách tạo cân bằng
hệ sinh vật đường ruột”. Nhóm làm việc tại Châu Âu thuộc Viện Khoa học
quốc tế năm 1998 đã định nghĩa: probiotic là vi sinh vật sống bổ sung vào
thức ăn tác động có lợi đến vật chủ” [38]. Theo Gram và cs (1999) đề nghị
probiotic là chất bổ sung vi khuẩn sống, tác dụng có lợi đối với động vật chủ
bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn của nó, định nghĩa này không gắn
liền với thức ăn [31]. Chúng chịu được ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ muối

khác nhau. Ngày nay, probiotic đã được sử dụng trong thức ăn nhân tạo, thức
ăn tươi sống và sử dụng trong môi trường nước.
2.1.3. Vai trò của Probiotic
Cho đến nay, vẫn còn có ít tài liệu chứng minh được việc bổ sung
probiotic có thể thay thế hoàn toàn quần thể VSV tự nhiên trong đường ruột.
Tuy nhiên, người ta hy vọng rằng probiotic có thể hình thành những tập đoàn
vi khuẩn có lợi, có thể hỗ trợ cho cơ thể động vật mà vẫn duy trì được những
chức năng như những VSV đường ruột tự nhiên (trong trường hợp tập đoàn
VSV tự nhiên này bị suy yếu và phải sau một thời gian mới hồi phục được). Từ
đó, probiotic được xem như là yếu tố điều hoà cho hệ sinh thái nội quan [1].
Một vài tác dụng có lợi của probiotic được liệt kê dưới đây [1]:
- Làm giảm cholesterol: nhiều chủng lactic làm giảm cholesterol huyết
thanh ở động vật bằng cách phân ly mật trong ruột, nhờ đó ức chế quá trình
tái hấp thu mật (mật vào trong máu có vai trò như cholesterol).


5
- Đề phòng được ung thư kết tràng: một số chủng vi khuẩn lactic có tác
dụng kháng chất gây đột biến, có khả năng đính vào các amin khác vòng và
các chất gây ung thư, thấy rõ ở loài gặm nhấm. Đối với người, có những
chủng có tác dụng kháng ung thư do giảm hoạt tính enzyme β - glucuronidase
(enzyme xúc tác hình thành chất gây ung thư đường ruột).
- Điều hoà trường hợp không dung nạp lactose: có những cá thể không
dung nạp được lactose, nhưng nhờ chủng vi khuẩn tích cực có trong probiotic
giúp cơ thể chịu đựng được lactose tốt hơn.
- Giảm viêm: probiotic có các vi khuẩn lactic điều hoà được quá trình
viêm và những đáp ứng quá mẫn nhờ điều hoà chức năng cytokin, ngăn ngừa
tái phát viêm ruột.
- Cải thiện hấp thu khoáng: vi khuẩn lactic trong probiotic có thể vô
hiệu hoá chứng suy hấp thu các khoáng vi lượng.

- Cải thiện chức phận miễn dịch và phòng ngừa nhiễm trùng: các vi
khuẩn lactic có thể ngăn ngừa những mầm bệnh bằng sự ức chế cạnh tranh
(cạnh tranh sinh trưởng).
- Vi khuẩn trong probiotic có tác dụng ngăn ngừa sự phát triển vi khuẩn
gây bệnh viêm ruột (đặc biệt đối với bệnh viêm ruột hoại tử ở gà).
- Làm tăng năng suất vật nuôi [4].
- Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải [4].
2.1.4. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật tới sức khỏe
vật nuôi
Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai
trò quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể. Do đó, nó là hệ
thống bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm
nhiễm. Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các
phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh.
Khu hệ vi sinh vật đường ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại
các tác nhân gây bệnh.
Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hóa của vật nuôi ở trạng thái vô
trùng, nhưng chỉ vài giờ sau khi vật nuôi được sinh ra các vi sinh vật đã bắt


6
đầu cư trú và trở thành những “cư dân” bình thường trong đường tiêu hóa
[26]. Theo thời gian, do tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức
ăn và nước uống, số lượng và tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng
sinh không ngừng tăng lên. Số lượng tế bào vi sinh vật cư trú trong đường
tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mười lần số lượng tế bào cấu tạo nên cơ
thể chúng. Số lượng loài có thể lên tới từ 400-500. Tuy nhiên, mật độ vi sinh
vật ở các phân đoạn khác nhau của đường tiêu hóa (dạ dày, tá tràng, ruột non
và ruột già) ở loài động vật dạ dày đơn rất khác nhau (khoảng 101-103, 101104, 105-108 và 109-1012 CFU/ml chất chứa tương ứng) [4].
Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: trạng thái sinh lý

của vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật. Các yếu tố này chịu tác động
của môi trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau. Trong số các nhân
tố trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động
bất lợi cả một trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật. Sự
cộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hóa của vật nuôi (chủ yếu là
trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật
được xác lập chỉ sau một thời gian rất ngắn sau khi sinh [4].
Có nhiều ý kiến khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi sinh
vật ruột. Theo Jans (2005) để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh vật
ruột được chia thành 3 nhóm: (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài vi
khuẩn kị khí (Clostridium, Lactobacillus, Bifidobacteria, Bacteroides,
Eubacteria), (2) nhóm vệ tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus
và E. coli và (3) nhóm còn lại (Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như
Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas…[36], Một quần thể vi sinh vật
được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các nhóm trên dao động trong khoảng
tương ứng là 90; 1,0 và 0,01%. Trạng thái mà các nhóm này hình thành một
tỷ lệ 90:1:0,01 được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy Lạp có nghĩa là sự
chung sống có lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật chủ). Ở trạng thái
“eubiosis”, vật chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ổn
định, pH trung tính, dinh dưỡng và sự đào thải khi các chất chuyển hóa. Đổi
lại, hệ vi sinh vật sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu
hóa các chất dinh dưỡng, giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin


7
K, loại trừ các vi sinh vật có hại, tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ.
Sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa bị tác động bởi một số
nhân tố vô sinh và hữu sinh như: sinh lý vật chủ, khẩu phần ăn và cơ cấu nội
tại của bản thân hệ vi sinh vật. Thức ăn là nền dinh dưỡng cơ bản của vi sinh
vật, bởi vậy sự thay đổi thành phần khẩu phần, thức ăn không đảm bảo vệ

sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý… đều làm tổn hại đến trạng thái cân
bằng hệ vi sinh vật ruột. Tương tự như vậy, các chất bài tiết của hệ tiêu hóa
(dịch mật, các enzyme, chất đệm và chất nhầy…) cũng như kiểu và tần số của
đường ruột cũng tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật. Kiểu và tần số của
đường ruột bị tác động rất lớn bởi các stress (sinh đẻ, cai sữa, dồn chuồng,
vận chuyển…). Khi quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ tạo
nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái “chung sống có hại”). Biểu hiện của
trạng thái “dysbiosis” ở vật chủ thường là thể trạng kém, sinh trưởng chậm và
mắc các bệnh đường tiêu hóa như tiêu chảy, viêm ruột hoại tử. Để cải thiện
quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột ở vật nuôi, một phương pháp thường
được áp dụng là bổ sung vào khẩu phần thức ăn một số loại kháng sinh liều
thấp như những chất kích thích sinh trưởng.
Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn một cách không có
kiểm soát đã và đang gây ra những hậu quả đáng lo ngại về vệ sinh an toàn
thực phẩm và đặc biệt là gây nên tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng
của các vi khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi. Chính vì vậy, từ năm 2006
các nước thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn
chăn nuôi. Việc cấm sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi cũng đặt ra
những thách thức lớn về kỹ thuật, đặc biệt đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm
non hoặc trong điều kiện vệ sinh kém và vật nuôi chịu nhiều stress. Để vượt
qua những thử thách thức đó, đã có rất nhiều những nghiên cứu nhằm tìm ra
tác nhân vừa để thay thế kháng sinh, vừa an toàn với vật nuôi. Một trong
những tác nhân tìm ra đó là probiotic.
2.2. Cơ chế tác động của Probiotic
Đã có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic, song
vẫn còn có nhiều ý kiến khác nhau. Sau đây là tóm tắt những kiểu tác động
của probiotic được nhiều nhà khoa học chấp nhận [15].


8

2.2.1. Probiotic sản sinh các chất ức chế
Sự có mặt của các vi khuẩn sản sinh các chất ức chế trong ruột của vật
chủ, trên bề mặt hoặc trong môi trường nuôi đã tạo ra một rào ngăn chặn sự
sinh sôi của các tác nhân gây bệnh cơ hội. Các chất diệt khuẩn hay ức chế
hoạt động của vi khuẩn gây bệnh do vi khuẩn probiotic sinh ra có thể tác động
đơn độc hoặc phối hợp với nhau bao gồm: các chất kháng sinh, bacteriocin,
siderophores, lysozyme, protease, hydro peroxit và các axít hữu cơ (làm biến
đổi giá trị pH). Ngoài ra gần đây, amoni và diaxetyl cũng được đưa thêm vào
danh sách này. Các vi khuẩn biển sản sinh enzyme phân giải vi khuẩn chống
lại Vibrio parahaemolyticus, Alteromonas sp, dòng B – 10 -31, phân lập từ
nước biển gần bờ biển của Nhật Bản sản sinh monastatin có tác dụng ức chế
hoạt tính protease của Aermonas hydrophila và V. anguillarum [15].
2.2.2. Cạnh tranh hóa chất/năng lượng với những vi khuẩn khác
Tất cả các vi khuẩn đều cần Fe để tăng trưởng. Siderophore là chất có
khối lượng phân tử thấp (nhỏ hơn 1500), có khả năng gắn với các ion sắt.
Siderophore có thể hòa tan sắt kết tủa thành dạng dễ sử dụng cho vi sinh vật,
do đó nó là một công cụ thu lượm sắt rất quan trọng đối với các vi sinh vật.
Các vi sinh vật vô hại sinh siderophore có thể được sử dụng như probiotic để
cạnh tranh sắt với các vi khuẩn gây hại. Bản thân vi khuẩn có hại bị loại bỏ thì
cũng có nghĩa là loại bỏ được đối thủ cạnh tranh các chất dinh dưỡng và năng
lượng dùng cho vi khuẩn probiotic và cho vật chủ. Sử dụng Pseudomonas
fluorescens như probiotic trong nuôi cá hồi nước ngọt và cá hồi đại dương có
tác dụng hạn chế A. salmonicida theo cơ chế này [15].
2.2.3. Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại
Vi khuẩn probiotic có thể ngăn cản sự khu trú của các vi khuẩn gây
bệnh bằng cạnh tranh giành vị trí bám trên thành ruột hay trên bề mặt các mô
khác. Vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột nhờ cơ chế đặc trưng (dựa vào
chất bám dính (adhesion) của vi khuẩn và các phân tử thụ thể của thượng bì
ruột) và cơ chế không đặc trưng dựa vào những yếu tố hóa lý học. Người ta đã
chứng minh được khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt, hoặc bên trong

ruột, hoặc niêm mạc ngoài của chủng Carnobacterium K1 làm cho chủng này


9
cạnh tranh vượt trội và ngăn cản được sự lan rộng của các vi khuẩn gây bệnh
ở cá như V. anguillarum và A. hydrophila [15].
2.2.4. Tăng cường đáp ứng miễn dịch
Kháng nguyên của probiotic kích thích tế bào niêm mạc ruột sản sinh
kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh. Chất ức chế của probiotic tiếp tục
nâng cao hiệu quả kháng thể của vật chủ. Trong thực nghiệm, người ta thấy
động vật thí nghiệm được bổ sung vi khuẩn lactic đã tăng khả năng chống lại
bệnh truyền nhiễm đường ruột khá rõ rệt. Tôm không có khả năng tạo kháng
thể vì không có đáp ứng miễn dịch thể dịch. Probiotic có tác dụng tăng cường
đáp ứng miễn dịch tự nhiên [15].
2.2.5. Một số tác động khác
- Tác động chống ung thư: probiotic giúp gắn kết và phân hủy các chất
gây ung thư, sản xuất ra những hợp chất kháng ung thư, điều hòa những
enzyme tiền chất gây ung thư.
- Tác động chống dị ứng: Nhiều bằng chứng cho thấy các vi sinh vật
probiotic kích thích tổng hợp IgA đặc hiệu ở niêm mạc ruột. Probiotic tăng
cường chức năng của hàng rào vi sinh vật đường ruột thông qua việc phục hồi
khu hệ vi sinh vật thông thường. Probiotic cũng có tác dụng biến đổi các yếu
tố tăng trưởng beta và sự sản sinh Interleukin 10 cũng như các cytikin kích
thích sản xuất kháng thể IgE.
- Làm tăng dung nạp của cơ thể với lactose, giúp tránh khỏi tình trạng
đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose
- Cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể như axit folic, niacin,
riboflavin, vitamin B6 và B12
- Làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm giảm huyết áp cao.
2.3. Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotic

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn
cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh trong
đường tiêu hóa vật chủ. Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp lý hóa thông
qua các thí nghiệm in vitro, thông qua đó người ta sẽ tuyển chọn được các
chủng có tiềm năng như là nguồn probiotic [26].


10
Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ
yếu sau:
- Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn
được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan
trọng nhất trong phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức
chế vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Salmonella và Campylobacteria. Hoạt
tính kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:
+ Sản sinh ra các chất Bacteriocin.
+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axít lactic.
+ Tạo ra H2O2.
+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau.
+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.
+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh.
- Khả năng tồn tại trong môi trường axít dạ dày: Khoang miệng và dạ
dày của vật chủ là nơi có môi trường axít pH từ 2 - 3 và có mặt các enzyme
tiêu hóa (amylase, protease, lysozyme…). Các chủng vi sinh vật được coi như
là nguồn probiotic phải tồn tại được trong điều kiện này. Hiện nay, các công
ty đã khuyến cáo dùng vỏ bọc (microcapsule) với chế phẩm probiotic nhằm tăng
khả năng sống của vi khuẩn probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày.
- Khả năng chịu muối mật: thông thường, muối mật trong ruột của động
vật trung bình là 0,3% [33]. Để tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải
có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật trung bình khoảng

0,3%, ngoài ra một số chủng probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus)
có khả năng sinh enzyme tiêu hóa như: amylase, xenlulase và protease, lipase
và phytase có vai trò làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hấp thu chất dinh
dưỡng của vật chủ.
2.4. Các vi sinh vật probiotic
- Vi khuẩn lactic: gồm 2 chi vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và
Bifidobacterium.
+ Các loài thuộc chi Lactobacillus: L. acidophilus, L. amylovorus, L.
brevis, L. Casei, L. rhamnosus (Lactobacillus GG), L. caucasicus, L.


11
crispatus, L. delbrueckii, L. bulgaricus, L. fermentum (L. fermenti), L.
gasseri, L. helveticus, L. johnsonii, L. lactis, L. leichmannii, L. paracasei, L.
plantarum, L. reuteri, L. Rhamnosu [15].
+ Các loài thuộc chi Bifidobacterium: B. adolescentis, B. bifidum, B.
breve, B. infantis, B. lactis (B. animalis), B. licheniformis, B. longum [15].
- Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic
Lactobacillus và Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium,
Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae [15].
2.5. Tính an toàn của probiotic trên động vật
Việc nghiên cứu, phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn
nuôi bắt đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia
súc, gia cầm [18]. Như vậy, các chủng vi sinh vật đã qua nhiều khâu tiếp xúc
với con người, môi trường trước khi vào cơ thể động vật. Điều này cho thấy
yêu cầu an toàn đối với chủng vi sinh vật là vấn đề quan trọng nhất đối với vật
nuôi, con người và môi trường.
Đối với động vật cần có thời gian thử nghiệm từ 1 - 3 tháng, kiểm tra
các chỉ tiêu tăng trọng, phản ứng cơ thể, theo dõi các bệnh tiêu hóa, bệnh
nhiễm khuẩn và các phản ứng phụ. Ngoài ra, cần có những thông số phân tích

sinh hóa về máu và đánh giá chỉ số Coliform trong phân.
Đối với con người, không cần thiết phải thử nghiệm như trên động vật
nhưng cần chú ý các phản ứng phụ như dị ứng với da, mũi, mắt [18]. Với môi
trường cần đảm bảo là vi sinh vật không có hại đối với con người và động vật,
không mang gen lạ. Nói chung các chủng vi sinh vật probiotic có nguồn gốc
tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi) là các chủng được khuyến cáo
sử dụng. Tổ chức FAO (2002) đưa ra hướng dẫn với việc tuyển chọn các
chủng probiotic, ngoài các đặc tính probiotic và đảm bảo an toàn thì các
chủng này phải được cụ thể hóa các thông tin về nguồn gốc chủng, tên phân
loại đến chi và loài [27].
Đối với vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu Âu đã lập một Ủy
ban khoa học về dinh dưỡng động vật (SCAN: scientific committee for
animal nutrition) đưa ra những quy định đánh giá an toàn đối với sản phẩm và


12
những khuyến cáo cho vấn đề này qua các điều luật và kỹ thuật trực tuyến
[41]. Tổ chức FAO (2002) [27] khuyến cáo các chủng probiotic không những
cần được phân loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các
bảo tàng vi sinh vật đạt tiêu chuẩn quốc tế. Quy trình sản xuất phải theo tiêu
chuẩn GMP (Good Manufacturing Practices).
2.6. Vi khuẩn Bacillus subtilis

Hình 2.1: Hình thái Bacillus subtilis
Nguồn: />2.6.1. Đặc điểm chủng Bacillus subtilis
- Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức
y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho
các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm
1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của

Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị
các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá.
Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y
học, chăn nuôi, thực phẩm [6]
Vi khuẩn Bacillus subtilis được phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Phần
lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100
triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi
khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển
cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis [6],


13
- Phân loại khoa học
Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Division): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (order): Bacillales
Họ (familia): Bacillaceae
Chi (genus): Bacillus
- Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, ngắn, hai đầu tròn, bắt màu Gram
(+), kích thước 0,5 - 0,8µm x 1,8 - 3µm, có khả năng sinh bào tử và đứng đơn
lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi
nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt
vào môi trường thạch. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào
tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, không theo
nguyên tắc, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm. Bào tử `phát triển bằng cách nảy mầm
do sự nứt của bào tử, không kháng axit, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia
tử ngoại, tia phóng xạ [2].
Nhiệt độ thích hợp cho Bacillus subtilis sinh trưởng là 30 – 50oC,

thường nuôi cấy ở 37oC. Vi khuẩn Bacillus subtilis có màng nhày (giác mô)
giúp vi khuẩn có khả năng chịu được điều kiện thời tiết khắc nghiệt, vì màng
nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh tổn thương khi khô hạn.
Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm tiêu bản, qua kính hiển vi thấy
màng nhày không màu, trong suốt còn tế bào vi khuẩn bắt màu nâu đỏ trên
nền tiêu bản xanh hoặc đen [2]..
Bacillus subtilis có khả năng sinh một số enzym như amylase, protease
kiềm có giá trị cao, đặc biệt có khả năng sinh tổng hợp riboflavin (tiền
vitamin B2). Vì vậy Bacillus subtilis được ứng dụng khá nhiều trong các
ngành công nghiệp. Loài vi khuẩn đang được sử dụng như chế phẩm sinh học
và bằng chứng cho thấy rằng loài vi khuẩn Bacillus rất quan trọng cho sự phát
triển của một hệ thống bạch huyết đường ruột [34].


14
Một số nghiên cứu cũng đã cho thấy bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis
như cư dân của đường tiêu hóa của cả hai vật có xương sống và không xương
sống bao gồm cả con người [22].
Bacillus subtilis chỉ biết là gây ra bệnh ở những bệnh nhân suy giảm
miễn dịch nặng và ngược lại có thể được sử dụng như một probiotic ở người
khỏe mạnh [39]. Nó hiếm khi gây ra ngộ độc thực phẩm.
- Đặc điểm nuôi cấy
Điều kiện phát triển khi nuôi cấy là môi trường hiếu khí, nhiệt độ nuôi
cấy tối ưu là 37oC. Mặc dù là vi khuẩn hiếu khí nhưng Bacillus subtilis có khả
năng phát triển trong môi trường thiếu oxy, pH thích hợp nhất khi nuôi cấy là
pH = 7,0 - 7,4. Trên môi trường thạch đĩa: khuẩn lạc chủng có dạng hình tròn,
rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, phát triển chậm, màu vàng xám,
đường kính 3 - 5mm. Sau 1 – 4 ngày thì bề mặt nhăn chuyển sang màu hơi
sẫm. Trên môi trường thạch nghiêng, chủng dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa
gợn sóng. Trên môi trường lỏng: chúng phát triển làm đục môi trường, tạo

màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên [6].
- Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis
Cấu tạo bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào
tử có nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của
nước và các chất hoà tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào
tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do
không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong
nhiều năm. Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và
tính chất sinh lý [11].
Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng
tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình
thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều
kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) [2].


15
Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn
tất [25]. Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất
và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô
đặc lại và tạo thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc
dần bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử
trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi
tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra.
Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào
mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử [11].
- Ứng dụng của Bacillus subtilis
Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, Bacillus
subtilis là một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lượng

khá lớn (15-20%) từ tinh bột.
Trong y dược, Bacillus subtilis được đóng thành ống thuốc Subtilis
10ml trị bệnh tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh đường
ruột do lị trực trùng, đắp các vết thương lở loét ngoài da.
Sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh
vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryza.
Người ta thấy rằng sự phát triển của Bacillus subtilis trong cây làm tăng khả
năng tổng hợp các peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ (Rhizobacterium).
Khả năng này được ứng dụng trong kiểm soát sinh học.
Ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung trong
thức ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng, giảm sự tái phát bệnh tiêu
chảy trên gia súc, bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn
chế bệnh cho thủy sản nuôi.
Hệ enzym của Bacillus subtilis được sử dụng nhiều trong sản xuất chất
tẩy rửa. Chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những dạng
hợp chất vô hại của nitrogen, carbon dioxide, và nước.
Một chủng Bacillus subtilis được biết trước đây là Bacillus natto được
dùng trong sản xuất thực phẩm thương mại của Nhật tương tự như thực
phẩm cheonggukjang của Hàn Quốc.


16
Bacillus subtilis tái tổ hợp được sử dụng trong sản xuất
polyhydroxyalkanoates (PHA) và chúng có thể sử dụng malt phế thải như là
nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí sản xuất PHA giảm.
2.6.2. Một số đặc tính probiotic của Bacillus subtilis
2.6.2.1. Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi
khuẩn gây bệnh
Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây
bệnh. Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả năng

chịu đựng được acid dạ dày, các chất dịch tiêu hoá trong đường ruột. Chúng còn
có khả năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột.
Với các vi sinh vật gây bệnh, môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện
diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh
dưỡng, cạnh trạnh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát
triển nhanh hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong
môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của nấm
bị ức chế [3].
2.6.2.2. Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa
Trong các điều kiện in vitro, nhiều chủng Bacillus subtilis đã được
tuyển chọn với khả năng tồn tại ở trong điều kiện bất lợi của đường ruột động
vật thủy sản như môi trường axít HCl ở dạ dày, môi trường kiềm của ruột,
lyzozym, dịch tụy, dịch mật [13].
Khả năng tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa
giúp cho các vi sinh vật probiotic có thể cạnh tranh được vị trí bám dính và
các nguồn dinh dưỡng, năng lượng với các vi khuẩn gây hại [5]
2.6.2.3. Khả năng chịu mặn
Khả năng chịu mặn của Bacillus subtilis có vai trò quan trọng vì đây là
yếu tố đầu tiên quyết định sự tồn tại của probiotic trong môi trường nước
biển. Khả năng chịu mặn là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này làm chế
phẩm cho nuôi trồng thủy sản ở các vùng khác nhau.