tiểu luận dịch công nghệ chỉnh sửa gen và liệu pháp gen

CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA GEN VÀ LIỆU PHÁP TẾ BÀO
Morgan L Maeder 1 và Charles A Gersbach 2,3,4
1

Editas Y, Cambridge, Massachusetts, USA
2
Department of Biomedical Engineering, Đại học Duke, Durham, Bắc Carolina, Hoa Kỳ
3
Center cho Gen và Sinh Học Máy Tính, Đại học Duke, Durham, Bắc Carolina, Hoa Kỳ
4
Department phẫu thuật chỉnh hình, Trung tâm Y tế Đại học Duke, Durham, Bắc Carolina, Hoa
Kỳ
Correspondence: Morgan L Maeder, Editas Y, 300 Third Street, Tầng, Cambridge, Massachusetts
02142, USA. E-mail: ; Charles A Gersbach, Cục Kỹ thuật y sinh,
Phòng 1427, FCIEMAS, 101 Khoa học Drive, Box 90.281, Đại học Duke, Durham, Bắc Carolina
27.708-0.281, Hoa Kỳ. E-mail:
Nhận ngày 06 Tháng 11 2015; Được chấp nhận ngày 07 tháng một năm 2016
bài viết xem trước được chấp nhận trực tuyến 12 Tháng một 2016; Tạm trực tuyến công
bố ngày 16 tháng 2 năm 2016

Liệu pháp gen trong lịch sử đã được định nghĩa là việc bổ sung các gen mới cho các
tế bào của con người. Tuy nhiên, sự ra đời gần đây của công nghệ tái tạo gen đã cho phép
một mô hình mới trong đó trình tự bộ gen của con người có thể được thao tác chính xác để
đạt được một hiệu quả điều trị. Điều này bao gồm việc sửa đột biến gây bệnh, việc bổ sung
các gen trị liệu vào trong trình tự bộ gen, và việc loại bỏ các gen bất lợi trong trình tự bộ
gen. Báo cáo này trình bày cơ chế của phương pháp chỉnh sửa bộ gen khác nhau và mô tả
các nền tảng nuclease phổ biến, bao gồm nucleases kẽm ngón tay, phiên mã kích hoạt
giống như nucleases effector (Talens), meganucleases, và CRISPR / hệ thống Cas9. Sau đó
chúng tôi tóm tắt những tiến bộ đạt được trong việc áp dụng chỉnh sửa gen tới các khu vực
khác nhau của gen và liệu pháp tế bào, bao gồm cả chiến lược kháng virus, miễn dịch, và
điều trị các rối loạn di truyền monogenic. Những thách thức hiện tại và triển vọng tương lai

của chỉnh sửa gen và liệu pháp tế bào cũng được thảo luận.
Việc thực hiện các cơ sở di truyền của bệnh di truyền dẫn đến khái niệm ban đầu
của liệu pháp gen trong đó "ngoại sinh DNA 'tốt' được sử dụng để thay thế các DNA bị lỗi
ở những người bị khuyết tật về gen" [1]. Hơn 40 năm nghiên cứu về chỉnh sửa gen và liệu
pháp gen đã cho thấy những ý tưởng đơn giản về thay thế gen có nhiều thách thức và phức


tạp về mặt kỹ thuật hơn để thực hiện cả hai một cách an toàn và hiệu quả hơn so với đánh
giá ban đầu. Nhiều nhà nghiên cứu các thách thức đó tập trung vào những hạn chế cơ bản
trong khả năng kiểm soát chính xác vật liệu di truyền đã được giới thiệu đến các tế bào.
Tuy nhiên, các công nghệ bổ sung của gen ngoại sinh đã đạt được tiến bộ đáng kể trong
thời gian này và bây giờ đang cho các kết quả lâm sàng đầy hứa hẹn trên một loạt các chiến
lược và chỉ dẫn y tế [2]. Tuy nhiên, một số thách thức vẫn còn. Lồng ghép các gen điều trị
vào bộ gen để duy trì ổn định trong các tế bào tái tạo có thể có tác động khó lường về biểu
hiện gen và tác dụng ngoài ý muốn trên các gen bên cạnh [3]. Hơn nữa, một số gen tác
động quá lớn nên khó sử dụng các vector chuyển gen. Cuối cùng, việc bổ sung các gen
ngoại sinh có thể không luôn luôn trực tiếp giải quyết các đột biến chiếm ưu thế hoặc loại
bỏ các vật liệu di truyền không mong muốn như bộ gen của virus hoặc các thụ thể. Để giải
quyết những hạn chế cơ bản của phương pháp thông thường để bổ sung gen, các lĩnh vực
chỉnh sửa gen đã nổi lên để làm cho chính xác, thay đổi nhắm mục tiêu vào chuỗi hệ gen.
Ở đây chúng ta xem xét sự phát triển thú vị gần đây về việc dễ sử dụng, đặc hiệu, công
nghệ chỉnh sửa gen và ứng dụng để điều trị một loạt các bệnh và rối loạn.
CƠ CHẾ CHỈNH SỬA GEN
Nền tảng cho lĩnh vực chỉnh sửa gen là những khám phá mục tiêu phá vỡ sợi đôi
DNA (DSBs) có thể được sử dụng để kích thích bộ máy điều khiển sửa chữa tế bào nội
sinh. Phá vỡ trong ADN thường được sửa chữa thông qua 2 con đường : sửa chữa tương
đồng (HDR) hoặc kết thúc con đường không tương đồng (NHEJ) (Hình 1). HDR dựa trên 1
mạch tương đồng bị hỏng và tiếp theo phá vỡ sự phụ thuộc của mạch đó [5]. Báo cáo từ
phòng thí nghiệm của Maria Jasin chứng minh rằng hiệu quả của mục tiêu thông qua tái tổ
hợp tương đồng ở tế bào động vật có vú thì gen có thể được kích thích bởi một số tác động

cùng cường độ bằng cách giới thiệu một DSB tại nơi diễn ra mục tiêu [6,8]. Ngoài ra, chức
năng NHEJ để sửa chữa DSBs mà không có một mẫu trực tiếp của đoạn kết thúc [9]. Con
đường sửa chữa này là dễ bị lỗi và thường kết quả trong việc đặt hoặc xóa (indels) tại nơi
diễn ra phá vỡ. Sự kích thích của NHEJ bởi DSBs chương trình cụ thể đã được sử dụng để
phá vỡ các gen mục tiêu trong một loạt các loại tế bào và các sinh vật bằng cách tận dụng
những indels chuyển khung đọc của gen[10,11,12,13,14]. Với khả năng điều khiển sửa
chữa DNA nội sinh của tế bào, nó bây giờ có thể thiết kế một loạt các thay đổi gen trong
trình tự bộ gen một cách cụ thể.


No donor template

Donor template with point mutation

STOP

*
*

STOP

Donor template with insertion

NHEJ between the two cut sites
produces specific, large deletions

STOP

STOP

NHEJ produces variable length
insertions and deletions (indels). These
often result in frameshifts generating
premature stop codons

*
*
*
*

GENE LOẠI TRỰC TIẾP/ ĐỘT BIẾN
Đây là hình thức đơn giản nhất của chỉnh sửa gen sử dụng các chất dễ bị lỗi của
NHEJ để giới thiệu indels nhỏ tại các nơi diễn ra mục tiêu. Cổ điển NHEJ trực tiếp
religates chưa qua chế biến DNA đầu trong khi thay thế - NHEJ (còn được gọi là
microhomology qua trung gian kết thúc tham gia, hoặc MMEJ) yêu cầu cuối cùng cắt bỏ
sau ủ của vùng ngắn mạch đơn của microhomology và DNA tiếp theo cuối thắt [15]. Trong
tất cả các giai đoạn của chu kỳ tế bào, cả hai con đường NHEJ sửa chữa DNA với một tần
số cao đột biến dẫn đến sự hình thành của indels tại nơi diễn ra của giờ nghỉ [15,16].
Khi nơi diễn ra mục tiêu nuclease được đặt trong vùng mã hóa của một gen, các
indels kết quả sẽ thường gây ra frameshifts. Trong các bệnh như bệnh teo cơ Duchenne
(DMD), nơi xóa gen dẫn đến frameshifts và mất sau đó của chức năng protein, mục tiêu
indels NHEJ gây ra có thể được sử dụng để khôi phục lại các khung đọc chính xác của gen
[17]. Tuy nhiên, các ứng dụng phổ biến nhất của đột biến mục tiêu liên quan đến việc gây
đột biến khung đọc với mục đích loại trực tiếp gen. Ngược lại với liệu pháp gen truyền
thống, đó là hạn chế việc bổ sung các chuỗi ngoại sinh vào hệ gen, khả năng knock out gen
nội sinh sẽ mở ra một con đường mới của liệu pháp điều trị, trong đó chức năng của gen có
thể bị phá vỡ vĩnh viễn. Một ứng dụng của phương pháp này là nhằm mục tiêu tăng chi
phối của các đột biến chức năng, chẳng hạn như những người tìm thấy trong bệnh
Huntington. Căn bệnh này được gây ra bởi một sự mở rộng lặp lại trên một alen của gen
huntingtin (HTT), dẫn đến việc sản xuất một protein HTT đột biến độc. Loại bỏ alen đột

biến này bằng cách chỉnh sửa gen NHEJ dựa trên có thể cung cấp lợi ích lâm sàng cho
bệnh nhân Huntington [18,19]. Trong các bệnh khác, đôi khi nó có thể được điều trị để loại


bỏ các chức năng bình thường của một gen. Ví dụ nổi bật nhất của việc này là phương pháp
gien chỉnh sửa hiện trong các thử nghiệm lâm sàng để điều trị HIV, trong đó loại trực tiếp
của CCR5, đồng thụ thể HIV lớn, cấm nhiễm virus của các tế bào T biến đổi [20,21,22].
Cuối cùng, chứ không phải là trực tiếp nhắm vào hệ gen của con người, loại trực tiếp của
các gen quan trọng trong việc xâm nhập vi khuẩn hoặc virus dựa trên DNA có thể phục vụ
điều trị chống vi khuẩn hiệu quả.
LOẠI BỎ GENE
Ngoài các indels tương đối nhỏ do NHEJ, nó có thể xóa phân đoạn lớn của DNA
bằng chầu liên tục với hai DSBs. Thật vậy, nó đã được chứng minh rằng giới thiệu đồng
thời của hai lần nghỉ nhắm mục tiêu có thể làm phát sinh xóa gen lên đến vài megabases
kích thước [25 - 29]. Phương pháp này rất hữu ích cho các chiến lược điều trị mà có thể
yêu cầu loại bỏ toàn bộ một yếu tố di truyền, chẳng hạn như một khu vực tăng cường, như
đã được đề xuất để điều trị hemoglobin bởi việc xoá BCL11A hồng cầu khu vực cụ thể
enhancer [30,31]. Ngoài ra, trong các bệnh như DMD nơi xóa gen khác nhau nội bộ có thể
chuyển gen ra khỏi khung , việc xoá bỏ chủ ý của một hay nhiều exon có thể sửa khung
đọc và khôi phục các biểu hiện của cắt ngắn, nhưng một phần chức năng protein [32 - 37].
Trái ngược với những đột biến khó lường do NHEJ, nhắm mục tiêu DSBs có thể
gây ra chỉnh sửa gen chính xác bằng cách kích thích HDR với một mẫu nhà tài trợ ngoại
sinh được cung cấp. Hoạt động chủ yếu trong S và G2 giai đoạn của chu kỳ tế bào, HDR tự
nhiên sử dụng các nhiễm sắc chị như một khuôn mẫu để sửa chữa DNA [15,16,38]. Tuy
nhiên, một chuỗi các nhà tài trợ ngoại sinh được cung cấp cũng có thể được sử dụng như
một mẫu sửa chữa [39]. Như vậy codelivery của nucleases nhắm mục tiêu cùng với một
vector nhắm mục tiêu có chứa tương đồng ADN đến trang web nghỉ phép chỉnh sửa gen
hiệu quả cao HDR-dựa [6,7,8]. Bất kỳ sự khác biệt tự hiện diện trong các mẫu của nhà tài
trợ do đó có thể được đưa vào các locus nội sinh để sửa chữa bệnh gây đột biến, như đã
được chứng minh trong nhiều bằng chứng nghiên cứu khái niệm [40-50]. Trong khi

plasmid có truyền thống được các nguồn thông dụng nhất của DNA các nhà tài trợ, gần đây
các nghiên cứu đã chỉ ra rằng oligonucleotide mắc kẹt đơn (ssODNs), với ít nhất là 80 cặp
bazơ tương đồng, có thể phục vụ các mẫu nhà tài trợ như hiệu quả cho HDR [51,52,53].
Đối với các tế bào mà khó có thể transfect, vector virus như integrase lentivirus thiếu hoặc
virus adeno liên quan (AAV) cũng có thể được sử dụng như là một nguồn tài trợ DNA [54


- 57]. Trong thực tế, bản chất tự nhiên của recombinogenic AAV, đặc biệt là khi kết hợp
với các chủng lai đặc biệt hiệu quả như AAV-DJ , làm cho các vector chuyển gen đến nơi
cần chuyển [54 - 62].
Mặc dù liệu pháp gen truyền thống đã sử dụng thành công vector virus để đưa các
gen ngoại lai vào hệ gen, không có khả năng kiểm soát các trang web của hội nhập của các
virus này làm tăng mối lo ngại nghiêm trọng của đột biến ghép, như đã được nhấn mạnh
trong các thử nghiệm lâm sàng đầu mà sử dụng các vec tơ retrovirus chuột [63, 64,65].
Việc sử dụng một mẫu của nhà tài trợ, trong đó chèn gen mong muốn hai bên là cánh tay
tương đồng bao gồm các trình tự giống với trang web cắt nuclease, cho phép trang web
chèn DNA cụ thể thông qua DSB-induced HDR [66]. Mục tiêu đưa các gen trị liệu vào các
trang web được xác định trước trong bộ gen, chẳng hạn như "bến cảng an toàn" locus, làm
giảm bớt nguy cơ của đột biến ghép và cho phép mức độ cao của sự biểu hiện gen phổ biến
[67,68,69]. Để duy trì kiểm soát biểu hiện gen của yếu tố điều hòa tự nhiên, kiểu sao chép
tự nhiên các bệnh lên gen có thể được chèn vào các locus nội sinh tương ứng và do đó là
dưới sự kiểm soát của promoter riêng [70,71]. Một cơ chế thay thế cho chèn gen chuyển
mục tiêu là sử dụng DSBs nuclease gây ra để tạo nhô ra tương thích trên DNA của nhà tài
trợ và các trang web nội sinh , dẫn đến thắt NHEJ qua trung gian của các chuỗi DNA chèn
trực tiếp vào mục tiêu locus [72].
NUCLEASES MỤC TIÊU
Bởi vì DSB chỉnh sửa gen gây ra dựa trên các cơ chế sửa chữa nội sinh của tế bào,
nó là phổ áp dụng cho bất kỳ loại tế bào hoặc sinh vật mà sử dụng các phương pháp để sửa
chữa DNA. Các yếu tố quan trọng để thực hiện bất kỳ các phương pháp chỉnh sửa gen là sự
ra đời chính xác của một DSB mục tiêu. Bốn nền tảng lớn hiện đang tồn tại gây những

DSBs trang web cụ thể: nucleases ngón tay kẽm (ZFNs), phiên mã kích hoạt giống như
effector (Tale) - nucleases (Talens), meganucleases, và gần đây nhất là CRISPR / hệ thống
Cas (Hình 2).


Fokl
3′

CCCCAACTGNNNNNNGCCGTAGAG
GGGGTTGACNNNNNNCGGCATCTC

CAAAAGTCGTGAAGACAGTTTC
GTTTTCAGCACTTCTGTCAAAG

5′

Fokl
Zinc finger domains

TALE

CRISPR/Cas9

TALE repeat domains

Cas9

Fokl
TACTAGGATCCGATTCGCNNNNNNNNNNNNTCATGCTAGACTGAGCA
CTGATCCTAGGCTAAGCGNNNNNNNNNNNNAGTACGATCTGACTCGT

Fokl

GTCCATGATAGGTGCCATAT

3′
5′

3′
5′

GTCCATGATAGGTGCCATAT
CAGGTACTATCCACGGTATA

GuideRNA

NUCLEASES NGÓN TAY KẼM
Kẽm ngón tay (ZF) protein là những lớp học phong phú nhất của các yếu tố phiên
mã và miền ngón tay kẽm Cys2-His2 là một trong những lĩnh vực DNA phổ biến nhất mã
hóa trong con người genome [73]. Cấu trúc tinh thể của Zif268 đã phục vụ như là cơ sở
cho sự hiểu biết nhận DNA bằng ngón tay kẽm [74,75,76]. Trong sự hiện diện của một
nguyên tử kẽm, miền ngón tay kẽm tạo thành một cấu trúc ββα nhỏ gọn với phần α-xoắn
của mỗi ngón tay tiếp xúc với 3 hoặc 4 bp trong rãnh chính của các ngón tay DNA
[74,77,78]. Tandem trong một mảng ngón tay kẽm quấn quanh DNA để ràng buộc trình tự
mục tiêu mở rộng như vậy mà một protein ba ngón tay liên kết với một trang web mục tiêu
9 bp. Cấu trúc mô-đun của Zif268 gợi ý rằng các protein này có thể cung cấp một khuôn
khổ hấp dẫn cho kỹ thuật mô típ DNA mới [79] nỗ lực ban đầu để thiết kế ZFS với đặc
trưng độc đáo dựa trên một tập hợp đơn giản các quy tắc đã có một số thành công [80,81].
Tuy nhiên, thư viện liên kết kết hợp với các phương pháp lựa chọn dựa trên chứng
tỏ là một cách tiếp cận mạnh mẽ hơn để tạo ra các ngón tay cá nhân với đặc thù gắn DNA

mới [82 - 87]. Sau thành công này, lĩnh vực này đã phải đối mặt với những thách thức của
kỹ thuật mảng đa ngón tay với các trang web mục tiêu mới đủ lâu để có thể duy nhất trong


hệ gen phức tạp. Các "lắp ráp mô đun" phương pháp tiếp cận dựa trên bộ sưu tập của các
module dụng một ngón tay, hoặc xác định trong tự nhiên protein [88] hoặc chọn để ràng
buộc cụ thể ba địa điểm mục tiêu cặp base [89 - 92], sau đó được liên kết song song để tạo
ra protein mới [93 - 97]. Ngoài ra, phương pháp lựa chọn trên, chẳng hạn như mở, có thể
được sử dụng để chọn các protein mới từ libraries [98]. Ngẫu nhiên khi nhiều hơn đáng kể
lao động, phương pháp này sẽ đưa vào tài khoản tương tác bối cảnh phụ thuộc giữa các
láng giềng ngón tay trong một mảng đa ngón tay [76,99,100,101]. Một số phương pháp,
bao gồm cả những người sử dụng bởi Sangamo Biosciences và nền tảng Sigma-Aldrich
CompoZr, kết hợp hai cách tiếp cận để lắp ráp các mảng tiểu thuyết sử dụng tài liệu lưu trữ
của đơn vị đa ngón tay đã được chọn trước đó để làm việc tốt cùng [13,102,103,104].
Các ngón tay kẽm nuclease (ZFN) công nghệ có thể được thực hiện bởi những khám
phá phần miền DNA và lĩnh phân cắt của FokI chức năng hạn chế endonuclease độc lập
của mỗi 0,105 khác. Bằng cách thay thế các tên miền ràng buộc FokI DNA với một miền
ngón tay kẽm, nó có thể tạo ra nucleases khảm với đặc thù ràng buộc mới [106,107]. Bởi vì
các chức năng nuclease FokI như một dimer, hai ZFNs ràng buộc sợi đối diện của DNA
được yêu cầu để khởi phát một DSB [108]. Thí nghiệm ban đầu cho thấy DSBs ZFN gây ra
có thể được sử dụng để sửa đổi bộ gen thông qua hoặc NHEJ hoặc HDR [10,109,110] và
công nghệ này sau đó đã được sử dụng để sửa đổi thành công gen soma nhân [40,66,98] và
các tế bào gốc đa năng [42,44,111,112,113].
TALENs
Việc phát hiện ra một đơn giản mã số một - một mệnh lệnh đặc hiệu DNA-binding
protein câu chuyện từ các mầm bệnh Xanthomonas một lần nữa dấy lên khả năng thú vị
cho thiết kế mô-đun của các protein gắn DNA mới [114,115]. Bảo tồn 33-35 amino axit
câu chuyện lặp đi lặp lại mỗi ràng buộc một cặp base đơn của DNA với độ đặc hiệu quyết
định bởi hai dư hypervariable. Cấu trúc tinh thể của những câu chuyện liên kết với DNA
tiết lộ rằng mỗi lặp lại tạo thành một cấu trúc hai xoắn nối với nhau bằng một vòng lặp

trong đó trình bày cặn hypervariable vào rãnh lớn như protein bọc xung quanh các DNA
trong một cấu trúc superhelical [116,117]. Những lặp đi lặp lại câu chuyện mô - đun có thể
được liên kết với nhau để xây dựng một mảng dài với độ đặc hiệu DNA - ràng buộc tùy
chỉnh [118,119,120,121,122].


Nhiều nền tảng tồn tại đối với các mảng kỹ thuật. Các phương pháp đơn giản nhất
sử dụng kỹ thuật nhân bản tiêu chuẩn để lắp ráp những câu chuyện từ kho lưu trữ của
plasmid, gồm câu chuyện duy nhất lặp đi lặp lại [123,124]. Một số phương pháp vừa thông
dựa trên hệ thống nhân bản Golden Gate để lắp ráp nhiều phần cùng một lúc trong một
phản ứng duy nhất [120,122,125,126,127,128,129]. Các phương pháp phổ biến nhất lắp ráp
[130,131,132] hoặc thắt độc lập kỹ thuật nhân bản [133].
Xây dựng ra nền tảng đặt bởi một thập kỷ chỉnh sửa gen ZFN gây ra, việc phát hiện
ra câu chuyện như một miền DNA có thể lập trình được nhanh chóng theo sau bởi các kỹ
thuật của Talens. Giống như ZFNs, những câu chuyện đã được hợp nhất với lĩnh vực xúc
tác của endonuclease FokI và hiển thị với chức năng như dimer để tách mục tiêu trang web
DNA dự định của họ [119,121,134,135]. Cũng tương tự như ZFNs, Talens đã được chứng
minh là gây ra hiệu quả cả NHEJ và HDR trong somatic nhân [119,132,134] và các tế bào
gốc đa năng [53,136].
Talens có thể được thiết kế để nhắm mục tiêu hầu như bất kỳ trình tự cho rằng kiềm
chế chỉ nhắm mục tiêu của họ là yêu cầu cho 5 'T, theo quy định của miền N-terminal
không đổi, cho từng mảng. Phạm vi nhắm mục tiêu không giới hạn này, ngoài sự dễ dàng
của kỹ thuật protein mới, làm cho Talens một nền tảng hấp dẫn để chỉnh sửa gen mục tiêu.
Ngược lại, kích thước lớn và tính chất lặp đi lặp lại của các mảng Tale trình bày một trở
ngại cho giao hàng trong cơ thể của các protein này. Trái ngược với một 30 amino axit
ngón tay kẽm, mà liên kết với ba cơ sở của DNA, Talens yêu cầu 34 axit amin để xác định
một cặp cơ sở duy nhất và khác biệt kích thước này có thể ngăn cấm giao của cả hai
monome Talen trong một vector virus duy nhất với dung lượng bao bì hạn chế. Ngoài ra,
bản chất không ổn định của lặp song song, chẳng hạn như những người có mặt trong
Talens, làm cho nó khó khăn để đóng gói các trình tự lặp đi lặp lại trong các hệ thống của

virus. Thật vậy, Talens giao bởi lentivirus đã được chứng minh là dễ bị sắp xếp lại, [137]
mặc dù hiện tượng này có thể được giảm nhẹ bằng cách đa dạng hóa codon giữa lặp [138]
hệ thống adenovirus cũng đã được sử dụng để cung cấp thành công Talens [139].
MEGANUCLEASES
Công nghệ Meganuclease liên quan đến việc tái kỹ thuật đặc trưng gắn DNA của tự
nhiên endonuclease homing. Các lớp lớn nhất của endonuclease homing là gia đình
LAGLIDADG, bao gồm nổi đặc trưng và thường được sử dụng I-CreI và I-SCEI enzyme


[140]. Thông qua sự kết hợp của thiết kế hợp lý và lựa chọn, các endonuclease homing có
thể được tái thiết kế để nhắm mục tiêu mới trình tự [141 – 148]. Trong khi nhiều nghiên
cứu cho thấy hứa hẹn cho việc sử dụng trong chỉnh sửa meganucleases gen [149 – 152],
các lĩnh vực DNA và phân tách của endonuclease homing rất khó để tách biệt, và những
khó khăn tương đối của các protein đặc trưng kỹ thuật với cuốn tiểu thuyết có truyền thống
giới hạn việc sử dụng này nền tảng. Để giải quyết hạn chế này, các protein khảm bao gồm
sự hợp nhất của meganucleases, ZFS, và câu chuyện đã được thiết kế để tạo ra các enzyme
monomeric cuốn tiểu thuyết mà tận dụng các mối quan hệ ràng buộc của ZFS và những câu
chuyện và những đặc phân cắt của meganucleases [153- 156]. Một lợi thế tiềm năng liên
quan đến công nghệ meganuclease là DSB-hình thành bởi các enzym này kết quả trong
một 3' nhô ra, có thể là recombinogenic hơn cho HDR hơn 5' nhô ra tạo ra bởi FokI phân
cắt. Ngoài ra, meganucleases là những lớp học nhỏ nhất của nucleases thiết kế, làm cho
chúng có khả năng tuân theo tất cả các phương pháp chuyển gen tiêu chuẩn. Trong thực tế,
nhiều monome meganuclease có thể dễ dàng đóng gói thành vector virus đơn đồng thời tạo
ra nhiều DSBs.
CRISPR / nucleases Cas
CRISPR-Cas nucleases RNA-hướng dẫn được bắt nguồn từ một hệ thống miễn dịch
thích nghi tiến hóa của vi khuẩn để bảo vệ chống lại các plasmid xâm lược và virus. Nhiều
thập kỷ của công việc điều tra hệ thống CRISPR ở loài vi sinh vật khác nhau đã làm sáng
tỏ một cơ chế mà chuỗi ngắn xâm nhập axit nucleic được đưa vào CRISPR loci [157]. Sau
đó, họ được phiên mã và chế biến thành CRISPR RNA (crRNAs), cùng với một crRNAs

xuyên kích hoạt (tracrRNAs), phức tạp với (Cas) protein CRISPR liên quan ra lệnh đặc
hiệu của sự phân cắt DNA bằng Cas nucleases qua Watson-Crick cơ sở ghép nối giữa axit
nucleic [158,159,160,161]. Xây dựng tắt của hai cuộc nghiên cứu cho thấy rằng ba thành
phần cần thiết cho các loại hình II CRISPR nuclease hệ thống là các protein Cas9, các
crRNA trưởng thành và tracrRNA [162, 163]. Doudna, Charpentier và các cộng sự đã cho
thấy thông qua trong thí nghiệm in vitro tách DNA rằng hệ thống này có thể được giảm
xuống hai thành phần của sự hợp nhất của các crRNA và tracrRNA thành một đơn hướng
dẫn RNA (gRNA) . Hơn nữa, họ đã cho thấy rằng lại nhắm mục tiêu của phức Cas9 /
gRNA đến các trang web mới này có thể được thực hiện bằng cách thay đổi trình tự của
một phần ngắn của gRNA [164]. Sau đó, một loạt các ấn phẩm chứng minh rằng CRISPR /


hệ thống Cas9 có thể được thiết kế cho sửa đổi di truyền có hiệu quả trong các tế bào động
vật có vú [165 - 168]. Nói chung các nghiên cứu này đã đẩy CRISPR / công nghệ Cas9
thành tâm điểm chú ý của các lĩnh vực gen chỉnh sửa.
Giới hạn chuỗi duy nhất của hệ thống CRISPR / Cas xuất phát từ sự cần thiết của
một motif protospacer liền kề (PAM) nằm ngay 3 'để trang web mục tiêu. Trình tự PAM là
đặc trưng cho loài Cas9. Ví dụ, trình tự PAM 5'-NGG-3 'là cần thiết để ràng buộc và sự
phân tách DNA bằng các Cas9 thường được sử dụng từ Streptococcus pyogenes
[169,170,171]. Tuy nhiên, Cas9 biến thể với PAMS cuốn tiểu thuyết có thể được thiết kế
bởi sự phát triển đạo, do đó mở rộng đáng kể số lượng các mục tiêu tiềm năng chuỗi .
172,173 Cas9 phức với crRNA và tracrRNA trải qua một sự thay đổi về hình dạng, liên kết
với các họa tiết PAM toàn bộ gen xét hỏi các chuỗi trực tiếp ngược dòng để xác định bổ
sung liên tục với các gRNA [171,174,175,176,177]. Sự hình thành của một DNA-RNA
heteroduplex tại một lần xuất hiện trang web mục tiêu cho phép phân tách của các DNA
mục tiêu của Cas9-RNA phức tạp [171].
Không giống như ba hệ thống nuclease thảo luận ở trên, CRISPR / Cas nucleases
không yêu cầu kỹ thuật của các protein mới cho mỗi trang web mục tiêu DNA. Sự dễ dàng
so với các trang web mới có thể được nhắm mục tiêu, chỉ đơn giản bằng cách thay đổi khu
vực ngắn của gRNA rằng mệnh lệnh đặc hiệu, làm cho hệ thống này là một phương pháp

rất hấp dẫn cho giới thiệu DSBs trang web cụ thể. Ngoài ra, do các protein Cas9 không
được kết nối trực tiếp đến các gRNA, hệ thống này là rất cao tuân theo để ghép thông qua
việc sử dụng đồng thời nhiều gRNAs để gây DSBs ở nhiều locus. Bởi vì sự đa dạng phong
phú của hệ thống CRISPR tự nhiên đã được understudied phần lớn, nó là hợp lý để mong
đợi nhiều công nghệ gen chỉnh sửa CRISPR mới dựa trên xuất hiện, bao gồm cả không
Cas9 dựa trên loại hệ thống II như được mô tả gần đây RNA-hướng dẫn endonuclease
Cpf1 và những người khác [178,179].
ĐẶC TRƯNG CỦA NUCLEASES MỤC TIÊU
Hiệu quả của việc chỉnh sửa gen mục tiêu dựa trên bóc DNA một cách cụ thể trong
khi giảm thiểu, hoặc lý tưởng ngăn chặn, thiệt hại tài sản thế chấp để phần còn lại của bộ
gen. Vì lý do này, các đặc trưng của nucleases nhắm mục tiêu là một trọng tâm chính của
lĩnh vực gen chỉnh sửa. Sửa đổi các miền dimerization FokI tăng mạnh đặc trưng của ZFNs
và Talens bằng cách yêu cầu hai heterodimers bắt buộc để ràng buộc các DNA mục tiêu


trong một định hướng và khoảng cách [180,181,182,183]. Gợi nhớ về kiến trúc của ZFNs
và Talens cụ thể, sự bất hoạt của Cas9 lĩnh nuclease để tạo Cas9 nickases hoặc hợp nhất
Cas9-FokI đã tăng đặc hiệu bằng cách yêu cầu hai phức gRNA / Cas9, mỗi bóc một sợi
đơn của DNA, để đến với nhau ở khoảng cách chính xác và định hướng để tạo ra một DSB
[184,185,186,187]. Ngoài ra, giảm độ dài của bổ sung giữa các gRNA và các trang web
mục tiêu 20-17 nucleotide làm tăng độ đặc của sự phân cắt DNA bằng Cas9 từ S. pyogenes
[188]. Gần đây, cấu trúc hướng dẫn kỹ thuật protein đã được sử dụng để phát triển tiểu
thuyết Cas9 biến thể với tăng tính đặc hiệu [189,190]. Những cải thiện có ý nghĩa giảm bớt
những lo ngại ban đầu về tính đặc hiệu của CRISPR / Cas nucleases [191,192,193]. Tuy
nhiên, không phụ thuộc vào công nghệ nuclease, rất khó để xác định đầy đủ các định offmục tiêu chia tách trong hệ gen phức tạp. Cho đến gần đây, các nghiên cứu đặc hiệu đã
được phần lớn giới hạn một ưu tiên, trong việc xác định silic tiềm năng của các chương
trình off - mục tiêu có thể được thông qua xét nghiệm thay thế với các protein tinh khiết
hoặc tích hợp virus tại vỡ hai sợi [194,195,196]. Tổng trình tự bộ gen của một số ít nhái có
nguồn gốc từ các tế bào đơn đã xác nhận việc thiếu hiệu off - mục tiêu trong các quần thể
lựa chọn, nhưng không thể xác định các trang web được cắt ở tần số thấp trong quần thể tế

bào số lượng lớn [197,198,199]. DNA bởi chIP-seq đã được rất nhiều thông tin cho sự hiểu
biết mục tiêu công nhận, nhưng phần lớn các off-mục tiêu gắn kết không phải là tiên đoán
của các hoạt động nuclease [200,201,202]. Gần đây phát triển của các phương pháp, xét
nghiệm gen toàn không thiên vị để xác định đặc đã đáng kể nâng cao các khả năng để mô
tả đặc nuclease với một mức độ nhạy cảm mà không phải là trước đây có thể
[195,203,204,205,206]. Những phương pháp mới có khả năng sẽ rất quan trọng để thúc đẩy
nucleases gen chỉnh sửa nhắm mục tiêu là phương pháp điều trị.
CUNG CẤP CÔNG CỤ TÁI TẠO GEN
Phân phối hiệu quả và an toàn để nhắm mục tiêu các tế bào và các mô đã được thách
thức lâu dài với các chiến lược điều trị gen thành công (Hình 3). Thách thức này kéo dài
đến phương pháp tái tạo gen tốt, nơi nucleases, và trong trường hợp của CRISPR / hệ thống
Cas9, một gRNA, phải được giao một cách hiệu quả. Hơn nữa, hàm lượng của các nhà tài
trợ mẫu DNA là quan trọng để đảm bảo sự tái tổ hợp tương đồng hiệu quả. Thời gian và
cường độ của biểu nuclease là một tham số quan trọng cho các cấp độ của cả hai trên mục
tiêu và off-mục tiêu hoạt động nuclease. Phát huy tối đa hiệu quả của giao hàng là đặc biệt


quan trọng vì chỉnh sửa gen là một sự kiện ngẫu nhiên vốn chỉ diễn ra ở một phần nhỏ của
các tế bào trong đó các nuclease được thể hiện.

Ex vivo

In vivo

Introduce modified cells
back into patient
Deliver targeted nucleases
to cells by physical, chemical,
or viral methods

AAV

DNA
RNA

Lipid nanoparticle

Protein
Lentivirus
Extract stem or
progenitor cells

Direct delivery to patient using
viral or non-viral delivery vehicle

Các phương pháp thông báo rộng rãi nhất để giới thiệu nucleases vào các tế bào
trong các nghiên cứu bằng chứng của nguyên tắc là thâm chuyển của DNA plasmid mang
nuclease và biểu hiện gRNA cassette. Mặc dù đơn giản và dễ hiểu, phương pháp này không
phải là lý tưởng đối với hầu hết các liệu pháp gen và tế bào do hiệu quả thấp của thâm
chuyển của tế bào sơ cấp, độc tế bào liên quan đến DNA, sự hiện diện của các chuỗi DNA
của vi khuẩn trong xương sống plasmid, và khả năng tích hợp ngẫu nhiên của mảnh
plasmid vào hệ gen. Do đó, electroporation của mRNA mã hóa các nucleases và gRNAs
tạo ra thông qua phiên mã trong ống nghiệm đã trở thành một phương pháp ưa thích cho ex
vivo chỉnh sửa gen của tế bào sơ cấp có liên quan đến liệu pháp gen, chẳng hạn như các tế
bào T và tế bào gốc tạo máu (bào gốc tạo máu)[168,207]. Ngoài ra, trực tiếp cung cấp các
protein nuclease tinh khiết hoặc phức Cas9 protein gRNA cũng đã rất thành công trong
việc đạt được mức độ cao của chỉnh sửa gen, hoặc bằng electroporation [208,209] hoặc
nhiệt hạch để peptide tế bào thâm nhập, mà obviates electroporation qua trung gian
[210,211,212]. Sửa đổi gRNAs tiếp tục tăng cường sự vững mạnh của biên tập gen trong tế
bào sơ cấp bằng cách tăng sự ổn định và / hoặc giảm phản ứng miễn dịch bẩm sinh [207].

Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng tập thể bằng cách hạn chế thời gian hoạt động nuclease
với ngắn ngủi mRNA hoặc protein, tác dụng off-mục tiêu có thể được giảm thiểu so với
giao plasmid dựa trên. nỗ lực trong tương lai có thể sẽ tận dụng lợi thế của các công thức
hạt nano mới nổi cho hiệu quả và không cung cấp riêng lẽ [213]
Đối với nhiều ứng dụng, vector virus vẫn là phương tiện tối ưu để tối đa hóa hiệu
quả của giao hàng trong khi giảm thiểu khả năng gây độc [214]. Trong đó, vector
lentivirus đã được tối ưu hóa cho truyền cao hiệu quả của các tế bào T và bào gốc tạo máu;
Tuy nhiên những vectơ cũng tích hợp vào hệ gen và ổn định thể hiện hàng hóa gen chuyển
của họ. Để tận dụng lợi thế của tính hiệu quả của truyền lentivirus trong khi hạn chế thời
gian biểu hiện nuclease trong các tế bào mục tiêu, vector lentivirus integrase thiếu đã được
sử dụng để cung cấp các công cụ thoáng qua bộ gen chỉnh sửa để nhắm mục tiêu các tế bào
[57,111]. Tương tự như vậy, hệ thống adenovirus cũng có thể đạt cao mức độ dẫn truyền
của một loạt các loại tế bào ex vivo trong khi cung cấp chỉ thoáng qua biểu hiện nuclease
[20,137,139]. Cả lentivirus và vec tơ adenovirus cũng có lợi thế về khả năng đóng gói đầy
đủ để thực hiện nhiều nucleases hoặc cassette biểu gRNA để chỉnh sửa multiplex nhiều loci
[215].
Trong gen in vivo chỉnh sửa lại những thách thức bổ sung mục tiêu mô cụ thể, phân
bố của các vector, và miễn dịch và biocompatibility của người vận chuyển. Mặc dù một số
ví dụ về các giao plasmid đến gan đã cho thấy bằng chứng của nguyên tắc quan trọng trong
việc biên tập gen in vivo trong các mô hình động vật [216, 217, 218], dịch các chiến lược
để điều trị con người không phải là chưa khả thi. Tuy nhiên, trong cơ thể chuyển gen với
AAV đến gan, mắt, hệ thần kinh và cơ xương và tim đã cho thấy hiệu quả ấn tượng trong
cả hai mô hình tiền lâm sàng và thử nghiệm lâm sàng [219]. Do đó, AAV cũng là một hệ
thống đầy hứa hẹn cho giao nucleases gen chỉnh sửa để nhắm mục tiêu tissues [220]. Hơn
nữa, các đặc tính recombinogenic tự nhiên của AAV làm cho nó một vector mong muốn
giao các mẫu sửa chữa DNA [56,61,62,221,222,223,224]. Mặc dù một số nghiên cứu đã
chỉ ra sự tái tổ hợp nhắm mục tiêu của locus gen với vec tơ AAV trong sự vắng mặt của
nucleases [58 , 71], hiệu quả thấp hơn so với các báo cáo có nucleases đáng kể. Thêm

những nghiên cứu cần thiết để hiểu được các dấu hiệu bệnh có thể được mạnh mẽ giải
quyết ở hiệu quả thấp của biên tập gen.


Mặc dù AAV đã thể hiện lời hứa đáng kể cho chuyển gen trong cơ thể, khả năng
đóng gói của nó được giới hạn ít hơn ~ 4,8 kb của DNA. Điều này đã đặt ra một thách thức
đối với việc cung cấp các nucleases lớn như Talens, đòi hỏi hai monome mỗi mã hóa bởi
các cDNA lớn hơn bốn kb, và thường được sử dụng S. pyogenes Cas9 nuclease được mã
hóa bởi một ~ 4,2 kb cDNA. vectơ Trans-nối đã được thiết kế để kết hợp lại trong các tế
bào để mở rộng kích thước của gen chuyển giao do AAV [225], nhưng hiệu quả của biểu
thức là thấp hơn so với gen cung cấp bởi một đơn AAV đáng kể. Một số orthologs Cas9
nhỏ tồn tại, và ~ 3.1 kb Cas9 từ S. aureus có đặc điểm kỹ lưỡng và thể hiện để làm trung
gian chỉnh sửa gen hiệu quả cao trong cơ thể sau sinh AAV [35,36,226,227]. Bước tiến
quan trọng này là rất quan trọng để tạo điều kiện dễ dãi và mạnh mẽ trong chỉnh sửa gen in
vivo với CRISPR hệ thống / Cas9. Nó là đặc biệt thuận lợi cho việc phát triển một sản
phẩm liệu pháp gen thể dịch có thể được đóng gói trong một vector đơn.
ỨNG DỤNG GENE THERAPY
Khả năng thao tác bất kỳ chuỗi gen bằng cách chỉnh sửa gene đã tạo ra các cơ hội đa
dạng để điều trị nhiều bệnh khác nhau và các rối loạn (Hình 4). Ở đây, chúng tôi thảo luận
về các loại chính của dấu hiệu bệnh đã được theo đuổi trong mô hình tiền lâm sàng (Bảng
1), cũng như làm nổi bật các thử nghiệm lâm sàng liên tục hoặc có kế hoạch sử dụng chiến
lược gen chỉnh sửa (Bảng 2)
Eyes
Leber’s congenital
amaurosis Glaucoma
Retinitis pigmentosa

Skeletal muscle
and heart

Muscular dystrophy

Lungs

Cystic
fibrosis

Gastrointestinal
system

Liver

Bacterial infections

Hemophilia
Tyrosinemia
type 1
Glycogen and
lysosomal
storage disorders
α-1-antitrypsin
deficiency
Cholestero
l levels
Viral
infections

Blood

Skin

Epidermolysis
bullosa
Bacterial
infections

Cancer
Immuno
therapy
Viral and bacterial
infections
Immunodeficiency
Sickle cell
disease
Thalassem
ias


CHIẾN LƯỢC KHÁNG VIRUS
Các ứng dụng đơn giản nhất của chỉnh sửa gen là sử dụng cơ chế tương đối hiệu quả
NHEJ để knockout gen trong một liệu pháp tế bào tự thân ex vivo, nơi các tế bào soma có
thể được cô lập, sửa đổi, và giao lại cho bệnh nhân. Hơn nữa, một trong những ứng dụng
hấp dẫn nhất của chỉnh sửa gen là công tác phòng chống nhiễm virus hoặc nhân rộng. Do
đó, chiến lược gen chỉnh sửa tiên tiến nhất cho đến nay là những thay đổi ex vivo của các
tế bào T để loại bỏ các đồng thụ thể CCR5 sử dụng cho HIV chính infection [20]. Nghiên
cứu đầu tiên này đã chứng minh giảm tải lượng virus và tăng lượng tế bào CD4 + T-cell ở
chuột bị nhiễm HIV engrafted với các tế bào T trong đó gen CCR5 đã bị đánh gục bởi
ngón tay kẽm nucleases này [20]. Sau đó đã được theo sau bởi cuộc biểu tình của các kết
quả tương tự như sau chỉnh sửa gen, ghép CD34 + HSCs vào chuột chiếu xạ, cho phép bảo
vệ của tất cả các dòng tế bào máu từ CCR5 nhiễm HIV -tropic [21,228]. Những nghiên cứu
này đã dẫn đến một loạt các thử nghiệm lâm sàng (Bảng 2) đánh giá các phương pháp này

trong các bệnh nhân HIV dương tính. Như vậy đến nay các nghiên cứu cho thấy việc ghép
an toàn và tồn tại của tế bào T CCR5 sửa đổi và kiểm soát tải lượng virus trong một số
bệnh nhân, cung cấp đầy hứa hẹn bằng chứng của nguyên tắc của phương pháp gen chỉnh
sửa trong con người [22]. Điều thú vị là, dữ liệu từ nghiên cứu này cho thấy một lớn hơn
hiệu quả lâm sàng ở bệnh nhân đó đã dị hợp tử trong tự nhiên ▵32 đột biến, cho thấy hiệu
quả gen chỉnh sửa có thể là một yếu tố quan trọng cho sự thành công.
Xây dựng trên những nghiên cứu đầy hứa hẹn với ZFNs, nhiều nỗ lực khác đã phát
triển các chiến lược gen chỉnh sửa tương tự như knockout CCR5 với Talens [134,229]
CRISPR / Cas9 (refs. 229, 230) và meganucleases [231], công việc khác đã mở rộng vượt
ra ngoài mục tiêu chỉ CCR5 để tăng sức đề kháng nhiễm HIV. Điều này bao gồm nhắm
mục tiêu các đồng thụ thể CXCR4 [232] hoặc gen PSIP1 mã hóa / protein P75 LEDGF cần
thiết cho hội nhập HIV [233,234]. Một số nghiên cứu đã được sử dụng nhắm mục tiêu hội
nhập gen vào gen CCR5 bởi HDR cùng lúc loại trực tiếp CCR5 và giới thiệu chống HIV tố
[235]. Cuối cùng, hoàn chỉnh cắt bỏ bộ gen của HIV từ tế bào bị nhiễm độc bằng nucleases
nhắm chuỗi trong lặp tận dài (LTRs) chầu bộ gen của virus cũng đã được báo cáo [236].
Do đó, một loạt các thế hệ tiếp theo chiến lược gen chỉnh sửa để ngăn ngừa nhiễm trùng và
nhân lên của HIV được trên đường chân trời.


Ngoài việc giải quyết nhiễm HIV, tất cả các nền tảng gen biên tập cũng đã được áp
dụng khác nhau pathogens 23 virus khác như virus viêm gan B [217, 218, 237, 238, 239,
240, 241, 242] herpes simplex virus [243.244.245] và virus papilloma [246]. Những chiến
lược này thường liên quan đến việc loại bỏ gen của virus bởi suy thoái sau tách nuclease và
bằng cách nhắm mục tiêu gen cần thiết cho sự ổn định hệ gen, bảo trì và nhân rộng. Trong
khi rất nhiều các nghiên cứu ban đầu tập trung vào các bằng chứng của nguyên tắc giảm tải
lượng virus trong nuôi cấy tế bào hoặc sau giao DNA plasmid thủy động lực cho những
con chuột, các nghiên cứu gần đây sử dụng giao AAV công cụ gen chỉnh sửa trực tiếp đến
gan chuột cung cấp một con đường chính đáng cho khả năng mở rộng lâm sàng [238]. Một
thách thức chung của liệu pháp kháng virus là đột biến cao của mục tiêu của virus. Đây là
một luận cứ thuyết phục ủng hộ mục tiêu gen chủ, chẳng hạn như CCR5, nhưng cũng có

thể được giải quyết bằng cách nhắm mục tiêu đồng thời nhiều trang web quan trọng trong
hệ gen của virus.
LIỆU PHÁP MIỄN DỊCH UNG THƯ
Liệu pháp miễn dịch ung thư đã được công nhận rộng rãi như là một trong những
tiến bộ vĩ đại nhất trong nghiên cứu y sinh học trong những năm gần đây [247]. Trong đó,
nuôi miễn dịch tế bào T, trong đó các tế bào T tự thân được thiết kế để tấn công các kháng
nguyên ung thư ex vivo và chuyển trở lại cho bệnh nhân, có được ấn tượng thành công
trong điều trị một số trường hợp ung thư hạch, ung thư máu, và u ác tính [248]. Mặc dù có
những thành công và thử nghiệm lâm sàng liên tục hứa hẹn, có một số lĩnh vực, trong đó tế
bào T miễn dịch có thể có khả năng cải thiện bằng cách chỉnh sửa gen. Tại đây, cả hai hiệu
quả chống lại các loại khối u khác nhau và khả năng sản xuất các sản phẩm di động có thể
được áp dụng cho một số bệnh nhân rộng có thể được tăng cường thông qua các kỹ thuật
gen-chỉnh sửa. Ví dụ, một chiến lược đầy hứa hẹn cho liệu pháp miễn dịch bao gồm các tế
bào T kỹ thuật để thụ thể tổng hợp được gọi là thụ thể khảm kháng nguyên, hoặc CAR, mà
nhận ra các epitope trên các tế bào ung thư. tế bào T CAR như vậy đã đặc biệt thành công
trong điều trị u lympho tế bào B bằng cách tấn công các tế bào CD19 bề mặt kháng nguyên
[247,248]. Tuy nhiên, một trong những hạn chế của phương pháp này là các tế bào T sửa
đổi thể hiện cả hai thụ thể tế bào T nội sinh cũng như các CAR kế . Bởi vì các thụ thể hoạt
động như các chất nhị trùng, các thụ thể tự nhiên và thiết kế có thể dimerize và tương tác,
kết quả là đặc epitope không thể đoán trước và có khả năng làm giảm hiệu lực điều trị. Để


giải quyết hạn chế này, một số nghiên cứu đã tập trung vào cách gõ ra các thụ thể tế bào T
với nội sinh nucleases kế [154,249,250,251].


Một thách thức lớn đối với sự phát triển của liệu pháp miễn dịch T-cell
immunotherapy là sự cần thiết phải sử dụng chính tế bào đó để tránh sự loại bỏ miễn dịch.
Đến lúc này, gene chỉnh sửa đã sử dụng để loại trực tiếp các kháng nguyên bạch cầu người
(HLA) mà hệ thống tự miễn dịch và ngoài tế bào. Quan trọng là cách tiếp cận này có thể

hữu ích cho liệu pháp tế bào. Ví dụ cách tiếp cận tương tự đã được áp dụng trong con
người ở tế bào pluripoten poten – tially có đa dạng sử dụng trong y học tái tạo và có thể
được sử dụng cho allogeneic mạch ghép [252].
Một trở ngại lớn để thành công T-cell immunotherapy là ức chế chức
năng effector T - cell bởi sự biểu hiện của điểm kiểm tra thuốc ức chế trên bề mặt của tế
bào khối u. Ví dụ, các ràng buộc của thuốc ức chế như vậy để các thụ thể PD-1 vào Tcell là doc-umented tốt để ngăn chặn T-cell effector chức năng và gây chết rụng và kiệt
sức. Ức chế thụ thể PD-1 do đó cung cấp một cơ chế mà bệnh ung thư tế bào thành công
tránh hệ thống miễn dịch. Như một chiến lược để khắc phục điều này, gene chỉnh sửa đã sử
dụng cho các loại

trực

tiếp PD-1 trong các T-cell,

[254] dẫn đến tăng T-

cell effector function [209,254]. Sự thành công của chiến lược gen chỉnh sửa này là có khả
năng mở rộng để các trạm kiểm soát chất ức chế con đường rằng ung thư tế bào khai
thác để vent mục immunosurveillance, và do

đó có

thể là một công

nghệ rất

quan

trọng cho rộng rãi cho phép immunotherapy cho các loại ung thư khác nhau.
Cuối cùng, cho các dấu hiệu như glioblastoma, apop-tosis của các T-cell thiết kế

phát sinh từ điều trị steroid glucocorticoid chống viêm sau phẫu thuật bị giới hạn hiệu quả
của T-cell immunotherapy. Để tạo ra một nguồn T-cell kháng glucocorticoid, gene chỉnh
sửa sử dụng để loại trực tiếp nội sinh T-cell receptor [255] điều này đã dẫn đến thành


công các liệu pháp T - cell chống glioma chuột models [255] và là cơ sở của một thử
nghiệm lâm sàng tiếp theo (bảng 2).
Rối loạn máu
Việc đầu tiên gene trị liệu thử nghiệm lâm sàng liên quan đến các ex vivo retroviral
phân phối của một điều trị adenosine deaminase (ADA) transgene T tế bào để điều trị trẻ
em bị nặng kết hợp immunodefi-ciency (ADA-SCID), [256] và sau đó điều trị liên kết với
X SCID (X-SCID) bởi retroviral gen giao CD34 + tạo máu tế bào gốc (hội)[257] này tập
trung đầu vào nguyên liệu pháp gen vivo cho suy giảm miễn dịch dựa trên tuyệt vọng cần
phải phát triển điều trị cho các rối loạn này nếu không gây tử vong cũng như khả
năng avail của các phương pháp cho việc phân phối hiệu quả retroviral gen vào các tế
bào trong nền

văn

hóa. Các quan

sát tiếp

thể dẫn đến insertional mutagenesis là một chất

theo giao
xúc

thức này ban

đầu có

tác chính cho các gen-chỉnh

sửa trường và đã chứng minh sự cần thiết cho sự điều chỉnh của đột biến gen trong cáctế
bào này, trái ngược với transgene delivery [63]. Trong thực tế, ví dụ đầu tiên về điều
chỉnh nội

sinh gen trong tế

bào của

con

người, tập

trung vào IL2 thụ

thể phổ

biến gamma chuỗi đó đột biến trong X-SCID[40] và tiếp cận là nhiều hơn mới có thể mở
rộng đến gen điều

chỉnh trong các công

cụ chỉnh

sửa CD34

+ HSCs

[57]. Gen cũng đã được phát triển để sửa chữa những đột biến gen liên quan đến ADASCID258 và radiosensitive SCID, gây

ra do suy

yếu phụ

thuộc

vào

ADN protein kinase (DNA-PK) activity [259]. Vì vậy, khả năng hiệu quả làm thay
đổi trình tự gen ở T - cell, CD34 + hội, và các tế bào của con người plu-ripotent có
thể cung cấp trị liệu gen chỉnh sửa chiến lược cho một loạt các khác nhau của con
người suy giảm miễn dịch.
Tương tự như vậy, việc thành lập các gen chỉnh CD34 + hội và con người
pluripotent tế bào có khả năng phân biệt thành ery-throid thâp đã cung cấp các tùy chọn
mới cho việc điều trị các rối loạn máu, bao gồm cả bệnh tế bào liềm, gây ra bởi một sự đột
biến điểm E6V cụ thể trong gen β-globin, và β-thalassemia, gây ra bởi các loại đột
biến để β-globin.Những đột

biến globin đã được sửa

chữa bởi gen chỉnh

sửa cả trong iPSCs của con người có thể được phân biệtthành chức năng eryth-rocytes [42,
48, 260] và trực tiếp trong CD34 + HSCs [261]. Tương tự như phương pháp tiếp


cận đã được phát triển nhằm mục tiêu hội nhập của trans-gen trị liệu vào cảng an toàn các

chương trình trong con người iPSCs α-thalassemia [69] và Fanconi anemia [262].
Bệnh hồng cầu lưỡi liềm và β-thalassemia là duy nhất trong đó defi-ciencies chức
năng β-globin hoặc biểu hiện có thể được bồi thường cho bởi inducing upregulation γglobin,mà là thể

hiện trong

quá

trình phát

triển bào

thai nhưng im

lặng sau

khi sinh. BCL11A là một điều transcrip - tế ngăn chặn các biểu hiện của γ-globin, và do
đó vòng đấu loại trực của BCL11A đã được đề xuất như là một cách tiếp cận để điều
trị bệnh tế

bào liềm và β-thalassemia. Tuy

cả các dòng

dõi tạo

nhiên, sự vắng

máu được quan

sát

mặt của BCL11A trong tất

thấy được bất

lợi trong các tế

bào nonerythroid. Điều thú vị, một yếu tố enhancer mà đặc biệt phối hợp BCL11A trong tế
bào erythroid và ngừng

hoạt

động của enhancer này của gen biên

chế của BCL11A và upregulation của γ-globin chỉ trong các tế

tập dẫn đếnức

bào erythroid lineage

[30,31,263]. Vì vậy, cách tiếp cận này cung cấp cả một cơ chế của liệu pháp gen chỉnh
sửa cho bệnh tế

bào liềm và β-thalassemia, nhưng

rộng hơn cho

thấy một chiến

lược chung của các điều chế trị liệu gen biểu hiện thông qua việc chỉnh sửa nhắm mục
tiêu di động dành riêng cho loại enhancers.
Nhắm mục tiêu theo dõi gen chỉnh sửa
Ngoài ex vivo gen chỉnh
dội trong gen chỉnh

sửa của máu và miễn

dịch tế

bào, đó là quan

sửa tại vivo cho gene correction và gen được

nhắm

mục

tâm dữ
tiêu bổ

sung cho các mô tế bào mà transplantation là khó khăn hay không thực tế. Điều này đòi
hỏi việc phân phối hiệu quả chỉnh sửa gene nucleases và nhà tài trợ vectơ để các mô mục
tiêu. Các cuộc biểu tình đầu tiên của gene với hiệu suất cao, nuclease trung gian chỉnh
sửa tại vivo dùng AAV vectơ để cung
có một promoter, gan của một mô

hình chuột hemo-Philia B

tiên của một yếu

tố con

quả của các yếu

tố IX cDNA vào quỹ

hình hemophilic. Nghiên

cấp ZFNs và một yếu

người đột
cứu đầu

tố IX cDNA, mà

[70]. Cleavage intron đầu

biến gen IX bởi ZFNs xúc
tích, dẫn đến sự
tiên

không

điều

này được thực

tác hội nhập hiệu
chỉnh của các kiểu

hiện ở trẻ

sơ

sinh mà trong đó các hepatocytes đang tích cực phân chia và vì thế đạo diễn homology sửa
chữa đường đang hoạt động. Đáng chú ý, mộthiệu quả ác quỷ-strated tiếp theo nghiên
cứu ở chuột dành cho người lớn mà trong đó các hepatocytes có sumably trước khi thoát


khỏi chu kỳ tế bào, mặc dù tích hợp các kết quả từ một sự kết hợp của HDR và mediated
NHEJ events [264]. Nghiên cứu thêm là cần thiết để xác định vai trò của chu kỳ tế
bào và gen chỉnh sửa với AAV và cácvectơ giao hàng trong các loại mô khác nhau.
Gen được nhắm mục tiêu chỉnh trong gan có tiềm năng để điều trị nhiều bệnh khác
nhau, bao gồm các rối loạn đông máu như các dể băng huyết A, hemophilia B, cũng như
các rối loạn lysosomal stor-tuổi bao gồm Fabry bệnh, bệnh Gaucher, căn bệnh Pompe, von
Gierke bệnh và hội chứng Hurler và thợ săn. Tuy nhiên, mỗi người trong số các quần
thể bệnh

nhân là tương

đối nhỏ và các loại

đột

biến để mỗi gen liên

quan

đến các bệnh này là đa dạng. Do đó, chi phí của lâm sàng phê duyệt regula tory vàphát
triển để phát

triển an

toàn và hiệu

quả công

cụ chỉnh

sửa

gene cho mỗi người

trong số các bệnh này có thểprohibitive. Hơn nữa, nó là không rõ ràng cho dù đủ các
cấp nhắm mục tiêu transgene tích hợp hoặc chỉnh sửa gen có thể đạt được để đạt được hiệu
quả điều trị nếu lái xe của promoter nội sinh tự nhiên tương ứng cho mỗi gen. Một cách
tiếp cận thông minh đến địa chỉ mỗi trong những thách thức là hội nhập được nhắm mục
tiêu của trị

liệu gen vào albumin locus ở

hạ

nguồn của promoter

[71,265]. Nội

sinh albumin vì albumin là cấp độ rất cao bày tỏ, thậm chí thấp của tar - geted gene tích
hợp vào trang web này có khả năng dẫn đến các mức độ điều trị biểu hiện gen. Hơn
nữa, này gen "cảng an toàn" có thể được sử dụng cho các bệnh khác nhau, bao gồm

cả những người được liệt kê ở trên, như vậy mà một đơn xác nhận chỉnh sửa gen hoá có
thể được sử

dụng cho một sig-nificantly lớn

hơn bệnh

nhân dân. Cách

tiếp

cận này đã được sử dụng có hiệu quả trong các mô hình chuột với AAV dựa trên tài
trợ tương đồng mẫu để điều trị dể băng huyết mà không có nucleases71 và ZFNs có khả
năng đáng kể nâng cao nhắm mục tiêu efficiency.265
Sự ra đời của hệ thống CRISPR/Cas9 đã thực hiện tại vivo gen-chỉnh sửa công
cụ có sẵn rộng rãi hơn com-munitykhoa học và do đó có nhiều nghiên cứu gần đây đã sử
dụng cách tiếp cận này cho các nước đang phát triển các mô hình bệnh tật và các chiến
lược cho gen có apy. Ví dụ đầu tiên tại vivo gen chỉnh sửa với CRISPR/Cas9 tham gia sửa
chữa của một

mô

hình chuột loại tyrosin-emia di

truyền tôi sau tiêm tĩnh

mạch thủy đuôi plasmid DNA thành mice [216], mặc dù tổng thể gen chỉnh sửa hiệu
quả tương đối thấp (~ 0.4%), mô hình này cho phép lựa chọn sửa chữa các tế bào để
repopulate gắn và do

đó nó đã

được thể quỷ-strate chỉnh của kiểu

hình bệnh. Mặc


dù phương pháp này nakedDNA giao hàng đến gan có khả năng không thể dịch với con
người, nghiên

cứu này là một bước

ngoặt trong việc

chứng

minh tại vivo gen chỉnh

sửa với CRISPR/Cas9 trong mô dành cho người lớn.
Ngoài gen correction, gián đoạn của gen đặc biệt trong gan cũng có thể có một tác
dụng mang

lại lợi

ích. Ví dụ,

PCSK9 gen mã

hóa một proteinase gây

ra sự

suy

thoái của các thấp den - sity lipoprotein thụ thể (LDLR). Giảm LDLR mức dẫn đến sự trao
đổi chất thấp LDL cholesterol(LDL-C), tăng mức độ LDL-C, và tăng nguy cơ bị bệnh tim
mạch. Các khám phá của tự nhiên biến thể di truyền dẫn đến cao hay thấp PCSK9 activity và tương ứng với mức cholesterol đã dẫn đến căng thẳng inter-est trong PCSK9 ngăn
chặn các loại thuốc để làm giảm cholesterol [266,267]. Tương phản với Cục quản
lý dược liên

tục, hai nghiên

cứu khác

nhau đã cho thấy rằng một điều

trị duy

nhất của Cas9 và một gRNA PCSK9 nhắm mục tiêu giao cho gan có thể dẫn đến hiệu
quả gen đập và giảm cholesterol levels [226 , 268].
Cuối

cùng, ngoài các gen chỉnh

sửa trong gan, các phương

pháp mới cho văn

hóa và sự khác biệt của con ngườipluripotent tế bào thành func-tế hepatocytes đang cung
cấp tùy

chọn cho ex vivo di

động sửa

antitrypsin muta-tions đã liên

chữa và engraftment vào gan. Ví dụ: α-1-

tụcđược sửa

chữa bởi gen chỉnh

sửa trong con

người iPSCs và sau đó phân biệt vào các tế bào gan thể hiện gene [45] được khôi phục
lại mặc dù đây là loại sản phẩm dựa trên di động có thể phức tạp hơn đáng kể so
với một loại

thuốc vi

rút, các chiến

lược được

mô

tả trong nghiên

cứunày cho phép một toàn diện gen analy-sis của các tế bào sửa đổi.

Rối loạn thần kinh cơ
Tiến

bộ gene tế

bào và phân

phối ghép hệ thần kinh trung ương và xương và cơ tim đã tạo
hội mớicho các gen và tế

bào điều

cả DMD, dystrophies muscular nịt

trị cho các rối
lưng chân

loạn thần

ra những
kinh

cơ

cơ, bao

tay, teo cơ xương

Friedreich ataxia, Huntington

gồm

sống, của
của dis-dễ

dàng và amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Trong lớp này của bệnh, gen chỉnh
sửa đã vậy, đến nay tiến hầu hết promi-nently cho DMD, mặc dù các chiến lược có thể áp
dụng bộ gen chỉnh sửa cho các điều kiện khác có thể được hình dung. DMD được gây
ra bởi đột biến dystrophin gene, phổ biến nhất lớn dele-tions chuyển gen hạ lưu đoạn ra


khỏi khung hình và đưa ra các sản phẩm protein nonfunctional. Bởi vì các trình tự mã hóa
của gen dystrophin đặc biệt lớn (14 kb), nó không thể được đóng gói vào kích thước giới
hạn

giao

hàng

viral

vectơ. Dù cắt

ngắn minigenes đã được phát

triển phù

hợp với vectơ virus, họ chỉ một phần chức năng so với gen dàivà khả năng của họ để đảo
ngược bệnh nhân vẫn còn được xác định. Vì những lý do, và vì không hiện không có liệu
pháp được chấp thuận có sẵn cho DMD, gen chỉnh sửa để sửa chữa các gen nội sinh là đặc

biệt hấp dẫn. Sớm báo cáo đề xuất một cơ chế sửa chữa dystrophin genvới các gen chỉnh
sửa, [269] và sau đó là bằng chứng của nguyên tắc experi-ments trong nuôi cấy tế
bào từ bệnh nhân DMD chứng tỏ dys-trophin gen sửa chữa bằng cáchnhắm mục tiêu hội
nhập của exons [270] đã bị xóa hoặc khôi phục lại biểu hiện protein dystrophin bởi nhắm
mục

tiêu

theo shift-ing của khung đọc bởi trung

gian

NHEJ indels

[17]. Tuy

nhiên, những chiến lược hai bị chỉ là một giới hạn dân kiên nhẫn với bất kỳ chiến lược cụ
thể gen chỉnh sửa địa chỉ hoặc thiếu dự đoán và đáng tin cậy kết quảchỉnh sửa do sự phụ
thuộc vào ngẫu nhiên trung gian NHEJ DNA repair, tương ứng. Do đó, các nghiên cứu gần
đây đã tập trung vào việc xoá một hoặc nhiều exon với sự kết hợp của nucleases để tạo
ra các protein chính xácphục hồi sản phẩm và địa chỉ các phân số lớn hơn của DMD bệnh
nhân population

[32–34], điều

này bao

300 kb gen ADN gồm exon 45-55 có

gồm một

thể được áp

chiến

lược duy

dụng để khôi

nhất xóa

phục

>

lại biểu

hiện dystrophin trong 62% của DMD patients [33] Để phát triển điều này vào một cách tiếp
cận có khả năng có thể được áp dụng lâm sàng cho bệnh nhân DMD , làm việc gần
đây đãtích hợp hệ thống CRISPR/Cas9 vào AAV vectơ với tropism cho skel-muscle [35–
37] etal và tim khi áp

dụng tại

lar tiêm hoặc quan qua tiêm tĩnh
sửa bởi CRISPR/Cas9 khôi

địa

phương thông

mạch cho một mô

qua intramuscu-

hình chuột của DMD, gene chỉnh

phục expres-sion dystrophin protein và bệnh

lý được

cải

thiện cơ bắp và sức mạnh. Đáng chú ý, một nghiên cứu cho thấy tương đối hiệu
quả trong vivo gen chỉnh sửa của tế bào tổ tiên cơ tích cực Pax7 có thể hành động như
là một nguồn tái
pháp tịnh này xây

tạo các tế

bào trong đó gen dystrophin đã là repaired.36 phương

dựng trên con

sửa trong cơ xương với adenoviral delivery

quỷ-stration của gen tạivivo chỉnh
[271] và chỉnh

sửa dystrophin đột

biến trong đơn bào chuộtembryos [41] để đảo ngược các triệu chứng bệnh. Trong tương lai,
những nỗ lực này có thể được mở rộng với liệu pháp tế bào bằng cách sử dụng loại có


nguồn gốc bệnh nhân tế bào, chẳng hạn như tế bào iPS, mà có thể được chỉnh sửa bởi gen
củ-tion hoặc nhắm mục tiêu dystrophin transgene insertion [272] và mở rộng cho một số
lượng lớn và hiệu quả engrafted vào cơ tissue [34,273].
Rối loạn da
Sự phát triển của thiết kế da ghép từ tế bào tự thân và allogeneic, bao gồm các tế
bào iPS, ở đây là tạo ra quan hệ opportuni mới cho việc điều trị các bệnh di truyền ảnh
hưởng đến da. Ví dụ, Lặn dystrophic epidermolysis bullosa là một bệnh gây ra bởi những
đột biến gen mã hoá loại VII collagen. Này phá vỡ các loại VII collagen biểu hiện kết
quả mở rộng làn da xỉn-ing. Điều này có thể chữa bằng cách chỉnh các tế bào bệnh
nhân với bộ

gen chỉnh

[274]. Trong một nghiên

sửa và sử
cứu kỹ

sư, đột

dụng những tế

bào da tự

biến để loại VII collagen genđã

thân grafts
được chỉnh

sửa trong chính bệnh nhân fibroblasts rằng đã được sau đó repro - grammed vào các tế
bào iPScó thể được sử dụng để tạo cấu trúc da ở vivo[275]. Một nghiên cứu khác cũng sửa
chữa bệnh gây ra muta-tion trong các tế bào bệnh nhân IP , và sử dụng các tế bào để tạo ra
các biểu mô keratinocyte tấm, dẫn đến phân tầng biểu bì trong ống nghiệm ở nền văn
hóa organotypic và tại vivo ở mice [276].
Rối loạn mắt
Các thành

công gần

trị của Amaurosis bẩm
hàng vào spotlight lĩnh

đây trong các thử

nghiệm lâm

sinh Leber loại 2 (LCA2) đã đẩy võng
vực trị

liệu gen. Sử

cận augmentationgene, tiêm subretinal AAV mã

sàng

mạc dis-đơn

dụng một cách

hóa gen RPE65 đầy

trong điều

đủ đã

đặt
tiếp

được tìm

thấy để được an toàn và hiệu quả. Các tạp chí chính thức của Hiệp hội người Mỹ của liệu
pháp gen & tế bào, nhiều đồng thời trials.277–280 LCA là nguyên nhân hàng đầu của trẻ
em-khói mù và được gây
[281] LCA10, các hình

ra bởi đột
thức

biến ở
phổ

ít nhất 18 ent khác

với genes

biến nhất của LCA, là do đột

biến trong gen CEP290kb khoảng 7.5, và do đó không amenable để các phương pháp trị
liệu gen tiêu chuẩn làm việc cho LCA2 do kích thước lớn của các gen gây bệnh. Trong khi
một nghiên cứu trong ống nghiệm bằng chứng của khái niệm sử dụng lentivirus để cung
cấp đầy đủ transgene cho các tế bào có nguồn gốc iPSC photoreceptor precur-sor, [282] an
toàn đã được chứng minh subretinal AAV giao hàng làm cho một gen chỉnh sửa chiến
lược, trong đó các thành phần nuclease được phân phối qua AAV, đặc biệt hấp dẫn. Như là


bằng chứng của nguyên tắc gene chỉnh sửa cho bệnh này, S. aureus Cas9 được sử
dụng để xóa một vùng intronic trong CEP290 gen có chứa một đột biến thường xuyên tạo
ra một trang web bất thường splice sẽ phá vỡ các gen mã hóa sequence[283] xóa của khu
vực intronic này khôi phục đúng CEP290 biểu hiện. Gene chỉnh sửa duy nhất cũng là positioned để rối loạn chi phối NST thường địa chỉ như các hình thức của bệnh tăng nhãn áp
góc mở chính và retinitis pigmentosa, mà có thể có khả năng được điều trị bằng loại nhắm
mục tiêu trực tiếp của các gen MYOC và RHO, tương ứng.
Rối loạn hô hấp
Xơ nang gây

ra bởi đột

năng của kênh clorua này kết

biến để CFTR clorua chan-nel.Mất các chức

quả trong dysregula-tion biểu

mô vận

chuyển chất

lỏng trong một sốcơ quan. Đặc biệt, mất mát thích hợp vận chuyển chất lỏng trong phổi kết
quả trong dày lên của chất nhầy và do đó thường xuyên bị nhiễm trùng và biến chứng hơi
thở-ing. Gene chỉnh

sửa đã được sử

dụng để sửa

chữa đột

biến CFTR trong văn

hóa bệnh đường ruột cells50 và IP tế bào gốc mà có thể được sau đó phân biệt thành biểu
mô cells [284,285] mặc dù một thách thức lâu dài cho cácliệu pháp gen và gen chỉnh
sửa cho cys-tic xơ đã đạt được hiệu quả gen giao cho biểu mô phổi, một nghiên cứugần
đây chứng tỏ chức năng chỉnh sửa của những con chuột bị xơ nang sau mũi giao nanoparticles chở peptidetriplex

tạo

thành các phân

tử axit nucleic là một tiến bộ rất hứa

hẹn trong regard [286].
Antimicrobials
Ngoài cách

thay

đổi gen trong bộ gen của

con

người, córất nhiều cách mà bộ

gen chỉnh sửa có thể được sử dụng đến địa chỉ người bệnh và cải thiện sức khỏe con
người bằng cách nhắm mục tiêu các bộ gen của sinh vật khác. Chính ví dụ này là phiên
bản tại applica-tion gen chỉnh sửa để tấn công gây bệnh do vi khuẩn infections [24]. Ví
dụ, chỉnh sửa gen nucleases có thể được thiết kế để gen mục tiêu trao virulence hoặc kháng
sinh kháng. Ngoài ra, nhắm mục tiêu theo trình tự gen cụ thể cho các chủnggây bệnh có
thể tạo điều kiện cho họ loại bỏ chọn lọc từdân hỗn hợp. Hai nghiên cứu gần đây đã chứng
minh bằng

chứng

của

thống CRISPR/Cas9 để loại
[287] và một mô

nguyên
bỏ các vi

hình bướmnhiễm ấu

tắc của phương

pháp này sử

khuẩn trong

một chuột da thực

trùng,

[288], cũng như chọn

dụng hệ
dân model
lọc loại

bỏ các plasmid và vi khuẩn popula-tions. Là một chiến lược thay thếhấp dẫn để cung