nghiên cứu môi trường nhân giống lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM


BÙI THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG LAN KIM
TUYẾN (Anoectochilus setaceus) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI
CẤY MÔ – TẾ BÀO
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
NGÀNH: SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm

Thái Nguyên, năm 2013
1


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đề tài, em luôn nhận được sự sự giúp đỡ, chỉ bảo, đóng
góp ý kiến hết sức quý báu của thầy cô, gia đình và bạn bè.
Em xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học sư phạm – Đại học Thái
Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá
trình học tập và nghiên cứu đề tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS Nguyễn Thị Tâm, người đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo để em hoàn thành đề tài.
Đồng thời, em cũng xin cảm ơn KTV Trần Thị Hồng phòng thí nghiệm Công nghệ
Tế bào đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em tiến hành các thí nghiệm của đề tài.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè luôn quan tâm, ủng
hộ và tạo động lực cho em để em hoàn thành đề tài này.
Trong quá trình làm đề tài không tránh khỏi những sai sót, em rất mong nhận được

những ý kiến đóng góp chân thành từ phía thầy cô và các bạn.
Xin chúc các thầy cô và các bạn luôn khỏe mạnh và thành công!
Thái Nguyên, ngày 15 tháng 03 năm 2013
Người thực hiện

Bùi Thị Huyền

2


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ...................................................................................................................... i
Mục lục ........................................................................................................................... ii
Danh mục bảng ............................................................................................................. iv
Danh mục hình .............................................................................................................

v

Danh mục chữ viết tắt .......................................................................................................vi
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1. Một vài nét giới thiệu về họ phong lan và cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus
setaceus) ............................................................................................................................ 3
1.1.1. Một vài nét giới thiệu về họ phong lan ................................................................... 3
1.1.2. Một vài nét giới thiệu về cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) .............. 3
1.2. Kĩ thuật nuôi cấy in vitro trong công nghệ tế bào thực vật .................................... 7
1.2.1. Cơ sơ khoa học của kĩ thuật in vitro ...................................................................... 7
1.2.2. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nhân giống in vitro......... 8
1.2.3. Các phương thức nhân giống in vitro ................................................................... 8

1.2.4. Quy trình nhân giống in vitro ........................................................................... 10
1.2.5. Một số thành tựu trong nhân giống in vitro ..................................................... 11
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 16
2.1. Vật liệu thực vật ..................................................................................................... 16
2.2. Hóa chất, thiết bị ..................................................................................................... 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 18
2.3.1. Phương pháp pha môi trường nuôi cấy ............................................................. 18
2.3.2.Thăm dò môi trường nuôi cấy .............................................................................. 19
2.4. Tính toán kết quả

................................................................................................. 20

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 21

3


3.1. Ảnh hưởng của BAP lên sự phát sinh chồi và tạo protocorm của lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus)

...........................................................................................21

3.2. Ảnh hưởng của kinetin lên sự phát sinh chồi và tạo protocorm của lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) ...............................................................................................26
3.3. Thăm dò ảnh hưởng của α- NAA đến sự phát sinh rễ của lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus)

............................................................................................30

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................................35

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................36

4


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường Phytamax ............................................. 18
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của BAP tới tỷ lệ mô sống, tỷ lệ mô tạo chồi và tỷ lệ mô tạo
protocorm ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)................................................... 22
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP tới sự bật chồi ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)
..........................................................................................................................24
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin tới tỷ lệ mô sống, tỷ lệ tạo chồi và tạo protocorm ở lan
Kim Tuyến ( Anoectochilus setaceus)

.................................................................

27

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của kinetin tới sự bật chồi ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus
setaceus) ..........................................................................................................................28
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của α- NAA đến sự ra rễ ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)
........................................................................................................................ 32

5


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cây và cụm hoa lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)............... 6
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm nhân giống lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) ..... 18
Hình 3.1. Biểu đồ ảnh hưởng của các nồng độ BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm

ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) sau 8 tuần nuôi cấy .................................. 25
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) sau 8 tuần nuôi cấy ............................................................. 26
Hình 3.3. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của các nồng độ kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo
protocorm ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) sau 8 tuần nuôi cấy ................ 29
Hình 3.4. Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) sau 8 tuần nuôi cấy ............................................................... 30
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của các nồng độ α – NAA tới sự ra rễ của lan Kim
Tuyến (Anoectochilus setaceus)................................................................................... 34
Hình 3.6. Ảnh hưởng của α – NAA tới sự ra rễ ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)
sau 8 tuần nuôi cấy

....................................................................................

6

34


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
- CT:

Công thức

- ĐC:

Đối chứng

- KTST:

Kích thích sinh trưởng

- PM:

Môi trường PM (phytamax)

- BAP:

6 – benzyl amino purin

- α – NAA:

Axit α- Naphtyl axetic

7


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay cùng với sự phát triển nhanh chóng của đời sống xã hội, nhu cầu về hoa
tươi trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng tăng nhanh hơn bao giờ hết. Trong
đó hoa lan trở thành loại sản phẩm có giá trị kinh tế cao, chiếm vị trí dặc biệt trong thị
trường hoa tươi các loại và đã được xuất khẩu lưu thông như một ngành thương mại. Bởi
từ ngàn năm nay, loài thảo mộc này đã được rất nhiều người ưa chuộng. Họ bị quyến rũ
bởi màu sắc hài hòa, trang nhã của các bông hoa cũng như mùi hương và những tinh dầu
có thể trích ra từ chúng [7]. Ngoài mặt thẩm mĩ, khoa học, chúng còn có giá trị về kinh tế.
Gía các loài lan quý dao động từ 400-10.000 USD/cây [11]. Chính vì thế mà hoa lan đã
được mệnh danh là nữ chúa các loài hoa và là mục tiêu săn tìm của rất nhiều người, đặc
biệt là những người yêu thích hoa.
Cây lan Kim Tuyến có tên khoa học là Anoectochilus setaceus, thuộc loài địa lan

trong họ lan (Orchidaceae). Cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) không những
được dùng làm cảnh mà còn là một loài thảo dược có giá trị và tiềm năng rất lớn. Cây
dùng làm thuốc chữa bệnh, tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng
khuẩn, chữa ung thư [31].
Những loài lan quý ở Việt Nam được các chuyên gia nghiên cứu về phong lan
đánh giá rất cao [23]. Song quá trình nuôi trồng lan ở nước ta lại mang tính chất cá nhân
lẻ tẻ. Nguồn giống chủ yếu từ khai thác lan rừng trong khi nguy cơ cạn kiệt nguồn lan
rừng đang được báo động bởi tình trạng khai thác lan bừa bãi như hiện nay. Vì thế để đáp
ứng nhu cầu thị trường cũng như để thương mại hóa ngành sản xuất lan thì cần phải có
một nền kĩ thuật cao mà trước hết phải có một công nghệ nhân giống thật hiện đại. Đó
chính là công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Công nghệ này đã trải qua hơn một trăm
năm hình thành và phát triển, đem lại giá trị to lớn cho loài người [8]. Ở Việt Nam kĩ
thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng từ giữa những
năm 80 của thế kỉ XX. Những kết quả bước đầu trong nghiên cứu và ứng dụng đã đạt

8


được kết quả khả quan đối với một số đối tượng cây trồng như: chuối, khoai tây, phong
lan, lúa… [4],[8].
Với những giá trị rất lớn trong y học, hiện nay cây lan Kim Tuyến bị thu hái nhiều
tới mức cạn kiệt ngoài tự nhiên. Hiện nay lan Kim Tuyến được cấp báo thuộc nhóm IA
của nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại [27] và là
nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d trong sách đỏ Việt Nam [3].
Từ những thực tế trên đồng thời góp phần bảo tồn các loại lan rừng quý hiếm,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu môi trường nhân giống lan Kim
Tuyến (Anoectochilus setaceus) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tìm được môi trường thích hợp cho việc nhân giống lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) trong ống nghiệm.

3. Nội dung nghiên cứu
1) Thăm dò ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (KTST) thuộc
nhóm xytokinin (BAP và kinetin) lên sự phát sinh chồi của lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) trong ống nghiệm.
2) Thăm dò ảnh hưởng KTST của nhóm auxin (NAA) đến việc ra rễ của chồi
lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) trong ống nghiệm.

9


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một vài nét giới thiệu về họ phong lan và cây lan Kim Tuyến
1.1.1. Một vài nét giới thiệu về họ phong lan
Họ Lan, hay họ Phong lan (Orchidaceae) là họ thực vật có hoa, thuộc bộ Măng tây
(Asparagales), lớp thực vật một lá mầm. Họ Phong lan là một trong những họ lớn nhất
của thực vật [27] và có các thành viên trên toàn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực. Có loài
lan sống dưới mặt đất và chỉ nở hoa trên mặt đất cũng như có loài lan sống tại vùng cao
nguyên của dãy núi Himalaya. Hoa lan có thể tìm thấy tại các vùng có khí hậu nhiệt đới
như trong rừng già của Brasil đến các vùng có tuyết phủ trong mùa đông như tại bình
nguyên của Manitoba, Canada. Các loài lan chủ yếu mọc trên cây cao, sống biểu sinh lâu
năm. Chúng được gọi chung là phong lan. Bên cạnh đó cũng có các loài mọc trong đất gọi
là địa lan và một số mọc trên đá gọi là thạch lan [9]. Số lượng loài lan cao gấp 4 lần số
lượng loài động vật có vú hay hơn 2 lần số lượng loài chim. Nó chiếm khoảng 6 – 11 %
số lượng loài thực vật có hoa [28]. Hoa lan được nhiều người tiêu dùng ưa chuộng vì vẻ
đẹp đặc sắc và các hình thức đa dạng của chúng. Hoa lan có màu sắc rất phong phú. Hoa
nhỏ nhất chỉ bằng hạt gạo trong khi hoa lớn nhất có đường kính khoảng 1m. Đa số các
loại lan được bán rộng rãi trên thị trường thường không có mùi thơm, nhưng trong tự
nhiên có rất nhiều loại hoa lan có mùi thơm đặc trưng. Vanilla là một loại hoa lan mà
hương thơm được dùng trong các loại ẩm thực của thế giới và có nguồn gốc từ Mexico,

trong khi đó có loài hoa lan tỏa ra mùi khó chịu như thịt bị hỏng để hấp dẫn các loài côn
trùng [28].
1.1.2. Một vài nét giới thiệu về cây lan Kim Tuyến
1.1.2.1. Phân loại và phân bố của lan Kim Tuyến
Phân loại
Lan kim tuyến có tên khoa học là: Anoectochilus setaceus, ngoài ra còn có tên
khác là: Chrysobaphus roxburghi Wall., Anoectochilus roxburghii (Wall.) Wall. Ex Lindl
[26], hay Anoectochilus roxburglihayata [30].

10


Ở Việt Nam, lan Kim Tuyến được gọi bằng nhiều tên khác nhau như: Cây Kim
Cương, lan Gấm, Kim Tuyến, Kim Tuyến Liên, Mộc Sơn Thạch Tùng, Thạch Tằm, Lá
Gấm [30] hay Kim Tuyến Tơ, Giải Thùy Tơ, Giải Thùy Roxburgh, Sứa Hồng, Lan Nhung
Sét, Hoa Hiệp Khai Thần Lan,… [28]; nhưng tên thường gọi là cây lan Kim Tuyến.
Lan Kim Tuyến thuộc Chi (genus):

Anoectochilus

Họ (familia):

Orchidaceae

Bộ (ordo):

Orchidales

Lớp (class):

Liliop

Ngành (phylum):

Magnoliophyta.

Phân bố
Ở Việt Nam, lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) phân bố ở:

Lào Cai

(Sapa), Hà Giang (Quản Ba), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức, Chùa
Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô, Đắc Uy), Gia Lai (Kbang, Kon Hà
Nừng);
Trên thế giới, lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) xuất hiện ở: Trung Quốc
(Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Indonexia [26].
1.1.2.2. Đặc điểm sinh học của cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)
Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) thuộc cây thân thảo, mọc ở đất, có thân
rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất với các đặc điểm [12] :
Thân rễ: nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Chiều dài thân rễ từ
5,0cm - 12,0cm, trung bình là 7,9cm. Đường kính thân rễ từ 3,0mm -4,0mm, trung bình là
3,2mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,0 lóng. Chiều dài lóng từ 1,0cm 6,0cm, trung bình là 2,0cm. Thân rễ có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường
nhẵn, không phủ lông [12].
Thân khí sinh: thường mọc thẳng lên trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều dài
thân khí sinh từ 4,0-8,0 cm, trung bình là 6,0 cm. Đường kính thân khí sinh từ 3,0-5,0cm,
trung bình là 3,1cm.Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số
lóng trên thân khí sinh thường từ 2-4 lóng, trung bình là 2,9 lóng. Chiều dài mỗi lóng là

11

1,0 - 4,0cm, trung bình là 2,2cm. Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ
lông, thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt [12].
Rễ: được mọc ra từ các mấu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân
khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mấu chỉ có một rễ, đôi khi
có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng
thay đổi tùy theo cá thể. Số rễ trên một cây từ 3-10, trung bình là 5,4. Chiều dài rễ thay
đổi từ 0,5cm - 8,0 cm. Rễ dài nhất trung bình là 6,7cm, ngắn nhất trung bình là 1,2cm.
Chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,8cm [12].
Lá: mọc cách, xoắn quanh thân cây, xòe trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở
gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3,0cm - 5,0cm, trung bình là 4,0cm,
và rộng từ 2,0-4,0cm, trung bình là 3,1cm. Lá có màu nâu đỏ ở bên trên và có lông phủ
mịn như nhung. Hệ gân có mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này
thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt
dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ,
gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ. Cuống lá dài 0,6cm - 1,2cm, thường nhẵn và có màu
trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ
2 - 6 lá, thông thường là 4 lá. Kích thước của lá cũng thay đổi. Các lá trên một cây thường
có kích thước khác nhau rõ rệt [12].
Hoa quả: cụm hoa dài 10cm - 20 cm ở ngọn thân, mang 4-10 hoa mọc thưa. Lá
bắc hình trứng dài 6,0mm - 10mm, màu hồng. Các mảnh bao hoa dài khoảng 6,0 mm,
cánh môi màu trắng, dài đến 1,5cm. Ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, chẻ đầu đôi. Mùa
hoa tháng 10-12, mùa quả chín tháng 12-3 năm sau [12].

12


Hình 1.1 Hình ảnh cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)
1.1.2.3. Một số ứng dụng của cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) trong y học
Theo Đông y, lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) có vị ngọt, hơi chát, tính

mát, có tác dụng chữa thần kinh suy nhược, ho khan, đau họng, cao huyết áp, suy thận;
chữa di tinh, đau lưng, phong thấp, làm tiêu đờm, giải độc, giải nhiệt, viêm khí quản,
viêm gan mãn tính, an thần, nhuận phế (mát phổi) và tăng cường sức khỏe, làm khí huyết
lưu thông [31].
Cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) được thu hái toàn cây quanh năm,
rửa sạch, đun tươi hay phơi khô dùng dần. Trước đây, khi giá trị của lan Kim Tuyến chưa
được biết tới, người dân thường hái về nấu canh ăn, vị ngọt mát như rau mồng tơi. Những
nguồn tài liệu về y học của Đài Loan cho thấy cây lan gấm lại là vị thuốc được coi là rất
quý [31].
Sách Thanh thảo gia đình tự nhiên liệu pháp ghi: trẻ em hay khóc dùng kim tuyến
liên sắc uống sẽ khỏi.
Sách khoa học quốc dược cho rằng: “Kim tuyến liên là một trong những dược thảo
quý, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan” [31].
Những công trình nghiên cứu của ngành dược học và kinh nghiệm của các thầy
thuốc Đài Loan cho thấy lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) có một số công dụng
sau: Toàn thân cây thuốc được dùng để làm tăng cường sức khỏe, chủ trị bệnh phổi, di
tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tì và còn có tác dụng bổ máu. Lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) có vị ngọt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, hạ sốt, giải trừ u
uất, phiền muộn, thanh huyết, bổ phổi, thông trung khí, bồi dưỡng sức khỏe, trẻ con chậm
lớn, suy thận. Ngưới dân tộc miền núi (Đài Loan) thường dùng Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) để sắc uống trị đau ruột, đau bụng, sốt cao, đắp bên ngoài để trị
các chỗ sưng vết thương và chỗ bị rắn cắn. Thanh huyết, nhuận phổi, trị bệnh phổi, trị
bệnh cao huyết áp : sắc uống với nước đường [31].

13


Theo ông Trần Ngọc Lâm, các thiền sư Tây Tạng sử dụng Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) để tăng cường sức khỏe, giải độc cơ thể, trị ung thư. Vận động
viên của Trung Quốc thường dùng cỏ nhung trước các cuộc thi đấu bởi nó có tác dụng

chẳng kém gì doping. Viện quân y Trung Quốc sử dụng Kim Tuyến (Anoectochilus
setaceus) cùng một số vị khác trong điều trị ung thư từ rất lâu rồi. Nhưng Kim Tuyến còn
có một tác dụng thần kì mà người Việt chưa biết đó là có khả năng tái tạo tế bào gan. Với
tác dụng này, lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) thực sự là thần dược, cỏ trường
sinh, quý hơn vàng ròng [30].
1.2. Kĩ thuật nuôi cấy in vitro trong công nghệ tế bào thực vật
Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn
chỉnh từ các bộ phận, cơ quan như chồi, mắt ngủ, đoạn thân, lá… của cây mẹ ban đầu
thông qua kĩ thuật nôi cấy in vitro. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật dùng để chỉ tất
cả các phương pháp nuôi cấy sử dụng nguyên liệu thực vật sạch (tế bào đơn, mô,…) trên
môi trường nhân tạo ở điều kiện vô trùng [4].
1.2.1. Cơ sơ khoa học của kĩ thuật in vitro
Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là tính toàn năng của
tế bào thực vật. Thuật ngữ tính toàn năng của tế bào thực vật được Habertland (Đức) đề
xuất năm 1902. Đó là mọi tế bào thực vật đều có khả năng biểu hiện toàn bộ tiềm năng di
truyền và phát triển thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy phù hợp. Nhờ cơ chế
nguyên phân các tế bào đều được sinh sản từ một tế bào gốc ban đầu. Nên chúng mang
thông tin di truyền giống nhau, giống với tế bào mẹ ban đầu và đều có khả năng phát triển
thành một cây hoàn chỉnh [4].
1.2.2. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính của công
nghệ tế bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các đặc điểm sinh trưởng
hoặc các mô phân sinh trong cây. Theo các công trình nghiên cứu, chỉ có đỉnh sinh
trưởng của chồi mới đảm sự ổn định về di truyền, tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích
thước nhỏ và kết hợp xử lí nhiệt làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [20].

14


Kĩ thuật nhân nhanh giống được sử dụng nhằm mục đích: (1) Duy trì và nhân

nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn giống; (2) duy trì và nhân nhanh
các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các cây trồng khác nhau; (3) nhân nhanh
trong điều kiện vô trùng cách li đảm bảo cách li với giống không bị bệnh; (4) rút ngắn
thời gian đưa các cây lai và các loài cây tự nhiên có đặc điểm tốt vào vào sản xuất; (5)
bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen.
Ngành công nghiệp nhân giống (in vitro) phát triển và mở rộng trong những năm
gần đây do yêu cầu về chất lượng giống cây trồng tăng lên nhanh chóng trên toàn thế giới
nhằm phục vụ những dự án trồng lại rừng, sản xuất lươg thực thực phẩm, thức ăn gia súc,
nông nghiệp và bảo vệ môi trường. Vì nhân giống in vitro đã mang lại hiệu quả hết sức to
lớn nhờ ưu thế nổi bật. Đó là: (1) hệ số nhân giống cao rút ngắn thời gian đưa con giống
vào sản xuất; (2) nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ; (3) làm sạch
bệnh cây trồng và cách li chúng với các nguồn bệnh; (4) thuận tiện việc vận chuyển và
bảo quản, (5) sản xuất quanh năm,quy trình sản xuất có thể được vận hành trong bất cứ
thới gian nào trong ngày, mùa nào trong năm [23].
1.2.3. Các phương thức nhân giống in vitro
1.2.3.1. Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng
Khái niệm mô phân sinh chỉ đúng khi mẫu vật nuôi cấy được tách đúng từ đỉnh
sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của đỉnh sinh trưởng [4]. Trong
thực tế, mẫu nuôi cấy được tách với kích thước như vậy chỉ khi nào người ta tiến hành
nuôi cấy với mục đích làm sạch bệnh cây trồng, do đó phải kết hợp các yếu tố tìm ra
phương thức lấy mẫu tối ưu. Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ phát
triển thành một hay nhiều chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ đầy
đủ.
Xét về nguồn gốc của cây có 3 khả năng:
-

Cây phát triển từ chồi đỉnh ( Chồi ngọn),

-

Cây phát triển từ chồi nách,

-

Cây phát triển từ chồi mới phát sinh.

15


Ở lan có sự phát triển qua giai đoạn dẻ hành (protocorm) cùng một lúc đỉnh sinh
trưởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm lại tiếp tục phân chia cho ra các
protocorm mới hay các chồi mới tạo cây hoàn chỉnh [4].
1.2.3.2. Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
Ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công các bộ
phận còn lại của một cơ thể thực vật đều có thể ứng dụng cho việc nhân giống in vitro [4]
như các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, các bộ phận của hoa, nhánh củ…
1.2.3.3. Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo
Trong khuôn khổ của mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn
chỉnh trực tiếp từ mẫu cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các
cây cũng đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy
không tái sinh cay ngay mà phát triển thành khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo khi cấy nhiều lần
sẽ không ổn định về mặt di truyền. Thông qua mô sẹo có thể thu được những cá thể sạch
virút như trường hợp của Kehr và Sechaffer thu được ở tỏi.
Một phương hướng nhân giống vô tính nữa là tạo phôi soma từ tế bào mô sẹo. Cho
đến nay thành công ở hai đối tượng đó là: Cà rốt (Daucus carota) và thuốc lá (Nicotiana
tabacum) [4].
1.2.4. Quy trình nhân giống in vitro
Theo Đỗ Năng Vịnh (2002) quy trình nhân giống in vitro gồm 5 giai đoạn sau đây:
Giai đoạn 1: Chuẩn bị vật liệu khởi đầu
Vì trong nuôi cấy cây con sẽ mang lại những đặc tính và tính trạng của cây mẹ ban

đầu nên trong giai đoạn này cần chọn lọc cay mẹ cẩn thận, cay mẹ thường là cây tốt,có
giá trị kinh tế cao. Sau đó chọn cơ quan để lấy mẫu thường là mô non, chồi thâncó chồi
ngủ, lá non, hoa non … Mô chọn để nuôi cấy thường có khả năng tái sinh cao trong môi
trường nuôi cấy sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý báu của cây mẹ, ít có nguy
cơ biếm dị [23].
Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

16


Là giai đoạn chuyển mẫu vật vào môi trường nuôi cấy, giai đoạn này được tiến
hành theo các bước:
Một là: Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các mẫu nuôi cấy.
Hai là: Cấy mẫu vật liệu đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn
môi trường nhân tạo đảm bảo điều kiện vô trùng.
Ba là: Nuôi cấy mẫu cấy trong phòng nuôi với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh
sáng… thích hợp. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy đã xuất hiện các cụm tế
bào, các cơ quan hoặc các phôi vô tính. Giai đoạn này yêu cầu từ 2-12 tháng hoặc ít hơn
4 lần cấy các mảnh [23].
Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống, quyết định hiệu quả của quy trình nuôi
cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy. Khi mẫu cấy sạch đã
được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt quá trình
nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất. Người ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất
trong điều kiện nuôi cấy. Thành phần và điều kiện môi trường cần tối ưu hóa nhằm đạt
được mục tiêu nhân nhanh. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường từ 1-2 tháng
loài cây. Tỉ lệ nhân nhanh khoảng 2-8 lần sau mỗi lần cấy chuyển. Nhìn chung giai đoạn
này thường kéo dài từ 10-36 tháng, giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu
không nên kéo dài quá lâu [23]. Ví dụ: Từ đỉnh sinh trưởng của cây chuối chọn lọc ban
đầu người ta chỉ nhân lên 2000-3000 chồi sau 7-8 lần cấy chuyển để tránh biến dị soma.

Đối với các cây khác như mía, hoa cúc, phong lan sau một năm có thể nhân lên 1.000.000
chồi từ cây mẹ ban đầu [20].
Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi được hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng
thông thường các chồi này phải chuyển sang một môi trường khác để ních thích tạo rễ. Ở
một số loài khác thì các chồi sẽ tạo rễ trước khi chuyển trực tiếp ra đất, thông thường giai
đoạn này cần 2-8 tuần [16].
Giai đoạn 5: Chuyển ra đất trồng

17


Đây là giai đoạn đầu cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thì nghiệm
ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này quyết định khả năng ứng dụng của quy trình
nhân giống in vitro. Đối với một số loài có thể chuyển cây ra đất khi cây chưa có rễ, nhưng
đối với đa số các loài cây trồng thì sau khi chồi đã tạo rễ và tạo cay hoàn chỉnh mới được
đưa ra vườn ươm. Qúa trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu được chăm
sóc đặc biệt. Vì vậy khi chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những
điều kiện khó khăn hơn nên vườn ươm cần phải đáp ứng các yêu cầu: che cây con bằng
nilon bao phủ, có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm mát cây, giá thể trồng cây
có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển, giai
đoạn này thường đòi hỏi 4-16 tuần [20].
1.2.5. Một số thành tựu trong nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được hình thành và phát triển từ những năm 80 của
thế kỉ XX và đã được ứng dụng trong các lĩnh vực: Nhân giống vô tính in vitro, nuôi cấy
mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cay sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro,
tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo [23].
Kĩ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng để nhập
khoảng 500 triệu cây giống trong một năm ở các giống cây trồng khác nhau. Dự kiến trên
thị trường cây giống, kĩ thuật nuôi cấy mô thu được khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăng

trưởng của thị trường này hàng năm vào khoảng 15% [23].
Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kĩ thuật in vitro được nhiều
cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng khác nhau như: cây rừng, cây
lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, dược liệu…
Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá do nhiều do
nhiều nguyên nhân khác nhau. Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ cho
công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nhà nước ta, hàng loạt quy trình nhân giống
in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo ra lượng lớn cây giống có chất lượng
tốt. Pomu (Fokienia hodginsii (Dun) A. Henry & H.H. Thomas) được xếp vào lọai cây gỗ
quý Việt Nam nhưng đang bị khai thác mạnh nên số lượng giảm nhanh. Nguyễn Thế Anh,

18


Trần Văn Minh (2007) đã nuôi cấy chồi đỉnh trên môi trường WPM để nghiên cứu khả
năng vươn thân và ra rễ của cây Pơmu và nhận thấy cây Pơmu vươn thân tốt nhất trong
môi trường WPM + IBP 0,3 mg/l + dịch chiết nấm men 1g/l, rễ nhiều và dài nhất trên môi
trường WPM + IBP 5mg/l sau 45 ngày nuôi cấy [2]. Năm 2009, Nguyễn Thị Tâm và CS
đã nghiên cứu quy trình nhân giống cây dẻ Trùng Khánh bằng kĩ thuật in vitro. Tác giả đã
chỉ ra môi trường kết hợp BAP 0,5mg/l + NAA 0,2 mg/l cho khả năng tạo đa chồi tốt nhất
và môi trường có thành phần : WPM + agar 8,5 g/l + đường glucose 25 g/l + nước dừa
200 ml/l + NAA 0,2 g/l có ảnh hưởng tốt nhất đến sự ra rễ của chồi dẻ tronh ống nghiệm.
Đề tài đã góp phần bảo tồn nguồn gen quý của giống dẻ Trùng Khánh – Cao Bằng [19].
Kĩ thuật nuôi cấy mô và tê bào thực vật phục vụ nhân giống cây trồng đã triển khai
trên 20 năm ở nước ta. Nhân giống thương mại quy mô lớn đã đạt được ở một ố cây trồng
như nhân chuối (nhân khoảng 2 triệu cây/năm ); nhân nhanh khoai tây sạch bệnh; nhân
nhanh giống mía nhập nội, trong vài năm đã tạo ra 5.330 ha mía giống mới K84 -200 từ
một ngọn mía nhập nội từ Thái Lan; nhân nhanh các giống bạch đàn chọn lọc và keo lai
đạt công suất 3 triệu cây/năm. Quy trình công nghệ nhân nhanh giống chuối và giống mía
đã được Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn công nhận và áp dụng để chuyển gen

kháng sâu đục thân [23].
Nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, rất thích hợp cho nhũng loài cây ăn
quả nhiệt đới phát triển. Hiện nay, nươc ta có rất nhiều vùng chuyên canh cây ăn quả
dược mở rộng, phục vụ cho nhu cầu xuất khẩu, nhu cầu công nghiệp chế biến nước hoa
quả. Bằng công nghệ nuôi cấy mô –tế bào thực vật đã co nhiều công trình được công bố
trên các đối tượng khác nhau như: đu đủ, dứa, mía….
Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2003), đã tiến hành vi nhân giống cây đu đủ (
Carica papaya linn) từ chồi đỉnh sinh trưởng của cây trưởng thành kích thước 1,0cm –
1,5cm được khử trùng và cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung các chất kích thích
sinh trưởng BAP, IAA, NAA, IBA, Nước dừa. Kết quả đã đưa được quy trình nuôi cấy in
vitro là 30 ngày. Cây con sinh trưởng và phát triển bình thường ngoài môi trường tự nhiên
[22]. Lâm Ngọc Phương và cộng sự (2003) đã tiến hành nhân giống dưa hấu tam bội [14].

19


Trên đối tượng cây cảnh và cây hoa cũng được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và
có nhiều công trình công bố. Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) nghiên cứu nhân giống
in vitro và nuôi trồng giống lan Hài P. hangianum perner Gurss (Hài Hằng). Kết quả
nghiên cứu cho thấy, môi trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi là môi trường RE có
bổ sung nước dừa 150ml/l và chuối chín 100g/l cho hệ số nhân cao nhất (4,3 lần). Bổ
sung α-NAA 0,4mg/l - 0,6mg/l vào môi trường cho khả năng ra rễ tốt nhất [5].
Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro lan
Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Tác giả kết luận, môi trường cơ bản là
phù hợp nhất để nhân nhanh chồi lan Kim tuyến in vitro. Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt
chín và chồi từ thể chồi cao từ 2-3cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường
thích hợp KC, bổ sung BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + NAA 0,3mg/l + nước dừa
100ml/l + dịch chiết khoai tây 100g/l + saccharose 20g/l + agar 7,0g/l + than hoạt tính
0,5g/l [13]. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu xây dựng
quy trình nhân giống và nuôi trồng phong lan Phalaenopsis (lan Hồ Điệp). Giống lan Hồ

Điệp được khử trùng bằng HgCl 2, sau đó được cấy lên môi trường nhân nhanh. Tác giả đã
đưa ra được quy trình nhân giống và nuôi trồng lan Hồ Điệp [17].
Nghiên cứu môi trường nhân giống in vitro giống lan Dendrobium fimbriatum
Hook. (Lan Hoàng Thảo Long nhãn), Nguyễn Thị Sơn (2011) đã khẳng định môi trường
thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi trường MS, bổ sung nước
dừa 100ml/l, saccharose 10g/l, agar 6,0g/l; môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là
môi trường Knud, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 10g/l, khoai tây 60g/l, agar
6,0g/l; môi trường MS, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 20g/l, chuối chín 60g/l,
agar 6,0g/l là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in vitro; môi trường tạo cây hoàn chỉnh
là môi trường RE, bổ sung saccharose 10g/l, than hoạt tính 1,0g/l, agar 6,0g/l [18].
Nguyễn Thái Hà và cộng sự (2003) đã tiến hành nhân giống củ in vitro các giống hoa
Lilium spp. Với giống hoa Lili nhập từ Mĩ được cấy trên môi trường cơ bản MS có bổ
sung các chất điều hòa sinh trưởng, tác giả đã đưa ra được quy trình nhân giống củ in

20


vitro các giống hoa Lilium spp [6]. Trịnh Cẩm Tú và Bùi Trang việt (2006),sử dụng kĩ
thuật nuôi cấy in vitro để nghiên cứu sự phát triển của hoa Dendrobium sonia [23].
Việt Nam có hàng ngàn cây thuốc quý hiếm được ghi tên trong danh lục đỏ. Nhiều
cây thuốc quý có nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác mạnh phục vụ cho việc sản xuất
trên quy mô công nghiệp. Để bảo tồn nguồn gen những cây thuốc quý này quy trình nhân
giống cây dược liệu được nhiều tác giả nghiên cứu, hoàn thiện như: nhân giống vô tính
các dòng Kava (Pipermethysticum G. Forster) có hoạt tính sinh học cao [9]. Với công
trình dòng hóa cây thanh hao (Artemisia annua L.) in vitro tác giả Nguyễn Thị Kim Uyên,
Trần Văn Minh (2007) đã nhân giống trên môi trường LV và nhận thấy: Môi trường có bổ
sung BAP 0,3 mg/l chồi phát triển cả về chiều cao và số lượng. Bổ sung kết hợp BAP 0,5
mg/lvà NAA 0,5 mg/l cho tế bào soma phát sinh đồng đều; cả BAP, NAA, và 2,4 –D đều
có tác dụng kích thích tăng tế bào soma và môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy tăng
sinh tế bào soma là môi trường LV có bổ sung BAP 0,5mg/l + NAA 0,5mg/l. Qua nghiên

cứu cũng thấy rằng, cần thiết nuôi cấy tế bào soma trong điều kiện có chiếu sáng trên môi
trường bán rắn và lỏng [24].

21


Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là giống lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) (sạch, trong
ống nghiệm) do phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học (Institute of
Biotechnology, IBT) (Hoàng Quốc Việt- Cầu Giấy- Hà Nội) cung cấp. Giống lan Kim
Tuyến (Anoectochilus setaceus) là các chồi in vitro có kích thước tương đối đều nhau
đang trong giai đoạn đầu của quá trình sinh trưởng.
2.2. Hóa chất và thiết bị


Hóa chất
Các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và xitokinin, đường glucose,

agar, than hoạt tính, ngoài ra có bổ sung thêm nước dừa, chuối, khoai tây.
Các thí nghiệm được tiến hành trên môi trường cơ bản PM (Phytamax).
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường PM

STT

Thành phần

Nồng độ

STT

Thành phần

(mg/l)
PM1
1

CaCl2

166,0

PM2

Nồng độ
(mg/l)

10

CoCl2.6H2O

0,0125

11

CuSO4.5H2O

0,0125

12

Na2MoO4.2H2O

0,125

2

KH2PO4

85,5

PM4

3

KNO3

950,0

13

FeSO4.7H2O

27,8

4

MgSO4.7H2O

90,35

14

Na2EDTA

37,26

5

NH4NO3

825,0

PM3

PM5

6

H3PO3

31

15

Thiamine HCl

0,10

7

KI

0,415

16

Pyridoxine HCl

0,50

8

MnSO4.4H2O

8,45

17

Nicotinic acid

0,50

22


9

ZnSO4.7H2O



5,3

18

Myo-inositol

100

Thiết bị
-

Bình tam giác, pipepman, cốc thủy tinh định mức,

-

Bông, giấy làm nút, giấy thấm,

-

Bình tam giác 250 ml,

-

Bộ đồ cấy bao gồm: dao cấy, que cấy, đĩa cấy,

-

Buồng cấy vô trùng, nồi khử trùng (Auto Clave) của hãng ToMy (Nhật),

-

Cân điện tử của Đức và một số dụng cụ liên quan khác

2.3. Phương pháp nghiên cứu
MÉu gièng

T¹o protocorm

T¹o ®a chåi

T¹o ®a chåi
T¹o rÔ
C©y hoµn chØnh
§a c©y ra m«i trêng tù nhiªn
H×nh 2.1. S¬ ®å thÝ nghiÖm nhân giống lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)
2.3.1. Phương pháp pha môi trường nuôi cấy
*Nguyên tắc:
Pha môi trường đặc với thành phần, nồng độ và các chất phù hợp. Môi trường cơ bản
là PM, có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin…Tất cả các hóa chất phải được

23


tan đều, không kết tủa. Môi trường có bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ không quá rắn
hay quá mềm để khi cấy mẫu được dễ dàng. Khử trùng môi trường theo phương pháp
thanh trùng Pasteur [4].
*Các bước pha môi trường nuôi cấy:
Sau khi xác định công thức môi trường cần pha, tính thể tích hóa chất cần sử dụng

trong môi trường cần nuôi cấy. Ví dụ: pha 1 lít môi trường nhân phong lan có công thức:
PM + 30g đường glucose + 8,5g thạch agar + 1g than hoạt tính + 100ml nước dừa +40g
khoai tây + 40g chuối pha trong 1 lít môi trường.
1) Đong khoảng 0,75 lít nước cất đun sôi trên bếp điện; dùng ống đong lấy dung
dịch PM đã pha vào cốc thủy tinh.
2) Cân đường 30g glucose; 8,5g agar; 1g than hoạt tính; 40g khoai tây; 40g chuối
chín (khoai tây, chuối chín cho vào máy xay, xay nhuyễn).
3) Dùng pipep hoặc ống đong để lấy các dung dịch PM cho vào một cốc thủy tinh
sạch.
4) Khi nước sôi khoảng 50-700C thì đổ agar khuấy đến khi nước trong rồi cho
đường, than, khoai tây, chuối chín vào rồi khuấy đều cho tan hết.
5) Bổ sung dung dịch hóa chất vào cốc thủy tinh. Định lượng hỗn hợp dung dịch
trên bằng nước cất cho đủ 1 lít.
6) Chia đều hỗn hợp nuôi cấy vào các bình tam giác đã chuẩn bị sau khi đã sấy khô
(các bình phải sạch và khô để tránh bị nhiễm; 1 lít môi trường chia đều cho khoảng 15
bình tam giác).
7) Đậy bình bằng nút bông đã hấp trùng và bên ngoài có đậy bằng nắp giấy ( nút
bông không được quá lỏng hoặc quá chặt vì quá lỏng cay dễ nhiễm, quá chặt thì không có
không khí lưu thông sẽ ảnh hưởng đến quá trình hô hấp, kết quả nghiên cứu bị ảnh
hưởng).
8) Sau đó đem đi hấp khử trùng ở nhiệt độ 120◦C, áp suất 1,2 atm trong thời gian
20 phút.

24


9) Lấy môi trường ra khỏi nồi hấp, lắc nhẹ bình tam giác chứa môi trường nuôi cấy
để than hoạt tính tan đều.
10) Sau khi hấp xong để 2 – 3 ngày cho môi trường ổn định rồi tiến hành cấy.
2.3.2. Thăm dò môi trường nuôi cấy

Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân chồi và ra rễ ở lan Kim Tuyến,
chúng tôi đã bố trí thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy. Tất cả các công thức (CT)
môi trường nuôi cấy đều sử dụng nền môi trường PM + 30g đường glucose + 8,5g thạch
agar + 1g than hoạt tính + 100ml nước dừa + 40g khoai tây + 40g chuối và bổ sung các
chất kích thích sinh trưởng (KTST) (NAA, BAP, kinetin).
1. Môi trường nhân chồi: Các chồi giống được cấy lên môi trường nhân chồi bổ sung
BAP hoặc kinetin với các nồng độ: 0,5mg/l – 0,7mg/l – 0,9 mg/l - 1mg/l. Mỗi CT
thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 4 –
6 – 8 tuần nuôi cấy.
2. Môi trường tạo rễ ( Môi trường tạo cây hoàn chỉnh): Sử dụng chất kích thích sinh
trưởng α-NAA nồng độ gồm: 0,1mg/l – 0,3mg/l – 0,5mg/l. Mỗi CT thí nghiệm
được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần. Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của
cây thông qua sự phát sinh rễ, lá, kích thước rễ, kích thước lá sau 4 – 6 – 8 tuần
nuôi cấy.
2.4. Tính toán ra kết quả
Các số liệu về tỉ lệ sống, tỉ lệ tạo chồi, tỉ lệ tạo protocorm, số chồi trung bình/1 mô,
chiều cao trung bình của chồi, số rễ/cây, chiều dài trung bình của rễ, số lá/cây… thu thập
sau thời gian 4 – 6 – 8 tuần nuôi cấy, xử lí số liệu bằng chương trình Excel [10].

Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của BAP tới sự tạo chồi và protocorm của lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) trong ống nghiệm

25