PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ - ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN-NẤM MÔC

TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ
&
ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN - NẤM MỐC


NỘI DUNG

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

ĐỊNH
ĐỊNH LƯỢNG
LƯỢNG TỔNG
TỔNG SỐ
SỐ VI
VI KHUẨN
KHUẨN HIẾU
HIẾU KHÍ
KHÍ TRONG
TRONG THỊT
THỊT

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN – NẤM MỐC

ĐỊNH
ĐỊNH LƯỢNG
LƯỢNG TỔNG
TỔNG SỐ
SỐ NẤM
NẤM MEN

MEN –
– NẤM
NẤM MỐC
MỐC TRONG
TRONG THỊT
THỊT

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Khái quát
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều
kiện có sự hiện diện của oxy (O2) phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong
mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Nguyên tắc
Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí
0
0
ở 30 C/72 giờ ± 6 giờ hoặc 37 C/48 giờ ± 6 giờ.
Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường
thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh
khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số

đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng
thực phẩm

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

 Quy trình phân tích bao gồm các bước:
- Cân mẫu
- Đồng nhất mẫu
- Pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân
- Chuyển và phân phối đều một thể tích xác định mẫu lên mặt môi trường rắn trong
đĩa petri bằng phương pháp hộp trải, hoặc hộp đổ.
- Ủ ở nhiệt độ và thời gian quy định

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Môi trường sử dụng
- Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water ( SPW) hoặc Buffer
Pepton Water (BPW).
- Môi trường nuôi cấy : Plate Count Agar (PCA)

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ



1. Định lượng mẫu



Bước 1: Cân chính xác hay 25 g mẫu cho vào bao PE vô trùng.



2. Đồng nhất và pha loãng mẫu



Bước 2: Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội.



Bước 3: Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu
nhưng không quá 150 giây.



-1
Bước 4: Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10 .



Bước 5: Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng

10

-1

-2
-2
cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10 . Hút 1ml từ độ pha loãng 10 cho tiếp vào

-3
9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10 . Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Định lượng mẫu
10g hoặc 10 ml

Đồng nhất và pha loãng mẫu

Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa Petri

Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

Đếm khuẩn lạc
Chọn đĩa có 25→250 khuẩn lạc

Sơ đồ quy trình định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí
ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

 Bước 6: Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đều bằng máy vortex mixer hay lắc mạnh bằng
tay.

 3. Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa Petri
 Bước 7: Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

o
Bước
5.
Đếm
Bước

9:khuẩn
8:
Tiếp
dùng
tục
lạcpipetman
đỗ khoảng
hút
15ml
1mlmôi
mỗitrường
độ phaPCA
loãng
đãcho
hấpvào
khử2 trùng
đĩa petri
để nguội
đã khửkhoảng
trùng. 45 C.
4. Ủ mẫu
Bước
10: lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và chờ
Bước 12: Chọn
o tất cả đĩa có số khuẩn
o lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đếm
môi trường
Bước
11: ủ 30
đặcClại,

sau
lật72
ngược
giờ hoặc37
đĩa
C trong 48 giờ

Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu
ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ



Công thức tính kết quả
Đếm tất cả các số khuẩn lạc xuất hiê n
ê trên các khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25- 250 để tính kết quả. Mâ tê
đôê tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính theo công thức sau

Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc ) trong 1g mẫu
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường
fi: Độ pha loãng tương ứng

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Ý nghĩa



Tổng vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu thực phẩm chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, đánh giá
chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong
quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm.



6
Sự tăng trưởng của vi sinh vật trong thực phẩm đẫn đến biến đổi chất lượng: 10 tế bào/g (ml) là ranh giới
6
để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng hay không. Một vài trường hợp vi sinh vật bằng 10 tế bào/g
(ml) thực phẩm chưa có dấu hiệu hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

Nguyên tắc

 Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2, bề mặt sản phẩm được áp
dụng để đánh giá độ nhiễm khuẩn trên bề mặt các sản phẩm thịt bằng phương pháp đếm
số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí có trên 1cm mẫu thử đã được chuyển tương đương với 1ml
dung dịch huyền phù ban đầu dưới các điều kiện thử được xác định trong TCVN.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

Môi trường
a) Nước muối sinh lý
b) Dung dịch đệm pepton
c) Thạch trypten glucoza
d) Thạch màng

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

Trình tự xác định
Chuẩn bị mẫu

 a) Dùng giấy thấm vô khuẩn được làm ướt trước bằng nước muối sinh lý có tổng diện tích là 100cm
dán lên các vị trí khác nhau của bề mặt mẫu cần dán để diện tích giấy thấm tiếp xúc trực tiếp với bề
mặt mẫu. Sau 2 phút, chuyển số giấy thấm trên vào ống nghiệm đã chứa 10 ml dung dịch đệm pepton.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

 b) Chuyển toàn bộ lượng mẫu trong ống nghiệm vào bình tam giác dung tích 100 ml chứa khoảng 10
viên bi thuỷ tinh vô khuẩn. Tráng ống nghiệm chứa mẫu bằng dung dịch đệm pepton và đổ cả vào
bình chứa mẫu, lắc nhẹ cho giấy thấm hoặc bông tan vụn, sau đó cho thêm dụch dịch đệm pepton tới
khoảng 100ml

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

 c) Để lắng hoặc tiến hành ly tâm dung dịch mẫu khoảng 5 phút ở tốc độ 200 vòng/ phút. Gạn lấy lớp
dng dịch trong vào bình định mức dung tích 100ml và cho thêm dung dịch đệm pepton tới vạch mức
2
100ml (tương đương với 100cm bề mặt mẫu được chuẩn bị). Dung dịch này được gọi là dung dịch
huyền phù ban đầu. Cần tiến hành kiểm tra ngay sau khi chuẩn bị xong dung dịch, nếu chưa kiểm tra,
0
dung dịch cần được bảo quản ở 0 đến + 5 C nhưng không quá 1h.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

Pha loãng mẫu

 Dùng dung dịch đệm tepton ( mục b điều 1.4.2) để pha loãng dung dịch huyền phù ban đầu
-1
-2
n
theo tỉ lệ 1/9 tới các độ pha loãng thập phân khác nhau (10 , 10 …10 ). Cần căn cứ mức
độ nhiễm khuẩn của mẫu để tiến hành pha loãng dung dịch mẫu tới các độ pha loãng phù
hợp.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

Tiến hành nuôi cấy
a) Với mỗi mẫu phải nuối cấy ít nhất 3 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng nuối
cấy 2 đĩa, phải dùng pipet riêng trong mỗi độ pha loãng.
b) Dùng pipet khác nhau lấy 1 ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau cho vào
giữa các đĩa petri. Rót vào mỗi đĩa khoảng 15 ml môi trường thạch trypton glucoza. Lắc
vòng tròn 5 lần theo chiều kim đồng hồ và 5 lần ngược lai để trộn đều môi trường và dung
dịch mẫu.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

Đặt các đĩa chứa môi trường trên mặt phẳng ngang sao cho môi trường đông tự nhiên.
Thời gian từ khi pha loãng mẫu (1.5.2) đến khi nuôi cấy xong không quá 20 phút.

c) Nếu nghi trong sản phẩm có chứa các vi sinh vật mà khuẩn lạc của chúng có
thểm mọc lan trên bề mặt môi trường thì sau khi môi trường đã đông rót thêm 4 ml thạch
màng lên bề mặt đĩa.

d) Khi môi trường đã đông, lật úp các đĩa peptri và đặt vào tủ ấm đã duy trì ở 30 ±
0
1 C trong 72 h.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

Tính kết quả
Dùng mắt thường hoặc kính lúp để đếm số khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa petri,
chỉ đếm những đĩa có số khuẩn lạc mọc riêng biệt và từ 25 đến 250 khuẩn lạc.
Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trong mỗi đĩa, trong trường hợp số lượng khuẩn
lạc lớn và phân bố đều, có thể phần đáy đĩa theo đường kính thành các phần đều
nhau có bội số là 2 để đếm một phần sau đó nhân kết quả với tổng số phần đã
chia.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

2
Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm mẫu thử ( X1) được quy ra tổng số vi
khuẩn hiếu khí có trong 1ml dung dịch huyền phù ban đầu của mẫu thử được
tính ở 2 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng gồm 2 đĩa theo công thức sau:

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

XÁC ĐỊNH TỔNG NẤM MEN, NẤM MỐC
Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào là lớp vở chitin, có nhân và các bào
quan khác. Tất cả các loài men và mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần
nguồn carbon hữu cơ để cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài. Có thể phân
biệt được nấm men và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau:

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM


Ủ mẫu
o
30±1 C trong 72 giờ

XÁC ĐỊNH TỔNG NẤM MEN, NẤM MỐC
Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh
thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau
thành chuổi.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM