KỸ THUẬT REAL time PCR

KỸ THUẬT REAL-TIME PCR
TÓM TẮT
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả nhân bản DNA đích trong ống nghiệm,
thành hàng tỷ bản sao, được hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do
đặc điểm này nên người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thao tác sau
đó để phát hiện sản phẩm nhân bản (điện di sản phẩm PCR trên gel agarose hoặc lai
với các đoạn dò đặc hiệu trên màng, giếng, …).
KỸ THUẬT REAL-TIME PCR
Real-time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’
polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự công bố năm 1991.
Trong phản ứng real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh
quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green,
EvaGreen ...) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ...).
Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA. Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản
phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch
đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này và phát tín
hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung dịch). Loại tác
nhân huỳnh quang này có thể sử dụng được cho mọi trình tự đích nên chi phí sẽ thấp;
nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ thông qua một bước
phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân tích đường cong nóng
chảy (Melting curve analysis).

Hình 1. Phương pháp real-time PCR với tác nhân phát huỳnh quang liên kết với
mạch đôi DNA (EvaGreen)
Tác tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu rất đa dạng như FAM, TAMRA, Texas
Red, Cy3, Cy5, …, được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau:
(1) Mẫu dò lai (hybridization probe): gồm hai mẫu dò có vị trí bắt cặp gần nhau trên
mạch khuôn và một hoặc hai mồi (primer). Các mồi cho phép nhân bản trình tự đích
trong phản ứng PCR. Mẫu dò phía đầu có mang nhóm hùynh quang ở đầu 3’ còn mẫu
dò phía đuôi mang nhóm huỳnh quang đầu 5’. Khi 2 mẫu dò bắt cặp trên cùng một

trình tự DNA, nhóm hùynh quang “cho” (donor dye) và nhóm “nhận” (acceptor dye)
trên 2 mẫu dò sẽ gây ra hiệu ứng FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer).
Hiệu ứng này được ghi nhận mỗi khi có sự bắt cặp của mẫu dò 5’ và mẫu dò 3’ lên
những trình tự mới được tạo thành trong quá trình PCR.

Hình 2. Phương pháp real-time PCR với mẫu dò lai
(2) Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe) với ví dụ thông dụng nhất là TaqMan probe
(còn gọi là kỹ thuật 5’ nuclease). Mẫu dò được đánh dấu đầu 5’ bằng nhóm phát
huỳnh quang (reporter dye), và đầu 3’ bằng nhóm dập tắt huỳnh quang (quencher
dye). Nhóm “dập” sẽ ngăn sự phát huỳnh quang của nhóm “phát” khi mẫu dò ở trạng
thái nguyên vẹn. Trong quá trình tổng hợp mạch mới, hoạt tính 5’ exonuclease của Taq
polymerase sẽ cắt rời nhóm “phát” khỏi mẫu dò, khiến nó không còn chịu tác động
của nhóm “dập”. Lúc đó nhóm “phát” sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và thiết bị tự động
được ghi nhận.


Hình 3. Phương pháp real-time PCR với mẫu dò TaqMan
(3) Mẫu dò dạng “kẹp tóc” (hairpin probe) điển hình như “Molecular beacon”: bao
gồm một trình tự bổ sung đặc hiệu với trình tự đích nằm giữa hai trình tự lặp lại đảo
ngược. Các nhóm “phát” (reporter) và “dập” (quencher) được gắn vào hai đầu mút của
mẫu dò. Do đó, sự phát huỳnh quang không xảy ra khi mẫu dò ở dạng tự do (cấu hình
“kẹp tóc”) trong dung dịch. Khi mẫu dò bắt cặp với trình tự đích, nó sẽ duỗi dài khiến
hai nhóm “phát” và “dập” tách xa. Lúc đó, tín hiệu huỳnh quang được phát ra và ghi
nhận.

Hình 4. Phương pháp real-time với mẫu dò “kẹp tóc” (molecular beacon probe)
Trong mọi trường hợp vừa nêu, cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với hàm
lượng sản phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng. Các tín hiệu huỳnh quang

phát ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệt real-time PCR thu nhận và xử lý. Khi
cường độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu vựơt qua đường tín hiệu huỳnh quang nền
(base line) của phản ứng thì mẫu được xem là dương tính và người ta lấy thời điểm
vượt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ngưỡng – Ct, Cycle Threshhold) để so sánh
với một đường cong chuẩn (standard curve) đã biết để suy ra nồng độ trình tự DNA
đích trong mẫu thử nghiệm ban đầu. Đường cong chuẩn được xây dựng từ chu kỳ
ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản phẩm đích đã biết trước nồng độ.
Định lượng nucleic acid là ứng dụng mạnh nhất của phương pháp này. Trong lĩnh vực
chẩn đoán bệnh, kỹ thuật real-time PCR được ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định
lượng các tác nhân gây bệnh ở người như virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán
và theo dõi điều trị. Nhiều bộ kit thương mại hóa sử dụng mẫu dò thủy giải (Roche
COBAS Taqman HBV test, Artus RealArt HBV PCR), mẫu dò lai (Roche
Diagnostics), mẫu dò dạng “kẹp tóc” (molecular beacon) (RealArt kit – Cobett
Research), HCV Quantitation ASR (Abbott).
VẤN ĐỀ KỸ THUẬT CƠ BẢN CỦA REAL-TIME PCR
Biểu đồ nhân bản của real-time PCR

Hình 5. Đường biểu diễn nhân bản ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ
ống phản ứng khi nhận được ánh sang kích thích vào mỗi chu kì nhiệt
Đường nền (baseline): được định nghĩa là số chu kỳ PCR trong đó tín hiệu huỳnh
quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị. Theo mặc
định, đường nền được xác lập trong khoảng chu kỳ 3 đến 15 và có thể được thay đổi.


Ngưỡng (threshold): là một giá trị huỳnh quang được xác lập một cách tùy ý, dựa trên
đường nền. Một tín hiệu huỳnh quang phát hiện trên ngưỡng được xem là tín hiệu đặc
hiệu, và sẽ được sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng. Ngưỡng được thiết lập theo từng
thí nghiệm và nó thường cắt tất cả các đường tín hiệu đặc hiệu trong pha nhân bản cấp
số mũ (exponential phase).

Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): được định nghĩa là số chu kỳ PCR mà ở đó tín
hiệu huỳnh quang đặc hiệu lớn hơn ngưỡng. Nói khác đi, đó là số chu kỳ PCR ở đó tín
hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền. Đây là nguyên lý cơ bản của real-time PCR và là
yếu tố quyết định tính chính xác và lặp lại của kết quả. Số trình tự mục tiêu trong mẫu
ban đầu càng cao thì số chu kỳ cần để vượt ngưỡng phát hiện càng nhỏ, nghĩa là giá trị
Ct càng thấp.
Đường chuẩn của real-time PCR
Một đường chuẩn được xây dựng với các nồng độ (pha loãng 5 đến 10 lần) của một
trình tự DNA chứng đã biết và các giá trị Ct tương ứng. Để định lượng trình tự mục
tiêu ban đầu có trong mẫu, người ta đo giá trị Ct của mẫu; giá trị này lắp vào đường
chuẩn sẽ cho được nồng độ trình tự mục tiêu có trong mẫu ban đầu. Đây là phương
pháp thường được sử dụng để định lượng hàm lượng vật liệu di truyền của tác nhân
gây bệnh hiện diện trong bệnh phẩm.

Hình 6: Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa số lượng DNA đích và chu kỳ
ngưỡng tương ứng. Trong biểu đồ trên này, E2, E4, E6, E8 là các ống phản ứng
chứa mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ, B4, B5 là ống phản ứng chứa mẫu thử cần
xác định nồng độ
Đường chuẩn (standard curve): thể hiện mối quan hệ giữa chu kì ngưỡng với số
lượng DNA đích ban đầu có trong mẫu chuẩn. Trên đường chuẩn này, trục tung Y là
Ct, trục hoành X là số lượng DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn. Do các mẫu
chuẩn thường được pha cách nhau theo hệ số pha loãng 10 nên số lượng bản DNA
đích trong các mẫu chuẩn được biểu thị bằng log10 của số lượng này. Do vậy, trị số 2,


4, 6, và 8 trên trục X tương ứng với các số lượng bản đích 102, 104, 106, 108 bản sao
trong ống phản ứng.
Hệ số tương quan (R2): Đánh giá độ chính xác của thao tác hút dung dịch mẫu chuẩn
(pipetting) có đúng thể tích mong muốn hay không. Trị số R2 phải đạt ≥ 0.99 có nghĩa
là đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao.

Hiệu suất phản ứng PCR (E%): Hiệu suất phản ứng PCR có thể ảnh hưởng đến chu
kỳ ngưỡng. Một khi PCR đạt hiệu suất lý tưởng, thì cứ sau mỗi chu kì nhiệt, cường độ
huỳnh quang trong một ống phản ứng phải tăng gấp đôi, khi đó hiệu suất nhân bản là
100%. Hiệu suất PCR thực tế chấp nhận được trong khoảng 90%-110%. Một loạt mẫu
chuẩn với nồng độ khác nhau được nhân bản dưới điều kiện hiệu suất thấp sẽ tạo ra
đường chuẩn với hệ số góc khác với được nhân bản dưới điều kiện hiệu suất cao.
Trong hình 7, hai mẫu (X và Y) được nhân bản dưới hai điều kiện hiệu suất thấp và
cao cho những giá trị Ct khác nhau với những nồng độ mạch khuôn giống nhau. Trong
ví dụ này, mặc dù điều kiện hiệu suất cao (đường màu xanh nước biển) cho giá trị Ct
trễ hơn ở nồng độ mạch đích cao, nó thể hiện độ nhạy tốt hơn ở những mẫu nồng độ
thấp. Hiệu suất PCR phụ thuộc vào kĩ thuật thực hiện, loại hóa chất (master mix) được
sử dụng và chất lượng của mẫu sau tách chiết.

Hình 7: Biến thiên của giá trị Ct với hiệu suất PCR khác nhau
Đường màu xanh nước biển có hiệu suất 100% (slope -3.3). Đường màu xanh lá có
hiệu suất 78% (slope -4)
ỨNG DỤNG CỦA REAL-TIME PCR
Kỹ thuật real-time PCR được ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng các tác
nhân gây bệnh ở người như virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán và theo dõi
điều trị.


Phương pháp real-time PCR với chất phát huỳnh quang SYBR Green phát hiện TB:
Trong bệnh phẩm sử dụng một cặp mồi được thiết kế để nhân bản vùng gene IS6110.
IS6110 là những trình tự gắn chèn đặc trưng cho các chủng vi khuẩn lao
(Mycobacterium complex) và hiện diện với số lượng lớn trong DNA bộ gene của
Mycobacterium và được xem là đối tượng thích hợp nhất để phát hiện vi khuẩn lao.
Mẫu xét nghiệm được kết luận là dương tính khi kết quả phân tích “đường cong nóng
chảy” cho thấy Tm của sản phẩm PCR thu được tương ứng với Tm của vùng gene
IS6110 được nhân bản.

Kit HBV định lượng được xây dựng dựa trên kỹ thuật real-time PCR, sử dụng mẫu dò
Taqman đặc hiệu cho DNA HBV được đánh dấu với tác nhân phát huỳnh quang.
Primer (mồi) và mẫu dò (probe) Taqman được thiết kế trong vùng gene S của HBV. Ở
các mẫu HBV dương tính, cường độ tín hiệu huỳnh quang tăng dần trong quá trình
nhân bản được ghi nhận theo thời gian và phản ánh số lượng trình tự DNA tạo ra.
Song song với các mẫu cần định lượng, một phổ nồng độ đã biết của trình tự mục tiêu
được dùng để xây dựng đường chuẩn. Đường chuẩn này là cơ sở cho việc định lượng
DNA HBV trong mẫu bệnh. Kết quả định lượng được đọc trên máy real-time PCR.
Real-time PCR còn được dùng trong phát hiện HCV, genotype HCV, phát hiện
H.pylori, chẩn đoán sớm HIV ở trẻ em, xác định type của virus sốt xuất huyết Dengue,
phát hiện thai nhi nhiễm Rubella… Những năm trở lại đây, kỹ thuật real-time PCR
được ứng dụng trong nghiên cứu thủy sản nhiều như định lượng Taura Syndrome
Virus (Tang và cộng sự, 2003), phát triển độ đặc hiệu và độ nhạy trong việc xác định
Taura Syndrome Virus và Yellow Head Virus (Mouillesseaux và cộng sự, 2003), định
tính và định lượng IHHNV và WSSV trên tôm (Dhar và cộng sự, 2001), định lượng
Streptococcus agalactiae trên cá (Ke và cộng sự, 2000)…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Arya M., Shergill I.S., Williamson M., Gommersall L., Arya N., & Patel H.R.H.
2005. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Rev. Mol. Diagn., 5:1-11
[2]. Bustin S.A., & Nolan T. 2004. Pitfalls of quantitative real-time ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction. Joiurnal of Biomolecular Techniques,
15:155-166
[3]. Hunt M. Real time PCR. Microbiology and Immunology On-line.
[4]. Schweitzer B., & Kingsmore S. 2001. Combining nucleic acid amplification and
detection. Current Opinion in Biotechnology, 12: 21-27.
Realtime PCR hay kỹ thuật Real time PCR là gì?
PCR là phản ứng khuếch đại DNA (polymerase chain reaction). Trong kỹ thuật PCR,
sau khi khuếch đại đoạn DNA đích, người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số
bước để đọc kết quả và xác định có sản phẩm khuếch đại mong muốn hay không bằng
kỹ thuật điện di (sử dụng máy điện di), hoặc sử dụng thí nghiệm lai với các mẫu dò
đặc hiệu để xem sản phẩm khuếch đại có chứa sản phẩm mong muốn hay không. Kỹ

thuật PCR mà cần phải có giai đoạn phân tích sau khi khuếch đại còn gọi là kỹ thuật
PCR cổ điển bằng việc sử dụng máy PCR, hay còn gọi là máy luân nhiệt.
Realtime PCR (Real time PCR) là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích
được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR, chính vì vậy mà được gọi là


real-time: thời gian thực, và do đặc điểm này mà với kỹ thuật Realtime PCR, người
làm thí nghiệm không cần phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc các sản phẩm khuếch
đại. Với kỹ thuật real-time PCR sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm là máy realtime
pcr, sản phẩm cuối cùng của phản ứng được hiển thị ngay sau khi phản ứng khuếch
đại hoàn tất. Vì vậy có thể nói Realtime PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong
ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại
trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người
làm thì nghiệm có thể thấy được.
Các vấn đề kỹ thuật cơ bản của Realtime PCR:
Biểu đồ khuếch đại của Realtime PCR
Bạn cần tìm hiểu về đường nền (baseline), ngưỡng (threshold), chu kỳ ngưỡng (cycle
threshold – Ct). Ngoài ra bạn cần tìm hiểu thêm về đường chuẩn (standard curve) và
hệ số tương quan (R).

Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime PCR
Đường nền (baseline): là số chu kỳ của phản ứng PCR mà tín hiệu huỳnh quang đặc
hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị. Mặc định, đường nền
được xác lập trong khoảng từ chu kỳ 3 đến chu kỳ 15 và có thể được thay đổi.
Ngưỡng (threshold): là một giá trị huỳnh quang được xác lập một cách tùy ý, dựa trên
đường nền.
Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): được định nghĩa là số chu kỳ PCR mà ở đó tín
hiệu huỳnh quang đặc hiệu lớn hơn ngưỡng. Nói khác đi, đó là số chu kỳ của phản
ứng realtime PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền.
Đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR

Đường chuẩn của phản ứng realtime pcr
Đường chuẩn được xây dựng với các nồng độ (pha loãng 5 đến 10 lần) của một trình
tự DNA chứng đã biết và các giá trị Ct tương ứng. Đường chuẩn (standard curve): thể
hiện mối quan hệ giữa chu kì ngưỡng với số lượng DNA đích ban đầu có trong mẫu
chuẩn.
Hệ số tương quan (R2): Đánh giá độ chính xác của thao tác hút dung dịch mẫu chuẩn
(pipetting) có đúng thể tích mong muốn hay không. Trị số R2 phải đạt ≥ 0.90 có nghĩa
là đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao.
Hiệu suất của phản ứng PCR (E%): Hiệu suất phản ứng PCR có thể ảnh hưởng đến
chu kỳ ngưỡng.
Để cho kết quả chính xác nhất, bạn nên sử dụng máy realtime PCR chất lượng tốt.
Bài viết liên quan


Phương pháp bảo quản hoa tươi lâu hơn
Hiện nay, kỹ thuật bảo quản hoa tươi cắt cành sau thu hoạch của Việt Nam còn mang
tính truyền thống và gặp nhiều hạn chế nên chất lượng chưa cao, nhiều…


Vậy,

cần

hiểu threshold là

cái

gì

:D

Real Time PCR được dùng để định lượng với 1 độ chính xác cực kỳ cao. Do đó, việc
đo tín hiệu huỳnh quang (là giá trị đại diện của nồng độ DNA mạch kép trong phản
ứng)
phải
được
tiến
hành
thật
chuẩn.
Để làm được điều này cần thiết phải có một hệ đệm được thiết kế để ổn định các điều
kiện. Trong hệ đệm này (do nhà sản xuất cung cấp) có một chất làm đối chứng
(Passive reference). Khi đo tín hiệu huỳnh quang của reporter, máy sẽ dựa trên tín
hiệu của Passive reference. Giá trị thương số khi lấy Cường độ tín hiệu huỳnh quang
reporter chia cho cường độ tín hiệu huỳnh quang Passive reference được ký hiệu
là Rn.
Threshold được định nghĩa là độ lêch chuẩn trung bình của giá trị Rn trong các chu kỳ
đầu
của
PCR.
Để hiểu đúng hoàn toàn cách tính toán, cách xử lý ... của Real time là rất khó. Nên
hiểu theo quan điểm của nhà sinh học, với tư cách người sử dụng công nghệ.
Ý nghĩa của Threshold và Threshold cycle:
- Threshold là điểm bắt đầu của sự phát hiện tín hiệu huỳnh quang.
- Ổn định: Trong các chu kỳ đầu của phản ứng PCR, cường độ tín hiệu huỳnh quang
thay đổi lên xuống thực chất chỉ là "nhiễu". Threshold cycle và Baseline phải được đặt
sao cho máy Real Time "không thèm chấp" các tín hiệu nhiễu này.
- Xác định giá trị Ct sao cho đúng đồng nghĩa với việc tìm được điều kiện phù hợp

nhất, đúng đắn nhất để đo cường độ huỳnh quang.
ghe người ta nói real time PCR sử dụng SYBR Green I có độ nhạy cao hơn real time
PCR sử dụng Taqman probe, molecular beacons... điều này có đúng không ? (theo
mình nghĩ về lý thuyết có thể đúng nhưng không biết thực nghiệm ntn, các bạn có ai
đã
so
sánh
thử
chưa).
À, tại sao mình không thay EtBr bằng SYBR Green khi nhuộm DNA nhỉ, mình thấy
có người đã làm rồi mà.
So sánh như vậy khập khiễng quá vì mục tiêu của 2 assay này khác nhau.
Tagman Probe (Hydrolysis Probe) ứng dụng chủ yếu để xác định đột biến: SNP,
Allelic Discrimination


SYBR Green I ứng dụng để làm định lượng. Có thể tính ra đến số lượng bản copy của
template nếu có mẫu làm đường chuẩn.
Về độ nhạy của SYBR Green I thì khỏi nói. Cực kỳ chính xác. Nếu bạn làm thí
nghiệm mà thấy củ chuối thì đầu tiên cần xem lại kỹ năng thực nghiệm của bạn và độ
sạch của các thành phần phản ứng.
Dĩ nhiên, các assay sử dụng probe của Realtime có thể ứng dụng làm định
lượng và ngược lại, thậm chí SYBR có thể dùng để xác định đột biến. Tuy nhiên,
mình chưa bao giờ nghĩ đến việc có ai đó lại đi so sánh chúng với nhau, và so sánh ở
điểm
gì
?
Ví dụ: So sánh tốc độ của một cái máy cày và một xe đua công thức 1. Rõ ràng cái
máy cày cũng là một loại xe cơ giới, có động cơ, dùng xăng ... giống như cái xe đua
Bây giờ, quay lại vấn đề chính mà cả tôi và bạn cùng quan tâm: Độ nhạy (số copy tối

thiểu
trong
template
mà
phản
ứng
có
thể
phát
hiện)
- Với SYBR Green I: Độ nhạy không phụ thuộc vào SYBR mà phụ thuộc vào các yếu
tố khác của một phản ứng PCR thông thường: Mồi, nhiệt độ bắt cặp, độ sách của mẫu,
chất lượng buffer, enzyme
- Với Hybridization probe & Hydrolysis probe: Cũng như vậy. Độ nhạy của
phản ứng cũng không phụ thuộc vào probe. Nếu primers làm tốt chức năng của nó thì
sẽ có sản phẩm PCR, còn việc probe có làm việc trên cái sản phẩm PCR đó hay không
thì là chuyện khác.
Vấn đề thứ hai là độ chính xác (specificity) của phản ứng Realtime: Tôi nghĩ
nếu cần so sánh thì đây có thể là chỗ để chúng ta làm những thí nghiệm so sánh. Ví
dụ: So sánh khả năng phát hiện đột biến giữa Hybridization probe, Hydrolysis probe
và
SYBR
Green
I.
(Ngay cả trong trường hợp cụ thể này, việc so sánh giữa các loại probe với SYBR
green cũng vẫn rất khập khiễng vì cách thưc tiến hành thí nghiệm là khác nhau).

Nếu hiểu độ nhạy theo nghĩa khả năng phát huỳnh quang dựa trên sự có mặt của số
lượng bản copy của DNA mach kép (hoặc nồng độ - tùy bạn), tạm ký hiệu là X, đối
với SYBR Green I, và số lượng probe liên kết với mạch đích, tạm ký hiệu là Y, đối với

các
assay
dùng
probe,
thì
có
2
điểm
thế
này:
- Việc tăng lượng X hay Y rất đơn giản chỉ bằng cách tăng số chu kỳ PCR.
- Khả năng phát huỳnh quang của SYBR Green I là rất cao. Tôi đã làm một thí nghiệm
mà đỉnh (pick) của Primer Dimer cũng cao gần bằng pick của sản phẩm. Liệu có phải


homosapiens nghĩ rằng độ nhạy của các assay dùng SYBR Green I có thể cao hơn các
assay
khác
là
theo
hướng
này
không
?
-----------Hiện tôi được biết có 2 hệ thống Realtime chính là LightCycler của Roche và ABI
Prism của Applied Biosystem. Có thể còn nhiều loại khác nữa nhưng tôi không biết,
bạn
nào
biết
thì

bổ
xung.
Hệ thống LightCycler có một số ưu điểm chính so với ABI Prism:
- Sử dụng bộ phận gia nhiệt bằng luồng khí nóng => nhanh hơn so với gia nhiệt block
như
các
máy
PCR
thường
và
ABI
Prism
vẫn
dùng.
- Có thể áp dụng Hibridization probe assay, còn ABI Prism thì không. Đây là một ưu
điểm
cực
lớn.
- Sử dụng ống mao quản (capilary) để chạy mẫu, có nắp đóng kín => giảm nguy cơ
nhiễm.
- Allelic Discrimination phân biệt theo pick => rất rõ ràng.
Tự
động
tính
toán
Ct
=>
đỡ
mệt.
Trước đây tôi có chạy demo bằng ABI Prism thì thấy có mấy điểm rất đáng lưu ý:

- Khả năng nhiễm rất cao do sử dụng plate để mix mẫu.
- Kết quả Allelic Discrimination đánh giá theo các vùng nên tương đối mệt lúc phân
tích và làm cho người ta không cảm thấy thật sự thoải mái khi kết luận.
- Bắt buộc phải dùng Hydrolysis probe nên lúc thiết kế thí nghiệm nhiều khi bị ràng
buộc.
Hybridization
probe
thì
khác
hẳn.
- Tính toán, thay đổi giá trị Ct => thêm 1 bước loằng ngoằng không thực sự cần thiết.
Lưu ý: Hệ thống LightCycler vẫn có thể tự điều chỉnh Ct nếu bạn thích.
Nếu cần so sánh cái gì đó, thì đây là những so sánh đáng giá nhất mà chúng ta nên làm
để có thể mua được hệ thống phù hợp cho Lab của mình.
Những so sánh này nếu tự tôi mò mẫm chăc cũng còn lâu mới hiểu được những cái
hay cái dở của nó. Rất may tôi được sếp chỉ dẫn. Cảm ơn sếp :D

Vụ dùng SYBR Green I để xác định đột biến là có thật, nhưng nó giống như cái máy
cày ý :D Để tôi lục lại tài liệu, đọc lại 1 tí rồi sẽ post sau nhé. Lưu ý lại 1 lần nữa: Tôi
không chỉ giáo ai hết, chúng ta cùng thảo luận, có gì sai thì cùng sửa. OK.


hực ra xét về độ nhạy, nên đặt ở điều kiện chuẩn cho một pứ PCR thông thường mà
nói, và như vậy các điều kiện đó không ảnh hưởng nhiều đến độ nhạy (đó là theo tôi
làm thực nghiệm mà rút ra như vậy !)
Bài này minh họa cho việc sử dụng melting curve để xác định Tm của đoạn sp PCR.
Dĩ nhiên SYBR chỉ được dùng để đo lệch giữa độ phát huỳnh quang của sp có và
không có đột biến . Nhưng mà doncry không biết chứ làm thế nào để xác định được
độ chênh lệch chỉ 1 nucleotide này là cả một vấn đề. Không tin hỏi thử anh Aigu xem.
Dựa vào Tm để xác định độ dài amplicon bằng melting curve là một điều gần như

không tưởng nếu chỉ chênh lệch 1 nu.
Về lý thuyết, đột biến điểm có thể được xác định bằng SBGR Green nếu nó có thể làm
thay đổi nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm ít nhất 1 độ C. Tuy nhiên, trên thực tế điều
này
là
khôgn
tưởng.
Vấn đề ở đây là sv_ngheo không phân biệt "Xác định đột biến điểm" và "Xác định đột
biến". Nếu dùng SYBR GREEN có thể phát hiện được đột biến mất đoạn như trong
bài báo đã viết. Việc sử dụng SYBR GREEN để làm điều này có ưu thế hơn so với sử
dụng PCR thông thường như thế nào ? Liệu sv_nghèo có vui lòng nói cho mọi người
rõ ? 8)

Về nguyên tắc chung, xác định đột biến mất đoạn trở nên dễ dàng hơn thằng cha SNP
kia nhiều lần. Vì đơn giản rằng Tm của dạng ko đột biến sẽ cao hơn Tm của dạng mất
đoạn.
SYBR cũng chẳng phải là cái gì ghê gớm cả, nôm na nó chỉ là EtBr loại tốt thôi, quan
trọng là phải ép con ngựa này chạy theo ý của ta. Loại dye cài xen này rất khó chịu, vì
cứ có DNA sợi kép là thôi rồi, phát huỳnh quang ầm ầm. Như mọi người đã biết, trong
quá trình PCR chuyện unspecific product là chuyện thường ngày ở huyện. SYBR cứ
thấy có người đến là hót ầm lên “Có khách, có khách” lắm khi thằng kẻ trộm cũng
được
đón
chào
!
Vì vậy để xác định đột biến mất đoạn thì nôm na nó theo hướng như vầy: Design lấy
đôi primer bao lấy vị trí mất đoạn, càng đặc hiệu càng ổn. Sau đó setup một phản ứng
PCR bình thường, có thêm SYBR trong đó. Cho mẫu vào real-time PCR machine -nhớ
chọn melting curve. Ở bước Mcurve này sẽ thấy độ đổ dốc của amplicon đột biến và
không đột biến khác nhau. Khác bi nhiêu là tùy đoạn mất dài hay ngắn. Nhưng nói

chung dưới 10 nu thì đừng hi vọng. Tốt nhất nên chuyển sang dùng pp khác. Mà pp
khác thì vô khối, sao mà những người phát minh ra chúng tài năng vậy không biết. !
Kể cả PCR thông thường cũng phát hiện được mới tài !


Nếu là PCR bình thường, người ta phải thiết kế primer nằm trên vị trí đột biết.
Nếu xảy ra đột biến thì primer không bám được vào và sẽ không có sản phẩm.
Còn Realtime thì khác. Như sv_ngheo đã nói là cặp mồi sẽ bao lấy vị trí đột
biến. Trong trường hợp này, dù mẫu là đột biến hay kiểu dại thì vẫn luôn luôn có sản
phẩm, nhưng khi phân tích Melting Peaks thì sẽ thấy Tm của hai sản phẩm khác nhau.
(1) Rõ ràng, việc kết luận dựa trên sự có hay không có sản phẩm PCR là không
an toàn, đặc biệt trong ứng dụng thực tế, khi mà nơi làm phản ứng PCR không được
trang bị như ở các Lab Sinh học phân tử chính thống và người làm pư PCR lại không
phải là những cán bộ nghiên cứu. Sản phẩm pư không xuất hiện phụ thuộc rất nhiều
vào những yếu tố khác chứ không chỉ riêng là do DNA template bị mất cái đoạn đó.
(2) Việc kết luận dựa trên Melting Curves Analysis thì có thể nói chính xác đến
100%. Tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến (1) đều không có tác dụng với Realtime trong
việc đưa ra kết luận.
Điểm khác biệt cơ bản thứ 2 khiến cho Realtime trở nên ưu việt hơn PCR
thông thường rất rất nhiều, đó là Realtime có thể kết luận mẫu phản ứng là đồng hợp
tử hay dị hợp tử dựa trên phân tích Melting curve. Dĩ nhiên, chiến đấu end point với
vũ khí là điện di trên gel agarose thì không thể làm được điều này.
Ngoài ra, một vài ưu thế lặt vặt khác như thời gian, công sức ... cũng nên được kể ra.
Đặc biệt: SYBR GREEN I không hề đắt.
So với PCR thường thì Realtime PCR có khả năng định lương tốt hơn và có độ nhạy
(và có thể cả độ đặc hiệu) cao hơn, nhưng lại cần thiết bị hiện đại hơn và hóa chất tiêu
hao đắt tiền hơn. Từ đó ta có thể dễ dàng phân biệt được ứng dụng của hai kỹ thuật
này bạn ạ
Buồng ủ nhiệt được làm bằng kim loại dẫn nhiệt cao, đặt trên 1 thiết bị peltier
có cấu tạo là 2 mảnh kim loại đặc biệt đặt áp vào nhau, 2 mảnh này được nối với 2 cực

của nguồn điện và được điều chỉnh tự động để chiều của dòng điện đi qua thiết bị
được thay đổi theo chiều này hay theo chiều ngược lại. Chính sự đổi chiều dòng điện
đã làm cho 2 mảnh kim loại của thiết bị peltier nóng lên ở mặt này và lạnh đi ở mặt
khác sẽ bị đảo ngược lại nhiệt độ, nghĩa là mặt nóng sẽ bị lạnh và mặt lạnh sẽ bị nóng
lên. Như vậy chu kì nhiệt mà người sử dụng nhập vào sẽ được bộ vi xử lí của máy sử
dụng để điều khiển chiều và cường độ dòng điện đi qua 2 mảnh kim loại của thiết bị
peltier, làm cho buồng ủ nhiệt được lên xuống nhiệt độ theo chu kì đã nhập vào.


Real-time PCR là một cải biến của PCR thồng thống. Vì vậy về độ đặc hiệu
không có sự khác biệt giữa PCR và Real-time PCR, mà độ đặc hiệu do chính primer
và việc tối ưu hóa quy trình quyết định. Real-time PCR có ưu điểm hơn so với PCR
truyền thống là: Độ nhạy cao hơn, có thể sử dụng để định lượng tuyệt đối dựa trên tín
hiệu huỳnh quang khi chạy cùng với đường chuẩn, trong khi đó PCR truyền thống chỉ
có thể định lượng một cách tương đối dựa vào cường độ sáng trên band điện di. và
real-time PCR giúp rút ngắn thời gian làm thí nghiệm hơn so với PCR truyền thống do
không phải trải qua các bước phân tích sau PCR........
PCR phát hiện được một trình tự quan tâm dựa vào việc phát hiện được sản
phẩm khuếch đại trên gel điện di. Vậy độ đặc hiệu của nó dựa vào sự bắt cặp đặc hiệu
của cặp mồi cộng thêm với xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại trên gel điện
di. Tuy nhiên, kích thước của sản phẩm PCR xác định trên gel điện di, đặc biệt là điện
di agarose hay điện di acrilamide bản nhỏ có độ phân giải không cao.
Ngược lại, Độ đặc hiệu của Realtime PCR thì khác, ngoài sự đặc hiệu của cặp mồi còn
được cộng thêm độ đặc hiệu của trình tự probe nằm giữa hai mồi. Xác suất để một
đoạn ADN nào khác được nhân lên bởi cặp mồi lại có thể bắt cặp bổ sung với trình tự
của probe sẽ nhỏ hơn rất nhiều, chính điều này làm cho Realtime PCR có độ đặc hiệu
cao hơn (ngay cả sản phẩm PCR được khuếch đại nhầm có cùng kích thước với sản
phẩm quan tâm thì cũng không có tín hiệu phát ra!). Ngoài ra, Realtime PCR còn có
thể giúp chúng ta xác định được Tm của sản phẩm PCR cũng là yếu tố làm cho nó đặc
hiệu

hơn
so
với
PCR
truyền
thống
bạn
ạ.
Tóm lại, Realtime PCR có thể sẽ đặc hiệu hơn PCR truyền thống.
Real time PCR hiện giờ được sử dụng nhiều nhất là trong y tế, nếu các bạn ai
mà đi viêm gan B, các bạn sẽ được các bác sỹ gợi ý đi làm định lượng HBV-DNA.
thực chất đây là một quá trình định lượng số đoạn AND của virut viêm gan B đang có
ở trong máu bệnh nhân. ngày trước họ thường dùng hóa chất là SybrGreeb cho rẻ,
nhưng hóa chất này độ chính xác cũng như đặc hiệu không cao khi sử dụng nhiều mồi
(probe). Hiện nay ngừoi ta sử dụng hóa chất taqman có ưu điểm là độ nhậy cao có thế
định lượng được từ 1 bản copy (đoạn ADN) trong mẫu nhưng lại rất đắt.
Biểu đồ chuẩn có trục hòanh là số lượng DNA ban đầu bạn cho vào những
phản ứng chuẩn (thường gọi tắt là standard), trục tung là giá trị Ct thu được từ những
phản ứng chuẩn này. Đường thẳng xuất hiện trên biểu đồ này được gọi là đường
chuẩn.
Biểu đồ khuyếch đại thể hiện sự nhân bản của các phản ứng real-time PCR. Trục
hòanh là số chu kỳ PCR, trục tung thường là cường độ hùynh quang thu được từ ống
phản ứng.