Kỹ thuật Real time PCR chẩn đóan sớm HIV trên trẻ em

1
Kỹ thuậtReal time PCR chẩn đóan sớmHIV trên
trẻ em
Eric Nerrienet
HIV/Hepatitis Laboratory
IP Cambodia, Phnom Penh
Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales
2
Tình nhiễm HIV ở Campuchia
•
Tần suất nhiễm HIV:
•Người lớn ở độ tuổi từ 15-49: 1.9% (2003)
•
Chủng lưu hành chủ yếu là HIV-1 CRF 01 AE
•Phụ nữ mang thai: 2.8%
•
Đường lây từ mẹ sang con là một trong những đường lây quan
trọng trong dịch bệnh
Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales
2
3
Vấn đề đặt ra
Nếu trẻ không được phát hiện sớm và điều trị thuốc kháng virus
Trẻ có nguy cơ tử vong là 50% trong 02 năm đầu tiên của cuộc sống
Nếu không có sự tầm sóat sớm nhiễm HIV ở trẻ, BS Nhi Khoa phải chờ đợi đến
tháng thứ 15 để có thể biết tình trạng huyết thanh học thực sự của trẻ sinh ra từ
bà mẹ HIV(+)
Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales
Kỹ thuật kinh điển trong chẩn đóan nhiễm HIV ở trẻ
-RT PCR/b-DNA
-Giá thành đắt

-Nested-DNA PCR (gen: Gag, Pol và/hoặcEnv)
-Đắt, kỹ thuật phức tạp
-Nuôi cấy và phân lập virus
-Đắt, kỹ thuật phức tạp, mất nhiều thời gian
-Cần labo an tòan mức độ 3
4
Mục tiêu
Xây dựng
Chuẩn hóa
Đánh giá
Kỹ thuật real time PCR
Để chẩn đoán sớm, giá thành thấp ở trẻ sinh ra từ mẹ nhiễm HIV
Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales
3
-1.00E-01
4.00E-01
9.00E-01
1.40E+00
1
6
11
16
21
26
31
36
Số chu kỳ
Huỳnh quang (delta Rn)
Phân tích theo thời gian thực
Phân tích điểm cuối

Kỹ thuật « Real-time PCR »
có độ nhạy, đặc hiệu cao, giá thành thấp so với những kỹ thuật kinh điển, dùng để định
tính hay định lượng RNA/DNA HIV
Ct
Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales
6
2 10
6
cp/ml
2 10
5
2 10
4
2000
200
Chu kỳ ngưỡng:35 (17 000 cp/ml)
Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales
Lượng virus dưới mức phát hiện
4
7
•
Xây dựng và chuẩn hóa kỹ thuật
• Nhóm nghiên cứu ANRS
(AC11/AC12)
trong việc định lượng HIV ở các
nước phía Nam bán cầu
•
Trên 10 phòng thí nghiệm virus ở Pháp
•
Châu Phi: Cote d’Ivoire, Cameroon, Senegal, Burkina Faso, Central

African Republic
•
Đông Nam Á: Việt Nam và Cambodia (bắt đầu từ tháng 1-7/2005)
Kết quả
• Ứng dụng đầu tiên ở Campuchia
•từ 3/2005: Chẩn đoán HIV-1 sớm ở trẻ sinh từ mẹ nhiễm HIV
• Đánh giá tại Campuchia
•9/2005: Kiểm định củaANRS
•11/2005: Kiểm định củaNIH
Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales
8
•
Phương pháp:
• So sánh phương pháp chẩn đoán HIV ở trẻ em
•
Phương pháp kinh điển nested DNA PCR
•
So sánh với kỹ thuật real time RT PCR thực hiện trên gene LTR (theo ANRS
protocol)
•
Mẫu bệnh phẩm:
•Huyết thanh của nhóm trẻ được chẩn đoán HIV (+) và nhóm trẻ HIV(-) ở
Campuchia (n=226) và Việt Nam (n=38)
•
145 trẻ em gái và 119 trẻ trai
•
độ tuổi từ 1-28 tháng, độ tuổi trung bình 7,2 tháng)
Tiếp cận kỹ thuật
Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales
5

9
10
1950DNA-
069DNA+
RNA-RNA +
Nested
DNA
PCR
Real RT PCR
Độ đặc hiệu 100% (95% CI, 90 đến 100%)
Độ nhạy 100% (95% CI: 97,3 đến100%)
Kết quả 2
Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales
264 trẻ sinh ra từ mẹ nhiễm HIV ở Cambodia và ViệtNam
Kết quả nồng độ HIV định lượng