Nghiên cứu lên men một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azotobacter ở quy mô phòng thí nghiệm

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi
đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân
thành và kính trọng đến:
PGS.TS. Nguyễn Anh Dũng, người trực tiếp hướng dẫn khoa học, đã tận tình
chỉ dẫn tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
TS. Võ Thị Phương Khanh trưởng bộ môn sinh học thưc nghiệm, Th.s Nguyễn
Văn Bốn cố vấn học tập và toàn bộ các thầy cô trong bộ môn sinh học thực nghiệm
cũng như các thầy cô trong Viện công nghệ sinh học và môi trường đã giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu cũng như đóng góp những ý kiến quý
báu cho tôi hoàn thành khóa luận này.
Các bạn sinh viên lớp Cử nhân Sinh học khóa 2010 – 2014 đã nhiệt tình giúp
đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện khóa luận.
Bạn bè, gia đình và những người đã luôn động viên tinh thần và tạo điều kiện
tốt nhất cho tôi học tập và hoàn thành khóa luận này.
Do thời gian tương đối hạn hẹp và lần đầu tiên làm quen với công việc nghiên
cứu khoa học, kiến thức còn giới hạn nên không thể tránh khỏi những thiếu sót. Vì
vậy rất mong nhận được sự thông cảm góp ý của quý thầy cô và các bạn

Đắk lắk, tháng 5, năm 2014
Sinh viên
Hòa Thị Nguyệt


ĐẶT VẤN ĐỀ

1. Tính cấp thiết của đề tài
Nitơ có vai trò đặc biệt quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển của cây
trồng. Nitơ có trong thành phần của hầu hết các chất trong cây như : protein, axit
nucleic, các sắc tố quang hợp, các hợp chất dự trữ năng lượng: ADP, ATP, các chất
điều hoà sinh trưởng ,…

Hàm lượng nitơ trong thành phần các chất khô của thực vật dao động từ 1 - 3
%. Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng.
Thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng,
đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp nên năng suất giảm. Nếu
thừa nitơ cũng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và năng suất
của cây trồng. như cây sinh trưởng mạnh thân lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ đổ,
thu hoạch gặp nhiều khó khăn. Như vậy Nitơ vừa có vai trò cấu trúc, vừa tham gia
trong các quá trình trao đổi chất và năng lượng. Nitơ có vai trò quyết định đến toàn
bộ các quá trình sinh lý của cây trồng.
Trong tự nhiên, nitơ được tạo ra từ các nguồn khác nhau như quá trình amon
hóa, quá trình nitrat hóa,ngoài ra nguồn nitơ còn được tạo ra từ quá trình cố định nitơ
phân tử được thực hiện bởi các nhóm vi sinh vật trong đất, trong đó có sự đóng góp
của nhóm vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter sp. Các vi sinh vật thuộc nhóm
này có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử thành các hợp chất chứa nitơ mà cây trồng
có khả năng hấp thụ được
Azotobacter sp là vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất, hiếu khí, không
sinh bào tử, Gram âm. Khi còn non tế bào thường có dạng hình que, kích thước
khoảng 2,0- 7,0 × 10- 2,5 μm.
Đã có nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến mối quan hệ
giữa Azotobacter sp và cây trồng. Chúng có tác dụng làm tăng cường nguồn thức ăn
nito cho cây. Nhờ đặc tính oxy hóa hiếu khí trong quá trình trao đổi chất nên hiệu
quả cố định nito cao hơn nhiều so với nhóm kị khí. Trung bình khi tiêu thụ 1g


glucose, Azotobacter sp có khả năng đồng hóa được 10-15mg N 2. Tác dụng
của Azotobacter sp đối với cây trồng còn được chứng minh ở khả năng tạo các chất
kích thích sinh trưởng như thymine, acid nicotinic, acid pantotenic, biotin..
Hiện nay người ta dùng phương pháp lên men để thu được một lượng lớn sinh
khối vi khuẩn Azotobacte sp để phục vụ vào việc tạo ra các chế phẩm phân vi sinh có
ích cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng

Đề tài: “Nghiên cứu lên men một số chủng vi khuẩn cố định đạm
Azotobacter ở quy mô phòng thí nghiệm” được thực hiện nhằm nghiên cứu các
điều kiện thích hợp cho sự lên men vi khuẩn cố định đạm Azotobacter .
2. Mục tiêu của đề tài
Xác định các điều kiện lên men tối ưu đến việc thu sinh khối của vi khuẩn
Azotobacter . Qua đó đánh giá hiệu quả của một số chủng vi khuẩn Azotobacrer
đến sự sinh trưởng của cây cải ngọt
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học

- Xác định được các điều kiện thích hợp cho việc lên men vi khuẩn cố định
đạm Azotobacter

- Đánh giá vai trò của vi sinh vật cố định nitơ trong tự nhiên đối với sự sinh
trưởng và phát triển của thực vật
3.2.

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài góp phần vào việc áp dụng công nghệ lên men trong quy
mô công nghiệp nhằm thu một lượng lớn sinh khối vi khuẩn cố định đạm ứng
dụng trong việc sản xuất phân bón vi sinh.
4. Giới hạn của đề tài
Trong quá trình thực hiện đề tài do thời gian có hạn nên chúng tôi chỉ bước
đầu đánh giá ảnh hưởng của số điều kiện lên men đối với một số chủng vi khuẩn
Azotobacter . Ngoài ra, đây là lần đầu tiên làm công tác nghiên cứu khoa học


nên không tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong quí thầy cô và các bạn góp ý
để báo cáo được hoàn thiện hơn.

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn nitơ trong tự nhiên
Trong nước, nitơ chủ yếu ở dạng hợp chất của NH 4+, NO2-, NO3-. Trong đất có
2 dạng nitơ tồn tại đó là nitơ vô cơ trong các muối khoáng và nitơ hữu cơ trong xác,
chất bài tiết từ sinh vật. Các hợp chất chứa nitơ trong xác, chất bài tiết của động vật
và thực vật bị một số loại nấm và vi khuẩn phân giải.


Trong đất không khí amon hầu như chuyển hóa toàn bộ thành hợp chất nitrat.
Phần lớn hợp chất nitrat được thực vật hấp thụ, phần còn lại bị mất đi do mưa rửa
trôi và tác dụng của phản ứng nitrat hóa.
Hợp chất đạm mà thực vật hút từ đất một phần như gốc rễ được trả lại đất, phần
còn lại được động vật và thực vật dị dưỡng tiêu thụ, lại biến thành các chất bài tiết
trả lại đất. Những chất hữu cơ này dưới tác dụng của nhiều loại vi sinh vật, nấm bị
khử thành đạm ở dạng hữu hiệu.
Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử (N 2) chiếm khoảng 80
%, ở dạng nguyên tử kép (N2) được khóa chặt với nhau thông qua liên kết cộng hóa
trị bền vững (N≡N). Mặc dù rất cần nguyên tố này, nhưng cây chỉ có thể hấp thụ
được nitơ ở dạng NO3- và NH4+ [3]. Để sử dụng được nguồn nitơ lớn từ không khí
có 2 con đường chính là hóa học và sinh học.
Hóa học: Kể từ năm 1920, phương pháp công nghiệp Haber - Bosch đã giúp
con người phá vỡ liên kết ba này. Biện pháp này đòi hỏi phải thực hiện ở nhiệt độ
rất cao (450 - 500oC), áp suất là 125 atm và Fe3+ là chất xúc tác. Các hợp chất nitơ
được tổng hợp hóa học trên cung cấp cho cây trồng một nguồn nitơ lớn và ổn định.
Tuy nhiên, bên cạnh việc sử dụng phân đạm tổng hợp hóa học cho nông nghiệp có
thể làm tăng năng suất cây trồng thì cũng đem lại những tác hại cũng không nhỏ, vì
trung bình chỉ có 40 - 50 % lượng đạm bón được cây hấp thu, phần còn lại gây ô
nhiễm môi trường đất, nước, không khí… từ đó gây hại thậm chí là tiêu diệt các
sinh vật có lợi. Các hợp chất chứa nitơ của phân bón hóa học gây hại rất lớn đối với

cá, động vật thân mềm và kể cả con người.
Sinh học: Nhờ các vi sinh vật có thể tiết ra enzyme nitrogenase để thực hiện
quá trình sinh học đặc biệt - quá trình cố định nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả năng
thực hiện quá trình này được gọi là các vi sinh vật cố định nitơ. Việc sử dụng phân
bón vi sinh làm đất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả
năng cải tạo đất do các hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp hơn,
cây dễ hút chất dinh dưỡng hơn. Ngoài ra, còn có các con đường tạo nitơ khác như
do sấm chớp hay cháy.
1.2. Vai trò của nitơ đối với thực vật


Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein, diệp
lục, ATP… Hàm lượng nitơ trong thành phần các chất khô của thực vật dao động từ
1 - 3 %. Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan
trọng trong đời sống sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất của cây trồng.
Thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng,
đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp nên năng suất giảm.
Nếu thừa nitơ cũng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và năng
suất của cây trồng. như cây sinh trưởng mạnh thân lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ
đổ, thu hoạch gặp nhiều khó khăn.
1.3. Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên
1.3.1. Quá trình khoáng hóa
Quá trình khoáng hóa là quá trình phân hủy xác hữu cơ dưới tác động của quần
thể vi sinh vật thành các chất khoáng hòa tan hay các chất khí và tỏa nhiệt, tùy
thuộc vào điều kiện khoáng hóa mà cho các sản phẩm khác nhau. Giai đoạn này có
sự tham gia của các chủng vi sinh vật nitrat hóa như Nitrosomonas và Nitrobacter những vi khuẩn tham gia vào quá trình oxy hóa những hợp chất chứa nitơ thành
nitrat (NO3-), một dạng thích hợp để cho cây trồng hấp thu.

Vi khuẩn amon hóa
NH4+

Hợp chất hữu cơ
Vi khuẩn nitrat hóa
+
4

NH

Nitrosomonas

2

NO

Nitrobacter

NO2-

NO3-

1.3.2. Quá trình phản nitrat hóa
Là quá trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat trong điều kiện yếm khí dưới
tác dụng của vi sinh vật tạo thành nitơ.


NO3-

Vi khuẩn phản nitrat
hóa

N2

1.3.3. Quá trình cố định nitơ phân tử
Quá trình này được thực hiện do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium
sống cộng sinh ở rễ cây họ đậu hay Azotobacter sống tự do, sẽ biến đổi N2 trong
không khí thành NH3, từ NH3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp
cho cây trồng và đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất. Để quá trình này xảy ra thì
phải có lực khử mạnh, ATP và thực hiện ở điều kiện kỵ khí (do chỉ trong điều kiện
này enzyme nitrogenase mới hoạt động).

Nitrogenase
N2 + H2

NH3

H2O

NH4+

Vi khuẩn cố định đạm
1.4 Tổng quan về vi khuẩn cố định Nitơ
Người ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng lấy đi
khỏi đất khoảng 30kg nitơ [2]. Theo thống kê hàng năm các sản phẩm nông nghiệp
trên thế giới lấy đi khỏi đất khỏang 100 – 110 triệu tấn nitơ (G. Colar và Greenland)
[2]. Trong khi đó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù đắp được một phần
lượng nitơ mà cây lấy đi khỏi đất, những tổn thất về nitơ được bù đáp bởi một quá
trình sinh học đặc biệt gọi là quá trình cố định nitơ do vi sinh vật thực hiện, chúng
có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử trong không khí thành các hợp chất chứa nitơ
và làm giàu thêm nguồn đạm trong đất, có thể xếp chúng thành ba nhóm lớn:
+ Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật.

+ Nhóm vi khuẩn sống tự do.
+ Nhóm khuẩn lam.
1.4.1 Nhóm Vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật
1.4.1.1 vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây bộ đậu


Nhà khoa học Hà Lan M. W. Beijrinck đã phân lập được loài vi khuẩn sống cộng
sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ đậu và ông đặt tên là Basillus radicicola, vi
khuẩn này được xếp vào chi riêng Rhizodium.
Trên môi trường đặc, vi khuẩn nốt sần thường có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, vô
màu. Khi còn non tế bào của chúng có dạng hình que hoặc cầu 0.5-0.9x1.2-3.0µm,
có khả năng di động nhờ tiêu mao; khi già tế bào trở nên bất động kích thước lớn
phân nhánh gọi là thể giả khuẩn [2], [8].
Đây là các loài hiếu khí, tuy nhiên vi khuẩn nốt sần vẫn có thể sử dụng được
ngay cả ở trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0.01atm. đa số
chúng thích hợp ở pH = 6.5-7.5, bị cản trở khi pH= 4.5 – 5.0 hoặc lớn hơn 8.0 nhiệt
độ thích hợp 24-260C,ở 370C sự phát triển của chúng bị cản trở.
Vi khuẩn nốt sần xâm nhiễm vào rễ cây bộ đậu thông qua lông hút, đôi khi
thông qua vết thương ở vỏ rễ. Người ta nhận thấy muốn xâm nhiễm tốt thì vi khuẩn
nốt sần cần đạt tới 104 tế bào/gam đất. Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ tiết ra
enzyme polylacturonase phân hủy thành lông hút, tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm
nhập vào rễ. Hằng năm vi khuẩn nốt sần cộng sinh trong rễ cây bộ đậu có thể làm
giàu cho đất khoảng 50-600kg nitơ/ha [2].
1.4.1.2 Vi sinh vật cố định đạm cộng sinh trong một số cây không thuộc bộ đậu
Ngoài những loại cây thuộc bộ đậu thì những loài cây không thuộc bộ đậu cũng
có khả năng tạo nốt sần như: một số thực vực thuộc ngành hạt trần: Bowenia,
Cycas...một số thực vật hai lá mầm: Coffee, Coriaria,... Ngoài ra một số thực vật
còn có khả năng tạo nốt sần trên lá.
Qua nghiên cứu cho thấy, ngoài vi khuẩn nốt sần một số loài xạ khuẩn thuộc
chi Frankia (cộng sinh trong rễ loài Casuarina) nhiều loài nấm rễ (khuẩn căn hay

mycorhiza ) cũng có khả năng cố định nitơ phân tử, tạo nốt sần. Có nhiều nghiên
cứu cho thấy, nhờ tác dụng của nấm rễ mà đất thông Pinus radiala ở Mỹ hằng năm
làm giàu thêm khoảng 50kg nitơ/ha [2].
Ngày nay, các nhà khoa học có thể phân lập, nuôi cấy vi khuẩn cố định N cộng
sinh Rhizobium để sản xuất chế phẩm Nitragin để xử lý hạt giống đậu trước khi


gieo. Vi khuẩn sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp sau đó hấp phụ vào chất
mang là đất, than bùn để bảo quản và sử dụng.
1.4.2 Nhóm Vi khuẩn cố định nitơ tự do
1.4.2.1 Vi khuẩn cố định nitơ tự do kỵ khí Clostridium
Clostridium được phát hiện lần đầu tiên bởi Vinogradxki (1893). Tế bào
Clostridium hình que có kích thước 2.5-7.5 x 0.7-1.3µm, có thể đứng riêng rẽ hoặc
kẹp đôi thành chuỗi ngắn. Khi còn non có khả năng di động, khi già mất khả năng
di động, bào tử nằm ở trung tâm, khuẩn lạc nhẵn và trắng có khả năng chịu được
nhiệt độ cao và khô hạn [5].
Vi khuẩn Clostridium có nhiều loài có khả năng cố định nitơ phân tử như: Cl.
pasteurianum, Cl. butylicum .... nhưng loài có khả năng cố định đạm cao nhất là
Clostridium pasteurianum. Chúng có khả năng cố định được 5-10 mg nitơ khi tiêu
thụ hết 1g carbon. Phạm vi hoạt động cố định nitơ của Clostridium trong khoảng pH
khá rộng 4.7 – 8.5, tối thích là 6.9 – 7.3.
1.4.2.2 Vi khuẩn cố định nitơ tự do hiếu khí
Nhóm này gồm hai chi chính là Beijerinskia sp và Azotobacter sp.
1.4.2.2.1 Nhóm vi khuẩn thuộc chi Beijerinskia sp.
Beijerinskia sp là loài vi khuẩn hiếu khí cố định nitơ rất giống với Azotobacter
sp. chúng được phân lập bởi R. J. Starkey (1939), tế bào có hình dạng thay đổi như
hình cầu, hình que, hình bầu dục. Beijerinski là vi khuẩn gram âm, không sinh bào
tử và bào xác, đặc điểm chung của vi khuẩn thuộc chi này là chịu chua cao. Có khả
năng sống tốt trong môi trường acid (pH=3), và nhiệt độ từ 16 – 370C.
Trên môi trường vô đạm, sau 3 ngày nuôi cấy xuất hiện khuẩn lạc nhầy. Lồi. Vi

khuẩn có khả năng cố định được 16-20 mg N khi đồng hóa hết 1g dinh dưỡng
carbon. Ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có khả năng tổng hợp các chất kích
thích sinh trưởng cho cây trồng.
1.4.2.2.2 Nhóm vi khuẩn thuộc chi Azotobacter sp.


Azotobacter sp đuợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1901 (M. Beijerinck). Chúng
thuộc vi khuẩn hiếu khí nhưng chúng có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí. Hầu
hết các loài Azobacter sp đều sống dị dưỡng.
Azotobacter sp là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả năng cố định N
tự do. Khi chưa trưởng thành tế bào thường có hình que, kích thước 2.0-7.0 x 1.02.5 µm, sinh sản bằng cách phân cắt, di chuyển nhờ tiêm mao. Khi trưởng thành
mất khả năng di chuyển, kích thước thu nhỏ thành dạng cầu được bao bọc bởi một
lớp nhầy.
Trong môi trường không chứa nitơ, Khuẩn lạc của Azotobacter sp có dạng cầu
lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo. Khi nuôi cấy trong môi trường đặc. Khuẩn lạc có
màu hồng hoặc nâu đen, sinh sắc tố hình quang màu vàng lục hoặc lam lục, sắc tố
khuếch tán vào môi trường [5, 14].
Azotbacter sp rất nhạy cảm với độ ẩm của đất và hàm lượng của các nguyên tố
khoáng có trong đất (P, K, MO, B, Cu...)
Nhiều nghiên cứu cho biết Azotobacter có thể phát triển đươc trên môi trường
có pH trong khoảng 4.5 – 9. quá trình cố định nitơ chỉ được thực hiện trong khoảng
pH 5.5 – 7.2. Nhiệt độ thích hợp nhất từ 26-300C [2, 5].
Các chủng phân lập từ tự nhiên có khả năng cố định 10-15 mg N khi tiêu thụ
hết 1g dinh dưỡng Carbon. Một số nòi tuyển chọn có khả năng cố định tới 30mg/1g
dinh dưỡng Carbon.
Trong đất, Azotobacter sp tập trung ở vùng đất xung quanh rễ cây. Ngoài khả
năng cung cấp dinh dưỡng N cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy mầm, kích
thích sinh trưởng. Trong đất, Azotobacter sp thường phổ biến các chủng sau:
+ Azotobacter chrococum: Kích thước tế bào 2.0 x 3.1 micromet, có khả
năng di động khi còn non. Khi già hình thành nang xác, khuẩn lạc có màu nâu hoặc

đen khi về già, không khuếch tán ra môi trường.


+ Azotobacter beijerinckii: Có kích thước 2.4 x 4.6µm. Không có khả năng
di động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng, sắc tố không
khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy.
+ Azotobacter vinelandii: Tế bào có kích thước 1.5 x 3.4 µm, có khả năng di
động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán
vào môi trường.
+ Azotobacter agilis: Tế bào có kích thước 2.8 x 3.3 µm, có khả năng di
động, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố
khuếch tán vào môi trường [2].
1.4.3 Nhóm vi khuẩn lam
Năm 1928, Drewes (Đức) lần đầu tiên chứng minh một cách xác đáng khả
năng cố định nitơ của ba loại khuẩn lam và đã phân lập chúng một cách thuần khiết.
Đa số các loài khuẩn lam có khả năng cố định nitơ sống tự do trong đất, trong
nước nhưng cũng có một số sống cộng sinh trong thực vật.
Đây là vi sinh vật hiếu khí, chúng thích hợp phát triển trong môi trường trung
tính hoặc kiềm. Nhiệt độ thích hợp từ 28 – 300C. Chúng có khả năng cung cấp cho
đất khoảng 50 kg N/ha/năm [2].
Ngoài các nhóm vi sinh vật cố định nitơ chủ yếu nói trên người ta còn thấy
nhiều vi sinh vật thuộc nhóm khác cũng có khả năng đồng hóa nitơ như: Tảo xanh
Lục, một số đại diện của nấm men và nấm mốc (Saccharomyces apiculatus, Oidium
Lactic...)
Như vậy, dù có sản xuất nhiều phân khoáng đi chăng nữa cũng không thể bổ
sung đạm cho đất nếu chỉ dụa vào công nghiệp hóa học. Có thể nói vi sinh vật đóng
vai trò hết sức quang trọng đối với nông nghiệp trong việc cung cấp đạm sinh học
cho đất. Vấn đề đặc ra cho các nhà khoa học hiện nay là nghiên cứu phương pháp
nuôi cấy hiệu quả nhất để tăng sinh khối tế bào. Từ đó ứng dụng vào nông nghiệp,
hướng đến một nền sản xuất nông nghiệp sinh thái vững bền trong cả nước nói

chung và ở tỉnh Tây Nguyên nói riêng.


1.5. Tổng quan về Azotobacter
Azotobacter thuộc chi vi khuẩn gốc rễ sống tự do, không sinh bào tử nhưng tạo
bào xác (cyst) giúp chúng chống chịu được với điều kiện khô hạn và bất lợi. Chúng
được tìm thấy trong đất trung tính đến kiềm, trong môi trường nước và trên
một số thực vật.
Azotobacter được quan tâm nhiều do chúng có khả năng cố định nitơ phân tử
từ không khí thành ammonia. Quá trình cố định này được thực hiện nhờ hệ
nitrogenase [17].
Chủng đầu tiên thuộc chi Azotobacter được phân lập từ đất là chủng
Azotobacter chrococcum ở Holland vào năm 1901. Kể từ đó các loài vi khuẩn này
đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả. A. chrococcum và A. algilis được nghiên
cứu bởi Beijerinck (1901). Trong nhiều năm tiếp theo thì các loài thuộc nhóm vi
khuẩn Azotobacterkhác đã được tìm thấy trong đất và xung quanh vùng rễ như A.
vinelandii (Lipman, 1903), A. beijernckii(Lipman, 1904), A. Nigricans
(Krassilnikov, 19490), A. Paspali (Dobereiner,1966); A. Armenicus (Thompson và
Skerman, 1981), A. salinestris(Page và Shivprasad, 1991). Các loài vi khuẩn cố
định nitơ này rất quan trọng trong ngành nông nghiệp và môi trường [23]
Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định nitơ của vi khuẩn sống tự do trong
đất
Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định N2 của vi sinh vật cho đến nay vẫn chưa
được sáng tỏ hoàn toàn, nhưng đa số các nhà nghiên cứu đồng ý với giả thuyết cho
rằng NH3 là sản phẩm đồng hóa sơ cấp của N 2 và có thể nêu ra giả thuyết về 2 con
đường cố định N2 của vi khuẩn sống tự do trong đất như sau :


Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho phản ứng
cố định N2 được giảm nhiều, chỉ vào khoảng 16-20 Kcalo/M, song lượng năng

lượng vẫn còn lớn so với trong cơ thể sinh vật. Tốc độ phản ứng nhanh chóng trong
tế bào vi sinh vật ở nhiệt độ thấp nhờ có hệ thống hydrogenase hoạt hóa H 2 và
nitrogenase hoạt hóa N2.
Năm 1961-1962, người ta đã tách từ Clostridium pasteurrianum hai tiểu phần
hoạt hóa H2 và N2. Sau này người ta tìm thấy ở Azotobacter cũng có các tiểu phần
đó. Trong quá trình hoạt hóa này có sự tham gia của 2 nguyên tố khoáng Mo và Fe.
Nguồn hydro để khử N2 có thể là hydro phân tử (H2). Trong trường hợp này thì
dưới tác dụng của hydrogenase, điện tử được chuyền theo hệ thống:

Nguồn cho điện tử và hydro là acid pyruvic. Đáng chú ý là trong quá trình
chuyền điện tử có sự tham gia tích cực của feredoxine (Fd). Fd là cầu nối giữa 2 hệ
enzyme hydrogenase và nitrogenase để cố định N2.


Sự cố định N2 của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ đồ phức tạp hơn.
Trong các nốt sần có một chất có bản chất HEM rất giống với hemoglobin trong
máu gọi là leghemoglobin. Nó dễ dàng liên kết với O 2 để biến thành
oxyhemoglobin. Leghemoglobin chỉ được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với
cây bộ đậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin
và không cố định được N2. Những nghiên cứu gần đây về quá trình cố định
N2 cho thấy quá trình cố định này đòi hỏi:
Có sự tham gia của enzyme nitrogenase. Có thể coi đây là nhân tố chìa khóa
cho quá trình này. Enzyme này hoạt động trong điều kiện yếm khí.
Có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP,...)
Có năng lượng ATP đủ và có sự tham gia của nguyên tố vi lượng. Nhóm
hoạt động của enzyme nitrogenase có chứa Mo và Fe. Vì vậy sử dụng Mo và Fe cho
cây họ đậu thường có hiệu quả rất cao.
Tiến hành trong điều kiện yếm khí. Các chất khử là NADH2 và Fd cùng với
năng lượng do hô hấp, quang hợp của cây chủ cung cấp. Sự cố định N 2 cần rất
nhiều năng lượng, cần 16 ATP để khử 1 N 2. NH3 tạo thành trong quá trình cố định

N2 được sử dụng dễ dàng vào quá trình amine hóa các cetoacid để tổng hợp một
cách nhanh chóng các acid amine, từ đó tham gia vào tổng hợp protein và nhiều quá
trình trao đổi chất khác.
Phản ứng cố định nitơ được xúc tác bởi enzyme nitrogenase theo phương trình
sau:
N2 + 8 H+ + 8 e- +16 ATP → 2 NH3 + H2 +16 ADP +16 Pi
Như phương trình trên, nitrogenase xúc tác cho phản ứng khử N 2 thành NH3
trong sự hiện diện của ATP và chất khử như dithionite trong phòng thí nghiệm hay


ferredoxin trong cơ thể sống. Nitrogenase là một phức hệ enzyme được cấu tạo bởi
2 thành phần, đó là protein có phân tử nhỏ. Một thành phần gọi là protein sắt molypden (Mo - Fe protein) còn gọi là thành phần I, thành phần kia gọi là protein
sắt (Fe protein), còn gọi là nitrogenase khử hay thành phần II. Thành phần I và
thành phần II của nitrogenase đều rất mẫn cảm với oxy, vì vậy nên hoạt động cố
định nitơ của vi sinh vật diễn ra trong điều kiện kỵ khí [17].
1.6. Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc
Hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm Azotobacter sp cho đất và hạt giống, cây
con đã được chứng minh trên các thí nghiệm đồng ruộng. Theo nghiên cứu của
Puneet (1998) cho thấy việc nhiễm Azotobacter sp kích thích nẩy mầm của hạt, kích
thích ra rễ và sinh trưởng, năng suất lúa mỳ, ngô tăng 10-15% so với đối chứng
[26]. Tổng kết các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ
cho thấy sử dụng chế phẩm Azotobacter có thể cung cấp cho cây trồng từ 30-60 kg
N/ha/năm và tổng lượng N do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể đạt đến 240
triệu tấn/năm. Vi khuẩn cố định N tự do Azotobacter còn có khả năng tổng hợp B1,
giberellin, cytokinin, IAA kích thích tăng trưởng cây trồng.
Theo Subba Rao (1988) công bố Ấn Độ tiến hành bón chế phẩm Azotobacter
cho lúa mì 3 lần trong năm:
- Lần 1: bón 20 kg chế phẩm Azotobacer/ha vào tháng 4-5.
- Lần 2: bón 15 kg/ha vào tháng 7
- Lần 3: bón 15 kg/ha vào tháng 10.

Với qui trình bón như vậy, có thể đáp ứng được 30% nhu cầu N của cây
trồng để giảm lượng bón phân hóa học, góp phần phát triển bền vững nông nghiệp.
Bagyaraj và Menger (1978) đã nghiên cứu tương tác giữa Azotobacter
chroococcum và các vi sinh vật vùng rễ và sinh trưởng của cà chua. Kết quả cho
thấy cà chua được ủ với chủng cố định N Azotobacter sẽ tăng sinh khối khô của cà
chua lên 65% so với đối chứng. Fulchieri (1994) nghiên cứu sử dụng 3 chủng
Azospirillum để xử lý hạt cho ngô. Kết quả cho thấy đã làm chiều cao cây, tăng sinh
khối và tăng năng suất ngô lên 59% so với đối chứng [ ].


Nghiên cứu của Puneet (1998) cũng cho thấy nếu bón phối hợp Azotobacter
sp. với các chủng phân giải P như Aspergillus niger sẽ làm tăng năng suất lúa mì
tăng 17,7%, trong khi Azotobacter chỉ tăng 9% [26]. Kapoor cũng cho kết quả
tương tự khi phối hợp chủng Azotobacter sp với các chủng phân giải phosphat như
Bacillus sp., Pseudomonas sp. Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa, bông vải lên 1020% [22].
El-Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố định N Azospirillum và
phân giải lân Bacillus megaterium xử lý cho lúa mì. Kết quả cho thấy hàm lượng N
trong thân lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 37-53%; hàm
lượng P trong thân tăng 48,6%; hàm lượng K tăng 10-14,3% so với đối chứng
không xử lý. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy xử lý phối hợp hai chủng có tác
dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý đơn chủng [ ].
Zemrany (2006) nghiên cứu sử dụng chủng A. lipoferum cho ngô. Kết quả
cho thấy khi sử dụng chủng này đã làm giảm 50% lượng N cho cây mà năng suất
vẫn đảm bảo.
1.7. Nghiên cứu trong nước
Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững và ứng dụng công
nghệ sinh học vào nông nghiệp, trong những năm gần đây Việt Nam có khá nhiều
nghiên cứu về Azotobacter và Azospirillum làm phân sinh học.
Phạm Bích Hiên và cộng sự (2003) đã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter của
Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định N chúng còn có khả năng sinh

tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA. Nhiệt độ thích hợp của các chủng này là
25-300C, pH thích nghi rộng từ 5,5-8,0 [8].
Phạm Ngọc Lan (1999) đã phân lập được 37 chủng Azotobacter trên đất gò đồi
vùng Thừa Thiên- Huế. Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn được hai chủng có khả
năng kháng kháng sinh, tồn tại được ở pH kiềm (pH=8). Kết quả thử nghiệm gây
nhiễm cây giống keo tai tượng trong vườn ươm đã làm tăng tỷ lệ sống, sinh khối,
chiều cao cây và hàm lượng nitơ trong lá cũng cao hơn so với đối chứng [11].


Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiệm chủng cố định N tự
do Azotobacter và chủng phân giải phosphate Archomobacter, Pseudomonas
aeruginosa. Kết quả cho thấy chế phẩm sinh học làm tăng sinh trưởng chiều cao mạ
7,47 -16,93%, và năng suất lúa tăng từ 13,39 – 55,85% [2].
Vũ Thúy Nga, Nguyễn Ngọc Quyên (2003) nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
IAA và phân giải phosphate khó tan của vi khuẩn Bradyrhizobium. Kết quả cho
thấy nhiều chủng có khả năng tổng hợp 20-100 microgam/ml môi trường nuôi cấy
[13].
Lâm Minh Tú, Trần Văn Tuân (2003) nghiên cứu sản xuất một số phân bón đơn
chủng, đa chủng cho cây trồng. Các chủng sử dụng trong nghiên cứu là Azotobacter
bejerinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa. Thử nghiệm
trên k hoai tây làm tăng năng suất từ 100-300% so với đối chứng [16].
Phạm Văn Toản (2003) sử dụng phân bón sinh học giảm được 20% phân bón vô
cơ N, P, K nhưng năng suất khoai tây vẫn tăng so với đối chứng 15-50%, cà chua
tăng 12-34%, lạc tăng 30% và giảm đáng kể bệnh héo xanh [15].
Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các
chủng cố định N trong rễ lúa đến sinh trưởng của mầm lúa CR 203. Nhóm tác giả
đã phân lập được 78 chủng cộng sinh với rễ lúa. Các chủng này có đặc điểm của chi
Azospirillum. Các chủng này kích thích sự nảy mầm và ra rễ của lúa CR 203 [5]

PHẦN 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu
-

Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến sinh khối vi khuẩn
Azotobacter

-

Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm Azotobacter .
đến sự sinh trưởng của cây rau cải ngọt.

2.2. Đối tượng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do Az15.2, Az3.1, Az3.2 được lưu trữ
tại Viện Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Tây Nguyên


2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm Viện công nghệ sinh học và môi trường, Trường Đại học
Tây Nguyên
- Phòng thí nghiệm bộ môn sinh học thực nghiệm , khoa Khoa học tự nhiên
và công nghệ, Trường Đại học Tây Nguyên
- Phòng thí nghiệm bộ môn khoa học đất , khoa Nông Lâm, Trường Đại học
Tây Nguyên
2.2.3. Thời gian nghiên cứu
- Đề tài thực hiện từ tháng 11/2013 tới tháng 05/2014
2.2.4 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu
Các hóa chất : K2HPO4, K2SO4, MgSO4.7H2O, NaCl, K2SO4,

CaCO3....Agar, Glucose
-

Thiết bị nghiên cứu:

• Đĩa petri, micropipette, ống nghiệm, que cấy, …
• Box cấy vô trùng,
•

Máy quang phổ

•

Tủ ấm.

•

Nồi hấp khử trùng.

• Máy lắc.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường và giống
2.3.1.1. Chuẩn bị môi trường
- Môi trường cơ bản sử dụng trong các thí nghiệm là môi trường Ashby
thành phần gồm:


Glucose

: 20 g.

K2HPO4

: 0,2 g.

MgSO4.7H20

: 0,2 g.

NaCl

: 0,2 g.

K2SO4

: 0,1 g.

CaCO3

: 5,0 g.

Agar

: 20 g.

Nước cất vừa đủ :1000ml
pH = 7
-

Môi trường Ashby lỏng thì không bổ sung agar. Môi trường thạch Ashby

được hấp khử trùng ở 1atm trong thời gian 30 phút.

2.3.1.2. Bảo quản và giữ giống thí nghiệm.
-

Sử dụng các ống giống của các chủng Az 15.2, Az 3.1, Az 3.2 đã
được phân lập và tuyển chọn trong các đề tài nghiên cứu trước đó để
nghiên cứu.

-

Cấy ống giống sang các đĩa petri có sẵn môi trường Ashby .Sau khi
thu đúng khuẩn lạc theo tài liệu miêu tả, chọn các khuẩn lạc đơn, cấy
dòng thuần từ 4-5 lần, sau đó cấy vào ống thạch nghiêng, đặt vào tủ
ấm ở nhiệt độ 30OC.

-

Sau 4-5 ngày làm tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi để xác định
đúng đối tượng nghiên cứu.

-

Các ống giống cho vào tủ lạnh, bảo quản ở nhiệt độ 4 OC. Cấy truyền
định kì sau 1- 2 tháng để giữ giống.

2.3.1.3. Phương pháp chuẩn bị giống thí nghiệm.
-

Trước khi tiến hành mỗi thí nghiệm chuẩn bị bình tam giác có chứa

50 ml môi trường Ashby lỏng, dùng que cấy lấy vi khuẩn Azotobacter


từ các ống giống, hòa tan vào bình. Lắc đều bằng tay, hoặc lắc trên
máy lắc ủ ấm ở nhiệt độ 30OC trong tủ ấm.
- Sau 24 giờ, dùng giống từ bình tam giác này để tiến hành các thí
nghiệm tiếp theo trong nội dung nghiên cứu.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến
sinh khối một số chủng vi khuẩn Azotobacter
2.3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon đến sinh khối
một số chủng vi khuẩn Azotobacter
- Để xác định nguồn carbon thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn ta tiến hành cấy
0.1ml chủng vi khuẩn Azotobacter đã chuẩn bị ở trên vào bình tam giác chứa 50ml
môi trường Ashby lỏng với sự thay thế các nguồn carbon khác nhau là glucose,
saccharose, tinh bột. Mỗi chủng cấy vào 3 bình .Tiến hành nuôi cấy với các thông
số cố định như pH = 7, tốc độ lắc 150 vòng/ phút, thể tích môi trường nuôi cấy,
thời gian nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy. Sau 5 ngày tiến hành đo OD660nm để xác định
sinh khối tế bào.Ở bình nào có sinh khối tế bào lớn nhất chứng tỏ môi trường có
chứa nguồn carbon đó thích hợp nhất đối với vi khuẩn Azotobacter sp. Thí nghiệm
lặp lại 3 lần
2.3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh khối một số
chủng vi khuẩn Azotobacter
Để xác định ảnh hửởng của pH nuôi cấy đến sinh khối Azotobacter sp tiến
hành nuôi cấy các chủng trên môi trường Ashby lỏng sử dụng nguồn carbon thích
hợp đã nghiên cứu được ở trên với pH = 5, 6, 7, 7, 8, 9. Nuôi cấy ở nhiệt độ 300C,
trên máy lắc xoay 150 vòng/phút. Sau 5 ngày tiến hành đo OD660nm để xác định sinh
khối tế bào . Mỗi chủng cấy vào 3 bình và lặp lại thí nghiệm 3 lần.
2.3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối một số
chủng vi khuẩn Azotobacter
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối Azotobacter

tiến hành nuôi cấy các chủng trên môi trường Ashby lỏng sử dụng nguồn carbon và
pH thích hợp đã nghiên cứu được ở trên với các nhiệt độ 300C, 350C, 400C trên


máy lắc xoay 150 vòng/phút. . Sau 5 ngày tiến hành đo OD660nm để xác định sinh
khối tế bào. Mỗi chủng cấy vào 3 bình và lặp lại thí nghiệm 3 lần.
2.3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối một số
chủng vi khuẩn Azotobacter
Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của một số
chủng Azotobacter ta tiến hành nuôi cấy các chủng Azotobacter trên môi trường
Ashby lỏng sử dụng nguồn carbon, pH và nhiệt độ thích hợp đã nghiên cứu được ở
trên, lắc trên máy lắc xoay 150 vòng/phút trong 6ngày. Sau ngày thứ 2, 3, 4, 5, 6
tiến hành thu đo OD660nm để xác định sinh khối tế bào. Mỗi chủng cấy vào 3 bình và
lặp lại thí nghiệm 3 lần.
2.3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ lắc đến sinh khối một số chủng vi
khuẩn Azotobacter
Tiến hành nuôi cấy các chủng Azotobacter ở nhiệt độ, pH, môi trường, thời
gian nuôi cấy thích hợp đã nghiên cứu trên máy lắc xoay vòng ở các tốc độ 0, 100,
150, 200, 250 vòng/phút. Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên
tiến hành đo OD660nm để xác định sinh khối tế bào. Mỗi chủng cấy vào 3 bình và lặp
lại thí nghiệm 3 lần..
2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm Azotobacter
đến sự sinh trưởng của rau cải ngọt.
2.3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm.
Hạt rau cải ngọt được xử lý theo các nghiệm thức sau.
Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức
Nghiệm thức 1 ( NT1) : Xử lí ngâm hạt rau cải với sinh khối của chủng
Az15.2 + bón 50% phân NPK hai lần sau khi gieo, lần một khi cây được 5 lá nhỏ
lần 2 sau đó 10 ngày
Nghiệm thức 2 ( NT2) : Xử lí ngâm hạt rau cải với sinh khối của chủng

Az3.1 + bón 50% phân NPK hai lần sau khi gieo, lần một khi cây được 5 lá nhỏ lần
2 sau đó 10 ngày


Nghiệm thức 3 ( NT3) : Xử lí ngâm hạt rau cải với sinh khối của chủng
Az3.2 + bón 50% phân NPK hai lần sau khi gieo, lần một khi cây được 5 lá nhỏ lần
2 sau đó 10 ngày
Nghiệm thức 4 ( NT4) : Không xử lí ngâm hạt rau cải với sinh khối của vi
khuẩn mà chỉ bón 100% phân NPK ( gấp hai lần so với các nghiệm thức trước),
cũng bón hai lần sau khi gieo, lần một khi cây được 5 lá nhỏ lần 2 sau đó 10 ngày
Nghiệm thức 5 ( NT5) : Đối chứng không nhiễm vi khuẩn , không bón phân.
Các chỉ tiêu theo dõi sinh trưởng của cây sau 25 ngày tuổi: số lá /cây, chiều
cao cây, khối lượng khô, khối lượng tươi, khối lượng rễ, chiều rộng lá, hàm lượng
nitơ tổng số trong lá cây, chất diệp lục.
2.3.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số ( phương pháp
Kjeldahl )
•

Mục đích

Xác định hàm lượng nitơ tổng số trong lá của các cây cải trong từng lô thí
nghiệm..
• Nguyên tắc
Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng (NH 4)2SO4 đem cho tác dụng với
dung dịch NaOH 30 % sẽ giải phóng NH3.

(NH4)2SO4 + 2 NaOH

Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O

Sau đó lượng NH3 được hơi nước lôi cuốn trong máy Parnas-Wargner và được
dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng dư H 2SO4. Từ đây cho phép xác định
được lượng NH3 phóng thích ra, có nghĩa là xác định được lượng đạm có trong mẫu
nguyên liệu.
• Thực hiện
Quá trình này gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Vô cơ hóa mẫu
Nguyên tắc: tất cả các chất đạm có trong nguyên liệu dù nằm ở dạng nào (hữu
cơ, vô cơ, protein) chuyển thành hợp chất vô cơ (NH 4)2SO4 bằng cách đun sôi với
H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác.
H2SO4 đậm đặc

Chất đạm
Xúc tác, t

0

(NH4)2SO4


Cách tiến hành: Cân 100mg lá cây cải đã sấy khô tuyệt đối vào bình Kjeldahl.
Thêm vào khoảng 200mg chất xúc tác K 2SO4/CuSO4 (tỉ lệ 3:1) và 10 ml H2SO4 đậm
đặc. Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí độc cho đến khi dung dịch có màu xanh da
trời nhạt hoặc trong suốt. Để nguội và định mức đến 100 ml với nước cất vô đạm.
Giai đoạn 2: Cất đạm
Chuyển 25ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn
25ml dung dịch NaOH 45% cùng vài giọt thuốc thử Tashiro dung dịch lúc này có
xanh lá mạ (nếu chưa chuyển sang màu xanh lá mạ thì tiếp tục cho thêm 5ml NaOH
45%).
Chuẩn bị một bình hứng có chứa 10ml dung dịch H 2SO4 0,1N và thêm vài giọt

thuốc thử Tashiro, lúc này trong bình có màu tím hồng.Tiến hành lắp hệ thống cất
đạm. Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm.
Sauk hi cất đạm 20 -25 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng
giấy quỳ thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi sang màu xanh là được.
Giai đoạn 3: Chuẩn độ và tính toán kết quả
Chuẩn độ H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N. Quá trình chuẩn độ kết thúc khi
dung dịch chuyển từ tím sang xanh lá mạ


Hình 3.2. Sự chuyển màu của dung dịch chuẩn độ từ tím đỏ sang xanh lá mạ.
• Tính toán kết quả
Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức
N (mg%)= (1,42* (V1 – V2)* 100/a)*2
V1: Số ml H2SO4 cho vào bình hứng
V2: Số ml NaOH 0,1N đã chuẩn độ
a: Số mg nguyên liệu
1,42: Hệ số, cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với
1,42 mg nitơ
2.3.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục
Hàm lượng diệp lục (chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid) được xác
định bằng phương pháp so màu
- Lấy 500mg lá, cắt nhỏ, ngâm trong 50ml aceton 80%, để trong tối.