Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh tụ cầu vàng staphylococcus aureus

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
KHOA CNSH-CNTP

BÁO CÁO KẾT QUẢ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG
MÃ SỐ: T2013 – 12

TÊN ĐỀ TÀI:

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN NHANH
TỤ CẦU VÀNG Staphylococcus aureus

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI:

Nguyễn Văn Duy

Thái Nguyên – 2014


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do trực tiếp nhóm nghiên cứu thực hiện
tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Kỹ thuật di truyền, Khoa Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Đề tài nghiên cứu được
thực hiện trên các thiết bị hiện đại, phù hợp với nội dung và mục tiêu nghiên cứu đề ra và
phù hợp với lĩnh vực nghiên cứu của đề tài. Do đó, các kết quả nghiên cứu thu được hoàn
toàn chính xác, trung thực và đủ tin cậy. Các kết quả nghiên cứu được công bố trong báo
cáo này đã được sự đồng ý của các thành viên trong nhóm nghiên cứu.
Thái Nguyên, ngày 02 tháng 03 năm 2014
Chủ nhiệm đề tài

Nguyễn Văn Duy

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, trước hết tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng
Quản lý Khoa học và Quan hệ Quốc tế, Ban Chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP đã tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi thực hiện và hoàn thành nghiên cứu này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Lê Quang Hòa, Viện Công nghệ Sinh học và Công
nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, TS. Nguyễn Đắc Trung, khoa Cơ
sở, Trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên, ThS. Đỗ Bích Duệ, cán bộ Viện Khoa học
Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã cung cấp chủng vi sinh vật để
chúng tôi tiến hành các nghiên cứu trong đề tài này.
Tôi xin cám ơn các thành viên của nhóm nghiên cứu đã giúp tôi hoàn thành các nội
dung nghiên cứu trong đề tài này.
Xin trân trọng cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 02 tháng 03 năm 2014
Chủ nhiệm đề tài

Nguyễn Văn Duy


DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình

Trang

Hình 2.1: Vi khuẩn Staphylococcus aureus

6

Hình 2.2. Các bước thực hiện một chu kỳ phản ứng PCR

11

Hình 4.1. Trình tự nucleotide của cặp mồi NucF- NucR

18

Hình 4.2. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA

19

Hình 4.3. Kết quả khuếch đại vùng gen đặc hiệu của Staphylococcus aureus
bằng phản ứng PCR sử dụng sản phẩm DNA tách chiết được bằng hóa chất

20

Hình 4.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng

20

các nồng độ khuôn DNA khác nhau
Hình 4.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR

21

ở các nhiệt độ gắn mồi và nồng độ MgCl2 khác nhau
Hình 4.6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách

chiết từ các loài vi khuẩn kiểm định

23


TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ
- Tên đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh tụ cầu vàng
Staphylococcus aureus”
- Mã số: T2013 – 12.
- Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Duy
- Điện thoại: 0915384836

Email:

- Cơ quan chỉ chì đề tài: Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
- Cá nhân phối hợp thực hiện:
+ SV. Đinh Thị Hoa, lớp 41 CNSH; Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên
+ SV. Nguyễn Anh Tuấn, lớp 43 CNSH, Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên
-

Thời gian thực hiện: Tháng 3/2013-3/2014

1. Mục tiêu
Xây dựng được quy trình kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Staphylococcus aureus
có độ nhạy và độ đặc hiệu cao
2. Nội dung chính
-

Nội dung 1. Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR

-

Nội dung 2. Tối ưu các điều kiện của phản ứng PCR

-

Nội dung 3. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR

3. Kết quả chính đạt được
-

Sản phẩm đào tạo: 01 kỹ sư Công nghệ Sinh học

-

Sản phẩm khoa học: 01 báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học

-

Sản phẩm ứng dụng:

+ 01 cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện nhanh vi khuẩn tụ cầu vàng
Staphylococcus aureus
+ 01 Quy trình phát hiện nhanh tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ở mức độ
chủng thuần trong phòng thí nghiệm.

SUMMARY

-

Research Project Title: “Application of PCR technique for rapid detection of
Staphylococcus aureus”

-

Code number: T2013-12

-

Coordinator: Nguyen Van Duy

-

Tel: 0915384836

-

Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agriculture and Foresrtry

-

- Cooperating Institution(s):

Email:

+ Dinh Kim Hoa, Class of 41st CNSH, Faculty of Biotechnology and Food

technology, Thai Nguyen University of Agriculture and forestry
+ Nguyen Tuan Anh, Class of 43rd CNSH, Faculty of Biotechnology and Food
technology, Thai Nguyen University of Agriculture and forestry
- Duration: from 3/2013 to 3/2014
1. Objectives
Constructing PCR process for rapid detection of Staphylococcus aureus with high
sensitivity and high specificity
2. Main contents
- Designing a pair of primer for PCR reaction.
- Optimizing conditions of PCR reaction
- Determining the Specificity of detection of the PCR reaction.
3. Obtained Results
- Trained Results: 01 engineer on Biotechnology
- Scientific Results: 01 Scientific researched Report
- Applied Results:
+ A pair of specific primer for PCR reaction for rapid detection of
Staphylococcus aureus.
+ 01 PCR process for rapid detection of Strains of Staphylococcus aureus in
laboratory level


MỤC LỤC
MỤC LỤC ....................................................................................................................... 1
Phần 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 3
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 3
1.2. Mục đích và yêu cầu của nghiên cứu ..................................................................... 4
1.2.1. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 4
1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu ....................................................................................... 4
1.3. Ý nghĩa của nghiên cứu......................................................................................... 4
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................... 4

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn............................................................................................ 4
Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 5
2.1. Tình hình ngộ độc do Staphylococcus aureus trong và ngoài nước........................ 5
2.1.1. Tình hình trong nước ..................................................................................... 5
2.1.2. Trên thế giới .................................................................................................. 5
2.2. Tổng quan về Staphylococcus aureus .................................................................... 6
2.2.1. Đặc điểm hình thái ......................................................................................... 6
2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa ...................................................... 6
2.3. Phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus ..................................................... 7
2.3.1. Phương pháp truyền thống ............................................................................. 7
2.3.2. Phương pháp hiện đại .................................................................................... 8
2.4. Tổng quan về kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .................................. 10
2.4.1. Khái niệm PCR ............................................................................................ 10
2.4.2. Nguyên tắc của thử nghiệm PCR ................................................................. 10
2.4.3. Thành phần phản ứng................................................................................... 11
2.4.4. Những ưu điểm hạn chế của kỹ thuật PCR ................................................... 12
2.4.5. Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh ...... 13
Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 14
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................... 14
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 14
3.3. Vật liệu, thiết bị, hóa chất nghiên cứu ................................................................. 14
3.3.1. Vật liệu ngiên cứu ........................................................................................ 14
3.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 14
3.4.1. Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR ............................................................ 14
3.4.3. Xây dựng qui trình phát hiện nhanh Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật PCR .... 14
3.4.5. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng PCR trong phát hiện nhanh Staphylococcus
aureus .................................................................................................................... 14
3.5. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 14
1

3.5.1. Phương pháp thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR từ vi khuẩn Staphylococcus
aureus.................................................................................................................... 14
3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA....................................................................... 15
3.5.3. Xác định điều kiện tối ưu của Phản ứng PCR ............................................... 16
3.5.4. Phương pháp xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR ................................. 16
3.5.5. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR .............................................. 17
Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................................. 18
4.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện nhanh Staphylococcus
aureus........................................................................................................................ 18
Trình tự nucleotide của cặp mồi được lựa chọn thể hiện trong bảng 4.1 ......................... 18
4.2. Tối ưu các điều kiện của phản ứng PCR phát hiện nhanh Stapylococcus aureu ... 19
4.2.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA bằng phương pháp sử
dụng hóa chất ........................................................................................................ 19
4.2.2. Kiểm tra DNA tổng số bằng phương pháp PCR ........................................... 19
4.2.3. Xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR phát hiện Staphylococcus
aureus.................................................................................................................... 20
4.2.4. Tối ưu phản ứng PCR phát hiện nhanh Staphylococcus aureus .................... 21
4.3. Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR ................................................ 23
Phần 5 KẾT LUẬN........................................................................................................ 25
5.1. Kết luận .............................................................................................................. 25
5.2. Kiến nghị.............................................................................................................. 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 26

2


Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Ngộ độc thực phẩm (NĐTP) đang là mối quan tâm đặc biệt ở mỗi quốc gia và
đang là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng. Nguyên nhân hàng đầu của
các ca NĐTP là do sự xuất hiện của các vi sinh vật gây bệnh nhiễm tạp trong mẫu thực
phẩm, trong đó tụ cầu vàng Staphyloccocus aureus là một trong số các tác nhân nguy
hiểm nhất [8]. Điển hình như vụ ngộ độc tập thể xảy ra trong một đám cưới ngày
12/4/2012 tại bản Hùn, xã Chiềng Cọ, Thành phố Sơn La do thực phẩm nhiễm vi khuẩn
Staphylococcus aureus làm hơn 300 người mắc và phải nhập viện cấp cứu. Một vụ ngộ
độc tập thể khác xảy ra ngày 16/4/2012 khiến hơn 200 công nhân của Công ty Dream
MeKong thuộc xã An Cư, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang bị ngộ độc…[4]. Theo
WHO/FAO (tháng 5/2005), ngộ độc thực phẩm xảy ra ở nhiều nơi, ảnh hưởng rất lớn đến
sức khỏe con người và kinh tế. Vì vậy mà hiện nay đã có nhiều phương pháp được sử
dụng để phát hiện vi khuẩn Staphylococcus aureus, phương pháp nuôi cấy truyền thống
luôn luôn bao gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết hợp với các bước kiểm tra sinh hóa tốn
nhiều thời gian (5- 7 ngày) [13]. Sự phát hiện chậm các vi khuẩn gây bệnh trong mẫu
thực phẩm là một trong những nguyên nhân làm tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan
trong cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khỏe của con người [8].
Ngày nay với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các kỹ thuật sinh học phân tử đã và
đang cho phép phát triển những phương pháp kiểm tra rất nhạy và nhanh sự hiện diện của
các dòng vi khuẩn, kỹ thuật PCR cũng được áp dụng để chẩn đoán nhanh S. aureus trong
thực phẩm có kết quả trong thời gian ngắn [10]. Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase
(Polymerase chain reaction PCR) là một kỹ thuật dùng để khuếch đại các đoạn DNA
chuyên biệt bằng cách sử dụng các cặp mồi chuyên biệt. PCR có thể được sử dụng để
phát hiện một lượng rất nhỏ của DNA mục tiêu đã bị pha lẫn trong các mẫu DNA khác
nhau. PCR có độ nhạy cao, cho phép phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh nên đã trở thành
công cụ phổ biến trong việc phát hiện nhiều tác nhân gây bệnh trên người, vật nuôi cũng
như trong các mẫu thực phẩm [7]. Điều này giúp người làm công tác xét nghiệm có định
hướng sớm trong chẩn đoán các trường hợp ngộ độc thực phẩm [14].
Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu của
Khoa CNSH và CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên, chúng
tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh tụ cầu vàng

Staphylococcus aureus”.

3


1.2. Mục đích và yêu cầu của nghiên cứu
1.2.1. Mục đích nghiên cứu
- Xây dựng được qui trình phát hiện nhanh Staphylococcus aureus dựa trên kỹ
thuật PCR.
1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu
- Thiết kế được cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện nhanh
Staphylococcus aureus
- Xây dựng được qui trình tách chiết DNA phù hợp cho phát hiện nhanh
Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật PCR
- Xác định được điều kiện tối ưu của phản ứng PCR phát hiện nhanh
Staphylococcus aureus
- So sánh được khả năng tách chiết DNA Staphylococcus aureus bằng phương
pháp sốc nhiệt và phương pháp hóa chất
- Xác định được độ đặc hiệu của phản ứng PCR phát hiện nhanh Staphylococcus
aureus trong mẫu thực phẩm
1.3. Ý nghĩa của nghiên cứu
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu phát triển kỹ thuật PCR phát hiện nhanh S. aureus trong mẫu thực
phẩm. Tạo tiền đề khoa học cho việc phát triển bộ kít phát hiện nhanh vi khuẩn gây bệnh
này trong mẫu thực phẩm.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu sẽ tạo cơ sở để phát triển bộ kit phát hiện nhanh S. aureus
trong mẫu thực phẩm phục vụ công tác giám sát, quản lý chất lượng trong sản xuất chế
biến thực phẩm.
Xác định nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm hoặc dịch bệnh, giám sát sự lan

truyền vi khuẩn gây bệnh trong cộng đồng.

4


Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình ngộ độc do Staphylococcus aureus trong và ngoài nước
2.1.1. Tình hình trong nước
Tuy thời gian gây bệnh ngắn nhưng những vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu để lại
hậu quả không nhỏ. Theo đánh giá của Tổ chức Y tế Thế giới, hàng năm Việt nam có
khoảng trên 3 triệu ca ngộc độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu USD. Trong những
năm gần đây số vụ ngộc độc thực phẩm ở nước ta ngày càng gia tăng [4]. Năm 2000 có
213 vụ ngộ độc thực phẩm với 4233 người mắc trong đó có 59 người tử vong [3]. Theo
số liệu từ Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong những vụ dịch được
tổng kết từ năm 1997 đến 2006 thì ngộc độc thực phẩm do tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ
lệ cao (từ 40- 45%) trong các loại gây ngộ độc, trong đó có nhiều vụ được xác định tác
nhân là Staphylococcus aureus [7]. Từ năm 2002 đến 2004 theo số liệu của trung tâm y tế
dự phòng đã có 77 vụ ngộ độc thực phẩm mà phần lớn nguyên nhân là do thức ăn bị
nhiễm khuẩn, chiếm 66% [8]. Trong năm 2005, số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta là
141 vụ, làm 4291 người bị ngộ độc, trong đó có 73 vụ (51,8%) là do vi sinh vật gây ra
(theo số liệu của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm, năm 2006) [8]. Qua các cuộc khảo sát
tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm chế biến sẵn tại các chợ cho thấy
mức độ nhiễm Staphylococcus aureus là rất cao, phù hợp với các kết quả xét nghiệm
trong các vụ ngộ độc tại các thành phố lớn trong những năm qua. Đáng chú ý hơn cả là
vụ ngộ độc thực phẩm của cán bộ, sinh viên khoa Địa chất và Sinh học trường Đại học
Khoa học tự nhiên TP.HCM vào ngày 27/07/2006 trong chuyến đi thực tế và đã ăn trưa
tại Nha Trang (Khánh Hòa). Ba giờ chiều cùng ngày, nhiều cán bộ sinh viên đau đầu, tiêu
chảy, ói mửa, tất cả 105 người phải vào bệnh viện cấp cứu. Nguyên nhân được xác định
là do thức ăn chế biến không hợp vệ sinh, lại để lâu nên đã nhiễm tụ cầu vàng và đã sinh

độc tố enterotoxin. Enterotoxin do tụ cầu tạo ra và là loại độc tố cực mạnh gây ngộ độc
cấp tính [13]. Mấy năm gần đây, những vụ ngộ độc thức ăn do tụ cầu được phát hiện và
nói đến nhiều hơn. Ở Việt Nam, chỉ tính riêng năm 2012, theo số liệu thống kê chưa đầy
đủ của Cục ATVSTP từ đầu tháng 4/2012 đến tháng 09/2012, cả nước đã xảy ra 10 vụ
ngộ độc thực phẩm làm 972 người mắc, trong đó có 726 người phải nhập viện, đã có 04
trường hợp tử vong. Phần lớn các vụ ngộ độc xảy ra với quy mô nhiều người mắc,
nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm nhiễm vi sinh vật, trong đó tụ cầu
vàng Staphylococcus aureus là một trong những nguyên nhân chính [4].
2.1.2. Trên thế giới
Ngộ độc thực phẩm không chỉ xảy ra ở nước ta mà còn xảy ra ở nhiều nước trên
thế giới kể cả những nước phát triển. Theo WHO/FAO (tháng 5/2005), ngộc độc thực
phẩm ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người và kinh tế, làm 1,5 tỉ lượt người nhiễm
5


bệnh [8]. Mỹ, 1 quốc gia có nền kinh tế và trình độ khoa học phát triển nhất thế giới,
trung bình mỗi năm có 76 triệu ca NĐTP với 325.000 người phải vào viện và 5.000
người chết, chi phí cho 1 ca NĐTP mất 1.531 đôla Mỹ (US - FDA, 2006) [29], [21].
Ngoài vấn đề viện phí còn phải mất nhiều thời gian làm việc cũng như sản phẩm lao động
của người bệnh và cả việc phải loại bỏ những sản phẩm bị nhiễm…Tại Nhật Bản, vụ
NĐTP do sữa tươi giảm béo bị ô nhiễm tụ cầu vàng tháng 7/2000 đã làm cho 14.000
người ở 6 tỉnh bị ngộ độc thực phẩm. Công ty sữa SNOW BRAND phải bồi thường cho
4.000 nạn nhân mỗi người mỗi ngày 20.000 yên [27]. Ở Đài Loan vào tháng 6 năm 2000,
vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu tại một trường trung học ở Taichung County làm 10
trong số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2- 3 giờ sau khi ăn sáng [23], [24]. Tại Pháp,
năm 1997 người ta tìm thấy S. aureus là tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1142 vụ ngộ
độc thực phẩm do vi khuẩn. Ngày 17/6/2004, 21 trong tổng số 53 công nhân sau khi ăn
trưa tại căn tin công ty ở Shizuoka Prefecter thì có biểu hiện bệnh, trong đó có 8 trường
hợp phải nhập biện [20].
2.2. Tổng quan về Staphylococcus aureus

2.2.1. Đặc điểm hình thái
Staphylococcus aureus (còn được gọi là tụ cầu vàng) có dạng hình cầu, Gram(+),
đường kính 0,8 - 1µm và đứng thành hình chùm nho, hình thức tập hợp này do vi khuẩn
phân bào theo nhiều chiều trong không gian. Trong bệnh phẩm, vi khuẩn thường thường
họp lại từng đôi một hay tạo thành những đám nhỏ. S. aureus không di động, không có
lông, không sinh nha bào và thường không có vỏ. Trên môi trường canh S. aureus có thể
hình chuỗi ngắn, khi canh trường già hơn 24 giờ nó có thể bắt màu Gram (-) [13].

Hình 2.1: Vi khuẩn Staphylococcus aureus

(Nguån: )
2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
Staphylococcus aureus mọc dễ trên nhiều loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn ở điều
kiện hiếu khí và kỵ khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp để S. aureus tiết ra sắc tố là 37oC
nhưng ở nhiệt độ phòng 20 - 25oC là tốt nhất [13].
6


Trên môi trường thạch dinh dưỡng: S. aureus tạo khuẩn lạc tròn ướt, lồi màu
vàng.
Trên môi trường Chapman agar: tạo khuẩn lạc vàng và môi trường chuyển từ hồng
sang vàng.
Trên môi trường Baird Parker (BP): tạo khuẩn lạc đen, quanh khóm có vòng sáng.
Trên môi trường thạch máu: gây dung huyết, khuẩn lạc tròn nhẵn, đường kính 1- 3
mm, hình thành sắc tố trắng đến hơi vàng [13].
Staphylococcus aureus lên men đường manitol glucose, lactose không lên men
glyxerin cho phản ứng Indol âm tính, Methyl Red dương tính, Voges - Proskauer dương
tính, chuyển Nitrate thành Nitrite, không sinh H2S, catalase dương, coagulase dương [6].
2.3. Phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus
2.3.1. Phương pháp truyền thống

Staphylococcus aureus được xác định dựa trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và
phản ứng huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường
phân lập.
2.3.1.1. Phương pháp định tính
Cho dung dịch mẫu vào môi trường TSB, ủ 37oC trong 24 giờ, sau đó cấy ria lên
môi trường thạch BP (Baird Paker), ủ 37oC trong 48 giờ. Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S.
aureus trên môi trường BP có màu đen nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính 1- 1,5mm, có
vòng sáng xung quanh khuẩn lạc để cấy sang môi trường BHI (Brain Heart Infusion), ủ
37oC trong 24 giờ. Sau đó cấy sang ống nghiệm nhỏ có chứa 0,3ml huyết tương để thử
phản ứng đông kết (phản ứng coagulase), thực hiện song song một ống đối chứng không
được cấy vi sinh vật, theo dõi kết quả đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8
và 24 giờ. Mẫu được kết luận là có S. aureus khi thử nghiệm coagulase dương tính [16].
2.3.1.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc
Nguyên tắc:
Phương pháp này được dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ S.
aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng phương
pháp đếm khuẩn lạc. Dung dịch mẫu được pha loãng thập phân với 3 độ pha loãng liên
tiếp. Tùy theo yêu cầu về độ chính xác của kết quả phân tích, có thể sử dụng phương
pháp MPN với hệ thống 9 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 3 lần lặp lại ở mỗi độ pha
loãng) hay hệ thống 15 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 5 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng).
Hình thái khuẩn lạc điển hình trên môi trường Baird- Parker khi ủ 35oC trong 48 giờ.
Mẫu được kết luận là có S. aureus khi thử nghiệm coagulase dương tính [13].
Ưu điểm của phương pháp đếm khuẩn lạc:
7


Cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu
Cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện môi trường [13].
Độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mức độ thấp trong mẫu [16].
Nhược điểm: Tốn nhiều thời gian và nhân lực.

2.3.1.3. Phương pháp MPN (Most Probale Number)
Nguyên tắc:
Tiêu chuẩn để xác định S. aureus là dựa vào các đặc điểm sau:
Staphylococcus aureus mọc được trên môi trường canh thang TSB có bổ sung
thêm 10% NaCl và 1% sodium pyruvate [13].
Hình thái khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch Baird- Parker sau khi ủ 35oC
trong 48 giờ. Mẫu được kết luận là có S. aureus khi thử nghiệm coagulase dương tính [16].
2.3.2. Phương pháp hiện đại
2.3.2.1. Phương pháp RPLA (Reversed Passive Latex Aggulutination)
Kỹ thuật RPLA được ứng dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm cũng như phát
hiện những dòng Staphylococcus có độc tố dương tính. Trong kỹ thuật này, hạt nhựa
được phủ kháng thể của độc tố trước khi cho vào giếng. Cho mẫu vào để tạo phản ứng
nếu có độc tố trong mẫu thì phản ứng giữa độc tố và kháng thể sẽ tạo ra sự ngưng kết, tùy
mức độ ngưng kết mà xác định được lượng độc tố. Phương pháp này đủ nhạy để phát
hiện độc tố trong hầu hết thực phẩm của các vụ ngộ độc, cũng như trong việc phát hiện
những dòng Staphylococcus tạo ra lượng độc tố thấp mà phương pháp gel- diffusion
không được phát hiện, chỉ với khoảng 10- 20ng/ml. Bộ kit RPLA được giới thiệu bởi
công ty Denka Seiken, Niigata, Nhật Bản và được bán tại Mỹ [27].
2.3.2.2. Kỹ thuật lai phân tử
Phương pháp này còn gọi là phương pháp mẫu dò, probes. Dùng để phát hiện vi
sinh vật trong thực phẩm dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật.
Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là quá trình lai phân tử. Quá trình này bao gồm sự tách
rời hai mạch đơn của chuỗi xoắn kép DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có nhiệt
độ nóng chảy Tm của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có trình tự
nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong hai mạch DNA bổ sung
được cố định trên một giá thể rắn. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự
nucleotide bổ sung với trình tự DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt [7].
Thử nghiệm DNA hybridization sử dụng đầu dò DNA S. aureus và thiết bị đo màu
để phát hiện S. aureus trong thực phẩm sau khi đã làm giàu mẫu. Phương pháp này dùng
để định lượng xác định sự hiện diện của S. aureus ở mức độ nhiễm > 3 tế bào/g mẫu thực

phẩm gốc. Một mẫu được xem là không có sự hiện diện của S. aureus nếu giá trị hấp thụ
8


thu được ít hơn hoặc bằng giá trị giới hạn mà thử nghiệm đã thiết lập. Ngược lại, một
mẫu được xem là có sự hiện diện của S. aureus, nếu giá trị hấp thụ thu được lớn hơn giá
trị giới hạn mà thử nghiệm đã thiết lập [7].
Ưu điểm:
Kỹ thuật này có thể sử dụng đầu dò với đoạn rARN đích do vậy có tính chính xác
và độ nhạy cao.
Cho phép sự phát hiện sự có mặt của nhiều loại vi sinh vật một lúc với thời gian
nhanh.
Nhược điểm:
Kỹ thuật này khá phức tạp.
Phải tốn công thiết kế các mẫu dò và sử dụng vật liệu phóng xạ.
2.3.2.3. Phương pháp ELISA
Phương pháp ELISA được ứng dụng để phát hiện độc tố S.aureus trong thực phẩm
khá phổ biến. Đây là phương pháp đơn giản, nhanh, nhạy có thể phát hiện cũng như định
lượng độc tố và có nhiều bộ kit phát hiện độc tố đang được bán trên thị trường [10].
Kiểu ELISA thường gặp nhất là phương pháp sandwich. Trong phương pháp này,
kháng thể được gắn với mẫu chưa biết, sau đó phức hợp kháng thể - độc tố được gắn với
cộng hợp enzyme – kháng thể. Qui trình này được sử dụng nhiều vì lượng enzyme và
màu được tạo ra từ phản ứng enzyme – cơ chất tỉ lệ thuận với lượng độc tố có trong mẫu
chưa biết. Hai enzyme alkaline photphatase và horseradish peroxidase đều được dùng
trong phương pháp này, nhưng alkaline photphatase dễ gắn với kháng thể hơn. Tuy nhiên
horseradish peroxidase cho phản ứng nhạy hơn, khi kết hợp với cơ chất cho màu xanh lá,
xanh dương hay cam, còn màu được tạo ra với cơ chất khi sử dụng với alkaline
photphatase, nitrophenyl photphatase (pNPP) là màu vàng. Hầu hết các phương pháp
ELISA nhạy ở ít nhất là 0,5ng độc tố/ml [10].
Ưu điểm của phương pháp ELISA:

- Nhanh chóng và thuận tiện.
- Kháng nguyên có nồng độ rất thấp hoặc không biết có thể được phát hiện kể từ
khi bắt giữa kháng thể chỉ lấy kháng nguyên cụ thể.
- Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể
bắt và kháng thể phát hiện khác nhau [10].
Nhược điểm của phương pháp ELISA
Bên cạnh những ưu điểm trên thì phương pháp ELISA còn một số hạn chế như:
- Thời gian xét nghiệm lâu.
9


- Chỉ có các kháng thể đơn dòng có thể được sử dụng như cặp phù hợp.
- Kháng thể đơn dòng có chi phí nhiều hơn so với các kháng thể đa dòng [10].
2.4. Tổng quan về kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.4.1. Khái niệm PCR
PCR là phản ứng chuỗi trùng hợp hay còn gọi là “phản ứng khuếch đại gen” trong
điều kiện phòng thí nghiệm.
2.4.2. Nguyên tắc của thử nghiệm PCR
PCR là một thử nghiệm nhằm khuếch đại chuỗi nucleic acid đích thành hàng tỷ
bản sao để sau đó có thể phát hiện được. Ðể thực hiện được việc khuyếch đại acid nucleic
đích, thử nghiệm PCR dựa vào những chu kỳ nhiệt mà mỗi chu kỳ có 3 bước (hình 2.2)
[14], [15], [17].
Ðầu tiên là nhiệt độ được nâng lên khoảng 95oC để làm biến tính acid nucleic
đích từ dạng sợi đôi (dsDNA) thành sợi đơn (ssDNA), đây là giai đoạn biến tính
(denaturation).
Kế đó là giai đoạn gắn mồi, lúc này nhiệt độ trong buồng ủ PCR hạ xuống khoảng
55 C để các đoạn mồi bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào hai đầu của chuỗi nucleic acid
đích. Cặp mồi được thiết kế ở hai đầu của trình tự đích và do đó sự tổng hợp DNA chỉ xảy ra
với đoạn DNA đích nằm giữa hai mồi. Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào độ dài và trình tự của
mồi, thông thường nằm trong khoảng 45- 60oC.

o

Cuối cùng là giai đoạn kéo dài (extension), lúc này nhiệt độ được nâng lên khoảng
72 C là nhiệt độ thích hợp để enzyme polymerase chịu nhiệt xúc tác phản ứng tổng hợp
bản sao của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung trên khuôn là các sợi đơn (ssDNA) đích
đã được đoạn mồi bắt bặp vào trước đó (ở giai đoạn bắt cặp). Sự tổng hợp này cần phải
có sự hiện diện các deoxynucleoside triphosphate (dNTP), và chiều của sự tổng hợp là
5’- 3’ (đoạn mồi) hay 3’- 5’ (ssDNA đích).
o

Sau 30 đến 40 chu kỳ nhiệt, để hoàn tất thử nghiệm PCR, thường có thêm giai
đoạn kéo dài cuối cùng. Giai đoạn này nhiệt độ được giữ 72oC trong thời gian tương đối
lâu, từ 5 phút đến 30 phút.

10


Hình 2.2. Các bước thực hiện một chu kỳ phản ứng PCR
Như vậy từ một số lượng N DNA đích ban đầu, sau n chu kỳ nhiệt, thử nghiệm
PCR đã tổng hợp được N.2n bản sao. Với một số lượng bản sao, hay còn gọi là sản phẩm
PCR (PCR product), chúng dễ dàng được phát hiện bằng các phương pháp phát hiện
nucleic acid (điện di phát hiện kích thước của sản phẩm bằng probe tóm bắt, Southern
blot rồi phát hiện sản phẩm) [18].
2.4.3. Thành phần phản ứng
Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần phải có đầy đủ các thành phần sau [18].
- DNA khuôn: chuỗi acid nucleic (ví dụ đoạn acid nucleic đặc hiệu của vi khuẩn
gây bệnh, của gene bệnh lý, của dấu ấn di truyền…) mà phản ứng PCR sẽ khuếch đại lên
để chúng có thể được phát hiện trong bệnh phẩm. Phản ứng PCR sẽ không xảy ra được
nếu bệnh phẩm không có acid nucleic đích [14].
- Primer hay đoạn mồi, tức là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích

thước chỉ vài chục base (18-30), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi
đầu và đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi
đơn. Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính :
+ Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng
đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp
được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử
nghiệm PCR càng đặc hiệu.
+ Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi
bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác
11


cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi. Thông thường trong phản ứng
PCR, người ta dùng một cặp mồi (mồi xuôi- mồi ngược). Cặp mồi này quyết định nên
kích thước của sản phẩm PCR. Chúng càng bắt cặp trên chuỗi đích xa nhau bao nhiêu thì
kích thước của sản phẩm PCR càng lớn bấy nhiêu và ngược lại, càng gần nhau bao nhiêu
thì kích thước càng nhỏ bấy nhiêu [14].
- dNTPs: deoxynucleoside triphosphate, là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản
sao của DNA đích, dNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể
là adenine (dATP) hay thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay guanine (dGTP), ở
carbone số 1 (C1). Ba phân tử phosphate (triphosphate) được gắn tại carbone số 5 (C5)
của phân tử deoxyribose này và đây chính là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi bổ
sung trên chuỗi đích [14], [18].
- Enzyme polymerase là loại enzyme chịu được nhiệt độ. Ngày nay có nhiều loại
men polymerase chịu được nhiệt độ đã được ly trích hoặc tổng hợp, tùy mục đích sử dụng
mà chúng ta có thể chọn polymerase thích hợp. Thường dùng nhất trong các phòng thí
nghiệm là Taq DNA polymerase. Là men polymerase trích từ vi khuẩn Thermus
aquaticus, là các vi khuẩn sống được trong các suối nước nóng [18].
- Dung dịch đệm cho phản ứng PCR, thường chứa muối đệm Tris HCl 10 mM,
KCL 50mM và MgCl2 1,5mM. Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0,001%

BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween hay formamide
nữa. Trong các thành phần trên, có lẽ ảnh hưởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng
độ MgCl2, vì vậy để có được một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phản ứng rõ nét,
người ta phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách thăm dò một nồng độ MgCl2 thích hợp nhất.
Ngoài ra, một thiết bị hết sức quan trọng cho thử nghiệm PCR là máy chu trình nhiệt
(thermal cycler) là máy có thể đưa nhiệt độ trong buồng ủ PCR lên cao rồi hạ xuống trong
những khoảng thời gian nhất định theo chương trình mà người sử dụng định sẵn [14].
2.4.4. Những ưu điểm hạn chế của kỹ thuật PCR
- Ưu điểm: Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được
một trình tự đáng quan tâm. Thực hiện đơn giản và ít tốn kém ( được thực hiện trong ống
nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện đồng thời). Yêu cầu về độ
tinh sạch của mẫu không cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ, những vết tích để lại của
người đã chết) [14].
Các phương pháp dựa trên PCR nhạy và chuyên biệt, cho phép phát hiện
Staphylococcus aureus tạo độc tố trong thời gian tương đối ngắn với lượng mẫu nhỏ. Ưu
điểm của phương pháp này là những tế bào sinh độc tố đã chết vẫn có thể phát hiện, điều
này rất quan trọng trong việc phân tích những thực phẩm đã xử lí nhiệt liên quan những
vụ ngộ độc thực phẩm [14] [18].

12


- Hạn chế: Tuy phương pháp PCR có ưu điểm là nhanh, nhạy, chuyên biệt nhưng
chỉ có thể xác định có sự hiện diện của các gen mã hóa độc tố mà không thể xác định
được có tạo độc tố hay không cũng như việc định lượng độc tố.
Phản ứng PCR cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại. Để có
đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại. Kích thước DNA
cần khuếch đại không vượt quá 3kb. Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần). Sai
sót còn do sử dụng enzyme taq polymerase khoảng 104 (sai sót cho một lần sao chép) [18].
2.4.5. Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh

Bằng các khuếch đại đoạn acid nucleic đặc trưng của vi sinh vật gây bệnh trong
mẫu bệnh phẩm, PCR có thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh với độ nhạy cao. Vì PCR chỉ
cần một vi sinh vật gây bệnh có mặt trong mẫu thử là có hiện diện acid nucleic đích và
được PCR khuếch đại [14].
Một ưu điểm khác của PCR trong chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn là PCR không
những phát hiện được tác nhân vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm mà còn có
thể phân loại type di truyền của các vi sinh vật này, không cần phải nuôi cấy vi khuẩn.
Ðây là một đóng góp rất lớn trong nghiên cứu dịch tễ học tìm hiểu mối liên quan của các
tác nhân gây bệnh trong cộng đồng. Ngoài ra PCR còn có thể phát hiện vi khuẩn kháng
kháng sinh ví dụ phát hiện M. tuberculosis kháng rifampicin, một chìa khóa để bác sĩ
điều trị có thể sử dụng phát đồ điều trị đúng cho bệnh nhân [2], [14].
Trong vi sinh học, PCR là một phương tiện hữu ích để phát hiện các tác nhân vi
sinh vật gây bệnh trong các trường hợp tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các
virus (viêm gan B, viêm gan C, Herpes…), các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella,
Mycoplasma, Treponema pallidum…), tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong
bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước đó (vd: Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não
mủ mất đầu…) [7], [14].
Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng PCR để phát hiện vi
sinh vật gây bệnh trong thực phẩm như Lê Văn Phủng (2001) [14], Nguyễn Thị Kê, Cao
Minh Nga (2006) [10]. Đã áp dụng kỹ thuật PCR để phát hiện S. aureus trong thực phẩm
nhằm rút ngắn thời gian giúp người làm công tác xét nghiệm và các nhà dịch tễ sớm có
định hướng trong chẩn đoán các vụ dịch ngộ độc thực phẩm. Giá thành tương đối phù
hợp đã mở ra một triển vọng mới cho các phòng xét nghiệm vi sinh thực phẩm.
Trên thế giới hiện nay có rất nhiều phương pháp để phát hiện vi sinh vật gây bệnh
trong thực phẩm nhưng PCR có nhiều ưu điểm hơn các phương pháp khác nên được ứng
dụng rộng rãi. Các nghiên cứu của Fang T.J. và cs (1999) [23], H.- L. Wei, C.- S. Chiou
(2001) [24] và Jogensen H.J. và cs (2004) [25] cũng đã ứng dụng kỹ thuật PCR để phát
hiện Staphylococcus aureus nhiễm trong thực phẩm chủ yếu trong thịt, trứng và sữa.

13

Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Vi khuẩn Staphylococcus aureus: do Viện CNSH & CNTP - Trường Đại học Bách
Khoa Hà Nội, Bộ môn Vi sinh thuộc Khoa Y học cơ sở - Trường ĐH Y- Dược Thái
Nguyên, Viện Khoa học sự sống - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Trung tâm y
tế dự phòng Thái Nguyên cung cấp.
- Các chủng vi sinh vật kiểm định: do Viện Khoa học sự sống - Trường Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên, Trung tâm y tế dự phòng Thái Nguyên cung cấp.
3.3. Vật liệu, thiết bị, hóa chất nghiên cứu
3.3.1. Vật liệu ngiên cứu
Cặp mồi được đặt sản xuất tại hãng Intergrated DNA Technologies của Mỹ
(www.IDTDNA.com). Trình tự mồi được liệt kê trong bảng sau:
Bảng 3.1. Trình tự cặp mồi thiết kế được
Tên

Trình tự nucleotide (5’→3’)

mồi

Tm
o

( C)

NucF

TTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCA

54

NucR

GCCACGTCCATATTTATCAGTTC

54

Kích thước sản phẩm
PCR (bp)
439

3.4. Nội dung nghiên cứu
3.4.1. Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR
3.4.3. Xây dựng qui trình phát hiện nhanh Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật PCR
3.4.5. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng PCR trong phát hiện nhanh
Staphylococcus aureus
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR từ vi khuẩn Staphylococcus
aureus
- Sưu tập các trình tự gen nuc của Staphylococcus aureus khác nhau trên ngân
hàng gen NCBI.
- So sánh 50 trình tự gen nuc sưu tập được sử dụng phần mềm CLUSTALW2 để
tìm các vùng trình tự gen giống nhau giữa 50 trình tự.

14

- Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho vùng tương đồng giữa 50 trình tự gen sử dụng các
phần mềm Vector NTI 11.0 (Invitrogen), FastPCR, Tm oligos Calculator
( />- Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi thiết kế với trình tự gen nuc của các chủng
Staphylococcus aureus đã công bố trên ngân hàng gen sử dụng phần mềm BLAST (
/>3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA
DNA tổng số của Staphylococcus aureus được tách chiết theo 2 phương pháp [17].
- Tách chiết bằng phương pháp sử dụng hóa chất:
+ Bước 1: Lấy 1000 µl dung dịch vi khuẩn S. aureus
+ Bước 2: Ly tâm 10.000v/phút trong 5 phút
+ Bước 3: Bổ sung 700 µl CTAB
+ Bước 4: Ủ trong tủ ấm 60oC trong 60 phút, sau 10 phút đảo trộn đều
+ Bước 5: Bổ sung 700 µl CIAA, đảo trộn đều. Ly tâm 10.000v/phút trong 10
phút.
+ Bước 6: Chuyển 450 µl dung dịch ở pha trên sang eppendorf 1500 µl mới, bổ
sung 50 µl muối CH3COONa 3M (pH = 5,5) và 500 µl dung dịch isopropanol, đảo trộn
đều.
+ Bước 7: Đặt ở -20oC trong 2 giờ
+ Bước 8: Ly tâm 10.000v/phút trong 30 phút.
+ Bước 9: Loại bỏ dịch nổi
+ Bước 10: Rửa tủa bằng 1ml EtOH 70%, đảo trộn đều, ly tâm 13.000v/phút trong 5
phút.
+ Bước 11: Để khô tự nhiên
+ Bước 12: Hòa tan kết tủa bằng 50µl TE 1X, đảo trộn đều, ủ trong tủ ấm 70oC
trong thời gian 5 phút và giữ ở nhiệt độ -20oC.
- Tách chiết bằng phương pháp xử lý sốc nhiệt.
+ Bước 1. Lấy 1000 µl dung dịch vi khuẩn S. aureus, ly tâm 10.000v/phút trong 5
phút. Loại bỏ dịch và thu cặn
+ Bước 2. Hòa nguyên cặn trong nước cất vô trùng (không chứa DNase hoặc
RNase).
+ Bước 3. Hỗn hợp được đưa vào nồi tủ sấy ở 95oC trong vòng 10 phút nhằm làm

sốc nhiệt để trích ly DNA.
15


+ Bước 4. Sau đó hỗn hợp được làm lạnh nhanh bằng cách cho vào tủ đông ở nhiệt
độ - 20oC trong vòng 10 phút.
+ Bước 5. Tiến hành ly tâm với tốc độ 10.000v/p trong 5 phút để loại tạp chất.
Phần cặn bã chất hữu cơ bị lắng xuống dưới.
+ Bước 6. Lặp lại các bước trên ba lần. Cuối cùng ta thu được phần dung dịch còn
lại có chứa DNA.
3.5.3. Xác định điều kiện tối ưu của Phản ứng PCR
Phản ứng PCR được thực hiện theo quy trình cơ bản. Các thành phần của phản ứng
PCR bao gồm:
- 10X PCR buffer

: 2,5 µl

- MgCl2 (25 mM)

: 1,5 µl

- dNTPs (2.5 mM)

: 1,5 µl

- Mồi xuôi (10 µM)

: 1,5 µl

- Mồi ngược (10 µM) : 1,5 µl

- Taq DNA polymerase (5U/µl) : 0,2 µl
- DNA khuôn

: 2,0 µl

- H2O khử ion

: 14,3 µl

Điều kiện chu trình nhiệt được thiết lập trên máy chu trình nhiệt bao gồm:
- Biến tính ban đầu ở 95oC:

5 phút

- Biến tính ở 95oC:

30 giây

- Gắn mồi ở 55oC:

45 giây

- Kéo dài mồi ở 72oC:

1 phút

- Kéo dài cuối cùng ở 72oC:

5 phút

- Ủ bảo quản mẫu ở 4oC:

35 chu kì

∞

3.5.4. Phương pháp xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR
DNA của Staphylococcus aureus được tách chiết và pha loãng thành các nồng độ
cách nhau 10 lần rồi được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Giới hạn phát hiện của
phản ứng PCR được xác định là nồng độ DNA tối thiểu cho phản ứng PCR khuếch đại
tạo ra sản phẩm điện di có thể quan sát được bằng mắt thường trên gel agarose [17].
Pha loãng mẫu: Mẫu tách chiết Staphylococcus aureus được pha loãng đến 10-5 lần
để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
Hút 45ml nước khử ion vào ống eppendorf, sau đó ủ 70oC trong 10 phút. Hút 5ml
mẫu DNA ở nồng độ 10o vào ống eppendorf, tiến hành vontex, spindown 2 lần liên tiếp
16


sau đó đặt trong tủ 70oC trong 10 phút. Tiếp tục thực hiện như trên ta thu được mẫu pha
loãng 10-5 lần.
Độ đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện nhanh Staphylococcus aureus được
xác định bằng kết quả thử nghiệm với các chủng Staphylococcus aureus và các chủng vi
khuẩn kiểm định: E.coli, Staphylococcus capitis, Staphylococcus epidermidis, Listeria
monocytogons và Clostridium perfringens.
3.5.5. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR
- Hòa tan hoàn toàn agarose nồng độ 1,5% trong đệm TE 0,5X sau đó đun trong lò
vi sóng cho tới khi agarose tan hết.
- Chuẩn bị bản gel agarose: Tùy vào số lượng mẫu để chọn khay điện di, cắm lược
lên phía trên khay theo thiết kế. Agarose sau khi đun xong để nguội khoảng 60oC rồi đổ
dung dịch vào khay. Khoảng 45 phút sau gel đặc lại, dùng tay rút lược, tránh bị bể gel,

đặt khay vào bể điện di, tra mẫu dung dịch điện di có bổ sung thêm loading dye.
- Chạy điện di trên thiết bị điện di với hiệu điện thế 100V trong thời gian 30 phút.
- Hiện thị kết quả điện di: ngâm bản gel 5-10 phút trong dung dịch ethidium
bromide sau đó hiển thị kết quả diện di trên máy soi gel.
- Phân tích kết quả điện di.
+ Kết quả dương tính được xác định bằng sự có mặt của băng DNA sáng, rõ đúng
kích thước trên đường chạy của bản điện di.
+ Kết quả âm tính được xác định bằng sự vắng mặt của băng DNA trên đường
chạy của bản điện di [17].

17


Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện nhanh Staphylococcus
aureus
Để thiết kế cặp mồi phát hiện S. aureus, 50 trình tự gen nuc mã hóa nuclease
chịu nhiệt của các chủng S. aureus khác nhau đã công bố trên ngân hàng gen
(GeneBank). Sau đó, 50 trình tự này được so sánh để tìm ra vùng tương đồng sử dụng
phần mềm ClustalW2 ( (phụ lục 1). Các
vùng tương đồng được lựa chọn để thiết kế các cặp mồi. Các cặp mồi được thiết kế tiếp tục
được kiểm tra các đặc tính về giá trị Tm, tỷ lệ %GC, khả năng bắt cặp chéo giữa các mồi,
khả năng tự bắt cặp sử dụng phần mềm vector NTI và phần mềm Tm Caculator
( Vị trí cặp mồi được lựa
chọn được thể hiện trong hình 4.1

Hình 4.1. Trình tự nucleotide của cặp mồi NucF- NucR
Trình tự nucleotide của cặp mồi được lựa chọn thể hiện trong bảng 4.1
Bảng 4.1. Trình tự cặp mồi thiết kế được

Tên mồi

Trình tự nucleotide (5’→3’)

Tm
(oC)

NucF

TTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCA

54

NucR

GCCACGTCCATATTTATCAGTTC

54

Kích thước sản
phẩm PCR (bp)
439

Theo công bố của Brakstad OG., Aasbakk K. and Maeland J. A.,(1992) [21] về
phát hiện S. aureus đã sử dụng gen nuc (mã hóa nuclease chịu nhiệt) làm gen đích. Kết
quả của các nghiên cứu này cho thấy gen nuc hoàn toàn có thể sử dụng để phát hiện [15].
Do đó trong nghiên cứu này gen nuc cũng được lựa chọn làm gen mục tiêu cho phản ứng
PCR phát hiện S. aureus.
Yêu cầu của một cặp mồi đặc hiệu cho một loài vi sinh vật phải cho phép khuếch đại
tất cả các chủng thuộc loài đó nhưng không cho phép khuếch đại sản phẩm PCR từ một trình

tự khác thuộc loài này và các trình tự gen của loài khác. Trong nghiên cứu này cặp mồi được
lựa chọn đã được so sánh với các trình tự gen đã công bố trên ngân hàng gen bằng phần mềm
BLAST ( Kết quả so sánh bằng phần mềm BLAST
được thể hiện trong bảng phụ lục 2.

18


Kết quả so sánh trên cho thấy cặp mồi nucF- nucR bắt cặp hoàn toàn 100% với các
trình tự gen của các chủng S. aureus và không tương đồng với các loài khác. Điều này khẳng
định cặp mồi đã được thiết kế hoàn toàn phù hợp cho phát hiện S. aureus.
4.2. Tối ưu các điều kiện của phản ứng PCR phát hiện nhanh Stapylococcus aureu
4.2.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA bằng phương pháp sử dụng
hóa chất
DNA tổng số của 4 chủng Staphylococcus aureus BK1, YD1, DP1, DP2 được tách
chiết bằng phương pháp hóa chất sử dụng CTAB ( Cetryl Ammonium Bromide ). Kết quả
điện di sản phẩm tách chiết DNA tổng số của 4 chủng này được thể hiện trong hình 4.2.

Hình 4.2. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA
Đường chạy 1, 2, 3 và 4 tương ứng với mẫu tách chiết DNA tổng số của 4 chủng
Staphylococcus aureus: BK1, YD1, DP1 và DP2
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số ở hình 4.2 cho thấy,
các băng DNA rõ nét nằm gần với vị trí của giếng điện di chứng tỏ đây là băng của DNA
tổng số, các băng DNA không đứt gãy đủ điều kiện thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
4.2.2. Kiểm tra DNA tổng số bằng phương pháp PCR
Để kiểm tra khả năng sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR, 4 mẫu DNA tổng số
của 4 chủng nghiên cứu được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi nucF –
nucR. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5%. Kết quả điện di được
thể hiện trong hình 4.3

19