CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH THỰC PHẨM

CHƯƠNG 2

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG
VI SINH THỰC PHẨM


I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP
- Dùng để xác định các loại vi sinh vật đơn bào
có kích thước lớn: nấm men, tảo đơn bào, bào
tử mốc
- Quy trình cho phép xác định nhanh chóng số
lượng vi sinh vật
-Không phân biệt được tế bào sống và chết
-Không phân biệt được các tế bào vi sinh vật
và hạt vật thể
-Hạn chế đối với huyền phù có mật độ thấp


Buồng đếm vi sinh vật




Đếm trực tiếp
bằng buồng đếm
Goriep
Pha loãng mẫu
cần đếm sao cho
trong mỗi ô nhỏ của
buồng đếm có

khoảng 5 - 10 tế bào


Cách đếm tế bào trong buồng đếm



Qui trình xác định số lượng tế bào vsv trực tiếp
bằng buồng đềm hồng cầu
Quy trình:
- Pha loãng mẫu (5-10 tế bào/ô nhỏ)
- Nạp mẫu vào buồng đếm
- Đếm số lượng tế bào hiện diện trong 5 ô
lớn
Tính mật độ:
Mật độ tế bào: N/ml = 0,25a x 106 tế
bào/ml


II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
- Dùng để xác định các loại vi sinh vật sống
trong mẫu
- Độ nhạy cao, định lượng vi sinh vật ở mật độ
thấp
- Có thể định lượng các vi sinh vật kích thước
nhỏ, di động


Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu

Không sử dụng nước cất và nước muối sinh
lý để pha loãng mẫu thực phẩm


Các dung dịch pha loãng mẫu
 Saline peptone water

(SPW)
NaCl
Peptone
Nước cất vừa đủ

8,5g
1,0g
1 lít

• Buffered peptone water (BPW)

NaCl
Peptone
Nước cất vừa
đủ

5g
10g
1 lít


Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu

pha loãng mẫu lỏng theo dãy thập
Đối vớiphân
các mẫu rắn hay bán lỏng:

10g mẫu + 90ml dung dịch pha loãng => độ
pha loãng 101
Các bước tiếp theo tương tự như pha loãng


Quy trình:
- Pha loãng
mẫu (25-250
khuẩn lạc/đĩa)
- Tạo hộp đổ
- Nuôi ủ, đếm
số lượng


Cấy mẫu vào môi trường

- Phương pháp cấy bề mặt
- Phương pháp đổ đĩa


Phương pháp đổ đĩa
• Chuẩn bị đĩa petri vô trùng
• Môi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng và
được bảo quản mát ở 45oC trong bể điều nhiệt
• Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ
thích hợp)

• Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường, lắc
đều
• Để nguội môi trường (thạch đông đặc)
• Đem ủ ở nhiệt độ thích hợp


Phương pháp đổ đĩa
Ưu điểm
- Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml)
- Xác định được các VSV cần dinh dưỡng tiếp
xúc từ nhiều phía
- Cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng
150-300 khuẩn lạc
Nhược điểm
- Không định lượng được những VSV quá nhạy
nhiệt
- Không xác định được hình dạng khuẩn lạc
nhất định
- Khó làm thuần một dòng VSV


Phương pháp cấy bề mặt
• Môi trường phải được chuẩn bị trên đĩa
trước 1-2 ngày để khô mặt
• Phương pháp
- Cấy 0.1 – 0,3ml vào đĩa môi trường
- Trải đều trên mặt bằng que trang tam giác
- Để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô
mặt

Film


Phương pháp cấy bề mặt
Ưu điểm
- Định lượng được các VSV nhạy nhiệt
- Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng
- Dễ dàng làm thuần chủng VSV mục tiêu
Nhược điểm
- Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ
- Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn lạc thấp



Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc

Bút đếm khuẩn lạc


Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc

Máy đếm khuẩn lạc

Máy đếm
khuẩn lạc tự
động


PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
Tính kết quả:

N (CFU / ghayCFU / ml ) =

∑C

(n1vd1 + ... + ni vd i )

Với :
N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi
khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu
ΣC: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri
đã chọn
ni : Số hộp petri cấy mẫu tại độ pha loãng thứ i
di: nồng độ pha loãng thứ i
v: Thể tích mẫu cấy vào trong mỗi đĩa


ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH HIẾU KHÍ TRONG
MẪU THỰC
10 g mẫu + 90 g Salin Pepton Watter
Đồng nhất bằng stomacher / 30 giây
Dung dịch 10 -1
Pha lõang 10-2, 10-3, 10-4,..
Cấy 1ml/petri – 3 độ pha loãng liên
tiếp – 2 petri/độ pha lõang
Cho 15-20 ml PCA/petri. Lắc đều


Để đông đặc
Lật ngược đĩa, ủ ấm

30±1oC/ 72±6h
Khuẩn lạc
Chọn đĩa có 25 – 250 khuẩn lạc
 đếm
Tổng VSV hiếu khí/g (TPC)
N
TPC =
n1V1F1 + ….+ niViFi
N: Tổng KL; n: số đĩa cho mỗi nồng
độ