Phương pháp lai phân tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ
GVBM : NGUYỄN THỊ MỸ LỆ
SVTH: NHÓM 12


PHÉP LAI
PHÂN TỬ
NỘI
DUNG
CÁC PHƯƠNG
PHÁP THỰC HIỆN

ỨNG DỤNG VÀO
THỰC TẾ

KẾT LUẬN


ĐẶC ĐIỂM

*Khi một phân tử DNA mạch đôi được
đun lên một nhiệt độ vượt quá nhiệt độ

ĐỊNH 
NGHĨA

+ Đặc hiệu
tuyệt
bắt cặp

chỉ xảy
nóng
chảyđối:
thì sự
haitái
mạch
sẽ tách
rời nhau
ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung với
do sự phá vỡ liên kết H giữa 2 mạch.
nhau.
+ Các trình
bổ 2sung
cótách
thể là
*Sautựkhi
mạch
rờiDNA
nhau,hay
nếu
RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử
nhiệt độ phản ứng đươc làm giảm
DNA-DNA, RNA-RNA hay DNA-RNA
xuống từ từ cùng với điều kiện thí
nghiệm thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở
lại. Và hiện tượng này gọi là sự lai phân
tử.


CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

Nồng độ DNA và thời gian phản ứng:
Ở nhiệt độ nhất định, số lượng các trình tự bổ sung càng n
hiều thì 
xác suất bắt cặp càng tăng.
Thời gian phản ứng càng dài, xác suất bắt cặp càng lớn, đồ
ng thời 
số lượng phân tử lai tăng dần
Nhiệt độ:
Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ. Thông thường tốc độ phản
ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm khoảng 25 %

Độ dài các trình tự:
Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn bình phương của độ dài các trình
tự bổ sung
Lực ion 
Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng tăng lên từ 5 đ
ến 10 
lần. Nồng độ NaCl vượt quá 1,2 M hoàn toàn không có tác d
ụng


CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ

LAI TRONG
PHA RẮN
LAI TẠI
CHỖ

LAI TRONG

PHA LỎNG




Nguyên tắc:



Các  trình  tự  bô ̉ sung  (các  mach 
̣
đơn)  nằm 
trong môi

trường long la
̉
̀ môt dung dich đêm. Lai phân t
̣
̣
̣
ử 

Lai trong
pha lỏng

chi ̉ xay 
̉ ra  khi  các  trình  tự  này  găp 
̣ nhau  do 
chuyên 
̉ đông 

̣
nhiêt 
̣ và  khi  nhiêt 
̣ đô ̣ môi  trường 
thấp hơn nhiệt độ nóng chảy) ít nhất vài đô.̣
Phân ti
̣ ương 
ượng cá c phân t
Ph
Ph
ương  ́ ch đinh l
Phương ử lai:
pháp 
pháp 
pháp sắc kí 
dùng 
dùng 
trên 
Nuclease 
quang 
hydroxylapati
S1
phô kế
̉
te




Phương phá p 

dù ng quang phô ̉
kế

Phương phá p 
dù ng Nuclease S1

Phương phá p sắ c 
kí  trên 
hydroxylapatite

DNA mach đôi hâ
̣
́p 
thu ánh sáng yếu 
hơn DNA mach đ
̣
ơn. 
Nên sự chuyên t
̉ ừ 
DNA mach đôi sang 
̣
dang mach đ
̣
̣
ơn được 
xác đinh thông qua 
̣
giá tri cua mât đô 
̣ ̉
̣

̣
quang (OD) ở bước 
sóng 260nm. Do đó, 
trong phan 
̉ ứng lai, 
sự tăng OD 260nm 
tương ứng với sự 
tăng số lượng các 

Dung dich phan 
̣
̉ ứng 
lai được trích ra môt 
̣
phần, đem xử lý với 
Nuclease S1. Các 
mach đ
̣
ơn đều sẽ bi ̣
thuy giai, s
̉
̉ ản phẩm 
của phản ứng là 
oligonucleotides hoặc 
nhóm nucleotide 5' 
phosphoryl

Kĩ thuât na
̣
̀y sử 

dung 
̣
đê lai v
̉
ới DNA, RNA 
hoăc v
̣ ới các protein 
ở trong các tế bào 
mà không cần tách 
chiết.
Ở nồng đô muô
̣
́i cao, 
chi nh
̉ ững nucleic 
mach đôi m
̣
ới gắn 
vào giá thê,phâ
̉
̀n 
nucleic không gắn 
vào giá thê se
̉ ̃ được 
thu nhân.  
̣


Tính ti lê % ca
̉ ̣

́c trình tự giống 
nhau ở hai loài gần nhau.
+DNA có nguồn gốc từ hai loài gần 
nhau, có thê lai đ
̉
ược với nhau. Đê ̉
tránh sự tái bắt căp gi
̣
ữa 2 mach 
̣
cua cu
̉
̀ng môt phân t
̣
ử ban đầu, DNA 
cua 2 loa
̉
̀i phai co
̉
́ nồng đô râ
̣ ́t khác 
nhau.
+Ty lê % ca
̉ ̣
́c phân tử lai có thê đ
̉ ược 
xem như tương ứng với ty lê % ca
̉ ̣
́c 
trình tự giống nhau giữa 2 loài đó. 

Ty lê ca
̉ ̣ ̀ng cao thì 2 loài càng gần 
nhau trong cây tiến hoá.
 Phân tích các trình tự lăp lai
̣
̣.
+Trong 1 dung dich DNA, môt tri
̣
̣
̀nh 
tự lăp lai nhiê
̣
̣
̀u lần sẽ có nhiều cơ 
may găp mach bô sung h
̣
̣
̉
ơn so với môt 
̣
trình tự duy nhất
 So sánh kích thước các bô gen 
̣

ỨNG
DỤNG




Nguyên tắc:

** Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai 
trên pha   lỏng. Điểm khác biệt ở đây là môt 
̣
trong hai trình tự bổ sung (thường là trình tự 
đích, trình tự cần tìm) được cố định trên môt giá 
̣
LAI TRÊN
PHA RẮN

thể rắn. 


Northern blot

Phương pháp:
Souther
n blot

LAI 
TRÊN 
PHA 
RẮN

Dot (SLot) 
blot.

Western 
blot.

Southe
rn blot

MỤC ĐÍCH:
Phương pháp
này dùng để
định vị
những trình
tự đặc biệt
trên DNA bộ
gen, hay
những DNA
kích thước
nhỏ


Northern 
blot

Mục đích:
Nhằm xác định kích
thước và hàm lượng
của một RNA thông
tin cụ thể (mRNA


Western 
blot.

Là quá trình proteinprotein kết hợp đặc
hiệu với nhau. Thường
sử dụng Antibody
protein có gắn phóng
xạ hoặc gắn lưu huỳnh
để phát hiện protein
Mục đích: là phương
pháp dùng để phát hiện
protein


ĐIỂM KHÁC NHAU CỦA 3 PHƯƠNG PHÁP
Southern blot

Northern blot

Western blot.

Trích DNA từ tế bào

Trích RNA từ tế bào

Trích protein từ tế bào

Cắt với enzyme giới hạn

Làm biến tính với
formaldehyde

Làm biến tính SDS

Chạy trên gel (dùng
agarose)

Chạy trên gel (dùng
agarose)

Chạy trên gel (dùng
polyacrylamide)

Chuyển lên màng
nitrocellulose( bằng hoạt
động mao dẫn)

Chuyển lên màng
nitrocellulose( bằng hoạt
động mao dẫn)

Chuyển lên màng
nitrocellulose( thường di
chạy điện di)

Tắc nghẽn với DNA dư

Tắc nghẽn với RNA dư

Tắc nghẽn với protein dư

Lai với mẫu dò DNA được

đánh dấu

Lai với mẫu dò DNA được
đánh dấu

Lai với mẫu dò kháng thể
được đánh dấu

Làm biến tính DNA


Southern blot
Rửa sạch khỏi mẫu dò
chưa được liên kết ( dưới
sự kiểm soát nghiêm ngặt)

Northern blot
Rửa sạch khỏi mẫu dò
chưa được liên kết ( dưới
sự kiểm soát nghiêm ngặt)

Western blot.
Rửa sạch khỏi mẫu dò
chưa được liên kết

Ứng dụng:
+ Bản đồ giới hạn của gen
X trong chromosome
+ Phát hiện các fragment
polymorphysm của cùng 1

gen ở các cá thể khác nhau.
+ Phát hiện đột biến mất
đoạn, điểm hay tái tổ hợp
trên 1 gen

Ứng dụng:
+Kĩ thuât na
̣
̀y dùng 
đê hiên thi s
̉
̉
̣ ự xuất 
hiên qua
̣
́ mức các gen 
gây ung thư và giam 
̉
các gen ức chế quá 
trình ung thư khi so 
sánh với mô bình 
thường

Ứng dụng:
+Các thử nghiệm 
khẳng định HIV sử 
dung ph
̣
ương pháp 
Western blot để phát 

hiện kháng thể chống 
HIV trong một mẫu 
huyết thanh của con 
người. 
+Western blot cũng có 
thể được sử dụng như 
một thử nghiệm xác 
minh về nhiễm viêm 
gan B.
+Một Western blot 
cũng được sử dụng như 


Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự
nucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong
tế bào hay trong mô.

Lai tại
chỗ

***Nguyên tắc.
Nghiên cứu acid nucleic mà không cần qua giai đọan
tách chiết chúng khỏi mô hay tế bào.

 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

Lai trên NST.
Lai trên khuẩn lạc.
Lai trên tế bào và mô.

Các NST ở giai đoạn trung kì được xử
lí bằng các kỹ thuật tế bào học trên
lame.

NST cố định trên lame được đem lai
với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ.

Để phát hiện phân tử lai, người ta sẽ
phủ lên lame một huyền dịch
(emulsion) nhạy cảm với tia xạ
Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên
huyền dịch. Lame được quan sát dưới
kính hiển vi, kết quả thể hiện thành những
hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị
trí có phân tử lai.

LAI TRÊN 
NST


LAI TRÊN KHUẨN LẠC

 Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai.
 Màng lai sẽ được xử lí bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn
và làm biến tính DNA
 Cố định DNA trên màng và tiến hành các phương pháp lai
như các phương pháp lai pha rắn khác.
 Kết quả phép này xác định dòng vi khuẩn cần tìm trên hộp
petri ban đầu. Dòng này sẽ được thu nhận và phân tích.

MỤC ĐÍCH:
Trong tế bào và mô, các RNA, đặc
biệt là các mRNA có sự phân bố
không gian xác định. Sự phân bố
không gian này liên quan đến chức
năng điều hòa cũng như tương tác
giữa mRNA với các thành phần
khác của tế bào và mô. Để nghiên
cứu trên mRNA đã tách chiết và
tinh sạch không cho phép thu nhận
các thông tin vừa kể, người ta
dùng phương pháp lai trên tế bào
và mô.

LAI TRÊN TẾ
BÀO VÀ MÔ

Mô được xử lí bằng phương
pháp mô học (cố định, khử
nước ; tẩm parafin, cắt thành
những lát mỏng từ 7 đến 10
micromet trải trên lame). Kết
quả được đọc trực tiếp trên
lame nhờ kính hiển vi.


Phạm vi ứng dụng



Đối tượng nghiên cứu có tổ chức phức tạp bao gồm nhiều tập hợp
các tế bào khác nhau.



Phương pháp này cho phép phát hiện một protein chuyên biệt thông
qua kháng thể đặc trưng của nó. Khi phối hợp những phương pháp
miễn dịch tế bào và lai tại chỗ, người ta sẽ phát hiện đồng thời
mRNA và protein của nó, từ đó xác định được mối tương quan giữa
hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen.



Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần như đồng nhất)
với nhiều mẫu dò khác nhau, người ta có thể xác định vị trí, sự phân
bố và tương tác giữa các mRNA cùng tham gia vào một quá trình
sống.


ỨNG DỤNG VÀO THỰC TẾ

1) Chăn nuôi
Trong ngành thuỷ sản, phương pháp lai tại chỗ thường dùng để
chẩn đoán bệnh của virut đốm trắng của tôm.
- Virus đốm trắng thuộc họ Nimaviridae, giống Whispovirus, có tên
khoa học Systemic Ectodermal and Mesodorma Baculoviras (SEMBV)
- Là một trong những virus được xếp vào nhóm gây chết cấp tính trên
tôm nuôi

2) Trong thực phẩm:
Dùng để kiểm tra thực phẩm biến đổi gen.
    Thực phẩm biến đổi gen (GMF - Genetically Modified Foods) là thực
phẩm mà bản thân chúng được tạo ra từ các cơ thể sinh vật mang các
gen tái tổ hợp được chuyển vào một cách nhân tạo nhằm phục vụ một số
lợi ích kinh tế.


THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN

Thực
phẩm
biến đổi
gen ???


XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CỦA GEN


Sử dụng phương pháp Southern



Mục đích: xác định sự có mặt của gen cần chuyển trong cây nhận,
ngoài ra còn cho biết số lượng bản sao đã được đưa vào cây.



Mẫu dò chính là một đoạn của gen chuyển có kích thước từ 100-300
bp được đánh dấu phóng xạ.


XÁC ĐỊNH BIỂU HIỆN GEN
Biểu hiện gen có ý nghĩa quan trọng, là mục đích
của chuyển gen. Nếu gen được đưa vào genome mà
không được biểu hiện thì coi như không có giá trị.
Quá trình biểu hiện gen được thể hiện qua 2 giai
đoạn:


Phiên mã từ DNA sang mRNA



Dịch mã từ mRNA tổng hợp các phân tử protein
thông qua bộ máy ribosome

Và để xác định sự có mặt của sản phẩm phiên mã
có thể thực hiện phép lai Northern hoặc lai tại chỗ.
Còn muốn đánh giá sự có mặt của protein do gen
chuyển tạo ra có thể thực hiện phép lai Western
hoặc ELISA.




LAI TẠI CHỖ

Mục đích: xác định gen chuyển
trong các bộ phận khác nhau của
cây chuyển gen



Thực hiện:lai giữa một đoạn đơn
đánh dấu bổ sung với trình tự
mRNA đặc hiệu.
Chỗ mô cắt từ cây chuyển gen được
cố định bằng cách làm lạnh nhanh,
sau đó gắn vào màng lai và lai với
mẫu dò.
Kết quả: xuất hiện mẫu gen chọn
lọc trên mẫu mô, chứng tỏ gen
chuyển đã được biểu hiện.

LAI WESTERN

Mục đích: phát hiện protein dựa trên phản ứng miễn dịch giữa kháng
nguyên (là sản phẩm protein cần tìm) và kháng thể đặc hiệu với kháng
nguyên đó.
Quá trình hiển thị sản phẩm lai có thể được thực hiện thông qua phản
ứng tạo màu với phosphatase kiềm hay hiện phim thông qua phản ứng
dạ quang ECL.