PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction)

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
BỘ MÔN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

PHƯƠNG PHÁP PCR
(Polymerase Chain
Reaction)


DANH SÁCH NHÓM
1. Trần Nguyễn Yến Linh
2. Phạm Trần Quỳnh Như
3. Mai Thị Ngọc Bích
4. Phạm Thị Luân Triết
5. Nguyễn Thị Thu Hiền
6. Lê Nguyễn Hoàng Tuấn


I

• GIỚI THIỆU

II

• THÀNH PHẦN CHỦ YẾU

III

• CÁC GIAI ĐOẠN CỦA PHẢN ỨNG

IV

• MỘT SỐ KỸ THUẬT PCR

V

• THIẾT BỊ

VI

• ỨNG DỤNG


Chương I:
GIỚI
THIỆU


Phương pháp PCR được Kary Mullis và
cộng sự phát minh năm 1985, ông đã đoạt
giải nobel về hóa học vào tháng 10 năm 1993
cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa
ra ý tưởng.
Ý tưởng: phát triển một quy trình mà DNA
có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo
qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA
polymerase.
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain
Reaction, gọi là “phản ứng khuếch đại gen”.

PCR là kỹ thuật nhằm khuyếch đại một đoạn DNA
mà không cần sử dụng các sinh vật sống
Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính
sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase được
tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt
PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học
và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát
hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những
bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen và xác định huyết
thống.


NGUYÊN TẮC
Phương pháp PCR là 1 phương pháp
invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn
là 1 trình tự đích DNA ban đầu, khuếch
đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này
thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động
của enzyme polymerase và một cặp mồi
đặc hiệu cho đoạn DNA này


Theo Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA
được thực hiện trong ống nghiệm. Sợi DNA
đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở
96 °C.
Không có hiệu quả cao, cần một lượng lớn DNA
polymerase và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình
PCR.
DNA-Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic

tên thermostable sống trong mạch nước phun
trên 110 °C,và khi dùng trong PCR nó không bị
phá vỡ.
Quá trình sao chép DNA có thể đơn giản và tự


Chương II:
Thành phần chủ yếu
của
Phương pháp PCR


a. DNA mẫu
b. Mồi
c. Enzyme polymerase chịu nhiệt
d. Các loại Nucleotid
e. Nước
f. Dung dịch đệm


II. Thành phần chủ yếu
a. DNA mẫu
Phản ứng PCR tối ưu xảy ra trên DNA thật
tinh sạch lẫn DNA thu nhận trực tiếp từ dịch
chiết tế bào. Có độ dài nhỏ hơn 1,5kb
Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng
giảm khi dùng các enzyme DNA polymerase
cho hiệu quả cao (<100mg).
Lượng DNA mẫu nếu cao quá phản ứng
PCR sẽ không xảy ra.

II. Thành phần chủ yếu
b. Mồi
Là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt
cặp bổ sung với 1 đầu mạch DNA mẫu. Giúp
cho DNA-polymerase nối dài và hình thành
mạch mới.

Nguyên tắc
Cùng tnc

Đặc hiệu

Kích thước
tối thiểu
18base

Tránh sự bổ
sung giữa 2
mồi


II. Thành phần chủ yếu
c. Enzyme polymerase chịu nhiệt
Enzyme sử dụng trong phản ứng PCR là enzyme
DNA polymerase từ Thermus aquaticus (Tag –
polymerase) không biến tính sau mỗi chu kì.
Hiện nay có nhiều enzyme chịu nhiệt khác được
sử dụng là: Vent – polymerase (Tli – polymerase),

Pfu – polymerase, rTth



II. Thành phần chủ yếu
c. Enzyme polymerase chịu nhiệt
Enzyme
Taq –
polymerase
Ventpolymerase
Pfu polymerase
rTth

Hiệu suất
tương đối
(relative
efficiency)

Tần số lỗi
(error rate)

Tần số mở
rộng
(extention
rate)

88

2 x 10-4

75

Không

Có

70

4 x 10-5

67

Có

Không

60

7 x 10-7

Không xác
đinh.

Có

Không

Không xác
định.

Không xác
định.

60

Không

Có

Exo
Exo
3’ – 5’ 5’ – 3’


II. Thành phần chủ yếu
d. Các loại nucleotid
Trong phản ứng PCR, 4 loại nucleotid thường
được sử dụng ở dạng deoxynucleotid: dATP,
dCTP, dGTP, dTTP
Nồng độ các nucleotid trong một phản ứng phải
bằng nhau để giảm lỗi sao chép.
Nồng độ khoảng 20- 200µM/ loại nucleotid để
kết quả mới ổn định, trung thực.



II. Thành phần chủ yếu
e. Nước

Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh

khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase,
RNAase, enzyme cắt hạn chế… Nói cách khác là
không chứa bất kì một thành phần nào khác.


II. Thành phần chủ yếu
f. Dung dịch đệm

Dung dịch đệm 10X (100mM KCl, 100mM
(NH4)2SO4 200mM Tris – Cl pH 8.8, 20mM
MgSO4, 1% (w/v) Triton X-100).
Thành phần quan trọng của dung dịch đệm là
Mg2+ giúp tạo phức với dNTP, cần thiết để gắn
dNTP vào enzyme. Kích thích hoạt tính
polymerase.
Nồng độ ion Mg2+ tối ưu là 150 - 200µM


Chương III:
CÁC GIAI ĐOẠN
CỦA PHẢN ỨNG
PCR


Bước 1: BIẾN TÍNH
ADN

Nhiệt độ tăng
94-96 để tách hai sợi
DNA ra. Trước chu

kỳ 1, DNA thường
được biến tính đến
thời gian mở chuỗi
để đảm bảo mẫu
DNA và mồi được
phân tách hoàn toàn
và chỉ còn dạng sợi
đơn.


Chương IV:
GIỚI THIỆU
MỘT SỐ KỸ THUẬT
PCR


MỘT SỐ KỸ THUẬT PCR
a. Kỹ thuật PCR ngược
b. Kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR)
c. Kỹ thuật PCR đảo (Inverse PCR)
d. Real-time PCR


IV. Một số kỹ thuật PCR
a. Kỹ thuật PCR ngược
Nguyên lý:
- Được cải tiến dựa trên kỹ thuật PCR chuẩn để
nhân các gen (các đoạn DNA) từ mạch khuôn là
mRNA.
- Phương pháp PCR ngược được sử dụng để phân

lập 1 đoạn DNA cạnh một trình tự đã biết trong
DNA genome.


IV. Một số kỹ thuật PCR
a. Kỹ thuật PCR ngược
Cách tiến hành:
- Người ta thiết kế một cặp mồi trong vùng đã biết
trình tự và hướng sang biên của nó. Sau đó, dùng 1
enzyme hạn chế 4 base cắt để tạo ra 1 phân đoạn
DNA chứa cả vùng đã biết lẫn vùng chưa biết trình
tự.
- Đóng vòng phân đoạn trên DNA và mở vòng bằng
1 enzyme hạn chế 6 base khác ở trong vùng đã biết
trình tự. Sử dụng 1 trong 2 mồi để đọc trình tự vùng
chưa biết trình tự.