Xây dựng Quy trình phát hiện Escherichia Coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR(Polumerase Chain Reaction) và thử nghiệm ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



ĐOÀN THỊ NGỌC TUYỀN





XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN
ESCHERICHIA COLI TRONG THỰC PHẨM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG






LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC







THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2005
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước

Đoàn Thò Ngọc Tuyền
LỜI CẢM ƠN


Em xin chân thành cảm ơn thầy Trần Linh Thước và thầy Nguyễn Tiến Dũng đã tận tình
hướng dẫn em thực hiện luận văn này.
Cảm ơn tất cả các thầy cô Khoa Sinh Trường Đại học sư phạm và Trường Đại học Khoa
học tự nhiên (Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh) đã tận tâm giảng dạy trong suốt thời gian em
học tập tại nhà trường.
Cảm ơn các bạn Huệ, Na, Phượng, Thanh, Ánh và tất cả các bạn của Phòng thí nghiệm
Công nghệ Gen - Vi sinh Trường Đại học Khoa học tự nhiên đã tận tình hỗ trợ tôi về mặt cơ sở
vật chất cũng như về mặt kó thuật.
Cảm ơn gia đình đã hỗ trợ vật chất và động viên tinh thần cho con trong suốt thời gian
học tập xa nhà.









Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AOAC : Assciation of Official Analytical Chemist (Hiệp hội các nhà phân
tích nhà nước)
bp : Base pair - cặp base

CEN : European Committee for Normalization (Hội đồng Châu Âu về chuẩn hóa)
dH
2
O : Nước cất
DNA : Deoxyribonucleic acid
d NTP : 3'- Deoxynucleoside - 5' triphosphate
ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay (Thử nghiệm hấp thu miễn dòch
gắn enzyme)
FDA : Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm)
FP : False positive (dương tính giả)
FN : False negative (âm tính giả)
KDa : Kilo Dalton (1000Da, đơn vò khối lượng protein)
RA : Relative accuracy (độ chính xác tương đối)
RS-P : Relative sensitivity (độ nhạy tương đối)
RS-N : Relative specificity (độ đặc hiệu tương đối)
ISO : International Standards Organisation (Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế)
Nordval : Nordic Committee on Food Analysis (Hội đồng phân tích thực
phẩm Bắc Âu)
PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi tổng hợp nhờ polymerase)
TAE : Tris acetic acid – EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid)
TE : Tris - EDTA
Taq : Thermus aquaticus
UV : Ultraviolet (tia tử ngoại)
WHO : World Health Organization



Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền

ĐẶT VẤN ĐỀ


Vấn đề vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong những chương trình phát
triển của các quốc gia. Trong những năm gần đây, tình hình ngộ độc thực phẩm có xu hướng gia
tăng cả về số lượng lẫn qui mô tác hại ở nhiều nước. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới
(WHO), có đến hơn 50% các vụ ngộ độc thực phẩm là do tác nhân vi sinh vật gây ra [20].
Hiện nay, xuất khẩu thực phẩm đang chiếm tỷ trọng quan trọng trong kinh tế xuất khẩu
của nước ta. Sự hội nhập kinh tế theo xu hướng toàn cầu hóa có tác động rất lớn đến các tiêu
chuẩn về chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm. Việc đẩy mạnh xây dựng qui trình, cải tiến các
trang thiết bò được xem là giải pháp đóng vai trò quyết đònh, giúp nâng cao năng lực kiểm soát
chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm. Về mặt này việc kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật
gây bệnh trong thực phẩm như E. coli, Samonella, Shigella, Virio… có vai trò rất quan trọng.
E. coli được xem là vi sinh vật chỉ thò nhiễm khuẩn thực phẩm, là loài vi khuẩn gây bệnh
cơ hội có thể gây viêm ruột và tiêu chảy ở trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lỵ hay tiêu chảy hội
chứng tả. Ngoài ra, E. coli còn gây bệnh viêm đường niệu, viêm khuẩn bàng quang, thận, tuyến
tiền liệt, ống dẫn trứng... Qui trình kiểm tra E. coli gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp
truyền thống thường chậm, tốn thời gian (kéo dài 3 - 4 ngày) và độ nhạy thấp. Trong khi đó các
phương pháp chẩn đoán phân tử dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử như lai phân tử, PCR... có
khả năng khắc phục được các nhược điểm này, đang được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng
trên thế giới.
Từ bối cảnh nêu trên, thực tiễn sản xuất ở nước ta đã đặt ra yêu cầu cần có phương pháp
phát hiện nhanh E. coli gây bệnh trong thực phẩm, thay thế các phương pháp truyền thống, cho
phép giám sát tính an toàn và giảm tối đa nguy cơ gây bệnh từ nhóm vi khuẩn này trong thực
phẩm.
Do vậy, mục tiêu của đề tài luận văn này là thiết lập qui trình phát hiện E. coli trong thực
phẩm bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) để thay thế các phương pháp truyền
thống.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền

PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1. NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM VÀ VI SINH VẬT GÂY BỆNH QUA THỰC PHẨM
1.1. Một số khái niệm liên quan
Trong lónh vực thực phẩm hiện nay, có hai khái niệm đang được sử dụng rộng rãi là vệ sinh thực
phẩm và an toàn thực phẩm và một số khái niệm quan trọng khác cần được phân biệt.
- Vệ sinh thực phẩm (food hygiene) [7,9] : là khái niệm để biểu thò thực phẩm không
chứa vi sinh vật gây bệnh và không chứa độc tố. Khái niệm này cũng bao hàm tình trạng vệ sinh
trong khi vận chuyển, chế biến và bảo quản thực phẩm.
- An toàn thực phẩm (food safety) [7, 9]: là khả năng không gây ngộ độc của thực phẩm
đối với con người bởi vi sinh vật hoặc bởi hóa chất, các yếu tố vật lý. Theo nghóa rộng, khái
niệm này còn được hiểu là khả năng cung cấp đầy đủ và kòp thời về số lượng và chất lượng thực
phẩm khi một quốc gia gặp thiên tai hoặc một lý do nào đó. Mục đích của an toàn thực phẩm là
việc bảo đảm được thực phẩm không bò nhiễm vi sinh vật gây bệnh, không chứa độc tố sinh học,
độc tố hoá học và các yếu tố khác có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng trong các quá trình sản
xuất, vận chuyển, chế biến và bảo quản thực phẩm.
- Ngộ độc thực phẩm [6,17]: dùng để chỉ tất cả các bệnh gây ra bởi các mầm bệnh có
trong thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm được chia thành 2 nhóm:
+ Ngộ độc do chất độc của vi sinh vật tạo ra trong nguyên liệu hoặc hóa chất từ quá trình
chăn nuôi, trồng trọt bảo quản, chế biến… Các độc chất này đã có trong thực phẩm trước khi
được tiêu thụ.

+ Ngộ độc do nhiễm trùng: là trường hợp vi khuẩn gây bệnh theo thực phẩm vào cơ thể
bằng đường tiêu hóa và tác động tới cơ thể do sự hiện diện của bản thân vi khuẩn hoặc do độc
tố của vi khuẩn .
- Độc tố [7, 8]: là các hợp chất hóa học có trong nguyên liệu, sản phẩm thực phẩm ở
một hàm lượng có thể gây ngộ độc khi được tiêu thụ bởi người hay động vật. Độc tố có thể tồn
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước

Đoàn Thò Ngọc Tuyền
tại ở nhiều trạng thái khác nhau và được tạo ra trong thực phẩm bằng nhiều con đường khác
nhau. Độc tố có nguồn gốc từ vi sinh vật được tạo ra bằng 2 con đường cơ bản sau:
+ Tế bào vi sinh chứa thành phần có độc tính. Vi sinh vật tăng trưởng thành mật độ cao
trong thực phẩm, khi tế bào bò chết đi, độc tố được phóng thích vào thực phẩm. Loại độc tố này
được gọi là nội độc tố (endotoxin).
+ Tế bào vi sinh tổng hợp các protein có độc tính được tiết ra ngoài tế bào. Loại độc tố
này được gọi là ngoại độc tố (exotoxin).
Nội độc tố và ngoại độc tố khác nhau nhiều về bản chất hóa học, các đặc tính hóa học và
phương thức hoạt động. Bảng 1 so sánh một số đặc trưng của hai loại độc tố này.
Bảng 1. So sánh một số đặc điểm của ngoại độc tố và nội độc tố của vi khuẩn [7, 26]
Ngoại độc tố (exotoxin) Nội độc tố (endotoxin)
- Do vi khuẩn còn sống tiết ra
- Có ở vi khuẩn Gram dương và Gram
âm
- Bản chất là protein
- Không bền với nhiệt
- Độc lực cao
- Triệu chứng bệnh đặc hiệu, không
gây sốt

- Do vi khuẩn chết phóng thích
- Có ở vi khuẩn Gram âm, ít ở vi
khuẩn Gram dương
- Bản chất là lipopolysaccharide
- Tương đối bền với nhiệt
- Tương đối ít độc
- Triệu chứng bệnh không đặc hiệu,
hay gây sốt, choáng.

1.2. Những vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm thường gặp
- Coliform [10]: Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật
dùng để chỉ thò khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Nhóm
coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, Gram âm, không sinh bào tử, hình que,
lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy lỏng. Dựa vào nhiệt độ tăng
trưởng, nhóm này lại được chia thành 2 nhóm nhỏ là coliform và coliform phân có nguồn gốc từ
phân của các loài động vật. Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu
nóng bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter. Trong các thành viên của
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
nhóm coliform phân thì E. coli là loài được sự quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực
phẩm.
- Escherichia coli [1,10]: vi khuẩn hiện diện trong ruột người và động vật, được thải ra
ngoài thiên nhiên theo đường phân nên thường gặp trong đất và nước. Năm 1971 E. coli được
xếp vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và là một vi sinh vật chỉ thò nhiễm
khuẩn thực phẩm. Loài này là trực khuẩn Gram âm mang đầy đủ tính chất cơ bản của vi khuẩn
đường ruột. Khả năng gây bệnh của E. coli rất đa dạng và tùy thuộc vào vò trí xâm nhập. Đối
với nhiễm khuẩn ngoài đường ruột, E. coli gây nhiều bệnh khác nhau với các triệu chứng không
đặc trưng và được xem là những vi khuẩn gây bệnh cơ hội (như viêm đường niệu, viêm nhiễm
bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng hay nhiễm trùng máu). Ngoài ra E. coli còn có
thể gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh. Đối với nhiễm khuẩn đường ruột, E. coli gây các bệnh
viêm ruột, tiêu chảy ở trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lỵ hay tiêu chảy hội chứng tả.
- Salmonella [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, di động bằng
chu mao. Vi khuẩn này chòu nhiệt kém nhưng chòu được một số hóa chất như brilliant green,
sodium lauryl sulfate, selenite, tetrathionate. Người ta đã

phân lập được 2324 chủng Salmonella
khác nhau. Ngoài nội độc tố Salmonella có thể tạo ra hai loại ngoại độc tố là độc tố ruột
(enterotoxin) và độc tố tế bào (cytotoxin). Dựa vào cấu trúc kháng nguyên O và H, người ta chia
Salmonella gây bệnh ra thành 3 nhóm: nhóm chỉ gây bệnh cho người, nhóm gây bệnh cho động

vật và nhóm gây bệnh cho người và động vật. Ở người Salmonella có thể gây sốt thương hàn
(do S. typhi hay S. typhi A, B,C), nhiễm trùng máu (S. cholera-suis), rối loạn tiêu hoá (S.
typhimurinum, S. enteritidis). Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể bằng đường miệng qua thức ăn.
Vào ruột non, vi khuẩn tăng trưởng xâm nhập vào máu và các cơ quan khác gây viêm . Ngộ độc
thực phẩm do nội độc tố của Salmonella gây ra các triệu chứng như nôn mữa, đau đầu, ớn lạnh,
tiêu chảy. Sốt xuất hiện vào 12 – 24 giờ sau khi ăn thức ăn có chứa 1 – 10 triệu tế bào
Salmonella/g thức ăn. Bệnh kéo dài 2 – 3 ngày, phần lớn bệnh nhân tự phục hồi nhưng cũng có
trường hợp tử vong, đặc biệt là người già, trẻ sơ sinh và người suy yếu hệ miễn dòch.
- Shigella [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy ý,
tăng trưởng ở nhiệt độ từ 10 – 40
C, pH 6 – 8, có kháng nguyên O, một số có kháng nguyên K,
không có kháng nguyên H. Shigella gồm có 4 loài: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boyalia, S.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
sonnei. Trong đó S. dysenteriae type 1 tạo độc tố thần kinh có độc lực rất cao, đã từng gây những
dòch lớn. Tỉ lệ tử vong của bệnh do Shigella cao hơn bệnh do Salmonella. Nhiễm khuẩn Shigella
chỉ giới hạn ở đường tiêu hóa chỉ cần 10 – 100 tế bào cũng đủ gây bệnh. Vi khuẩn này tạo hai
dạng độc tố. Nội độc tố lipopolysaccharide có ở thành tế bào vi khuẩn gây kích thích thành ruột.
Ngoại độc tố vừa tác động lên ruột vừa tác động lên hệ thần kinh trung ương gây các triệu
chứng tiêu chảy, ức chế hấp thu đường, axit amin ở ruột non, nếu tác động lên hệ thần kinh có
thể gây tử vong. Vi khuẩn sẽ tấn công niêm mạc ruột già tạo vết loét rồi hoại tử. Khi ruột già bò
tổn thương gây đau bụng quặn dữ dội, đi tiêu nhiều lần, phân nhầy nhớt và có máu được gọi là
hội chứng lỵ Shigella.
- Vibrio [6,10]: là phẩy khuẩn, Gram âm, di động nhờ tiên mao ở một đầu, hiếu khí hoặc
yếm khí không bắt buộc. Vibrio thường gặp trong thực phẩm, nhất là trong hải sản, gồm khoảng
28 loài, trong đo có 4 loài gây bệnh là V. parahaemolyticus, V. cholerae,V. vulnificus và V.
alginolyticus.
+ V. cholerae là loài vi khuẩn phổ biến trong thiên nhiên gây dòch tả ở người sử dụng
nước bẩn và thực phẩm bò nhiễm. Bệnh tả xuất hiện khi V. cholerae xâm nhập vào đường tiêu
hóa, qua được hàng rào axit của dòch vò, kết dính vào màng nhầy biểu mô của ruột và tiết ra độc

tố ruột. Độc tố ruột V. cholerae là một protein không bền nhiệt, cấu tạo bởi đơn vò A và B. Phần
B giúp độc tố gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào ruột là GM
1
. Tiểu đơn vò A vào ruột tăng hoạt
động của adenylcylase khiến tế bào sản xuất cAMP quá nhiều làm tăng tiết ồ ạt nước và chất
điện giải từ tế bào thượng bì vào lông ruột gây tiêu chảy. Virio còn có thể tạo hemolysin (chủng
Eltor), mucinase làm tróc niêm mạc thượng bì ruột, neuramirdase làm tăng thụ thể tiếp nhận
độc tố.
+ V. parahaemolyticus đa số gây độc trong thức ăn làm viêm ruột.
+ V. vulnificus hiện diện rộng rãi ở nước biển, hải sản, có khả năng tổng hợp độc tố
cytotoxin, hemolysin, cytolysin. Tỉ lệ tử vong bởi độc tố của vibrio thường rất cao.
+ V. alginolyticus ít gặp và được phát hiện gây bệnh lần đầu tiên vào năm 1971. Vi
khuẩn này có khả năng tạo độc tố ruột. Khi vào cơ thể, chúng phát triển rất nhanh trong máu và
gây bệnh.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
- Yersinia [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không tạo bào tử, tạo độc tố ruột
chòu nhiệt. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua da (vết bọ chét cắn), niêm mạc (kết mạc, niêm
mạc hầu trong, đường hô hấp). Khi vào cơ thể Yersinia sinh sản rất nhanh, biểu hiện lâm sàng là
các hạch trên cơ thể. Vi khuẩn đi vào máu và xâm nhập vào các phủ tạng gây xuất huyết. Thời
gian ủ bệnh là 2 – 7 ngày. Sau đó có thể sốt cao và đột ngột, hạch to dần gây đau đớn. Trường
hợp nhiễm độc thần kinh, người bệnh cảm thấy bứt rứt, lo âu. Trường hợp nhiễm trùng máu sớm
có thể kèm theo nôn mữa, tiêu chảy, nếu nhiễm muộn thì đông máu nội hạch, hạ huyết áp,
người trở nên lừ đừ, suy thận, suy tim.
- Proteus [8,10]: là vi khuẩn có trong tự nhiên, trong đường tiêu hóa của người và động
vật. Thực phẩm bò nhiễm Proteus chủ yếu từ nguồn nước hay từ

dụng cụ vật liệu chế biến thực
phẩm không được xử lý tốt. Proteus chỉ gây độc khi lượng tế bào trong cơ thể đủ lớn. Độc tố chỉ
đóng vai trò phụ trợ để làm tăng khả năng thẩm thấu của niêm mạc ruột, giúp vi khuẩn xâm

nhập vào máu nhanh và nhiều hơn. Thời gian ủ bệnh tương đối ngắn (khoảng 3 giờ, đôi khi kéo
dài 16 giờ). Khi bò nhiễm khuẩn, người bệnh bò nôn mữa, tiêu chảy cấp, viêm dạ dày, ruột.
Nhiệt độ cơ thể tăng. Bệnh xuất hiện rất nhanh nhưng cũng khỏi nhanh. Cơ thể sẽ phục hồi sau
1 – 3 ngày và không gây tử vong.
- Staphylococcus [6,10]: là cầu khuẩn Gram dương, tế bào bình thường liên kết với nhau
hình thành chùm, thường sống ở da người, đường hô hấp, đường tiêu hoá, quần áo , đồ vật...
Staphylococcus tạo 9 loại độc tố chòu nhiệt (A, B, C
1
, C
2
, C
3
, D, E, G, H) và các enzyme có khả
năng hỗ trợ cho độc tố gây độc ở người. Nếu bò ngộ độc chỉ sau 1- 8 giờ người bệnh sẽ buồn
nôn, ói mữa, tiêu chảy dữ dội, không sốt và phục hồi. Lượng độc tố có thể gây ngộ độc cho
người là 2mg.
- Clotridium [6,10]: là những trực khuẩn Gram âm, yếm khí, tạo bào tử, nhiệt độ phát
triển tối ưu 43 – 47C. Hai chủng gây ngộ độc thực phẩm là:
+ C. botulium lần đầu tiên được ghi nhận gây ngộ độc vào năm 1973 và có 6 người
chết do nhiễm độc. C. botulium có khả năng tạo độc tố thần kinh và rất nhiều độc tố khác nhau
(A, B, F, G, G
2
, D và G). Độc tố thường có độc lực rất cao.
+ C. perfringens phát triển ở nhiệt độ từ 12 - 50
C, bò ức chế ở nồng độ muối NaCl 6%.
Phần lớn trường hợp ngộ độc thực phẩm do C. perfringens khi mật độ tế bào trên 10
6
tế bào/gam
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền

thực phẩm. Thời gian ủ bệnh là 8 – 24 giờ. Triệu chứng là đau bụng, tiêu chảy, sốt, buồn nôn.
Độc tố của

C. perfringens bò bất hoạt ở 60C trong 10 phút.
- Listeria [6,10]: loài gây bệnh chủ yếu là L. monocytogenes, là vi khuẩn ưa lạnh, có thể
phát triển ở nhiệt độ 2,5 - 44C, thường hiện diện trong trong sữa, thòt, cá, rau và cả nước bề
mặt. Triệu chứng bệnh là tiêu chảy, sốt nhẹ. Trường hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản
trong các đại thực bào gây nhiễm trùng máu, tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và
có thể xâm nhập vào bào thai trong bụng mẹ gây sẩy thai , đẻ non hoặc nhiễm trùng thai nhi.
Ngoài các vi khuẩn thường gặp kể trên còn có nhiều vi khuẩn khác có vai trò nhất đònh
trong việc gây bệnh cho người từ thực phẩm như Bacillus cereus, Campylobacter jejuni,
Corynebacterium, Aeromonas hydrophila...
- Virus [6,10]: là nhóm vi sinh vật gây bệnh có kích thước nhỏ nhất, thay đổi từ 5- 20nm.
Virus gây bệnh ở thực phẩm ít được nghiên cứu do khó nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy thông
thường. Có rất nhiều vụ dòch hay ca bệnh từ thực phẩm do virus gây ra nhưng trong nhiều trường
hợp người ta không phát hiện được nguồn gốc gây bệnh. Thực phẩm đóng vai trò môi trường lan
truyền mầm bệnh. Một số virus trong thực phẩm gây bệnh ở người đã biết là virus Fadeno
serotype 40 và 41 gây loét dạ dày (họ Adenoviridae, chứa DNA, kích thước 100 nm), virus
Hepatitis E gây bệnh gan (họ Calciviridae, chứa RNA, kích thước 34 nm), virus Pravo gây đau
bao tử ( họ Pravoviridae, chứa DNA, kích thước 22nm), virus Popilo type 1 – 3 và Echo type 1 –
65 gây viêm phổi (họ Picornarividae, chứa RNA, kích thước 28nm)...
- Nấm mốc tạo độc tố [7,20]: một số loài có khả năng tạo độc tố gây ngộ độc hay ung thư
ở người và động vật. Trong thực phẩm, một số loài có khả năng tạo ra các độc tố, thường gặp và
nguy hiểm nhất là aflatoxin do Aspergillus flavus và A. parasiticus tạo ra. Mức độ ngộ độc bởi
nấm mốc là khác nhau, biểu hiện như nhiễm độc nhẹ (gây nôn mữa, tiêu chảy), tổn thương ở
gan, thận, túi mật và ống mật. Một số độc tố còn gây u tuyến hoặc u gan, gây thoái hóa tế bào
nhu mô gan, xơ hóa. Citrinin của Penicilium citrinum và P. viridicatum có thể gây các bệnh tăng
urea huyết, albumin niệu, viêm tiểu cầu thận. Một số độc tố của nấm mốc như tetronic acid,
terestic acid, viridicatic acid... tác động vào tim gây độc đối với chức năng của tim. Độc tố của
Stachybotrys ata, Fusarium tricinctum, Dendrodocium toxicum, Aspergillus ochraceus... tác động

vào máu và hệ tuần hoàn gây hội chứng chảy máu.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
- Tảo sinh độc tố [7]: các tảo này làm ô nhiễm nguồn nước, thủy sản, gây ngộ độc cho
động vật hoang dã, gia súc, gia cầm và con người. Các loài tảo độc có thể chia ra thành 3 nhóm:
+ Tảo Dinoflabellates: có mặt trong hơn 75% trường hợp thủy triều đỏ nhưng chỉ có
9,5% có độc tính nói chung và 1,5% gây độc cho người. Thường gặp là các giống Gymmodinium,
Pyrodinium, Dinophysic, Alexandrium, Gonyaulas...
+ Tảo silic: thường sinh ra domoic, là một axit amin gây độc cho hệ thần kinh trong cơ
thể.
+ Tảo lam: có nhiều loại, tạo nhiều loại độc tố khác nhau, đặc biệt là các chất có hiệu
ứng gây độc cho hệ thần kinh như Aphanizomenonf aquae sinh ra các alkaloid gây độc cho hệ
thần kinh gây ảo giác.
2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ BỆNH HỌC CỦA E. COLI
2.1. Đặc điểm sinh học
- Phân loại và đặc điểm hình thái [8]
Escherichia coli còn có tên là Bacterium coli comme, Bacillus coli communis do Escherich
phân lập năm 1885 từ phân trẻ em. Ngày nay, E. coli được xếp vào họ Enterobacteria, giống
Escherichia, loài E. coli. Trong giống Escherichia, phản ứng sinh hóa để phân loại ít có giá trò,
việc phân chia thành các type thường phải căn cứ vào cấu tạo kháng nguyên. E. coli là trực
khuẩn hình gậy ngắn kích thước 2 – 3 x 6
m, hai đầu tròn (Hình 1), tế bào đứng riêng lẽ, đôi
khi xếp thành chuỗi ngắn, có tiên mao chung quanh thân nên có thể di động, không tạo bào tử,
Gram âm, thỉnh thoảng có hiện tương bắt màu ở hai đầu.

Hình 1. E. coli dưới kính hiển vi điện tử quét SEM [10]
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
- Đặc điểm nuôi cấy [6,8]
E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ ý, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 15 - 44C

(tối ưu ở 37C), pH từ 5,5 – 8,5 (tối ưu ở 7,4). Khi tăng trưởng trên mặt thạch PCA ở 37C trong
24 giờø, E. coli hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, trong, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường
kính 2 – 3 mm. Trong môi trường nước peptone E. coli phát triển tốt, làm môi trường rất đục có
lắng cặn màu tro nhạt ở đáy dụng cụ nuôi cấy, đôi khi hình thành màng xám nhạt. Canh trường
có mùi phân thối. Trên môi trường Endo, E. coli hình thành những khuẩn lạc màu đỏ ánh kim. Trên
môi trường DA (Desoxycholate Agar), E. coli cho khuẩn lạc màu đỏ, dẹt tròn và khô. Trên môi
trường EMB( Eosine Methylene Blue), E. coli hình thành những khuẩn lạc màu tím đen, đỏ tía
thường có ánh kim, bờ tròn đều. Vi khuẩn này không phát triển ở môi trường Kauffmann và môi
trường Wilson Blair.
- Đặc điểm sinh hóa [10]
E. coli lên men sinh hơi với nguồn cacbon là glucose, galactose, lactose, maltose,
arabinose, xylose, ramnose, mannitol, fructose; có thể lên men hay không lên men saccharose,
rafinose, esculin, duncid, glycerol; ít khi lên men inulin, pectin, adonite; không lên men dextrin,
amidon, glycogen, inositol, cellobiose. Vi khuẩn thường sinh indol, không sinh urea và H
2
S, có
sinh lysin decarboxylase, không sử dụng citrate. Sự tăng trưởng của vi khuẩn bò ức chế bởi
chlorine, các dẫn xuất của muối mật, brilliant green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate,
selenite... Để phân biệt E. coli với các vi khuẩn đường ruột khác, 4 tính chất sinh hoá thường
được dùng là Indol, Methyl Red, Voges Proskauer và Citrate( còn được gọi là thử nghiệm
IMViC).
+ Indol (I): trong môi trường có tryptophan, tryptophanase của E. coli thuỷ phân
tryptophan thành indol. Để phát hiện indol, dùng vài giọt thuốc thử Kovac
,
s có chứa chất p-
dimethylaminobenzaldehyde. Chất này sẽ kết hợp với indol tạo nên hợp chất muối dimethyl
amonium có màu đỏ .
+ Methyl Red (đỏ methyl, MR): khi được nuôi cấy trong môi trường có glucose, E. coli
sẽ tạo ra một nồng độ H
+

cao ( pH < 4,5). Khi bổ sung vào môi trường đã nuôi cấy 24 giờ ở 37C
vài giọt thuốc thử Methyl Red, môi trường sẽ có màu đỏ.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
+ Voges Proskauer (VP): trong quá trình lên men glucose, vi sinh vật có thể cho những
sản phẩm cuối khác nhau, một trong số đó là acetoin
.
Khi bổ sung vào môi trường vài giọt
potassium hydroxide (40%) và -naptol (5% trong cồn tuyệt đối), acetonin sẽ tạo ra một phức
hợp màu đỏ.
+ Citrate (C): trong môi trường Simons có nguồn C duy nhất là citrate, vi khuẩn nào sử
dụng được citrate sẽ làm kiềm hoá môi trường và điều này được nhận diện bởi sự đổi màu của
môi trường (xanh lá cây thành xanh dương).
E. coli có kết quả thử nghiệm IMViC là như sau : I (+), MR (+), VP (-) và C (-).
- Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên [22]
Từ năm 1930, Kauffmann đã đưa ra biểu đồ phân type huyết thanh của E. coli dựa trên
kháng nguyên thân (O), kháng nguyên vỏ (K) và kháng nguyên lông ( H ).
+ Kháng nguyên O được cấu tạo bởi phức hợp lipopolysacharide, có liên kết chéo về
đặc tính huyết thanh với vi khuẩn khác như Shigella, Samonlla.
+ Kháng nguyên K có thành phần chính là polysaccharide có tính axit và được chia làm
3 nhóm A, B và L. Tính ngưng kết của nhóm A không bò bất hoạt ở 121
C trong khi L bò bất hoạt
ở 100C trong 1 giờ.
+ Kháng nguyên H có tính đa dạng phụ thuộc vào sự hiện diện của tiên mao ở từng
chủng. Nhiều E. coli ban đầu khi phân lập thì không di động hoặc chuyển động chậm nhưng khi
được chuyển qua môi trường thạch bán rắn thì di động tích cực. Chỉ những chủng di động mới
có kháng nguyên H.
- Phân bố
E. coli hiện diện ở phần sau của ruột, nhiều nhất là ở ruột già, ít khi ở dạ dày hay phần
trước ruột động vật (trâu, bò, heo, chó, mèo, gia cầm và người). Các loài động vật ăn thòt và loài

hỗn thực bài tiết nhiều E. coli hơn loài ăn cỏ. Vi khuẩn này được thải theo phân người và động
vật ra ngoài và nhiễm vào đất và nước. Việc phát hiện E. coli trong nguồn nước là một thử
nghiệm chính nhằm xác đònh nước có bò nhiễm phân hay không. Trước đây, E. coli được xem là
một vi khuẩn bình thường trong ruột. Hiện nay có nhiều chủng được xem như một trong những
tác nhân gây tiêu chảy, đặc biệt ở trẻ em.

Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
2.2. Đặc tính gây bệnh [1,7]
E. coli sống cộng sinh trong ruột người. Bình thường vi khuẩn này không gây bệnh và ức
chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác, tổng hợp vitamin C và K rất cần thiết cho con
người. Khi tỉ lệ E. coli giảm xuống dưới 20% so với tổng số vi sinh vật đường ruột thì mới xuất
hiện các triệu chứng rối loạn tiêu hóa do loạn khuẩn.
Một số chủng E. coli có khả năng gây bệnh. Bệnh gây ra bởi E. coli thay đổi theo vò trí
xâm nhập và chủng gây bệnh. Một số biểu hiện lâm sàng thường gặp là:
- Nhiễm khuẩn đường tiểu: E. coli có thể gây bệnh nhiễm khuẩn đường tiểu với các
triệu chứng như tiểu nhiều lần, tiểu lắt nhắt, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Có trường hợp
biến chứng thành nhiễm khuẩn tử cung, đường niệu, ống dẫn trứng, thận và nhiễm khuẩn máu.
- Nhiễm khuẩn máu: khi sức đề kháng của cơ thể người giảm, vi khuẩn có thể vào
máu và gây nhiễm khuẩn. Thường gặp ở trẻ sơ sinh và sau khi nhiễm khuẩn đường tiểu.

- Viêm màng não: E. coli và streptococci nhóm B là những nguyên nhân hàng đầu gây
viêm màng não ở trẻ em. E. coli chiếm khoảng 40 trường hợp gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh,
trong đó 75% E. coli có kháng nguyên K1.
- Tiêu chảy và các bệnh đường ruột: trước đây, vai trò gây tiêu chảy của E. coli ít được
đề cặp đến. Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của kó thuật xét nghiệm, người ta ngày càng phát
hiện được nhiều chủng E. coli gây tiêu chảy và các bệnh đường ruột khác. E. coli được xem là
nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy, đặc biệt là trẻ em. Bệnh gặp khắp nơi trên thế giới,
ở các nước phát triển lẫn các nước đang phát triển. Nhiều nơi phát sinh thành dòch do khả năng
lây lan rất nhanh và gây hiệu quả nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng.

Người ta chia các chủng E. coli gây bệnh đường ruột ra thành các nhóm sau:
- EPEC (Enterophathogenic E. coli): là các chủng E. coli đầu tiên được xác đònh gây
bệnh tiêu chảy ở người. Nhóm này gồm một số typ huyết thanh cổ điển gây viêm ruột và tiêu
chảy dạng nước hoặc lẫn máu ở trẻ em cũng như người lớn.
- EIEC (Enteroinvavise E. coli): gây tiêu chảy với triệu chứng lâm sàng dạng lỵ giống
Shigella. Bệnh thường gặp ở trẻ em lẫn người lớn và được xác đònh khi thấy có máu và đờm
xuất hiện trong phân.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
- ETEC (Enteroxigenic E. coli): gây tiêu chảy cho trẻ em và 20 – 65% khách du lòch
đến những nước đang phát triển hoặc những vùng mà điều kiện vệ sinh còn kém. ETEC xâm
nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa từ nước và thức ăn. Khả năng gây bệnh của ETEC tùy thuộc
vào khả năng bám dính vào thành ruột và tạo ra một hay nhiều độc tố. Độc tố ETEC gồm 2 loại
ST và LT. Độc tố ST (Heat stable toxin) là độc tố bền nhiệt gồm 2 loại là STI (STa) và STII
(STb). Độc tố LT (Heat labile toxin) là độc tố không bền với nhiệt, có cấu trúc và chức năng
tương đương như độc tố của Vibrio cholerae là một protein được cấu tạo bởi một tiểu đơn vò A
(30k Da) và 5 tiểu đơn vò B. Độc tố LT gồm 2 loại LT1 và LT2.
- EHEC (Enterohemorrhagic E. coli): gây xuất huyết ruột, còn có tên là VTEC
(Verocytocin - producing E. coli), do có khả năng sản xuất độc tố verocytocin có độc tính đối với
tế bào vero. VTEC không những là nguyên nhân gây tiêu chảy mà còn là nguyên nhân gây hai
biến chứng có thể dẫn tới tử vong là viêm đại tràng xuất huyết và hội chứng tan máu urê huyết
(50% ca bệnh dẫn tới tử vong). E. coli O157:H7 là đại diện của nhóm này, tạo ra một loại độc tố
mạnh. Nguồn thức ăn dễ nhiễm E. coli O157: H7 là xúc xích, sữa không qua khử trùng pasteur,
nước trái cây, nước uống… Vi khuẩn trong phân của người bò tiêu chảy có thể được lây lan sang
người khác nếu thói quen rửa tay hoặc vệ sinh không tốt. Triệu chứng gây bệnh bởi E. coli
O157: H7 là tiêu chảy nặng và chuột rút bụng, ít khi bò sốt. Bệnh sẽ khỏi sau 5 - 10 ngày. Ở một
số người, đặc biệt là trẻ em dưới 5 tuổi và người già, bệnh có thể biến chứng thành hội chứng
tan máu urê huyết, khoảng 2 - 7 trường hợp lây nhiễm dẫn đến biến chứng trên.

3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN E. COLI TRONG THỰC PHẨM

3.1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống [6,10]
Phương pháp nuôi cấy truyền thống để phát hiện E. coli gồm ba bước: (1) tăng sinh chọn
lọc trên môi trường phù hợp như BGBL (Brilliant Green Bile Lactose 2%) hoặc canh Lauryl
Sulphate Tryptose; (2) phân lập trên một các môi trường như Endo, EMB (Eosine Methylene
Blue Agar), DA (Desoxycholate agar) và (3) thử sinh hóa trên các môi trường MRVP (Methyl
Red Voges Proskauer) và Simons citrate agar.
- Tăng sinh chọn lọc: mục tiêu của bước này là làm tăng số lượng E. coli có trong mẫu,
ức chế một số lượng lớn các sinh vật khác. Môi trường dùng để tăng sinh chọn lọc là BGBL vì
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
trong thành phần của môi trường này có chứa mật bò chọn lọc vi khuẩn Gram âm, ức chế sự
phát triển của vi khuẩn Gram dương.
- Phân lập: bước này nhằm tách biệt và nhận dạng E. coli từ tập hợp các quần thể vi sinh
vật khác nhau trong mẫu sau bước tăng sinh chọn lọc. Có nhiều môi trường rắn khác nhau được
sử dụng để phân lập E. coli, mỗi môi trường nhận dạng một vài đặc tính chung nhất của E. coli.
Mức độ chọn lọc, tính đặc trưng và hình thái biểu hiện khuẩn lạc của E. coli trên từng môi
trường cũng khác nhau. Vì vậy các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích cùng
một lúc sử dụng ít nhất hai loại môi trường phân lập khác nhau để tăng cường khả năng phát
hiện E. coli, trong đó môi trường EMB được khuyến khích sử dụng. Các biểu hiện của E. coli
trên các môi trường khác nhau như sau:
+ Trên môi trường Endo khuẩn lạc E. coli thường có màu đỏ ánh kim tròn, bờ đều,
đường kính khoảng 0,5mm.
+ Trên môi trường EMB khuẩn lạc E. coli đỏ tía, có ánh kim, bờ đều, đường kính
0,5mm.
+ Trên môi trường DA khuẩn lạc E. coli có màu đỏ, tròn, khô và hơi dẹp, đường kính
0,5mm.
- Thử phản ứng sinh hóa: chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là E. coli từ môi trường phân
lập để thử nghiệm IMViC (trang 13, 14).
Mẫu kiểm được kết luận là có E. coli khi làm đổi màu và sinh hơi trên môi trường tăng sinh, tạo
khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập và cho kết quả sinh hóa là: I (+), MR (+), VP (-),

Ci (-).
Phương pháp này cho kết quả sau 4 - 6 ngày kể từ ngày phân tích. Mặc dù tiêu tốn nhiều
thời gian và công sức, song phương pháp truyền thống vẫn được áp dụng tại nhiều nước trên thế
giới, vẫn được xem là phương pháp tiêu chuẩn để đánh giá các phương pháp thay thế khác.

Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
3.2. Các phương pháp cải tiến
Do phương pháp truyền thống tốn nhiều thời gian, chậm thu kết quả, mất nhiều công sức,
tốn kém... nên nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được phát triển và thương mại hóa [10].
Một số phương pháp không truyền thống đang được phát triển và sử dụng là:
- Phương pháp ELISA ( Enzyme - Linked Immunosorbent Assay) [4, 10]
Phương pháp ELISA (hấp thụ miễn dòch dùng enzym) được quan tâm nhiều do đơn giản
và hiệu quả cao. Phương pháp này được dựa trên nguyên tắc là sử dụng kháng thể phủ bên
ngoài những đóa giếng (microplate). Kháng nguyên (nếu có) trong mẫu sẽ được giữ lại trên bề
mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có
gắn với enzyme horseradish peroxidase hoặc alkaline phosphatase. Khi bổ sung một cơ chất đặc
hiệu vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra sản phẩm có màu hoặc
phát sáng. Theo dõi sự đổi màu có thể phát hiện và đònh lượng được kháng nguyên trong mẫu.
Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. ELISA đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng
các bộ hóa chất (kit) thương mại (phát hiện Samonella, E. coli gây bệnh, Listeria…) và có thể
được cải tiến để tự động hóa. ELISA có thể sử dụng phát hiện và đònh lượng vi sinh vật trong
thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng
10
6
CFU/ml. Tuy nhiên trong phương pháp này vẫn cần thực hiện bước tăng sinh và tăng sinh
chọn lọc trước khi thực hiện các phản ứng miễn dòch.
- Phương pháp lai phân tử [4,10]
Phương pháp lai phân tử để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát
hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của phương pháp này là sự bắt cặp của hai

sợi nucleic acid mạch đơn (DNA, RNA) nếu có hai trình tự bổ sung ngược chiều nhau ở nhiệt độ
thấp hơn nhiệt độ tách mạch T
m
của hai phân tử nucleic acid mạch đơn. Một trong hai mạch
DNA bổ sung (thường là DNA mục tiêu) được cố đònh trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên
tế bào hay mô. Sự lai phân tử xãy ra khi đoạn mẫu dò có trình tự nucleotide bổ sung với một
vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường
thấp hơn T
m
ít nhất vài độ. Sự lai phân tử còn có thể xãy ra giữa DNA và RNA [10]. ETEC là
một trong những vi sinh vật gây bệnh đầu tiên được phát hiện bằng phương pháp lai phân tử.
Năm 1982, người ta đã sử dụng có hiệu quả các mẫu dò DNA để phát hiện gen mã hóa ST và
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
LT trong mẫu phân và mẫu môi trường bằng phương pháp lai phân tử. Hiện nay đã có một số bộ
kit thương mại dựa trên kó thuật phân tích nucleic acid dùng trong phát hiện E. coli gây bệnh
trong thực phẩm.

4. PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN E. COLI TRONG PHẨM [4, 10]
Dựa trên sự hiểu biết về nguyên tắc nhân bản DNA trong tế bào, năm 1985 Karl Mullis
và cộng sự đã phát minh ra một phương pháp cho phép nhân bản sao của DNA trong ống
nghiệm gọi là phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). Đây là một trong những phương
pháp nhân bản DNA in vitro được sử dụng rộng rãi nhất.

4.1. Nguyên tắc
Tất cả DNA polymerase đều cần mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu)
đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen. Mồi là đoạn oligonucleotide ngắn, bắt cặp
bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này
được nối dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này

của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu
của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, phản ứng PCR cho
phép nhân bản đoạn DNA nằm giữa hai mồi thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy
được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide. Như vậy để khuếch đại (nhân bản sao) một trình tự
DNA xác đònh, cần có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở
hai đầu đoạn DNA để tạo cặp mồi bổ sung chuyên biệt. Cặp mồi này gồm mồi xuôi (sense
primer) và mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gen.
Phương pháp PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước là:
- Bước biến tính (denaturation): trong một dung dòch phản ứng bao gồm các thành phần
cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tan (tách
mạch) T
m
của phân tử DNA (thường là 94 - 95C) trong vòng 30 - 60 giây. Mạch đôi DNA tách
ra thành dạng mạch đơn để làm khuôn cho phản ứng PCR.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
- Bước bắt cặp (anealation): trong bước này, nhiệt độ phản ứng được hạ thấp hơn T
m
của
mồi và DNA, cho phép mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động
trong khoảng 40 - 70C tùy thuộc T
m
của các mồi sử dụng và kéo dài 30 - 60 giây.
- Bước kéo dài (elongation): được xúc tác bởi DNA polymerase các deoxynucleoside
triphosphate lần lượt gắn vào đầu 3’-OH mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch
mới được tạo thành từ mồi được nối dài. Nhiệt độ phản ứng khoảng 72C.
Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần (mỗi
chu kỳ) lại làm tăng gấp đôi số lượng bản sao của lần trước (Hình 2, 3). Đây là sự khuếch đại
bản sao theo cấp số nhân. Trong thực tế sau 30 - 40 chu kỳ, phản ứng sẽ tạo ra khoảng 10
6

bản
sao. Sau phản ứng PCR, sản phẩm phản ứng được điện di trên gel agarose và vạch của sản
phẩm khuếch đại được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể thấy được dưới hộp đèn soi UV
bước sóng 312nm.

















Hình 2. Các bước trong phản ứng PCR

94C
94C
72C
72C
4C

55Caa

1’30’’
10’
0,45’’
5’
1’
30 Chu kỳ
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền











Hình 3. Số lượng bản sao DNA qua các chu kỳ khuếch đại của phản ứng PCR

4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
- DNA khuôn: về lý thuyết DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch
nhưng trên thực tế kó thuật này cũng cho phép khuếch đại trên DNA thu nhận trực tiếp từ dòch
chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt. Lượng DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR ở mức 1pg.
Lượng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn hay còn gọi là
vạch kí sinh. Khuôn DNA có thể được thu nhận từ các mẫu không được bảo quản tốt, đã bò phân
hủy từng phần như trong các vết máu lâu ngày, tinh dòch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của
người đã chết...
- Enzyme: thông thường DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải chòu được nhiệt

độ biến tính DNA để có khả năng xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối của quá trình phản ứng.
Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn suối
nước nóng Thermus aquaticus. Ngày nay, nhiều loại enzyme polymerase chòu nhiệt khác đã
được phát hiện và đưa ra thò trường với chức năng hoàn thiện và chuyên biệt hơn. Enzyme Tth
polymerase được tách từ Thermus thermophilus vừa có thể hoạt động như một enzyme phiên mã
Chu kỳ 1
2.097.152 bản sao (lý
thuyết)
Chu kỳ 3
dNTP
Taq
1 bản sao

Chu kỳ 2
> 20 chu kỳ
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
ngược đểï hình thành cDNA trong trường hợp khuôn là RNA, vừa có khả năng xúc tác phản ứng
khuếch đại DNA.
- Mồi và nhiệt độ lai: mồi là một trong những yếu tố quan trọng để đạt được sự khuếch
đại đặc trưng. Việc thiết kế và chọn mồi phải đạt các yêu cầu sau:
+ Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và
mồi “ngược”, không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác
nhau của một mồi.
+ “Nhiệt độ nóng chảy” (Tm) của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa. Thành
phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh chứa nhiều GC.
+ Mồi phải dặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại
trên gen.
+ Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR tốt nhất cho
những trình tự nhỏ hơn 1kb.

- Các thành phần khác trong phản ứng PCR: bốn loại nucleotide (dNTP) thường được sử
dụng ở nồng độ là 200
M cho mỗi loại nucleotide. Nồng độ dNTP cao hơn dễ dẫn đến sự
khuếch đại ký sinh. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép
của polymerase. Nồng độ Mg
2+
cũng là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại. Nồng
độ tối ưu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thường phải được xác đònh cho
từng phản ứng.
- Số lượng chu kỳ phản ứng: Số lượng chu kỳ trong một phản ứng PCR thông thường
không vượt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, trong giai đoạn đầu số
lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu. Sau đó, ở các chu kỳ tiếp theo
hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì nhiều nguyên nhân như sự phân hủy và cạn kiệt các thành
phần của phản ứng; sự xuất hiện những sản phẩm phụ ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao
vừa được tổng hợp không bắt cặp với mồi mà chúng tự bắt cặp với nhau... Ngoài ra, số chu kỳ
cho một phản ứng còn phụ thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu.

4.3. Ưu nhược điểm của phương pháp PCR để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm
[10,18]
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
Phương pháp PCR giúp phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm một cách nhanh
chóng và tin cậy. Ưu điểm của phương pháp này là thời gian cho kết quả nhanh, ít tốn kém về
mặt nhân sự, có thể nhận diện được những sinh vật khó nuôi cấy, việc nuôi cấy tăng sinh là đơn
giản hơn và có khi không cần thiết. Ngoài ra, hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ
tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học và không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán
phức tạp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số nhược điểm như:
- Sự ức chế hoạt tính của Taq DNA polymerase bởi thành phần phức tạp của mẫu thực
phẩm. Mặc dù vậy việc tách chiết và tinh chế DNA từ thực phẩm hay môi trường trước khi thực
hiện phương pháp PCR cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế.

- Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thường thấp, nên trong đa số trường
hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có mật độ đủ để phát hiện bằng PCR.
- Phương pháp PCR không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết. Do vậy có thể dẫn
đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. Ngược lại phương pháp này cho phép
phát hiện bào tử dạng tiềm sinh, hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ
độc.
Một giải pháp chung đối với các nhược điểm trên là kết hợp một bước tăng sinh ngắn và
một bước ly tâm loại bỏ thành phần môi trường nuôi cấy và rửa tế bào trước khi tiến hành phản
ứng PCR.

4.4. Các nghiên cứu ứng dụng PCR trong phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm [10]
Hiện nay, có nhiều ứng dụng của phản ứng PCR trong các bộ kit thương mại dùng để
phát hiện đặc hiệu các chủng vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm, bệnh phẩm hoặc những loài
khó nuôi cấy. Việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp PCR cần
phải qua bước nuôi cấy tăng sinh chọn lọc vi sinh vật cần phát hiện trước khi tách chiết DNA để
thực hiện phản ứng PCR. Sau khi nuôi cấy tăng sinh, tiến hành thu tế bào từ dòch tăng sinh để
tách chiết DNA làm khuôn cho phản ứng PCR. Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu ứng dụng
kó thuật PCR trong việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm tại Trung tâm Khoa học
và Công nghệ Sinh học, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. HCM đã thiết lập
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
được một số bộ kit phát hiện một số loài gây bệnh khác trong thực phẩm như Samonella,
Shigella…bằng PCR [10]
5. XÁC NHẬN HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP [20, 21]
5.1. Đònh nghóa
Xác nhận hiệu lực (validation) là quá trình thực hiện để củng cố một mục đích sử dụng,
thực hiện một qui trình hay một phương pháp bằng những thí nghiệm kiểm tra và cung cấp
những chứng cứ khách quan về những kết quả thu được. Xác nhận hiệu lực một phương pháp
phân tích vi sinh mới (hay phương pháp thay thế, alternative method) là quá trình thực nghiệm
để so sánh những kết quả thu được từ phương pháp thay thế và kết quả thu được so vớiø phương

pháp tiêu chuẩn (phương pháp tham chiếu, reference method) cho cùng mục đích sử dụng.
Qui trình xác nhận hiệu lực của phương pháp thay thế thường gồm 2 bước:
- Xác nhận hiệu lực sơ cấp (primary validation): bước này do phòng thí nghiệm đề xuất
phương pháp mới tiến hành nhằm đưa ra các thông số kó thuật của phương pháp để chứng minh
rằng phương pháp này có tính năng tương đương hay có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp
tiêu chuẩn.
- Xác nhận hiệu lực thứ cấp (secondary validation): bước này nhằm thẩm tra các thông số
kó thuật trong bước xác nhận hiệu lực sơ cấp đồng thời xác nhận độ lặp lại (repeatability), độ tái
lập (reproducibility), độ lệch chuẩn (standard deviation) của phương pháp thay thế. Bước này
được tiến hành bởi nhiều phòng thí nghiệm khác nhau dưới sự chủ trì của một cơ quan có chức
năng. Kết quả xác nhận hiệu lực thứ cấp sẽ được trình lên hội đồng quốc gia hay các tổ chức
quốc tế có thẩm quyền ban hành phương pháp để xem xét, đánh giá và ban hành phương pháp
trở thành một phương pháp chính thức.
5.2. Các thông số kó thuật trong xác nhận hiệu lực phương pháp
Độ chính xác (accuracy): là thông số đánh giá khả năng cho kết quả chính xác của
phương pháp thay thế so với phương pháp tham chiếu. Độ chính xác của phương pháp thay thế
biểu thò bằng tỉ lệ cho kết quả dương hay âm tính trên các mẫu có kết quả dương tính hay âm
tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu.
- Độ đúng (precision): là mức độ thống nhất giữa những kết quả kiểm tra độc lập của
những lần phân tích khác nhau từ một mẫu chung. Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ tái lặp.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
- Độ lặp lại (repeability): là mức độ thống nhất giữa các kết quả từ những lần khảo sát
độc lập trên một mẫu xác đònh ở trong cùng một điều kiện thực hiện về qui trình, thiết bò, người
thực hiện, tại cùng một thời điểm.
- Độ tái lặp (reproducibility): là mức độ thống nhất giữa các kết quả từ nhiều lần phân
tích khác nhau trên một mẫu xác đònh bằng phương pháp phân tích nhưng được thực hiện tại các
phòng thí nghiệm khác nhau, thời gian, điều kiện thực hiện và người phân tích khác nhau.
- Độ ổn đònh (robustness): là khả năng duy trì tính ổn đònh của kết quả phân tích khi các
điều kiện thực hiện có sự thay đổi nhỏ. Độ ổn đònh cho biết giới hạn thay đổi cho phép của các

thành phần tham gia vào qui trình phân tích và cung cấp thông tin về độ tin cậy của phương pháp
trong quá trình sử dụng.
- Độ nhạy (sensitivity): là chỉ số đánh giá khả năng phát hiện vi sinh vật mục tiêu có
trong mẫu của phương pháp thay thế. Chỉ số này là tỉ lệ giữa số kết quả phát hiện dương tính so
với số kết quả dương tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu.
- Độ đặc hiệu (specificity): là khả năng phương pháp đó cho kết quả âm tính trên mẫu
phân tích không chứa vi sinh vật mục tiêu (được kiểm chứng bằng phương pháp tham chiếu). Chỉ
số này là tỉ lệ giữa số kết quả phát hiện dương tính so với số kết quả âm tính khi phân tích bằng
phương pháp tham chiếu.
- Âm tính giảû (false negative): là kết quả âm tính khi phân tích một mẫu chắc chắn chứa
vi sinh vật mục tiêu.
- Dương tính giả (false positive): quả dương tính khi phân tích mẫu chắc chắn không chứa
vi sinh vật mục tiêu.
- Giới hạn phát hiện: là mật độ tế bào vi sinh vật thấp nhất mà một phương pháp phân
tích có thể phát hiện được. Tại giới hạn phát hiện, số lần phân tích cho kết quả dương tính phải
trên 50%.
Việc xác nhận hiệu lực phải chứng minh được rằng phương pháp thay thế có giới hạn
phát hiện bằng hoặc thấp hơn giới hạn phát hiện cuả phương pháp tham chiếu. Theo tiêu chuẩn
AOAC, giới hạn phát hiện cuả phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chọn ở các cấp độ khác
nhau. Thấp nhất là 1 –5 tế bào/25g mẫu thực phẩm, cao nhất là 10 – 50 tế bào/25g mẫu thực
phẩm.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
Các thông số kó thuật nêu trên cho phép ta đánh giá tính khả thi của phương pháp thay
thế, đồng thời cũng cho biết độ tin cậy của kết quả khi phân tích bằng phương pháp này. Các
thông số kó thuật của phương pháp thay thế khi được công bố, sẽ cho phép các phòng thí nghiệm
lựa chọn phương pháp phù hợp với yêu cầu và năng lực của mình.

5.3. Ý nghóa của việc xác nhận hiệu lực phương pháp thay thế
Một phương pháp mới phải được đánh giá so sánh với những phương pháp truyền thống

đã được xem là đáng tin cậy, được sử dụng từ trước tới nay. Việc đánh giá này giúp cho chúng ta
nhận đònh một cách tương đối phương pháp nào là tối ưu hơn về các mặt như thời gian, tiền bạc...
Từ đó tùy vào điều kiện yêu cầu cụ thể phòng thí nghiệm và người phân tích sẽ lựa chọn phương
pháp mang tính hiệu quả nhất đáp ứng cho công việc của mình. Do đó việc xác nhận hiệu lực
phải được thực hiện một cách khách quan và phải được kiểm đònh lại bởi các cơ quan tổ chức có
thẩm quyền. Xác nhận hiệu lực phương pháp thay thế giúp bổ sung những thiếu sót hạn chế của
phương pháp để trở thành một phương pháp đáng tin cậy và được sử dụng rộng rãi.
Trong bối cảnh vấn đề về an toàn vệ sinh thực phẩm đang rất được quan tâm như hiện
nay, việc lựa chọn phương pháp phân tích nào để đánh giá chất lượng của các loại thực phẩm là
vấn đề rất quan trọng. Việc xác nhận hiệu lực để hoàn thiện phương pháp, giúp phương pháp
thay thế được chấp nhận rộng rãi tạo sự thống nhất, sự hòa hợp mang tính quốc tế trong việc
phân tích các chỉ tiêu vi sinh sẽ góp phần mang lại sự tiện lợi trong quá trình mua bán trao đổi
các mặt hàng thực phẩm.