ENZYME PECTINASE VÀ ỨNG DỤNG

MỤC LỤC
Nội dung

Trang

LỜI MỞ ĐẦU ..................................................................................3
I.Enzyme ............................................................................................4
1.Khái niệm ......................................................................................4
2.Bản chất của Enzyme ...................................................................4
2.1 Bản chất sinh học của Enzyme ................................................4
2.2 Bản chất hóa học của enzyme ..................................................5
3.Cơ chế hoạt động..........................................................................6
4.Trung tâm hoạt đông (TTHĐ) của enzyme ...............................8
5.Tính đăch hiệu của enzyme .........................................................9
II. Enzyme Pectinase .......................................................................11
1.Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian ....................................11
2.Thu nhận Enzyme Pectinase từ vi sinh vật ................................11
2.1.Cơ chất ........................................................................................11
2.2.Pectinase.....................................................................................13
2.3.VSV tổng hợp pectinase ...........................................................16
2.4.Các đặc tính kỹ thuật quan trọng của enzyme pectinase. .....17
2.5. Thu nhận ....................................................................................21
3. Enzyme Pectinase trong sản xuất nước quả và rượu vang......24
3.1 Các chế phẩm Enzyme ..............................................................24
3.2. Cơ chế tác động của enzyme pectinase .................................26
3.3. Hiệu quả của việc sử dụng enzyme pectinase ......................29
KẾT LUẬN .......................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................38

1

LỜI MỞ ĐẦU
Đã từ lâu enzyme được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành
công nghiệp, nông nghiệp, y học và nghiên cứu khoa học. Việc nghiên
cứu và sử dụng các chế phẩm enzyme có ý nghĩa rất lớn vì nó thúc đẩy
các quy trình sản xuất, rút ngắn thời gian sản xuất, tối ưu hóa chất
lượng sản phẩm, làm tăng hiệu xuất chế biến,…Vì vậy nâng cao hiệu
quả kinh tế cho người sử dụng.
Hiện nay người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật và
được ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai
thác enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật có
nhiều ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme
từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có
thể sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp.
Trong số các enzyme thì pectinase có ứng dụng khá rộng rãi
chỉ sau amylase và protease. Để hiểu rõ hơn về enzyme pectinase và
tác dụng của nó như thế nào, chúng tôi chọn đề tài enzyme Pectinase
và ứng dụng.

2


I.Enzyme.
1. Khái niệm:
Enzyme là protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản
ứng hóa học. Chúng thúc đẩy một phản ứng xảy ra mà không có mặt
trong sản phẩm cuối cùng. Enzyme có trong nhiều đối tượng sinh
học như thực vật, động vật và môi trường nuôi cấy vi sinh vật.Hiện
nay người ta đã thu được nhiều loại chế phẩm enzyme khác nhau và
sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y học , nông nghiệp, công

nghiệp…
2. Bản chất của Enzyme:
2.1 Bản chất sinh học của Enzyme:
Enzyme là một loại Protein được sinh vật tổng hợp nên, và
tham gia vào các phản ứng sinh học.
Như vậy bản chất sinh học của enzyme là sản phẩm của các quá
trình sinh học, và thực hiện các phản ứng sinh hóa trong và ngoài tế
bào sinh vật. Các loại enzyme đều có những đặc tính sinh học chung
như sau:
- Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật. Qúa trình tổng hợp
Enzyme là một quá trình hết sức phức tạp và được điều khiển, kiểm
soát rất chặt chẽ.
- Enzyme than gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi
enzyme được tách khỏi tế bào sống.
- Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa.
Vì trong quá trình sống của tế bào, enzyme được tổng hợp và hoạt
động trong điều kiện nhiệt độ của tế bào và nhiệt độ của cơ thể. Nhiệt
độ của cơ thể và của tế bào sinh vật thường la nhiệt độ thấp. Phần lớn
nhiệt độ cơ thể sinh vật dao động trong khoảng 30-400C.
- Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài
cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng
dự trữ trong các hợp chất hóa học. Qúa trình chuyển hóa này được
thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi phản ứng được xúc tác bởi một
loại enzyme. Các enzyme này lần lượt thay nhau xúc tác để các phản
ứng lần lượt xảy ra, để lần lượt tạo thành CO2 , H2O, một số chất khác
và giải phóng năng lượng. Cũng có thể chuỗi phản ứng sẽ tạo thành
những chu kỳ chuyển hóa khép kín. Trong chuỗi chuyển hóa hở hay
3

chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của các phản ứng trước sẽ là cơ
chất của các phản ứng sau.
- Enzyme có thể được thực hiện một phản ứng. Các phản ứng
này thường xảy ra ở ngoài tế bào ( khi ta thực hiện chúng trong ống
nghiệm). Trong tế bào thường không xảy ra phản ứng enzyme đơn (
một phản ứng) mà thường xảy ra các phản ứng theo chuỗi phản ứng.
- Phản ứng enzyme là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất
ít. Trong khi đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc
tác hóa học đòi hỏi năng lượng rất lớn. Nhờ có hoạt động xúc tác của
enzyme, các phản ứng sinh hóa xảy ra liên tục trong điều kiện năng
lượng ôn hòa.
- Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng.
Gen quyết định tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết
định một phản ứng sinh hóa.Cơ chế như sau:
Một gen  một enzyme  một phản ứng
Như vậy, gen sẽ quyết định bản chất sinh học và bản chất hóa
học của enzyme. Cơ chế này có ý nghĩa rất lớn trong việc điều khiển
tổng hợp enzyme trong tế bào vi sinh vật.
2.2 Bản chất hóa học của enzyme:
Ngoại trừ một nhóm nhỏ RNA có tính xúc tác, tất cả enzyme
đều là protein. Tính chất xúc tác phụ thuộc vào cấu tạo của protein.
Nếu một enzyme bị biến tính hay phân tách thành những tiểu đơn vị
thì hoạt tính xúc tác thường bị mất đi, tương tự khi bản thân protein
enzyme bị phân cắt thành những amino acid. Vì vậy cấu trúc bậc 1, 2,
3, 4 của protein enzyme là cần thiết cho hoạt tính xúc tác của chúng.
Enzyme, cũng như những protein khác, có trọng lượng phân tử
khoảng 12.000 đến hơn 1000.000.Một số enzyme cấu tạo gồm toàn
những phân tử L amino acid liên kết với nhau tạo thành, gọi là enzyme
một thành phần. Đa số enzyme là những protein phức tạp gọi là
enzyme hai thành phần. Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại

hay coenzyme. Một coenzyme khi kết hợp với các apoenzyme khác
nhau (phần protein) thì xúc tác cho quá trình chuyển hóa các chất
khác nhau nhưng chúng giống nhau về kiểu phản ứng.
4


Một số enzyme cần ion kim loại cho hoạt động
như:
Cu2+



Cytochrome

oxidase

Fe2+ hoặc Fe3+ Cytochrome oxidase,
catalase, peroxidase

K+ Pyruvate kinase
Hexokinase,glucose
6 phosphatase, pyruvate

Mg2+
kinase

Mn2+
Arginase,
ribonucleotide


reductase





Mo Dinitrogenase
Ni2+
Urease
Se Glutathione peroxidase
Zn2+
Carbonic
anhydrase, alcohol dehydrogenase,
các carboxypeptidase A và B.

Một số coenzyme và chức năng vận chuyển nhóm tương
ứng của chúng như sau:

Biocytin
CO2

Coenzyme A Nhóm
Acyl

5’- Deoxyadenosylcobalamin
Nguyên tử H và nhóm alkyl
(coenzyme B12 )

Flavin

adenine
dinucleotide
Điện tử

Lipoate
Điện tử
và nhóm acyl

Nicotinamide adenine
dinucleotide
Ion Hydride (:H-)

Pyridoxal
phosphate
Nhóm Amino

Tetrahydrofolate
Nhóm 1 Carbon
5



pyrophosphate

Thiamine
Aldehyde.

3. Cơ chế hoạt động:
Những quan điểm hiện nay nhằm giải thích cơ chế tác
dụng của enzyme đều cho rằng khi enzyme (E) tưong tác với cơ

chất (S) sẽ làm giảm năng lựợng hoạt hóa các phản ứng hóa
sinh. Muốn làm giảm năng lượng hoạt hóa các phản ứng enzyme
cần trải qua nhiều giai đoạn trung gian và tạo thành phức chất
nhất định giữa E và S.
Khi kết hợp với phân tử enzyme, do kết quả của sự cực
hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các
mối liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng sẽ làm thay đổi
động năng và thế năng nên phân tử cơ chất trở nên hoạt động và
dễ dàng tham gia phản ứng.
Việc tạo thành phức hợp E-S giai đoạn đầu xảy ra rất nhanh
và rất không bền. Do đó sau một thời gian dài mới được chứng
minh bằng thực nghiệm. Bằng chứng rõ ràng nhất về sự tồn tại của
phức hợp E-S là thành công của hai nhà hóa sinh Nhật Bản K.
Iaglu và T. Ozava là tách được phức E-S trong phản ứng khử
amin bằng cách oxy hóa (loại trừ nhóm amine) một amino acid
dãy D do oxydase xúc tác.
Nhìn chung ta có thể hình dung cơ chế tác dụng của
enzyme lên cơ chất tạo sản phẩm bằng phương trình tổng
quát như sau:
E+S
E-S
P+E
Giai đoạn 1: E kết hợp với S để tạo thành E-S. Giai đoạn này
xảy ra rất nhanh, nhờ các liên kết không bền như liên kết hydro,
tương tác tĩnh
điện, tương tác Van der Waals… Mỗi loại liên kết đòi hỏi
những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước.
Giai đoạn 2: Sau khi tạo phức, cơ chất có những biến đổi
nhất định về mật độ điện tử, cấu hình làm cơ chất trở nên hoạt động
hơn, phản ứng được dễ dàng để tạo thành sản phẩm P.

Trong nhiều phản ứng do enzyme xúc tác có 2 hay nhiều
lọai cơ chất, ví dụ hexokinase xúc tác phản ứng:
ATP + glucose
hexokinase
ADP+glucose6
phosphate
6


Cơ chế enzyme xúc tác cho phản ứng 2 cơ chất có thể như
sau:
a/ Cơ chế tạo phức 3 thành phần:
S2

b/ Cơ chế không tạo phức 3 thành phần:

Đây là trường hợp cơ chất thứ 2(S2) chỉ kết hợp vào enzyme
( ở trạng thái E’) sau khi P1 được tạo thành.
4. Trung tâm hoạt động (TTHĐ) của enzyme:
Từ kết quả nghiên cứu về bản chất hoá học, về cấu trúc trung
tâm hoạt động , cơ chế tác động, về trung tâm hoạt động chúng ta có
thể có một số nhận xét chung về trung tâm hoạt động như sau:
- Là bộ phận dùng để liên kết với cơ chất.
- Chỉ chiếm tỉ lệ rất bé so với thể tích toàn bộ của enzyme.
- Gồm các nhóm chức của amino acid ngoài ra có thể có cả các
ion kim loại và các nhóm chức của các coenzyme.

7

Đối với E một thành phần: TTHĐ chỉ gồm những nhóm chức
của các amino acid như nhóm hydroxy của serin, carboxy của
glutamic, vòng imidazol… Các nhóm chức của các amino acid có thể
xa nhau trong chuỗi polypeptide nhưng nhờ cấu trúc không gian nên
nó gần nhau về mặt không gian.
Đối với E hai thành phần: TTHĐ cũng như trên, các nhóm chức
của các amino acid tham gia tạo thành TTHĐ liên kết với nhau bằng
các liên kết hydro. Ngoài ra trong TTHĐ của loại này còn có sự tham
gia của coenzyme và có thể cả ion kim loại.
Theo Fisher TTHĐ có cấu trúc cố định, khi kết hợp với cơ chất
để tạo phức E-S ta có thể hình dung giống như chìa khóa và ổ khóa.
Ngày nay người ta đã chứng minh được rằng: TTHĐ của enzyme chỉ
có cấu tạo hoàn chỉnh khi có sự tương tác với cơ chất (thuyết tiếp xúc
cảm ứng của Koshland).
5. Tính đặc hiệu của enzyme:
Người ta chia tính đặc hiệu ra làm 3 kiểu:
+ Đặc hiệu phản ứng
+ Đặc hiệu cơ chất
+ Đặc hiệu không gian
a/ Đặc hiệu phản ứng:
Đó là biểu hiện của một enzyme chỉ thường xuyên xúc tác cho
một kiểu phản ứng nhất định, ví dụ vận chuyển hydro từ chất cho
(rượu bậc nhất hay rượu bậc hai) đến chất nhận (NAD+ hay NADP+)
hay chuyền nhóm amin từ một amino acid đến một ceto acid. Các
phản ứng loại thứ nhất do dehydrogenase xúc tác, còn phản ứng loại
thứ hai do aminotransferase xúc tác.
b/ Đặc hiệu cơ chất:
Tuỳ mức độ người ta chia thành: đặc hiệu tương đối và đặc hiệu
tuyệt đối
+ Đặc hiệu tuyệt đối: Enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất

định, một ví dụ có tính chất kinh điển về chuyên hoá tuyệt đối là
urease, enzyme chỉ phân giải ure:

8


Hằng trăm thí nghiệm trên các dẫn xuất của ure đều cho thấy
chúng không bị phân giải dưới tác động của urease. Thực ra người ta
đã phát hiện khả năng phân giải cơ chất hydroxyure nhưng với tốc độ
bé hơn khoảng 120 lần.
+ Đặc hiệu nhóm tuyệt đối: Các enzyme này chỉ tác dụng lên
những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử, một liên kết và có
những yêu cầu xác định đối với nhóm nguyên tử đối vơi nhóm nguyên
tử ở gần liên kết chịu tác dụng. ví dụ : maltase chỉ phân giải liên kết
glucosidic được tạo thành từ glucoside của glucose với -OH của
monose khác.
+ Đặc hiệu nhóm tương đối: Các enzyme không có những yêu
cầu đối vơi nhóm chức ở gần liên kết chịu tác dụng. ví dụ lipase thuỷ
phân lipid.
c/ Đặc hiệu không gian:
Các enzyme chỉ xúc tác cho một dạng đồng phân nào đó như
dạng L hay dạng D, dạng cis hay trans mà thôi.

9


II. Enzyme Pectinase:
1.Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian của Enzyme
Pectinase:
Enzyme pectinase cũng như hầu hết các enzyme khác là chất

xúc tác sinh học có bản chất là protein, có khả năng xúc tác với độ đặc
hiệu cơ chất cao. Các chất xúc tác này thường có cấu trúc rất phức tạp
và thường để đảm bảo có tính xúc tác, enzyme có cấu trúc bậc IV.
Trong cấu tạo bậc IV, nhờ vào tương tác hóa học giữa các thành phần
mà chúng hình thành nên trung tâm hoạt động. Enzyme
polygalacturonase (pectinase) chứa 1 vùng 8 – 10 vòng xoắn kép về
phía phải với 2 vòng sẽ tạo thành 1 khe liên kết với cơ chất. Người ta
nguyên cứu nhận thấy rằng trung tâm hoạt động của enzyme này chứa
2aa là Aspartat và lysin. Người ta cũng bảo rằng có một histidin nằm
gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của
enzyme.
2.Thu nhận Enzyme Pectinase từ vi sinh vật:
2.1.Cơ chất:
Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết
hợp của các acid galacturonic qua các liên kết α-1,4-glucoside.

Hình Cấu tạo đơn phân tử galacturonic
và liên kết α-1,4-glucoside giữa chúng

10


Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử
từ 80000-200000. Pectin không hòa tan trong rượu và các dung môi
hữu cơ khác. Pectin hòa tan trong nước, ammoniac, dung dịch kiềm,
carbonate natri và trong glycerin nóng. Độ hòa tan của pectin trong
nước tăng lên khi mức độ ester hóa trong phân tử pectin tăng vả khi
khối lượng phân tử pectin giảm.
Pectin là tên chung gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần
rất khác nhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu. các

pectin tự nhiên định vị trong thành tế bào có thể lien kết với các cấu
trúc polyssacharide và protein để tạo thành các rotopectin không tan.
Có thể phân hủy làm cho pectin tan trong nước bằng cách đun nóng
pectin trong môi trường acid. Vì thế, các pectin thu nhận được là kết
quả của sự phân hủy phân tử pectin không tan và chúng không đổng
dạng với nhau.
Trong thực vật, pectin tồn tại dưới 3 dạng: pectin hòa tan,
pecinic acid và protopectin.
Pectin hòa tan là ester methylic của acid polygalacturonic
pectin, trong tự nieên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của
polygalacturonic acid được ester hóa bằng methanol. Pectin được
ester hóa cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch
đường có nồng độ 65%. Emzym pectinase tác động lên các hợp chất
pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không
đồng dạng. cấu trúc hóa học cơ bản của pectin là α-D-galacturonan
hay α-D-galacturonoglycan,mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vị Dgalactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu α-1,4). Mặt khác,
mức độ oxy hóa trong các phân tử polymer này cũng khác nhau,
11


trong đó một số nhất định các nhóm carboxyl bị ester hóa bởi các
nhóm methoxyl. Trong một số trường hợp, chẳng hạn trong pectin củ
cải đường, có sự ester hóa giữa các nhóm carboxyl và các nhóm
acetyl.
Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các
nhóm carboxyl được ester hóa bằng methanol. Pectinate là muối của
pectinic acid. Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải
phóng khỏi nhóm methoxy, tức là trong đó có chứa một nhóm
carboxyl tự do trên một đơn vị galacturonic acid. Pectate là muối của
pectin acid.

Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước
và có cấu tạo hóa học phức tạp. Trong thành phần pectin có các phân
tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2+, các gốc
phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị phân hủy
bằng acid thì giải phóng pectin hòa tan.
2.2.Pectinase:
Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi người ta hiểu biết
về cấu trúc pectin và cơ chế phân cắt pectin của những enzyme này.
Trong nhiều thập niên gần đây việc sản xuất pectinase từ vi
sinh vật đã trở nên phổ biến. Nhiều vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men,
nấm mốc đều có khả năng sản xuất enzym pectinase. Người ta cũng đã
chứng minh rằng: pectinase là một enzyme cảm ứng có thể được sản
xuất từ nhiều nguồn cacbon khác nhau.
Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử người ta đã đẩy
mạnh nghiên cứu việc tạo dòng và biểu hiện gen của enzym pectinase

12


trong các tế bào chủ khác nhau. Tuy nhiên, tế bào chủ được sử dụng
nhiều nhất vẫn là Saccharomyces.
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các
polymer pectin. Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xày ra khi
trái cây chín. Những enzyme này vì vậy có một vai trò rất quan trọng
trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Việc kiểm soát các
enzyme này trong cà chua chuyển gen là một ví dụ điển hình trong
việc ứng dụng RNA đối mã để thao tác sự biểu hiện gen. Enzyme
pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong thực phẩm, đặc biệt là khả
năng làm trong nước quả. Việc kiểm soát hoạt động của enzyme
pectinase cũng có thể điều chỉnh được độ nhớt của sản phẩm. Enzyme

pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật. Ở thực vật
bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà
chua, cỏ ba lá. Trong các loại cỏ khác thường chỉ có enzyme
pectinesterase. Nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinase thường khoảng
45-55 0C.
Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng
của chúng như sau:
Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm
methyl ester. Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl
của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hóa, phân cắt
các nhóm methoxy (COOCH3 ) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do,
tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Pectinesterase
thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị ph tối ưu khác nhau. Nếu
thu từ nguồn vi sinh vật thì ph tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn
thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5. Pectinesterase từ nấm mốc có
13


nhiệt độ tối ưu là 30-45 oC và bị vô hoạt ở 55-62oC. Pectinesterase
thường được hoạt hóa bởi các ion Ca2+ và Mg2+.
Polygalacturoase còn có tên gọi là poly α-1,4galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên
kết α-1,4-glycosid. Các exo-PG (exo-poly 1,4-α-D-galacturonide)
galacturonohydrolase, EC 3.2.1.67) phân cắt từ các đầu không
và

khử,

endo-PG

(endo-poly

1,4-α-D-galacturonide)

gycanohydrolase,EC3.2.1.15) tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ
chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất, enzyme
polygalacturonase được chia làm 4 loại:


Polymethylgalacturonase

hay

galacturonite-methylesglucanohydrolase,

còn
tác

gọi

là

dụng

α-1,4trên

polygalactorunic acid đã được methyoxyl hóa ( tức là pectin).
Enzyme này lại được phân thành 2 nhóm nhỏ là endo-glucosidasepolymethyl galacturonase kiểu І và exo-glucosidase- polymethyl
galacturonase kiểu Ш.


Polygalacturonase,

enzym

trên pectic

acid hoặc

pectinic, cũng được chia thành 2 nhóm nhỏ là endo-glucosidasepolygalacturonase kiểu ІІ và exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu
ІV. Enzym endo-glucosidase-polymethyl-galacturonase kiểu І là
enzym polymethylgalacturonase dịch hóa pectin có mức độ methyl
hóa càng cao thì bị thủy phân bởi enzym này càng nhanh và càng có
hiệu quả. Trong dung dịch, khi có mặt của enzym pectinesterate thì
hoạt độ của enzyme này thường bị giảm. enzym này rất phổ biến
trong vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc A.niger, A.awamori.

14


Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị
galacturonate không bị lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp
hơn cả cho các enzym này. Nói chung, cả 2 enzym này đều có
khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để
hoạt động. Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng
có ở vi khuẩn và nấm. các enzym vi sinh vật này đóng một vai trò rất
quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy
mô của thành tế bào làm mềm và làm mô thực vật.
Ngoài ra còn có:
Pectin-transeliminase hay còn gọi là poly α-1,4galaturonite- methylesteglucanolise, là enzym tác dụng trên pectic
aicd và pectinic acid.

Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị
galacturonate đã bị ester hóa. Tất cả các PNL đều do enzym endoenzym.
2.3.VSV tổng hợp pectinase:
Nguồn giàu enzym pectinase là nấm mốc, nấm men và vi
khuẩn.
Nấm mốc: Penicillium glaucum, P. ehrlichii, P.chrysogenum,
P.expanam, P. cilrimim, aseergillus awamori, A.foetidus, A.niger,
A.terrus, A.saitoi, Fusarium moniliforme,…
Nấm men: saccharomyces fragilis.
Vi khuẩn: bacillus polymyxa, Flavobacterrium pectinovorum,
Klebsiella aerogenes,…
Các loài vsv thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ
phận khác của thực vât. Khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết,
15


chúng sẽ cùng các loài VSV khác phá hủy rất nhanh quả và các bộ
phận của thực vật.
2.4.Các đặc tính kỹ thuật quan trọng của enzyme
pectinase:
a.Pectinesterase(PE):
các PE ở thực vật tấn công vào hoặc đầu không khử hoặc gần
với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi
đơn, tạo ra các khối galacturonic acid không bị este hóa rất mẫn cảm
với calcium. Các cấu trúc khác nhau của chuỗi galacturonan, chẳng
hạn như các monomer acetyl hóa, các nhóm este bị chuyển thành các
amide hay bị khử đến rượu bậc 1, hay sự tồn tại của các vùng có
nhiều mạch nhánh, ức chế hoạt động của PE. PE có tính đặc hiệu cao
đối với nhóm methylester của polygalacturonic acid. Các este khác
chỉ bị tấn công rất chậm, còn các nhóm methylester của

polymanuronic acid thì không hề bị tấn công. Tốc độ để este hóa trên
mạch

pectin

phụ

thuộc

vào

độ

dài

của mạch; trimethyl

trigalacturonate không bị tấn công. Các PE của nấm khác với PE của
thực vật theo cơ chế đa mạch, các nhóm methoxyl bị lấy đi một cách
ngẫu nhiên.
b.Polygalacturonase (PG):
Việc xác định hoạt tính của enzyme này bằng cách đo độ nhớt
của dung dịch pectic acid gồm methylester và glycolester cho thấy sự
giảm nhanh tốc độ và mức độ thủy phân, đồng thời tăng mức độ ester
hóa. Các nhóm acetyl có mặt làm giảm mức độ thủy phân bằng cách
giảm mức độ thủy phân bằng cách giảm ái lực của các phân tử cơ
chất qua khối chứa các điểm liên kết. Sự thủy phân bị hạn chế do sự
16

có mặt của các nhóm acetyl có thể được xác minh bằng cách sử dụng
pectin củ cải đường làm cơ chất. PG tạo bởi nấm có thể phân hủy đến
70% pectin bị acetyl hóa. Tuy nhiên, kiểu tác dụng lên cơ chất của
các PG có từ các nguồn khác nhau thì khác nhau.
Cơ chất tốt nhất cho sự phân hủy của các endo-pectin-lyase ở
pH > 7 là pectin hoàn toàn bị ester hóa. Tuy nhiên ở các giá trị pH
nhỏ hơn, enzyme này vẫn hoạt động đối với pectin bị ester hóa ít hơn,
đồng thời cần Ca++ để kích hoạt. Điều này có ý nghĩa thực sự đối với
các quá trình chế biến trái cây. Những enzyme này cần các nhóm
methylester để hoạt động, trái lại chúng bị bất hoạt khi có mặt các
nhóm glycolester và các pectate bị amidate hóa.
c.Endo-pectate lyase:
Trái lại, endo-pectate-lyase không phân biệt methylester và
glycolester của pectic acid. Điều thú vị là pectate không phải là cơ
chất tốt nhất cho vi khuẩn PAL từ vi khuẩn. Chúng có hoạt độ cực
đại (tốc độ ban đầu và mức độ phân hủy) lên pectin có hàm lượng
methoxyl thấp.
d.Rhamno-galacturonase:
Gần đây, rhamno- galacturonase là enzyme được phát hiện có
khả năng phân cắt liên kết glucoside trong các vùng phân nhánh
nhiều của phân tử galacturonic rhamnose acid có trong pectin của táo
với hoạt tính rất cao khi những phân tử này bị đề ester hóa và
arabinose bị lấy đi do bị thủy phân bởi acid (vùng phân nhánh nhiều
bị sửa chữa). Enzyme này có mặt trong các chế phẩm thương mại của
pectinase và chắc chắn phải được phân loại là pectinase. Sản phẩm

17


cuối là các oligomer có các đơn vị rhamnose và galacturonic acid,

trong đó rhamnose làm hình thành đầu không khử.
e.Pectinase thương mại:
Enzyme thương mại là các chế phẩm enzyme của nấm mốc,
được điều chế chủ yếu từ các loài Aspergillus. Chúng thường là hỗn
hợp của các PE, PG và PL, hemicellulase và endo--glucanase (C-xcellulase). Hoạt tính của ba chế phẩm thương mại khác nhau được
trình bày ở bảng 1. Các enzyme đều được thu nhận từ nấm mốc được
sử dụng để sản xuất chế phẩm pectinase, trừ enzyme C-1-cellulase
(cellobiohydrolase) là được thêm vào để chế phẩm đạt được mục đích
kỹ thuật. Enzyme arabinanase đóng vai trò rất quan trọng trong quá
trình chế biên nước ép trái cây.

18


Bảng 1. Hoạt tính riêng của các phức hợp đa enzyme trong
các chế phẩm pectinase được sản xuất từ nấm.
Cơ chất

Hoạt tính enzyme

A

B

C

PG

Polygalacturonic acid

1982

3314

1878

PL

Pectin DE 90

43

53

74

PE

Pectin DE 65

548

448

227

Combined pectolytic

Pectin DE 75

198

290

274

C--cellulase

CMC

998

180

1228

C-l-cenllulase

A vicel

99

1

22

Arabanase:linear arabinan

1-5--L-arabinan

9

10

16

Arabanase: branched arabinan

1,3;1,2;1,5--Larabinan

14

14

16

-L-Arabinofuranosidase

PNP-Arabinofuranoside

35

37

333

Galactomannanase

Galactomannan

3

4

9

Mannanase

1,4--D-Mannan

7

0

0

Galactanase

1,4--D-Galactan

11

58

91

Xylanase

1,4--D-Xylan

4

0

2

Có một điều chắc chắn là kỹ thuật gen sẽ được sử dụng nhằm
mục đích sản xuất các chế phẩm enzyme, mở ra những khả năng mới
cho các ứng dụng công nghiệp của các chế phẩm enzyme này.

19


2.5. Thu nhận:
Hiện nay, người ta thu nhận chế phẩm pectinase chủ yếu từ vi
sinh vật. Có 2 phương pháp sản xuất pectinase:
a.Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt:
Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận
pectinase thường là cám gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm.
Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonium,
phosphoric,…Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60%. Nấm
mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 30 0 C trong thời gian 40h,
sau đó giảm xuống 24 0C và nuôi trong 48-52h. Sản phẩm sau lên
men được sấy khô thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế.
Để thu dược chế phẩm enzyme pectinase tinh khiết thì chế
phẩm enzyme thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ
dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfate. Dung môi hữu cơ sử
dụng để kết tủa enzyme pectinase có thể là rượu ethanol (72,5-75%)
hoặc isopropanol (55-57%). Muối ammonium sulfate sử dụng có độ
bão hòa 0,79. Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzyme thu

được có độ tinh khiết khoảng 90%, còn nếu bằng muối thì độ tinh
khiết đạt khoảng 75%. Nhiệt độ kết tủa đối ưu đối với rượu là 2-5 0C,
thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt. Sau đó, ly tâm để tách
kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay
sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản.
b.Thu nhận chế phẩm enzyme từ canh trường bề sâu:
Phương pháp hiếu khí:
Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát
triển của vi sinh vật gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid
20


hóa mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn. pH
của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7,2 là thích hợp. Đối với
nấm mốc, pH kiềm kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy
enzyme pectinase. pH = 4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzyme
pectinase. Khi pH dịch về acid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng
4,5-5,0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo
thành enzyme enzyme pectinase bị kìm hãm. Tuy nhiên, pH của các
môi trường nuôi cấy A. niger và A. awamori 16 có thể dịch về 3,5-3,8
và 2,9-3,2 theo thứ tự.
Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi và với
hàm lượng từ 2-10%. Đối với A. niger và A. awamori, vật liệu gieo
cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến
khi bắt đầu nứt nanh bào tử. Thời gian ủ sơ bộ thường là 38-42h.
Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình nuôi
cấy, hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6%
xuống còn 1,5-1,8%.
Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường
lỏng. Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất

khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun
là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180 0C và đi ra đạt
60-70 0C. Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun
phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không
quá 40 0 C. Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để tránh
hút ẩm. Có thể thu chế phẩm pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa
enzyme trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỷ lệ 4:1, với
aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol theo tỷ lệ 1,3:1, hoặc với muối
21


ammonium sulfate (50-80% trong muối kết). Nếu kết tủa bằng
ethanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với
hoạt độ của dịch canh trường ban đầu. Nếu kết tủa bằng muối
ammonium sulfate, cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phương pháp
thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khô. Khi độ bão
hòa của (NH4 )2SO4 bằng 0,5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ
pectinase thấp (đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nhưng nếu
kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hòa 1,0 thì sẽ kết tủa được đoạn
chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao.
Phương pháp yếm khí:
Môi trường: Bã củ cải: 2% ; (NH4 )2 HPO4: 0,75%
KH2 PO4: 0,1%; CaCO3: 0,3%; nước chiết ngô: 0,5%.
Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp
pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh
trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối. Sự tích lũy
enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua
55-60h. pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6,5-7,0. Vật liệu
gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường chứa bào tử và
được cấy với lượng 4% theo thể tích. Qúa trình nuôi cấy được tiến

hành ở nhiệt độ 350C.
Cl. felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu
pectinase. Thành phần môi trường gồm có: Lactose: 2%; pectin củ
cải: 1%;

(NH4 )2 HPO4: 0,4%; K2HPO4 : 0,7%; KH2PO4: 0,3%;

NaCl: 0,1%; MgSO4 : 0,025%; FeSO4: dạng vết; CaCO3 : 0,5%; dịch
nấm men tự phân: 0,05%; ascorbic acid: 0,5%.

22


Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng
cách kết tủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium
sulfate. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử
lý là 6,5-6,8. Nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích acetone thì hoạt độ của
enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu.
Khi kết tủa bằng ammonium sulfate có độ bão hòa bằng
0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và
pectintranseliminase; khi độ bão hòa là 0,9-1 thì sẽ thu được chế
phẩm chỉ chứa pectintranseliminase và exopolygalacturonase.
Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzyme
pectinase thường theo các bước cơ bản sau đây:
-Khử muối bằng phương pháp lọc gel (Biogel P100)
-Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion (DEAE Biogel
A), hay trao đổi cation (CM Biogel A)
-Tách enzyme pectinase bằng alginate liên kết ngang
-Tinh sạch bằng FPLC.
Alginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực,

ảnh hưởng tĩnh điện và thay thế pectate liên kết ngang.
3. Enzyme Pectinase trong sản xuất nước quả và rượu vang:
3.1 Các chế phẩm Enzyme:
Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzyme là
một tiến bộ khoa học lớn. Các chế phẩm enzyme được sử dụng trong
sản xuất nước quả và rượu vang có thể là một hỗn hợp nhiều loại
enzyme và cũng có thể là một loại enzyme riêng biệt . Việc sử dụng
hỗn hợp enzyme hay từng loại enzyme riêng biệt phụ thuộc vào
nguyên liệu và sản phẩm cần đạt tới. Ngoài ra, việc sử dụng các loại
chế phẩm enzyme như trình bày trên còn phụ thuộc vào công nghệ sản
xuất. (các yếu tố kỹ thuật).
23


Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử
dụng một trong sáu nhóm enzyme sau:
-Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả đục. Mục
đích sử dụng nhóm chế phẩm enzyme này là làm tăng hiệu suất trích ly
để thu được lượng sản phẩm lớn.
-Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả trong,
không chứa pectin. Mục đích sử dụng nhóm chế phẩm enzyme này là
làm tăng hiệu suất trích ly và thủy phân hoàn toàn các chất protein.
Pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục nước
quả.
-Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả năng đồng hóa
nước quả và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả
-Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất bán sản phẩm rượu
vang, nhằm làm tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm.
-Nhóm chế phẩm enzyme dùng ngăn cản quá trình oxy hóa và
làm cản trở sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước

quả, trong rượu vang.
-Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục dích chống lại sự lại
đường trong sản xuất siro thành phẩm.
Việc sử dụng các chế phẩm enzyme phải được xem xét cẩn thận
trên cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý. Trong các đặc điểm
trái cây, người ta quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên
của sản phẩm. Trong nhiều trường hợp việc sử dụng enzyme phải đảm
bảo giữ được màu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắc
theo ý muốn bằng cách điều khiển phản ứng enzyme.
Theo màu sắc tự nhiên các loại trái cây được chia làm hai loại:
-Trái cây có màu nhạt: táo, lê nho trắng, chuối, cam, bưởi…
-Trái cây có màu sẫm do chứa nhiều antoxian: anh đào, mận đỏ,
nho đỏ, mơ, mận đen, dâu…
Để xử lý quả nghiền có màu hạt, người ta thường sử dụng một
loạt các enzyme sau:
-Enzyme endo-PMG để giảm độ nhớt của dịch quả.
-Enzyme PE làm tăng hiệu suất trích ly.
24


-Enzyme khác như cellulose, hemicellulose, protease không bắt
buộc.
Khi chế biến nước quả có màu đỏ cần lưu ý phải bảo tồn chất
màu antocian. Vì vậy không được sử dụng những loại enzyme có khả
năng phân giải antocian
Trong nhiều trường hợp, enzyme protease đóng vai trò rất quan
trọng trong quá trình làm trong nước quả, người ta thường kết hợp
protease acid với enzyme phân hủy pectin.
Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta thường xử dụng chế
phẩm enzyme bao gồm pectintrancelinutase, hemicellulose, cenlulase.

Trong đó, enzyme pectintrancelinutase đóng vai trò quan trọng nhất.
trong hỗn hợp chế phẩm enzyme trên, tuyệt đối không được có mặt
enzyme polygalacturonase, đặc biệt là không được chứa enzyme
endopolygalacturonase. Những enzyme này thường làm giảm độ nhớt
của dịch quả và phá vỡ độ đồng nhất của nước nước quả.
Việc ứng dụng enzyme vào chế biến nước quả và trong sản xuất
rượu vang bắt đầu từ năm 1930. Khi đó, Z,J.Kertesz và A. Meilliz
được xem như những người đầu tiên đưa ra ý tưởng sử dụng enzyme
trong chế biến rau quả. Từ đó đến nay, trên thế giới có rất nhiều loại
chế phẩm thương mại được sản xuất và ứng dụng trong chế phẩm rau
quả.
3.2. Cơ chế tác động của enzyme pectinase:
Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm
enzyme nhằm hai mục đích cơ bản.
-Phá vỡ thành tế bào thực vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước
quả.
-Làm trong và ổn định lượng nước.
Phá vỡ thành tế bào. Tế bào thực vật được cấu tạo từ vỏ tế bào
(thành tế bào). Vỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rất hữu hiệu và tạo
hình cho tế bào. Ở vỏ tế bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất
pectin được xem như chất ciment gắn các tế bào với nhau, phá vỡ sự
gắn kết này sẽ tạo điều kiện cho các vật chất có trong tế bào thoát ra
khỏi tế bào. Các chế phẩm enzyme có chứa không chỉ pectinase mà
25