Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro loài lan quý hiếm Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana)

LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì
công trình nào khác.
Tác giả

Nguyễn Thị Hoài Phương


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
2,4-D

: Diclorophenoxyacetic acid

AC

: Active carbon (than hoạt tính)

BA

: 6 - benzyl adenine

BAP

: 6 - benzyl amino purine

B5

: Gamborg (1968)

CW

: Coconut water (nước dừa)

IBA

: Indole 3 - butyric acid

I&Y

: Ichihashi & Yamashita

KC

: Knudson C (1965)

KIN

: Kinetin

ĐHST

: Điều hòa sinh trưởng

M

: Mitra et al.

MKC

: Modified Knudson ‘C’

MS

: Murashige và Skoog (1962)

NAA

: α-naphthalen acetic acid

PM

: Phytamax

RE

: Robert Ernst (1979)

SH

: Schenk và Hildebrandt (1972)

VW

: Vacin và Went (1949)

THT

: Than hoạt tính

IUCN

: International Union for Conservation of Nature


MỤC LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
3.1

Tên bảng
Ảnh hưởng của chất ĐHST và nước dừa đến khả năng nhân nhanh

3.2

protocorm sau 8 tuần nuôi cấy.
Ảnh hưởng của KIN, NAA đến khả năng nhân chồi in vitro của lan

3.3

sau 12 tuần nuôi cấy.
Ảnh hưởng chất BA, NAA đến khả năng kéo dài chồi in vitro sau 12

3.4

tuần nuôi cấy.
Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro sau 8 tuần nuôi

3.5

cấy.
Đánh giá khả năng sống sót của cây con khi đưa ra trồng vườn ươm
sau 2 tuần.

Trang
21
25
27
29
31


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình
2.1

Tên hình
Cây lan Huyết nhung trơn ngoài tự nhiên.

2.2

Nguyên liệu nghiên cứu.

2.3

Sơ đồ mô tả các bước thí nghiệm

3.1

Ảnh hưởng của KIN, NAA đến khả năng nhân nhanh protocorm

3.2

sau 8 tuần nuôi cấy.
Ảnh hưởng của nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến

3.3

khả năng nhân nhanh protocorm sau 8 tuần nuôi cấy.
Ảnh hưởng của KIN, NAA đến khả năng nhân chồi in vitro sau

3.4

12 tuần nuôi cấy.
Ảnh hưởng chất BA, NAA đến khả năng kéo dài chồi in vitro sau

Trang
18
18
18
22
24
26
28

12 tuần nuôi cấy.
3.5

Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro sau 8 tuần nuôi

3.6

cấy.
Cây con ra ngoài vườn ươm trồng trên giá thể tốt nhất.

MỞ ĐẦU

30
31


1. Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về hoa trên thế giới
nói chung và ở Việt Nam nói riêng đang ngày càng gia tăng. Chính vì thế hoa tươi
đang trở thành một loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí đặc biệt
trên thị trường [31]. Trong đó, hoa lan là một trong những loài hoa được nhiều
người ưa chuộng bởi lẽ nó mang một vẻ đẹp sang trọng, thuần khiết, sự đa dạng về
màu sắc, hình dáng và hương thơm quyến rũ [7]. Huyết nhung trơn (Renanthera
imschootiana Rolfe) là một trong những loài phong lan đẹp và quý hiếm [68, 77,
79]. Hoa thường nở vào mùa hạ, có màu đỏ và nổi tiếng với những đặc điểm trang
trí độc đáo. Ở Việt Nam, Huyết nhung trơn phân bố chủ yếu ở một số tỉnh Tây
Nguyên và Nam Trung Bộ như Kontum, Lâm Đồng, Khánh Hòa. Tuy nhiên, số
lượng nhiều loài lan trong tự nhiên, trong đó có loài Huyết nhung trơn đang có xu
hướng giảm đi bởi ảnh hưởng bất lợi của điều kiện môi trường và nạn khai thác bừa
bãi. Bên cạnh đó, trong tự nhiên cây lan thường nhân giống chủ yếu bằng hình thức
sinh sản vô tính (nhân chồi) hoặc bằng hạt với hệ số nhân và khả năng này mầm rất
thấp [57]. Điều này đã góp phần làm cho nhiều loài lan đang đứng trước nguy cơ
tuyệt chủng.
Nhân giống in vitro bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem là

phương pháp hữu hiệu nhất trong việc nhân nhanh và bảo tồn nhiều loài lan quý
hiếm [4, 68, 78]. Đã có nhiều tác giả trong và ngoài nước nhân giống các loài lan
quý hiếm này bằng phương pháp nhân giống in vitro (Nguyễn Văn Song và cs,
(2011); Nguyễn Thị Sơn và cs, (2012); Vũ Ngọc Lan và cs, (2013); Luan và cs,
(2006)) [18, 10, 19, 55]. Năm 2014, tác giả Phạm Thị Thu và cs đã lần đầu tiên tiến
hành nghiên cứu sự nảy mầm in vitro và nhân nhanh protocorm loài lan Huyết
nhung trơn với hệ số nhân protocorm tương đối cao [27]. Tuy nhiên, những nghiên
cứu tiếp theo để hoàn thiện quy trình nhân giống loài lan này vẫn chưa đề cập đến.
Chính vì vậy, việc hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro loài lan Huyết nhung
trơn là rất cần thiết, từ đó có thể vừa bảo tồn được loài lan này không bị tuyệt
chủng, vừa cung cấp số lượng lớn cây lan cho thị trường tiêu thụ cây cảnh.


Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu hoàn
thiện quy trình nhân giống in vitro loài lan quý hiếm Huyết nhung trơn
(Renanthera imschootiana Rolfe)”.
2. Mục tiêu đề tài
2.1. Mục tiêu tổng quát
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống lan Huyết nhung trơn với hệ số
nhân giống cao, chất lượng cây giống tốt.
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Xác định được môi trường nuôi cấy dinh dưỡng phù hợp nhất cho các giai
đoạn:
+ Nhân nhanh protocorm
+ Tái tạo chồi từ protocorm
+ Kéo dài chồi in vitro
+ Tạo rễ in vitro hình thành cây hoàn chỉnh
- Xác định được giá thể để ra cây thích hợp.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về nhân
giống vô tính cây lan Huyết nhung trơn bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, góp
phần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về các kĩ thuật nuôi cấy của cây hoa lan.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ giúp chúng tôi đề xuất một quy trình nhân
giống cây lan Huyết nhung trơn bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào, góp phần sản
xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt, khắc phục được những hạn chế của
phương pháp nhân giống truyền thống. Ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần phục
tráng giống, góp phần bảo tồn và nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành sản xuất hoa
lan Huyết nhung trơn.

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. Sơ lược về cây hoa phong lan
Họ phong lan được đánh giá là một trong những loài hoa cao cấp trong
vương quốc thảo mộc, bao gồm 750 chi và hơn 25.000 loài khác nhau [8]. Lan là
loại cây thân thảo, thân leo sống lâu năm. Những loài sống chủ yếu trên môi trường
đất, có thân dạng củ, rễ chùm được gọi là địa lan, sống trên vách đá gọi là thạch lan,
sống trên thân cây tách khỏi mặt đất được gọi là phong lan cùng với những loài mới
được khám phá và mô tả theo từng năm. Họ phong lan có sự phân bố khá rộng lớn,
trải dài từ đường xích đạo cho đến Bắc Cực, từ đồng bằng cho đến các vùng núi
băng tuyết nên giữa các loài có sự khác biệt nhau [29].
Các loài lan có thể xếp thành hai nhóm: [25].
- Nhóm đa thân (polypodial) bao gồm các chi như Dendrobium, Cymbidium,
Cattleya… Cây đa thân gồm rất nhiều giả hành. Mỗi giả hành có một số lá bao che
và mang rễ ở đáy. Đáy lá to tạo thành bẹ bao quanh giả hành, ở nách lá của mỗi bẹ
lá có thể có chồi mà mỗi chồi có thể phát triển thành cành mang hoa (phát hoa) hay
tạo cơ quan dinh dưỡng mới (giả hành mới).

- Nhóm đơn thân (monopodial) bao gồm các chi như: Monkara, Vanda,
Aerides,… Thân luôn mọc cao về phía đỉnh.Sự mọc dài của đỉnh không giới hạn
nên cây chỉ có một thân phát triển vô hạn theo chiều thẳng đứng. Sự phát triển này
chỉ ngừng khi đỉnh ngọn bị tổn thương, lúc đó chồi bên sẽ xé rách bẹ lá để mọc dài
ra thành nhánh. Các nhánh này cũng phát triển vô hạn định về phía đỉnh. Có thân
cây lan cao với các lóng dài, lá mọc xa nhau (Vanda), có những cây lá khít nhau
hơn, thân ngắn lại (lan Đai châu, Hồ điệp).
Việt Nam với vị trí địa lý, địa hình đặc trưng của kiểu khí hậu nhiệt đới gió
mùa nên hoa lan rất phong phú và đa dạng. Mặc khác, sự tiếp nhận ba luồng thực
vật di cư vào từ ba hướng: từ phía Nam lên, từ Tây Bắc xuống, từ Tây Tây Nam đã
làm cho hoa lan Việt Nam phong phú, đa dạng thêm rất nhiều và được xem là nơi
tập trung nhiều lan đẹp trên thế giới.
1.2. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và Việt Nam
1.2.1. Trên thế giới


Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng.
Các nước có truyền thống sản xuất hoa lan như Anh, Pháp, Mỹ, Thái Lan, Đài
Loan..., hàng năm thu được hàng chục triệu đô la Mỹ từ nguồn xuất khẩu hoa lan.
Hoa lan đang là mặt hàng xuất khẩu quan trọng, mang lại nguồn lợi kinh tế cao cho
nhiều quốc gia, đặc biệt ở một số nước Châu Á.
Từ năm 1957, Thái Lan, Indonexia bắt đầu phát triển nuôi trồng lan quy mô
ngày càng lớn phục vụ cho xuất khẩu. Có thể nói Thái Lan là một nước điển hình
cho ngành nuôi trồng và xuất khẩu hoa lan ở các nước châu Á với sản phẩm chủ lực
là lan Dendrobium, đã cho doanh thu mỗi năm từ xuất khẩu gần 600 triệu USD [26].
Trong những thập niên cuối thế kỉ 20, ở châu Âu, lan trở thành một mặt hàng
thương mại, từ Anh sang Pháp… sau đó lan sang Mỹ. Nước có tốc độ phát triển lan
khá nhanh là Trung Quốc. Vào đầu thập kỷ 80, Trung Quốc bắt đầu nhập nội lan Hồ
Điệp. Năm 2002, sản lượng lan Hồ điệp của Trung Quốc là 3 triệu cây, bao gồm 50
- 60 xí nghiệp có quy mô lớn, trong đó Quảng Đông có hơn 10 công ty sản xuất 1,2

triệu cây (chiếm 40% sản lượng lan Hồ điệp của Trung Quốc). Hiện nay đối với các
nước châu Âu, hoa lan là cây trồng có giá trị kinh tế cao, với diện tích sản xuất chưa
đầy 500 ha lan Hồ điệp (Phalaenopsis), hàng năm Đài Loan đã thu về 35 triệu USD
từ xuất khẩu sản phẩm hoa này [15]. Ngày nay, thị trường xuất khẩu hoa lan trên thế
giới ngày càng mở rộng. Kim ngạch thương mại hoa lan cắt cành thế giới năm 2000
đạt 150 triệu, trong đó Nhật Bản là nước nhập khẩu hoa lan cắt cành số một thế
giới, thứ hai là Ý, tiếp theo là Pháp…[18].
1.2.2. Trong nước
Tại Việt Nam ngành sản xuất kinh doanh hoa kiểng nói chung và lan nói
riêng trong vòng 10 năm trở lại đây rất phát triển, với nhiều chủng loại. Tham gia
sản xuất gồm nhiều thành phần kinh tế (cá thể, tập thể, nhà nước, liên doanh hoặc
100% vốn đầu tư nước ngoài). Tuy nhiên sản xuất còn chưa được áp dụng khoa học
kỹ thuật nên ngành trồng hoa lan nói riêng vẫn chưa thực sự phát triển, sản xuất lan
ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh phía Nam, đặc biệt là thành phố
Đà Lạt và thành phố Hồ Chí Minh [3].
1.3. Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và Việt Nam
1.3.1. Trên thế giới


Ngày nay, nhờ kỹ thuật nhân giống hiện đại bằng phương pháp nuôi cấy mô
đã hỗ trợ cho phương pháp nhân giống cổ truyền theo kiểu tách chiết, nên đã nhân
được số lượng lớn lan giống cung cấp cho thị trường. Ban đầu Morel khám phá ra
phương pháp nuôi cấy mô thành công là loài lan đa thân. Năm 1970, N.Vajrabhaya
và T.Vajrabhaya đã cấy mô thành công loài lan đơn thân. Năm 1974, các nhà khoa
học đã cấy mô thành công hầu hết các loại lan thuộc nhóm đơn thân khác và cũng
nhờ có phương pháp nuôi cấy mô tế bào, các cây lan đã chọn lọc từ phương pháp lai
hữu tính được nhân rất nhanh có thể đáp ứng nhu cầu sản xuất, kinh doanh. Để đạt
được thành công đó thì trong nuôi cấy mô, môi trường có vai trò rất quan trọng
trong quá trình nuôi cấy, nó cung cấp chất dinh dưỡng đảm bảo cho sự sinh trưởng
và phát triển của mô. Và nghiên cứu cho thấy, môi trường dinh dưỡng thích hợp cho

việc nuôi cây là môi trường MS (Marushige - Shoog, 1962), VW (Vacine – went,
1949), KC (Knudsonc)…[14].
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về lan bằng phương pháp nhân
giống in vitro, những kết quả của các công trình nghiên cứu góp phần rất lớn vào
việc bảo tồn cũng như nhân nhanh nhiều loài lan quý hiếm. Vào năm 2000,
Sheelavantmath và cs (2000) đã thành công trong việc nghiên cứu nhân giống in
vitro loài lan Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr - một loài lan quý hiếm.
Những năm tiếp theo, H.N.Murthy và cs (2005) đã nhân giống in vitro loài lan
Aerides crispum – một loài lan quý hiếm ở Ấn Độ. Năm 2010, Basker và cs đã
nghiên cứu nhân giống loài lan hiếm Epiphytic [37]. Cũng trong năm đó, Chyuam Yih Ng và cs đã nhân giống một loài lan có nguy cơ tuyệt chủng Paphiopedilum
rothschildianum ở núi Kinabalu, Sabah Malaysia [41]. Sana Asghar và cs (2011) đã
nghiên cứu nhân giống cây phong lan Dendrobilum Nobile var. Emma trắng [34].
Trong một tạp chí của Ấn Độ cũng nói về bài nghiên cứu của Sharma U., Rama Rao
V., Mohan JSS và Reddy AS., nhân giống in vitro cây phong lan quý Dendrobilum
microbuibon A.Rich có tác dụng làm thuốc chữa đau bụng, dạ dày [70].

1.3.2. Ở Việt Nam
1.3.2.1. Nghiên cứu về thu nhập, chọn tạo và đánh giá nguồn gen


Việt Nam là nước có khí hậu gió mùa nóng ẩm, được thiên nhiên ưu đãi vì
khắp vùng rừng núi từ Nam chí Bắc, từ đồng bằng đến tận cao nguyên, nhiều vùng
nổi tiếng có nhiều giống lan quý hiếm được thế giới công nhận. Chính vì vậy đã có
những nghiên cứu về lan ở Việt Nam rất sớm. Nhà truyền giáo người Bồ Đào Nha,
đã mô tả cây lan ở Việt Nam lần đầu tiên vào năm 1789, trong cuốn “Flora cohin
chinensis” và sau này đã được Bentham và Hooker ghi lại trong cuốn “Genera
Planterum” (1862 - 1883) [9].
Bên cạnh đó cũng có 1 số nhà khoa học Việt Nam cũng có bước đầu nghiên
cứu về lan như: GS. Phạm Hoàng Hộ với 289 loại được mô tả và vẽ hình trong cuốn
“Cây cỏ Việt Nam” [5]. Năm 1996 - 1997, Nguyễn Xuân Linh và tập thể cán bộ

trung tâm hoa cây cảnh viện di truyền Nông Nghiệp đã thu thập được 88 loài hoa
lan thuộc 34 chi, trong 88 loài có 30 loài có khả năng nở hoa tại Hà Nội. Chúng
được xem là nguồn gen quý cho công tác lai tạo giống sau này [12]. Nguyễn Xuân
Linh và cs (2001) khi đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của một số giống
phong lan Hồ điệp nhập từ Hà Lan đã đi đến kết luận: Các giống lan Hồ điệp nhập
nội đều có khả năng sinh trưởng, phát triển và cho ra tỉ lệ hoa tốt hơn các giống có
nguồn gốc từ hạt [11].
1.3.2.2. Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro hoa lan
Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong
những kĩ thuật nhân giống được áp dụng phổ biến ở Việt Nam trong những năm
qua. Việc nghiên cứu áp dụng công nghệ này đã mở ra một bước mới về cải tiến
giống cây trồng và nhân giống vô tính. Nó còn là phương tiện cho các nhà chọn
giống rút ngắn giai đoạn chọn lọc. Hiện nay, việc nhân giống bằng phương pháp
này đang tiếp tục mở rộng và nghiên cứu trên nhiều đối tượng thực vật. Theo
nghiên cứu của Nguyễn Văn Song (2011), đã nghiên cứu nhân giống bằng kĩ thuật
in vitro ở loài lan Kim điệp (Dendrobium chrysotoxum) - một loài lan rừng có nguy
cơ bị tuyệt chủng [18]. Hoàng Thị Giang và cs (2010) đã nghiên cứu nhân giống in
vitro và nuôi trồng giống lan Hài quý Paphiopedilum hangianum perner Gurss (Hài
hằng) thu nhập ở Việt Nam [2]. Vào năm tiếp theo (2012), Nguyễn Thị Sơn và cs đã
nhân giống in vitro loài lan Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium fimbriatum Hook.)
là loài lan đẹp được sử dụng làm cảnh và làm thuốc, đang đe dọa tuyệt chủng [19].


Nguyễn Thị Pha và cs năm 2011, tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hồ
điệp từ mầm ngủ phát hoa không qua giai đoạn tạo mô sẹo [16]. Nguyễn Quang
Thạch và cs (2005) đã thiết lập quy trình nhân giống in vitro lan Hồ điệp
Phalaenopsis [23].
1.4. Một số vấn đề cơ bản trong nghiên cứu nhân giống in vitro
1.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro hoa lan
1.4.1.1. Môi trường nuôi cấy

Thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo mỗi loài cây,
bộ phận nuôi cấy, thậm chí mỗi kiểu gen và mục đích nuôi cấy (nuôi cấy mô sẹo,
huyền phù tế bào, tế bào trần, bao phấn, hạt phấn). Các môi trường khoáng cơ bản
thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là MS (1962), B5 (1968), SH
(1972) hoặc White (1963) [13]. Môi trường được sử dụng nhiều để nuôi cấy hoa lan
là VW (1949) và KC (1946).
Theo Morel (1960), môi trường KC (1946) rất tốt để nuôi cấy hầu hết các
loài lan [31]. Tuy nhiên hiện nay môi trường cơ bản MS (1962) được xem là môi
trường có hàm lượng và thành phần các muối khoáng phong phú hơn cả. Vì thế hầu
hết các thí nghiệm nuôi cấy mô đều được thực hiện trên môi trường này. Trong nuôi
cấy mô, tế bào thực vật, đường được xem là nguồn cung cấp carbon quan trọng giúp
các tế bào phân chia, tăng trưởng sinh khối. Hai dạng thường được sử dụng nhất là
saccharose và glucose, nhưng saccharose phổ biến hơn. Saccharose là cacbonhydrate
phổ biến nhất trong vỏ cây và nhựa cây tham gia trong việc kiểm soát quá trình phát
triển [39, 45].
Bên cạnh đó, nhiều dung dịch hữu cơ phức tạp có thành phần không xác định
như CW, dịch chiết được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sự sinh
trưởng và phát triển của mô cấy. Trong CW có chứa cytokinin, myo - inositol và các
hợp chất có hoạt tính auxin có hiệu quả tốt đối với sự phát triển của mô nuôi cấy.
CW thường được bổ sung vào môi trường từ 10 - 25% để giúp cho quá trình kích
thích tạo callus và protocorm. Ngoài ra, CW còn có khả năng giảm bớt sự tiết hợp
chất phenol của mẫu cấy [38].
1.4.1.2. Điều kiện nuôi cấy


Để tăng hiệu quả của kỹ thuật nuôi cấy in vitro, ngoài thành phần môi trường
thì điều kiện nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ, pH cũng phải được tối ưu hóa.
-

Ánh sáng: Chất lượng ánh sáng (chất lượng quang phổ), số lượng (photon thông

lượng) và thời gian chiếu sáng có ảnh hưởng sâu sắc đến sự phát triển và phát sinh
hình thái của các mô nuôi cấy [44, 72]. Nhìn chung, đèn huỳnh quang là nguồn ánh
sáng chính cho việc duy trì nuôi cấy mô [44]. Ánh sáng phải được sử dụng liên tục
với quang chu kỳ là 16 giờ, 18 giờ hoặc 24 giờ tùy loài [14]. Nhiều nghiên cứu cho
thấy ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hình thái cây nuôi cấy mô.
Trong giai đoạn tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần
1000 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần nhiều ánh sáng, cường độ ánh sáng
cao từ 3000 – 10.000 lux để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự
dưỡng [1].

-

Nhiệt độ: Là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình
trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của
auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây con được nuôi cấy. Nhiệt độ
thích hợp để nuôi cấy các loài hoa lan khác nhau thường không giống nhau. Ở các
loài lan đa thân, nhiệt độ thích hợp là 22 ± 10C hoặc 26 ± 30C đối với lan đơn thân
[52].

-

Độ pH: pH của môi trường là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng đến sự phát sinh
hình thái của mẫu nuôi cấy tại các giai đoạn khác nhau. Sự ổn định pH của môi
trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. Giá trị của pH trong môi trường
thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thực vật biến đổi từ 5,5 – 6,0
[14, 35].
1.4.1.3. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Chất điều hòa sinh trưởng của thực vật được chú ý vào năm 1928 khi Went
phát hiện vai trò của auxin lên khả năng phát triển tế bào của lúa mạch, đã mở đầu
cho việc phát hiện, ứng dụng chất điều hòa sinh trưởng của thực vật vào nuôi cấy

mô [28].
Việc bổ sung một hoặc nhiều chất ĐHST như auxin, cytokinin,… là rất cần
thiết để kích thích sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan, cung cấp sức sống


tốt cho mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu của những chất này thay đổi theo từng
loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất ĐHST nội sinh của chúng [4].
- Nhóm auxin
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là IAA. IAA có tác dụng
ĐHST kéo dài tế bào, điều khiển sự hình thành rễ. NAA và 2,4-D cũng đóng vai trò
quan trọng trong sự phân chia mô và trong quá trình tạo rễ. IAA kích thích sự ra rễ
và kìm hãm sự phát triển callus. Ngược lại, 2,4-D kích thích sự hình thành callus và
kìm hãm sự hình thành rễ trong môi trường nuôi cấy tại nồng độ cao. Mặc dù cùng
nhóm chất auxin nhưng hai chất này lại có tính chất đối kháng. NAA được Went và
Thimann (1937) tìm ra. Chất này có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô
nuôi cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nito, tăng
khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy [30].
- Nhóm cytokinin
Cytokinin là chất ĐHST có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào. Các
cytokinin thường gặp là BA, KIN. KIN được Shoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi
chiết xuất axit nucleic. KIN là dẫn xuất của base nito adenin, BA là cytokinin tổng
hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn KIN. BA và KIN có tác dụng kích thích
phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế
sự già hóa của tế bào [59].
Nếu tỉ lệ Auxin/Cytokinin thấp thì sẽ kích thích thành lập chồi, ngược lại thì
sẽ hình thành rễ, còn nếu ở một mức độ cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển mô
sẹo. Vì vậy chúng ta có thể sử dụng Cytokinin kết hợp với Auxin theo một tỉ lệ nào
đó để thu được các sản phẩm như mong muốn [22].
1.4.2. Các con đường nhân giống in vitro các loài lan
1.4.2.1. Nhân giống từ hạt

Hiện nay, một số loài lan quý hiếm bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên đã
được bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm từ hạt [50]. Với công nghệ nhân giống in
vitro hiện nay hệ số nhân giống từ một trái lan là một số rất lớn, từ vài ngàn đến một
triệu cây con [13].
Trong thời gian qua, đã có một số tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu
nhân giống bằng hạt ở các loài lan khác nhau. Năm 1922 Knudson ở Mỹ, thành


công trong việc thay thế nấm bằng môi trường thạch để gieo hạt. Knudson nhận
thấy rằng với các chai cấy có chứa thạch và muối khoáng thích hợp thì sự nảy mầm
của lan là rất lớn. Gieo hạt in vitro có thể làm cho các hạt chưa chín nảy mầm và
việc khử trùng cả quả dễ dàng hơn. Khi quả đã chín 2/3 có thể khử trùng quả bằng
thuốc tẩy và cồn. Sau đó dùng dao tách vỏ và hạt rồi tiến hành cấy lên trên môi
trường thích hợp trong điều kiên vô trùng. Sau khi hạt nảy mầm từ 30 - 60 ngày thì
chuyển sang môi trường mới [52].
Park và cs (2000) đã gieo Calanthe sieboldii vào một trong ba môi trường:
MS; MSH (tức là các muối vô cơ của MS cộng với các yếu tố hữu cơ của Schenk và
Hildebrandt); Hyponex. Kết quả thu được sự nảy mầm và protocorm phát triển trên
môi trường MS và MSH trong vòng 8 tuần, nhưng phần trăm nảy mầm thấp. Việc
bổ sung các putrescine (1,0 mg/L) hoặc adenine sulfate (25 mg/L) vào môi trường
MSH đã tăng cường sự nảy mầm. Protocorm được cấy chuyền trên môi trường bổ
sung Hyponex đã phát triển thành cây con sau 12 tuần nuôi cấy. Sau đó, cây con
được chuyển ra trồng ngoài tự nhiên [64].
Shiau và cs (2002) nghiên cứu nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus
formosanus) một loài thảo dược truyền thống tại Đài Loan, Trung Quốc… Hạt được
nảy mầm trên môi trường MS bổ sung 0,2% AC và 8% bột chuối. Hạt giống nảy
mầm được nhân nhanh chồi trong môi trường nuôi cấy ½ MS bổ sung 2,0 mg/L BA.
Cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,2% AC; 8% bột chuối; 2,0 mg/L BA và
0,5 mg/L NAA để tạo rễ. Kết quả khoảng 90% cây giống sống sót khi chuyển sang
trồng với giá thể dớn [71].

Nghiên cứu của Bhadra và Hossain (2003) khi nuôi cấy hạt giống
Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr. trên môi trường MS 0,8% agar và PM thì sau
45 – 60 ngày, hạt nảy mầm và phát triển trực tiếp thành cây con trên môi trường MS
Geodorum densiflorum đã được nhân giống in vitro [39].
Vào năm 2006, Luan và cs, đã nuôi cấy hạt một số loài Dendrobium sp.
Dactylorhiza fuchsia, tỉ lệ hạt nảy mầm cao đạt được trên các môi trường: ½ MS
chứa 0,5 mg/L NAA, 20% CW và 3% saccharose; MS có 20% CW, 0,1 % AC và
3% saccharose; môi trường Hyponex chứa vitamin, 30% dịch chiết cà chua, 0,1 %


AC và 3% saccharose; môi trường VW có 0,5 mg/L BA, 0,5 mg/L NAA, 15% CW,
1,0 % AC và 3% saccharose [55].
Năm 2008, Taniguchi và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro lan
Cypripedium macranthos Var. rebunense - một loài hoa có nguy cơ tuyệt chủng tại
Nhật Bản. Hạt từ quả lan đã nảy mầm trên môi trường và môi trường MS bổ sung
3% sucose. Sau đó protocorm được cấy chuyển sang môi trường MS cơ bản để tạo
cây hoàn chỉnh. Sau 7 năm, cây in vitro hoàn chỉnh đã ra hoa [73]. Pinaki Sinha và
Shyamal K. Roy (2008) nghiên cứu nhân giống lan Vanda teres (Roxb.) thông qua
tạo protocorm từ hạt lan đã được khử trùng. Hạt lan nảy mầm trong vòng 40 - 45
ngày trong môi trường Vacin và Went với 1,0 mg/L BAP + 0,5 mg/L NAA + 2,0%
sucrose + 2 g/L peptone. Chồi tái sinh tốt nhất từ protocorm đã được tìm thấy trên
cùng một môi trường có bổ sung 10% nước dừa. Các cây con tiếp tục phát triển trên
môi trường 2 g bột/L chuối + 100 mg/L casein thủy phân đã được thêm vào. Cây
con giống hệt nhau với chồi mập và rễ được thu được trên môi trường ½ MS, không
có bổ sung chất kích thích sinh trưởng [69]. Tawaro và cs (2008) đã nghiên cứu
nhân nhanh loài Cymbidium findlaysonianum Lindl. từ hạt giống. Hạt nảy mầm tốt
nhất trên môi trường VW có bổ sung 15% CW; 5% bột chuối; 5% bột khoai tây;
0,2% AC và 20 g/L saccharose. Số lượng protocorm tăng 4 lần khi được nuôi cấy
trên môi trường VW bổ sung 15% CW và 20 g/L saccharose. Các cây con được tiếp
tục phát triển trên môi trường VW bổ sung 15% CW, 5% bột chuối và 5% bột khoai

tây trong vòng 3 tháng [74].
Cũng trong năm 2008, Hossain đã nuôi cấy hạt lan Epidendrum ibaguense
trên môi trường M và PM có bổ sung 2,0 g/L peptone với tỉ lệ nảy mầm khoảng
90%. Hệ thống rễ in vitro phát triển mạnh mẽ trong môi trường ½ PM và M có bổ
sung 0,5 - 1,0 mg/L IAA. Cây in vitro được chuyển ra trồng ở nhà kính có tỉ lệ sống
sót đạt 90% [48].
Nguyễn Thanh Tùng và Trương Thị Bích Phượng (2010), đã nhân giống
thành công cây lan Hoàng thảo thân gãy. Nguyên liệu được sử dụng cho việc nuôi
cấy là hạt lan còn nằm trong vỏ sau ba đến bốn tháng thụ phấn. Sau khi hạt được
khử trùng cấy lên môi trường cơ bản có BA, KIN hay NAA để thăm dò khả năng
nảy mầm. Sau đó là quá trình nhân nhanh chồi và thể chồi, tạo rễ rồi chuyển cây


con in vitro hoàn chỉnh ra khỏi phòng nuôi để huấn luyện thích nghi với điều kiện
bên ngoài. Cây con được trồng trên giá thể rêu nước và dương xỉ ở chế độ ánh sáng
50% và tưới phun sương trong quá trình sinh trưởng. Sau một tháng trồng ở vườn
ươm, tỉ lệ sống đạt tới gần 91% [20].
Nguyễn Văn Song và cs (2011), đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro lan Kim
điệp (Dendrobium chrysotoxum). Nguyên liệu sử dụng là hạt của quả lan 3 tháng
tuổi. Môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS bổ
sung 20 g/L saccharose; 8 g/L agar; 15% CW và 2,0 mg/L BA. Môi trường nhân
nhanh protocorm tốt nhất là MS bổ sung 20 g/L saccharose; 8 g/L agar, 15% CW và
2,0 mg/L BA. Môi trường MS bổ sung 30 g/L saccharose; 8 g/L agar; 1,0 g/L AC;
15% CW; 2,0 mg/L BA và 1,0 mg/L NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ
protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro [18]. Nghiên cứu của Hoàng Thị Giang
và cs (2011) trên cây lan Hài hằng (Paphiopedilum hangianum) cho thấy môi
trường RE thích hợp cho hạt nảy mầm (58 - 67%). Môi trường nhân nhanh
protocorm là môi trường RE có bổ sung 15% CW và 100 g/L chuối cho hệ số nhân
cao nhất (4,3 lần). Môi trường này cũng rất có hiệu quả để tạo chồi. Bổ sung 0,4 0,6 mg/L NAA vào môi trường cho khả năng ra rễ tốt nhất. Các kết quả thí nghiệm
ngoài nhà kính cho thấy: cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm cao 3 - 4 cm, có từ 3 - 4

lá, 4 - 5 rễ; trồng trên giá thể dớn; chế độ dinh dưỡng NPK (30:10:10) với lượng
bón là 1,0 g/L và chế độ phun 2 lần/tuần [2].
Năm 2012, Nguyễn Thị Sơn và cs tiến hành nghiên cứu trên đối tượng lan
Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium fimbriatum Hook.). Đây là loài lan đẹp được sử
dụng làm cảnh và làm thuốc, và đang bị đe dọa tuyệt chủng. Việc nhân giống in
vitro với mục đích bảo tồn và phát triển nguồn gen loài lan quý. Kết quả nghiên cứu
đã chỉ rõ: Nguyên liệu sử dụng là quả lan 3 tháng tuổi, môi trường thích hợp cho
nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi trường MS + 100 ml ND + 10g
saccharoza + 6,0g agar/lít môi trường. Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là
môi trường KC + 100 ml ND + 10g sacaroza + 60g khoai tây + 6,0g agar/lít môi
trường. Môi trường MS + 100 ml ND + 20g sacaroza + 60g chuối chín + 6,0g
agar/lít môi trường là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in vitro. Môi trường tạo
cây hoàn chỉnh là RE + 10 g sacaroza + 1,0 g THT + 6,0g agar/lít môi trường [19].


Năm 2013, Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh đã tiến hành nghiên cứu trên
loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl). Nguyên liệu sử dụng là quả lan 5 tháng
tuổi thu thập tại Hòa Bình, đang được nuôi trồng tại Viện Sinh học Nông nghiệp,
trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội. Quả lan được khử trùng tối ưu là nhúng quả trong
cồn 96% rồi đốt trên ngọn lửa đèn cồn. Môi trường gieo hạt thích hợp là: MS + 100
ml nước dừa + 10g sucrose + 6,0g agar môi trường. Nhân nhanh in vitro bằng nuôi
cấy mô kinh điển: Môi trường nhân nhanh protocorm tối ưu là KC + (100ml nước
dừa + 10g saccaroza + 6g agar) / lít; HSN 4,2 lần/8 tuần nuôi cấy. Môi trường nhân
nhanh cụm chồi tốt nhất là MS + (100 ml ND+10g saccharose + 6g agar) / lít, HSN
chồi 3,08 lần/8 tuần nuôi cấy [10].
1.4.2.2. Nhân giống in vitro từ các cơ quan của cây lan
Trịnh Cẩm Tú và Bùi Trang Việt (2006), đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro
để nghiên cứu sự phát triển của phát hoa Dendrobium Sonia. Mô phân sinh hoa tự là
vị trí phát sinh cơ quan liên tục với một vùng nhỏ các tế bào gốc đa năng. Đời sống
và hoạt động của mô phân sinh hoa tự liên quan đến số nụ hoa trên phát hoa được

quan sát bằng cách sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh hoa tự trên môi trường
Ma (Chatelet 1992) có bổ sung zeatin 1,0 mg/L, 0,5 mg/L IAA và 1,0 mg/L GA 3.
Trên môi trường này, mô phân sinh hoa tự có thể kéo dài đời sống tới trên 8 tuần
đồng thời vẫn tiếp tục duy trì hoạt động tạo mới các mô phân sinh hoa. Với 5,0
mg/L BA, mô phân sinh hoa tự phát hoa tạo cụm chồi dinh dưỡng thay vì tiếp tục
phát hoa [21].
Kalimuthu và cs (2006) đã thành công trong sử dụng đỉnh chồi và đốt thân
của Vanilla planifolia để nhân chồi và tạo rễ trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L
BA và 15 % CW [49].
Phùng Văn Phê và cs (2010), đã nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro loài lan
Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii Wall. Lindl.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
Môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi lan Kim tuyến in vitro là Knud*. Thể
chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2 - 3 cm là phù hợp nhất
để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud * bổ sung 0,5 mg/L BA + 0,3 mg/L
KIN + 0,3 mg/L NAA + 10% CW + 100 g/L dịch chiết khoai tây + 2% saccharose +
0,7 % agar + 0,05% AC [17].


Năm 2012, Nguyễn Quang Thạch, Phí Thị Cẩm Miện đã tiến hành nghiên
cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Cơ
quan vào mẫu phù hợp nhất là thể chồi và mắt đốt ngang thân được khử trùng và
đưa vào các môi trường nền khác nhau (MS, Knud, Knudson). Tiếp đó, các chồi và
mắt đốt được chuyển sang môi trường nền thích hợp có bổ sung BA, KIN, αNAA
trong 4 tuần. Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang
thân là Knud* + 0,5 mg/L BAP + 0,3 mg/L KIN + 0,3 mg/L αNAA + 20 g/L
sucrose + 0,5 g/L than hoạt tính + 7g agar/L cho hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/mẫu.
Các chồi có chiều cao từ 3 - 4 cm được sử dụng để ra rễ in vitro. Tỉ lệ ra rễ là 100%
và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trường có bổ sung 1,0 mg/L
αNAA [24]. Cũng trong năm 2012, Nguyễn Thanh Tùng và cs đã áp dụng nuôi cấy
lát mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây lan Hoàng thảo thân gãy (Dendrobium

aduncum) – một loài lan rừng có giá trị của Việt Nam. Nguyên liệu ban đầu là lát
cắt mỏng đoạn thân theo chiều ngang (tTCL - traverse thin cell layer) của chồi in
vitro. Các tTCL được cảm ứng tạo protocorm - like bodies (PLB) trên môi trường
cơ bản ½ MS có bổ sung riêng lẻ BAP hay bổ sung kết hợp BAP và NAA. Môi
trường tối ưu cảm ứng protocorm - like bodies là môi trường ½ MS bổ sung 0,5
mg/L BAP cho 29,85 protocorm - like bodies/lát mỏng sau 8 tuần nuôi cấy. Cụm
protocorm - like bodies được cấy lên môi trường MS có bổ sung TDZ, kinetin,
NAA riêng lẻ hay kết hợp để tái sinh chồi. Môi trường MS bổ sung kinetin 3,0 mg/L
kết hợp với NAA 0,3 mg/L cho tỉ lệ tái sinh chồi cao nhất đạt 5,67 chồi/mẫu. Chồi
in vitro được cấy lên môi trường MS bổ sung NAA để cảm ứng tạo rễ. Nồng độ
NAA 2,0 mg/L là thích hợp nhất cho việc tạo rễ in vitro với kết quả 9,18 rễ/chồi.
Cây con in vitro tái sinh đầy đủ được huấn luyện và trồng lên giá thể, sau 6 tuần tỉ lệ
sống đạt 90% [20].
Đối với nhiều loài lan hiếm và giá trị thì lá là nguồn mẫu thích hợp cho nhân
giống, vì số lượng nhiều và có thể giữ được cây mẹ. Năm 2010, Sungkumlong và
Chitta nghiên cứu thành công khả năng tái sinh của 2 loài lan Coelogyne
Suaveolens và Taenia Latifolia thông qua nuôi cấy mô lá. Nghiên cứu chỉ ra rằng,
đối với lan Coelogyne suaveolens khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 3%
saccharose, 0,1% AC và sự phối hợp của 6 μM NAA và 9 μM BA cho khả năng tái


sinh cao, chồi cảm ứng hình thành và phát triển tốt (73%). Khoảng 75% các phần
của mô lá loài lan T. latifolia cảm ứng tốt và hình thành 5 chồi trong vòng 5 tuần
trên môi trường MS bổ sung 3% saccharose, 0,1 % AC và sự phối hợp của 3 μM
IAA và 6 μM BA [42].
Năm 2011, Niknejad A. và cs tiến hành nghiên cứu tái sinh in vitro từ
protocorm mô sẹo của Phalaenopsis gigantea thông qua mô lá. Phần lá từ in
vitro cây non được nuôi cấy trên môi trường New Dogashima (NDM) có bổ sung
cytokinin (6 -Benzylaminopurine (BAP), Thidiazuron (TDZ), và Kinetin (KIN) với
nồng độ 0,01; 0,1; 0,5 và 1,0 mg/L riêng lẻ và kết hợp với NAA (auxin anaphthaleneacetic axit) với nồng độ 0,01; 0,1; 0,5 và 1,0 mg/L. Đánh giá khả năng

nhân nhanh mô sẹo và protocorm – like - bodies (PLBs) trong vòng 6 - 8 tuần nuôi
cấy. Môi trường cảm ứng tối ưu nhất là 0,1 mg/L TDZ kết hợp với 1,0 mg/L NAA
[60].
Năm 2013, Devi HS. và cs, nghiên cứu tái sinh lan Aerides odorata Lour. từ
mẫu lá và cho thấy phản ứng đáng kể trong môi trường ½ MS vừa bổ sung
thidiazuron (TDZ) và 6 - benzylaminopurine (BAP). Callus được hình thành sau 60
ngày nuôi cấy trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L TDZ. Mô sẹo được hình thành chỉ
trong môi trường có chứa axit acetic α - naphthalene (NAA). Tần số mô sẹo cao
nhất trong môi trường có chứa 2,0 mg/L (NAA), (85,71 ± 0,21). Chồi tái sinh có số
lượng cao nhất ở môi trường có nồng độ cao hơn của NAA (2,0 mg/L) và BAP (4,0
mg/L) (4,80 ± 0,18). Qua đó cho thấy ảnh hưởng kết hợp của cytokinin khi có sự
kết hợp với auxin. Các chồi tiếp tục cấy lên môi trường ra rễ, bổ sung NAA (0,5
mg/L) và ½ MS, cho thấy tỉ lệ cảm ứng rễ cao nhất. Hơn 95% các cây con sống sót
trong điều kiện ex in vitro [43].
Trong năm vừa qua, việc nhân giống các loài lan dược liệu quý được đẩy
mạnh nghiên cứu trên các đối tượng thuộc chi Dendrobium, Cymbidium,
Rhynchostylis, Aerides… Pant và cs (2012) đã nghiên cứu nhân nhanh loài
Dendrobium primulinum Lindl bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Mẫu cấy bật chồi
sớm và sinh trưởng nhanh trên môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L BA với giá trị
trung bình 4,5 chồi/mẫu. Môi trường nhân nhanh chồi là MS bổ sung 1,5 mg/L BA
và 0,5 mg/L NAA. Môi trường tạo rễ tốt nhất là MS bổ sung 0,5 mg/L IAA. Gần


70% cây con sống sót khi đem trồng thử nghiệm với giá thể xơ dừa, dớn theo tỉ lệ
2:1 [70].
1.5. Giới thiệu về lan Huyết nhung trơn
1.5.1. Đặc điểm hình thái
Huyết nhung trơn là loài sống phụ. Cây thuộc nhóm đơn thân không có giả
hành, mọc thẳng đứng dài 50 – 60 cm, thân cây to 5,0 mm với nhiều rễ dài và thòng
làm nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng, quang hợp. Lá có hình thuôn và phân thùy, dài 5

- 11 cm, rộng 1,5 cm, hẹp, màu lục đậm, đầu có 2 thùy không bằng nhau. Phát hoa
nằm ngang, phân nhánh, mang nhiều hoa mọc song song với lá và thẳng gốc với rễ.
Hoa to 4 cm, không thơm, có màu đỏ đậm, cánh hoa cạnh cao bằng nửa lá đài ở
giữa, vàng cam, có đốm đỏ, lá đài cạnh to nhất. Hoa thường nở vào mùa nắng,
nhiều nhất vào tháng 2, tháng 3 [5, 6]. Có 12 chủng rải rác từ miền Trung Quốc
xuống đến Đông Dương, Thái Lan, Malaysia, Philippinesis. Phân nửa chúng được
thuần dưỡng phổ biến như Ren.coccinea, Ren.monichica, Ren.imschootiana,
Ren.Philippinnesis và Ren.clongata [7].
1.5.2. Phân bố
Trên thế giới Huyết nhung trơn phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam,
New Guinea, Malaysia, Indonesia, Philippines và quần đảo Solomon [77, 78, 79]. Ở
Việt Nam, Huyết nhung trơn được phân bố chủ yếu ở Nam và Trung Nam Bộ, các
vườn quốc gia như Kon Ka Kinh, Lâm Đồng, Đồng Nai [54].
1.5.3. Thực trạng
Huyết nhung trơn là loài lan quý hiếm đang bị đe dọa và nằm trong sách đỏ
IUCN, cũng như trong Sách đỏ thực vật của Ấn Độ, Huyết nhung trơn nổi tiếng với
những đặc điểm trang trí độc đáo của nó [66]. Chính vì vậy, phương thức nảy mầm
hạt lan in vitro cũng là một phần quan trọng của chương trình bảo tồn và nhân giống
các loài lan hiếm, cung cấp cây con cho rừng cho chương trình phục hồi rừng tái
sinh [58].
1.5.4. Một số nghiên cứu liên quan
Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana Rolfe) là một loài lan quý hiếm
đang bị đe dọa do khai thác quá mức và mất môi trường sống phù hợp. Vì vây, việc
bảo tồn và nhân giống thông qua phương pháp nuôi cấy mô là rất cần thiết. Hiện
nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về loài lan này.


Theo Seeni S. và cs (1922), nghiên cứu sự tái sinh từ lá của loài lan có nguy
cơ tuyệt chủng này. Chồi lan Huyết nhung trơn được nuôi cấy trên môi trường bổ
sung 2% sucrose, 2 g/L peptone, 44,4 mM benzyladenine (BA) và 10,7 axit mM

naphthaleneacetic (NAA) thì tỉ lệ phát sinh đạt 10 chồi/protocorm. Khi cấy truyền
lên môi trường có bổ sung thêm 10% nước dừa và 35 g/L bột chuối chín thì có ảnh
hưởng tích cực đến khả năng tạo chồi, số lượng chồi trung bình cao nhất đạt 40
chồi/protocorm trong 12 tuần. Các chồi tiếp tục cấy lên môi trường ra rễ, bổ sung
4,4 mM BA, 10.7 mM NAA và 1% than hoạt tính cho thấy tỉ lệ cảm ứng rễ cao nhất
[68].
Kunlin Wu và cs (2014), đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài này từ hạt.
Hạt giống sau 150 ngày thụ phấn là giai đoạn tối ưu cho nuôi cấy in vitro. Hạt nảy
mầm đạt 93,1% trên MS cơ bản, có bổ sung 0,5 mg/L α - naphthaleneacetic acid
(NAA), 20% nước dừa (CW), 1,0 g/L peptone, 10 g/L sucrose và 1,0g/L than hoạt
tính (AC). Trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 1,0 mg/L BA, 0,5 mg/L NAA,
1,0 mg/L peptone, 10 g/L sucrose và 20% CW là thích hợp cho nhân nhanh
protocorm - like – bodies (PLBs ). Trong đó tỉ lệ tăng sinh PLB là 2,88. Trên môi
trường MS cơ bản có chứa 1,0 mg/L NAA, 1,0 mg/L peptone, 100 g/L chuối đồng
chất (BH), và 1,0 g/L AC là thích hợp cho sự hình thành cây non và 95,67% của cây
con phát triển từ PLBs trong vòng 60 ngày nuôi cấy. Môi trường MS cơ bản có 0,5
mg/L NAA, 1,0 g/L peptone, 20 g/L sucrose, 150 g/L BH, và 1,0 g/L AC là thích
hợp cho sự phát triển in vitro của cây con, cây con cao khoảng 2,0 cm. Khi đưa cây
huấn luyện ngoài nhà kính thì 95% cây con sống sót sau 60 ngày [78].
Tại Việt Nam, công trình nghiên cứu của Phạm Thị Thu và cs (2014) cũng
tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro lan Huyết nhung trơn. Nguyên liệu sử
dụng là hạt lan có đường kính 2,0 cm, dài khoảng 8,0 cm. Khử trùng bằng dung
dịch HgCl2 1%, (NaOCl) 5% trong thời gian 15 phút cho hiệu quả khử trùng tốt
nhất. Tỉ lệ mẫu sống sót đạt 81,25 %. Trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,8%
agar; bổ sung 2,0 mg/L KIN là môi trường thích hợp nhất để tạo thành thể
protocorm của hạt sau khi nảy mầm. Môi trường MS cơ bản có 2,0 mg/L KIN kết
hợp 0,75 mg/L NAA là môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh protocorm của lan
Huyết nhung trơn [27].

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và nguyên liệu
Đối tượng nghiên cứu là loài lan Huyết nhung trơn hay còn gọi là lan
Phượng vĩ, có tên khoa học là Renanthera imschootiana Rolfe, họ Orchidaceae và
thuộc chi Renanthera (hình 2.1). Nguyên liệu được sử dụng để nghiên cứu là thể
protocorm có kích thước xấp xỉ 4 – 5 mm (hình 2.2).



Hình 2.1. Hoa lan Huyết nhung trơn
ngoài tự nhiên
2.2. Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.2. Thể protocorm xấp xỉ
4 - 5 mm. Thanh tỉ lệ: 0,5