Góp phần nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống hoa đồng tiền bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro

Trêng §¹i Häc Vinh
Khoa Sinh Häc

Góp phần hoàn tiện quy trình nhân nhanh
giống hoa đồng tiền gerber gerbera bằng công

nghƯ nu«i cÊy m« invitro

Luận văn tốt nghiệp đại học
Ngµnh cử nhân s phạm sinh học

Ngời thực hiện: Trần Nữ Thanh Xuân

Ngêi híng dÉn: Th.S Mai Văn Chung

Vinh , 2006

Lời cảm ơn

Để hoàn thành đề tài này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi xin chân
thành cảm ơn sự chỉ bảo, giúp đỡ tận tình của Thầy giáo, Th.S Mai Văn
Chung, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào, những ý kiến đóng góp quý báu của
các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Sinh lý- Sinh hoá thực vật, sự tạo điều
kiện và ủng hộ của khoa, của các cán bộ phòng thí nghiệmNuôi cấy mô, tế
bào thực vật và sự giúp đỡ, cung cấp t liệu, mẫu vật của nhân dân huyện
Nghĩa Đàn.

1

Lần đầu tiên tham gia nghiên cứu khoa học sẽ không tránh khỏi những
thiếu sót, rất mong nhận đợc ý kiến đóng góp của các thầy cô và bạn bè để

đề tài nghiên cứu khoa học của tôi đợc hoàn thiện hơn.

Xin chân thành cảm ơn.
T¸c gi¶.

Những chữ cái viết tắt sử dụng trong luận văn

NCM - TB : Nuôi cấy mô - tế bào
CNSH : C«ng nghƯ sinh häc
IAA : Axit - indol axetic

NAA : Axxit - naphtyl axetic
IBA :
BA/BAP : 6 benzyl adenin(6 benzyl amino purin)
GA : Gibberelin
K : Kinetin
MS : Murashige – Skoog 1962
Ppm : part per million(phÇn triƯu)
mM : milimol

2

Mở đầu

Lý do chọn đề tài
Ngµy nay, sư dơng hoa trong sinh hoạt và công tác hàng ngày đà trở

thành một thói quan tót,tạo nên một nét văn hoá mới trong thởng ngoạn, giải
trí cũng nh trong tiêu dùng. Hoa đà trở nên quen thuộc và cần thiết trong
cuộc sống hàng ngày của mỗi con ngời.Để có thể đáp ứng đợc nhu cầu tiêu

thụ hoa ngày càng tăng, nhiều giống hoa, loại hoa mới, có giá trị thẩm mĩ,
giá trị kinh tế và giá trị văn hoá đợc đa vào sản xuất trên quy mô lớn, dùng
nhiều phơng thức tạo giống khác nhau, trong đó, Nuôi cấy mô - tế bào thực
vật invitro đợc đánh giá là một phơng pháp tiªn tiÕn, u viƯt.

Trong các loại hoa đợc a chuộng trên thế giới hiện nay, Đồng
tiền(gerbera) đợc coi là một trong 10 loài hoa ®Đp nhÊt, chØ xÕp sau hoa
hång, lay ¬n, cóc, cÈm chớng. Đồng tiền là loại hoa có nhiều u điểm nổi bật:
hoa to, cánh dày, xếp nhiều tầng, màu sắc phong phú, dáng hoa đẹp, cho
năng suất cao, nên đang ngày càng đợc ngời tiêu dùng a chuộng. Song một
khó khăn trong sản xuất hoa đồng tiền hiện nay là nguồn giống cây cung cấp
cho quá trình trồng trọt chủ yếu là cây tách thân, mặc dù sinh trởng mạnh
trong giai đoạn đầu nhng sau đó cây sinh trởng chậm, nhanh già cỗi, do đó
năng suất thấp, chất lợng và sản lợng hoa không cao, không ổn định. Bên
cạnh đó,bằng phơng pháp tách thân, số lợng cây giống mỗi lần tạo ra là
không nhiều,do đó không đủ đáp ứng nhu cầu của thị trờng sản xuất.[ ]

Phơng pháp nhân giống vô tính invitro đà bổ sung cho kĩ thuật tạo cây
giống bằng cách tách thân trong sản xuất hoa đồng tiền và đang ngày càng đ-
ợc chú ý phát triển bởi kỹ thuật nhân giống vô tính invitro cho phép sản xuất
những cây giống đòng tiền khoẻ mạnh, sạch bệnh, có đọ đồng đều cao va
chất lợng tốt. Hiện nay ở Việt Nam đà có nhiều nghiên cứu về quy trình nhân

3

giống vô tính các loại hoa đa đợc công bố và ứng dụng.[ ].Tuy nhiên việc
tiếp tục hoàn thiện cũng nh đề xuất những quy trình kỹ thuật mới cho các
giống hoa vẫn thực sự cần thiết. Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn đó,
chúng tôi thực hiện đề tài Góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống hoa
đồng tiền - gerbera bằng công nghệ nuôi cấy mô - invitro”.

Mơc ®Ých cđa đề tài là áp dụng cơ sở khoa học của công nghệ vi nhân
giống để nhân nhanh giống hoa đồng tiền từ mô phân sinh đỉnh của cây,
nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính giống hoa đồng tiỊn nµy,

Néi dung cđa đề tài là nghiên cứu tim ra các điều kiện nuôi cấy invitro
thích hợp trong các giai đoạn xử lý mẫu, nhân chồi invitro, ra rễ, tạo cây
hoàn chỉnh, huấn lun thÝch nghi,…tõ ®ã ®tõ ®ã ®Ị xt mét quy trình nhân giống
hoàn thiện đối với hoa đồng tiền.

CHƯƠNG I: tổng quan tài liệu

1.1 Cơ së khoa häc cđa nu«i cÊy m« invitro[ ].
1.1.1 TÝnh toàn năng của tế bào thực vật

Theo Habertland, mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật nào cũng đều
mang toàn bộ lợng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi
gặp điều kiện thuận lợi, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể
hoàn chØnh.

4

Tính toàn năng của tế bào mà Habertland đa ra chính là cơ sở lý luận
của Nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con ngời đà hoàn toàn
chứng minh đợc khả năng tái sinh mọt cơ thể thực vật từ một tế bào riêng rẽ.

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật invitro
thực chất là kết quả của sự phân hoá và phản phân hoá tế bào[]
1.1.2 Phân hoá và phản phân hoá tế bào

Tất cả các loại tế bào trong một cơ thể sinh vật đều bắt nguồn t một tế
bào phôi sinh, từ tế bào phôi sinh này sẽ chuyển thành tế bào của các mô
chuyên hoá đảm nhận các chức năng khác nhau. Đó gọi là sơ phân hoá tế
bào.

Tuy nhiên trong trờng hợp cần thiết ở diều kiện nhất định, các tế bào
của các mô chuyên hoá lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại có khả
năng phân chia mạnh mẽ. Quá trình này đợc gọi là phản phân hoá tế bào.[]
1.1.3 Môi trờng nuôi cấy [ ]

Môi trờng nuôi cấy là một trong những điều kiện đặc biệt cần thiết ,
quyết định đến sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy. Môi trờng nuôi cấy
phải có đầy đủ các chất dinh dỡng cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế
bào cũng nh hco quá trình sinh trởng bình thờng của cây.

Thành phần của môi trờng nuôi cấy thay đổi tuỳ đối tợng nuôi cấy, bộ
phận nuôi cấy, ngoài ra còn tuỳ thuộc giai đoạn phát triển của cây và mục
đích nuôi cấy: tạo rễ, tạo mầm, tái sinh hay muốn giữ trạng thái mô sẹo.

Tuy nhiên tất cả các môi trờng nuôi cấy bao giờ cũng có các thành phần
:
_ Nguồn carbon (thờng là đờng)
_ Khoáng đa lợng.
_ Khoáng vi lợng.
_ Vitamin.
_ Chất điều tiết sinh trởng.

Có thể bổ sung thêm một số hợp chÊt : axit amin, EDTA, níc dõa hay dÞch
chiÕt nÊm men, . . .
a. §êng

Đờng là nguồn cung cấp carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các
chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối của mô nuôi cấy nhân tạo.
Các loại đờng thờng dùng là saccaroze va glucoze nhng saccaroze đợc dùng

5

phổ biến hơn. Nồng độ đờng có thể thay đổi từ 1-6%, thông dụng nhất là 2-3
% .
b. Các khoáng đa lợng

+. Nitơ : Cây sử dụng đợc dới hai dạng NH4+ và NO3- với tỷ lệ tuỳ loại
cây và tuỳ giai đoạn phát triển.

Nitrat đợc cung cấp chủ yếu dới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3,
NaNO3 hoặc NH4NO3, (NH4)2SO4 và trong một số trờng hợp còn dới dạng
ure. Nồng độ trong môi trờng khoảng 3-6 mM.

+ Lu huúnh ( S )
Lu huỳnh đợc cây hấp thu dới dạng SO42-; còn SO32- và SO2 thờng gây
độc cho cây.
Lu huúnh tham gia vµo cấu trúc của một số loại axit amin và tham gia
vào quá trình khử, tổng hợp chất hữu cơ tơng ứng, ngoàI ra, lu huỳnh còn
điều tiết quá trình trao đổi chất và năng lợng, xây dựng các chất kháng sinh,
vitamin, . . .
+Kali ( K )
Cung cÊp cho cây dới dạng KNO3, KCl, KH2PO4, với nồng độ biến
thiên từ 2-25 mM, trung bình khoảng 10 mM.
+ Magie ( Mg )
Mg đợc cung cấp cho cây dới dạng MgSO4.7H2O, nồng độ 0,5-3 mM

Trong tế bào, Mg có vai trò xúc tác cho nhiều hệ enzim quan trọng, là
cầu nối giữa enzim và cơ chất, làm tăng hoạt tính enzim, Mg còn ảnh hởng
đến quá trình hấp thu, đồng hoá P, O2, . . .
+ S¾t ( Fe )
Trong môi trờng cổ điển, dùng Fe dới dạng FeCl2.FeCl3.6H2O;
FeSO4.7H2O; Fe2(SO4)2; Fe(C4H4O), còn hiện nay dùng Fe ở dạng EDTA, ở
dạng này Fe không bị kết tủa mà giải phóng dần ra môi trờng tuỳ nhu cầu
của mô thực vật.
+Canxi ( Ca )
Đợc cung cấp cho cây dới dạng Ca(NO3).4H2O, CaCl2.6H2O,
CaCl2.2H2O, nồng độ 1-3,5 mM.
c. Các khoáng vi lợng
Các nguyên tố vi lợng đợc tìm thấy trong cây dới dạng các phức chất
hữu cơ- khoáng, các phức chất này có thể tham gia vào các phản ứng mà bản
thân các chất thành phần không thể tham gia đợc. Đặc biệt vai trò của c¸c

6

nguyên tố vi lợng quan trọng nhất là tham gia vào cấu trúc của các enzim và
tham gia vào tất cả các quá trìng sinh tổng hợp và chuyển hoá các chất trong
tế bào, do đó có thể nói các nguyên tố vi lợng là cơ sở của sự sống.

B¶ng : Một số các nguyên tố vi lợng thờng dùng []

Nguyªn tè D¹ng sư dơng Nång ®é (mM)
Mn MnSO4.4H2O 15-100
B 6-100
Zn H3PO3 15-30
Cu ZnSO4.7H2O 0,04-0,08
Mo CuSO4.5H2O

(NH4)6Mo7O24.4H2O 0,07-1
Co NaMoO4.2H2O 0,1-0,4
I CoCl2.6H2O 2,5-20

KI

d. C¸c vitamin

Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro có khả

năng tổng hợp đợc hầu hết các vitamin nhng thợng không đủ về lợng, do đó

cần phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, nhất là các vitamin nhóm B.

Bảng : Một số vitamin thờng đợc dùng trong môi trờng nuôi cấy [ ]

Tªn vitamin Nång ®é sư dơng (mg/l)
Myo_Inositol 100

Axit nicotinic ( niaxin ) 0,5-1

Pyridoxine HCl ( vitamin B6 ) 0,05-0,5

Thiamine HCl ( B1 ) 10-50

Pandothenat canxi 1-5

Riboflavin ( B2 ) 1-5

Biotin 0,1-1

Axit folic 0,1-1

C¸c vitamin thờng đợc pha trong hỗn hợp các dung dịch mẹ có nồng độ
cao gấp 500 đến 1000 lần so với dung dịch lam việc, cần giữ trong điều kiện
lạnh dới 0oC để tránh nấm khuẩn nhiễm tạp.
e. Các chất ®iỊu khiĨn sinh trëng

7

Bảng : Một số chất điều khiển sinh trởng thờng dïng [ ]

Tªn chÊt sinh trëng Nång ®é sư dơng ( mg/l )
2,4 D [dichlorophenoxy axetic] 0,2-5
_NAA [ naphtylaxetic axit] 0,1-5
5-20
_NAA [ indol axetic axit] 1-5
IBA [ indol butyric axit] 0,1-2
0,1-2
Kinetin [6 finfurylaminopurine] 0,1-2
BA [ 6_BAP ][ 6 benzyl amino purine] 0,1-2
2_iP [ N6 _ Dimetylallylaminopurine]

GA [ Gibberelic axit ]

Thờng pha các dung dịch mẹ chất sinh trởng có nồng độ cao gấp 1000 lần
so với dung dịch làm việc.
g. Các hỗn hợp chất tự nhiên
+ Nớc dừa:

Từ 1941, nớc dừa đà đợc sử dụng để nuôi phôi Daruta và năm 1949
nuôi mô của Daucus. Lợng nớc dừa dùng trong môi trờng khá lớn, 10-20 %
thể tích môi trờng.
+ Dịch chiết nấm men

Là các chế phẩm thờng dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động
vật. 1934,White lần đầu tiên đà nuôi cấy thành công rễ cà chua trong ống
nghiệm kéo dài vô thời hạn trên nền dịch chiết nấm men. Thành phàn hoá
học không râ, chđ u chøa ®êng, axit nucleic, axit amin, vitamin, auxin và
khoáng.Lợng thờng dùng là 1g/l môi trờng.
h. Một số môi trờng nuôi cấy cơ bản

+ Môi trờng Murashige-Skoog( MS ): Là một trong những loại môi trờng
đợc sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Thích hợp cho
cây Một lá mầm và cây Hai là mầm.

+ Môi trờng Anderson : Chuyên dùng cho việc nhân giống vô tính các
cây họ Rhododendron ( Mẫu đơn ) và một số cây thân gỗ loại nhỏ. Nồng độ
các loại muối khoáng dùng trong môi trờng này thấp, chỉ bằng một nửa so
víi m«i trêng MS.

+ M«i trêng Gamborg: Đợc thử nghiệm lần đầu tiên cho cây đậu tơng nh-
ng đợc dùng nhiều trong nhân giống vô tính, đặc biệt trong nuôi và tách tế
bào trần.

8

+ M«i trêng nu«i cÊy phong lan ( P )
+ M«i trêng N6 _ Chu : Hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn của lúa và cây
hoà thảo

Bảng : Thành phần một số loại môi trờng thông dụng dùng trong Nuôi
cấy mô_ Tế bào thực vật[]

STT Thành phần MS A G P N6

Muèi kho¸ng

1 NH4NO3 1650 400 134 825 -

2 (NH4)2SO4 - - - - 463

3 H3PO3 6,2 6,2 3,1 3,1 1,6

4 CaCl2 322,2 332,2 113,2 166 125,3

5 Ca3(PO4)2 - - - - -

6 CuSO4.5H2O 0,025 0,025 0,025 0,0125 -

7 CoCl2.6H2O 0,025 0,025 0,025 0,0125 -

8 Natri tactrat.2H2O 37,26 74,5 37,26 37,26 37,26

9 S¾t tactrat.2H2O - - - - -

10 FeSO4.7H2O 27,8 55,7 27,8 27,8 27,8

11 MgSO4 180,7 180,7 122,1 90,35 90,35

12 MnSO4 16,9 16,9 10 8,45 33,3

13 Na2(NH4)4Mo7O24.H2O 0,25 0,25 0,25 0,125 -

14 KI 0,83 0,3 0,75 0,415 0,8

15 KNO3 1900 480 2500 950 2830

16 K2HPO4 - 330 130,5 85,5 400

17 KCl - - - - -

18 ZnSO4.7H2O 8,6 8,6 2,0 5,3 1,5

Chất hữu cơ và vitamin

19 Glyxin 2 - - - 2

20 Vitamin B1 0,4 0,4 10 1 1

21 Bios I 100 100 100 100 100

22 Vitamin B6 0,5 - 1 0,5 0,5

23 Axit nicotinic 0,5 - 1 0,5 0,5

24 MES - - - 1000 -

9

25 Pepton - - - 2000 -

Các chất điều tiết sinh tr-

ëng

26 Adenin hemisulphat - - - - -

27 6_Dimetylallylaminopurine - 80 - - -

28 2,4_ Dichlophenoxy axetic

axit - 2 - - 2

29 _indolaxetic axit - - - - -

30 _ Naphthalen axetic axit - - - 0,5 -

31 6_Benzyl amino purine - 0,5 - 2 -

32 Saccaroza (g/l) 30 30 30 20 20

33 Agar ( g/l ) 8 8 8 - 8

PH 5,6 5,8 5,8 5,8 5,8

1.2 Quy trình chung của NCM_TB invitro

Về nguyên tắc, quy trình nhân giống vô tính invitro gồm 4 giai đoạn []

1.2.1 Giai đoạn vào mẫu và cấy gây

Đây là giai đoạn rất quan trọng, đóng vai trò quyết định đối với toàn

bộ quy trình. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo đợc nguyên liệu thực

vật vô trùng để đa vào nuôi cấy invitro.

Yêu câù của giai đoạn này là:

- Tû lƯ nhiƠm thÊp

- Tû lƯ sèng cao

- Tèc ®é sinh trởng cao

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy các mẫu, quan trọng

nhất là đỉnh sinh trởng, chồi nách, sau đó là hoa tự. đoạn thân, cành,mảnh lá,
rễ,từ đó đĐể khử trùng mô, ngời ta thờng dïng mét sè ho¸ chÊt: HgCl2, CoCL2,

NaOCl, H2O2, . . .tuỳ thuộc vào từng loại mô thực vậtmà lựa chọn nồng độ và

thời gian xử lý hoá chất thích hợp. Đối với mẫu dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy,

có thể bổ sung vào môi trờng than hoạt tính hoặc ngâm mẫu trớc khi cấy vào

hỗn hợp axit ascobic và axit citric nồng độ 25-150 mg/l

Chọn đúng phơng pháp khử trùng sẽ đa lại tỷ lệ sống cao, chọn môi tr-

ờng dinh dỡng thích hợp sẽ giúp cho mẫu đạt tốc độ sinh trởng nhanh.

Môi trờng nuôi cấy thờng dùng là môi trờng MS.

1.2.2 Giai đoạn nhân nhanh

10

Toàn bộ quá trình nhân giống invitro nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân
chồi invitro cao nhất, vì vậy đây đợc coi là giai đoạn then chốt của quá trình.

Để tăng hệ số nhân,phải đa thêm vào môi trờng dinh dỡng nhân tạo các
chất điều hoà sinh trỡng: auxin, xitikinin, gibberelin,từ đó đ,các hợp chất tự
nhiên: nớc dừa, dịch chiết nấm men,từ đó đkết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh
sáng thích hợp. Trong giai đoạn này, ngời ta kích thích tạo cơ quan phụ hoặc
có cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh.Những khả năng
tạo cây mới là: phát triển chồi nách, tạo phôi vô tính hoặc tạo đỉnh sinhtrởng
mới.
1.2.3 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi, cần chuyển chồi sang môi trờng tạo rễcó bổ sung
một lợng nhỏ auxin, thờng sau 2-3 tuần,từ những chồi riêng lẻ sẽ xuất hiện rễ
và tạo thành cây hoàn chỉnh.Auxin là nhom hoormon thực vật quan trọng có
vai trò sinh lý là tạo rễ bất định cho mô nuôi cấy, trong đó các chất IAA;
IBA; _NAA; 2,4D đợc sử dụng nhiều nhất.
1.2.4 Giai đoạn hn lun thÝch nghi

Qu¸ trình thích nghi đợc hiểu là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh
lý và giải phẫu của bản thân cây non đó. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi

là 2-3 tuần, trong thời gian này cây cần đợc chăm sóc bảo vệ cẩn thận trớc
một số yếu tố bất lợi: mất nớc, nhiễm khuẩn, nấm , nắng,từ đó ®

Trong giai ®o¹n huấn luyện thích nghi này, cây hoàn chỉnh với đầy đủ
rễ, thân , lá đợc đa từ ống nghiệm ra đất. Giai đoạn này cây cần có giá thể và
chế độ chăm sóc phù hợp. Yêu cầu của giai đoạn này là:

- Cây trong ống nghiệm đà đạt đợc những tiêu chuẩn hình thái nhÊt
định

- Có giá thể tiếp nhận cây invitro thích hợp, đạt yêu cầu tơi, xèp,
thoát nớc.

- Phải giữ ẩm cho cây khi mới đa ra từ ống nghiệm, cần che chắn để
giữ ẩm và tránh ánh sáng quá mạnh.Cụ thể độ ẩm đất phải đạt 76-80
%, ®é Èm không khí phải đạt 82-85 %.

1.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống invitro trên thế giới và ở Việt
Nam

1.3.1 Trªn thÕ giíi:

11

Công nghệ sinh học là một ngành khoa học mố phát triển trong mộ
vài thập niên trở lại đây, với thời gian ngắn nhng có ý nghĩa thực tiễn và triển
vọng phát triển to lớn, công nghệ sinh học đà có nhiều thành tựu đáng kể,
đặc biệt trong lĩnh vực trồng trọt. Hiện nay công nghệ sinh học là lĩnh vực đ-
ợc đầu t khá lớn ở hầu hết các nớc trên thế giới.Cây giống nuôi cấy mô- tế
bào không còn xa lạ đối với các nông hộ.

§èi víi lÜnh vực nhân giống cây trồng, Công nghệ nuôi cấy mô- tế
bào đà cho phép sản xuất giống nhiều loại cây trồng nh: khoai tây, bắp cải,
củ kiệu, các cây công nghiệp nh: bông , hông , tếch,...,các loại cây thuốc
quý: sa nhân, sâm,..., nhiều loại hoa: cúc, hồng, phong lan, ...,cây cảnh, các
loại cây ăn quả có giá trị kinh tÕ cao: nho, chuèi , cam , chanh,...[]

Đối với các lĩnh vực khác có ứng dụng những thành tựu của nuôi cấy
mô- tế bào cũng có nhiều thành tựu đáng chú ý: phục tráng cây, tạo dòng cây
sạch bệnh [], lựa chọn dòng lúa , ngô đáp ứng yêu cầu cụ thể của môi trờng,
cấy ghép cam, chanh, nhân nhanh cây từ ph«i,....

C«ng nghệ Mô- tế bào, ngoài việc sử dụng để nhân nhanh các giống
cây trồng, còn đợc sử dụng vào nhiều lĩnh vực khác đạt nhiều thành công,
đóng góp đáng kể cho nhiều ngành sản xuất, phục vụ nhu cầu ngay càng lớn
của con ngời: sản xuất sinh khối các loại thức ăn cho ngời và động vật,
nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài cây, con, tạo ngân hàng gen va
tinh trùng, thụ tinh nhân tạo, chuyển gen,...Trong tơng lai đây sẽ là một trong
những ngành có nhiều tiềm năng phát triển nhất, và nớc nào phát triển đựơc
càng cao về công nghệ nuôi cáy mô- tế bào, nớc đố sẽ phát triển về cong
nghiệp, nông nghiệp, và có nền kinh tế vững mạnh.
1.3.2 ở Việt Nam
ở nớc ta, ứng dụng thành tựu của Nuôi caýy mô- tế bào còn là một lĩnh vực
khá mới mẻ và có nhiều tiềm năng phát triển.Do điều kiện chiến tranh kéo
dài, các ngành khoa học nói chung và Nuôi cấy mô- tế bào nói riêng của nớc
ta đà đi chậm hơn so với thế giới, tuy vạy chúng ta cũng đà đạt đợc một ssố
thành tựu đáng kể, nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mo- tế bào đà đợc xây
dựng tại các ViƯn: ViƯn C«ng nghƯ sinh häc, ViƯn Sinh häc nhiƯt đới thành
phố Hồ Chí Minh, Viện Nghiên cứu Đà Lạt,...Ngoài ra nhiều trờng Đại
họccũng đà bắt đầu chú ý đầu t xây dựng các phòng thí nghiệm Nuôi cấy

mô- tế bào để cho sinh viên có thể tiếp cận với công nghệ mới mẻ này.ở
nhiều tỉnh, thành phố đà xây dựng phòng thí nghiệm nuôi cấy mô- tế bào ,

12

thực hiện những nghiên cứu và chuyển giaocong nghệ nuôi cấy mô- tế bào
trên các đối tợng có kinh tế của địa phơng( Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh,
Bình Định,...)

HiÖn nay, C«ng nghƯ sinh häc nãi chung, Nu«i cÊy m«- tế bào nói
riêng đà thu đợc nhiều thành tựu đáng kể trong thực hiện nhân nhanh các
loại cây: cà phê, cỏ ngọt, chuối(Trung tâm công nghệ sinh học), dứa(Viện
nghiên cứu dầu và cây có dầu, Viện khoa học Việt Nam), mía đờng(Trung
tâm công nghệ sinh học, Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu, Trung tâm sinh
học thực nghiệm), cây vani(Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu), nho không
hạt(Trung tâm công nghệ sinh học), dâu tằm, măng cụt, lúa, khoai tây và các
loại cây có củ khác.Đối với các giống hoa, ngoài phong lan và cúc là hai đối
tợng thờng đợc nuôi cấy mô- tế bào, hiện nay có rất nhiều loại hoa đợc
nghiên cứu nhân nhanh bằng công nghệ này, chủ yếu phụ thuộc vào giá trị
của các loại hoa chứ không phải phụ thuộc vào mức độ dễ thành công nh trớc
đây: rẻ quạt (Viện ngiên cứu hạt nhân Đà Lạt ),Cẩm chớng(Đại học Tổng
hợp Đà Lạt ), cóc chïm Hµ Lan, loa kÌn,[]......

Chơng II: Đối tợng, nội dung và
phơng pháp nghiên cứu

I.Đối tợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu.
2.1.1Đối tợng nghiên cứu.

Đối tợng nghiên cứu của đề tài là hoa đồng tiền (gerbera) kép, hoa đỏ,

vàng có nguồn gốc từ Hà Lan đợc nhập nội từ 2003 . Các bộ phận đợc sử
dụng để tiến hành nghiên cứu là : chồi , đỉnh sinh trởng, chồi nách,từ đó đ
2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

13

_ Các giai đoạn: khử trùng, vào mẫu, nhân nhanh, ra rễ, tạo cây hoàn
chỉnh đợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô_ tế bào thực vật Khoa
sinh học, trờng Đại học Vinh.

_ Các nghiên cứu về khả năng thích ứng của cây invitro với điều kiện
môi trờng bình thờng đợc tiến hành tại nhà lới _ Koa Sinh học_ trờng Đại
học Vinh.
2.1.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 3-2005 đến tháng 4-2006
2.2 Néi dung nghiªn cøu

Néi dung nghiên cứu của đề tài là:
ảnh hởng của thời gian, nồng độ, hoá chất khử trùng đến các chỉ tiêu:

tû lƯ sèng, tû lƯ nhiƠm, tû lƯ bËt chåi cđa mÉu.
 ¶nh hëng cđa BAP đến sự phát triển của chồi invitro trong quá trình

nh©n nhanh.
ảnh hởng của - NAA đến sự ra rễ của chồi invitro.
ảnh hởng của giá thể đến sức sống của chồi exvitro.
2.3 Phơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Vật liệu khởi đầu
Vật liệu khởi đầu,tức là các cây giống để từ đó lấy các chồi, đỉnh sinh tr-

ởng, là các cây đồng tiền trởng thành đợc trồng tại nhà lới. Các cây muốn đ-
ợc sử dụng làm vật liệu khởi đầu phải đạt đợc các yêu cầu về hình thái, phải
khoẻ mạnh, không mang mầm bệnh, phát triển tốt. Mẫu đợc lấy vào những
ngày nắng ráo , trớc đó 3 ngày không có ma để hạn chế sự nhiễm khuẩn.
2.3.2 Giai đoạn khử trùng mô nuôi cấy_ vào mẫu

Bộ phận đợc dùng là đỉnh sinh trởng . Đồng tiền có đỉnh sinh trởng yếu,
ít, khó tách, mặt khác có nhiều lông tơ là nơi có nhiều vi khuẩn, do đó việc
vào mẫu gặp nhiều khó khăn, hoá chất và thời gian xử lý phải vừa đủ để diệt
hết vi khuẩn, nấm mà không ảnh hởng đến đỉnh sinh trởng. Các công thức đ-
ợc sử dụng là :

 CT M1 : Cån 700 (3 phót) + H2O2 15% (10 phót) + HgCl2 0,1%
(10 phót)

 CT M2 : Cån 700 (3 phót) + H2O2 15% (15 phót) + HgCl2 0,1%
(10 phót)

 CT M3 : Cån 700 (3 phót) + H2O2 15% (15 phót) + HgCl2 0,1%
(15 phót)

14

 CT M4 : NaOCl 10% (10 phót) + NaOCl 5% (8 phót) + NaOCl 1%

(3 phót)

Môi trờng đợc sử dụng để vào mẫu cấy gây là

MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + 2mg/l BAP + 10% nớc dừa

giai đoạn này , các chỉ số đợc đánh giá là:

_ Tỷ lệ cây chết

_ Tỷ lệ cây bật chồi

_ Tỷ lệ cây đợc sử dụng để cấy chuyển

Thời gian nghiên cứu giai đoạn này là 2-3 tuần

2.3.3 Giai đoạn nhân nhanh

Giai đoạn này chúng tôi bố trí các công thức nuôi dỡng chồi đồng tiền có

các chất điều tiết sinh trởng khác nhau và với nồng độ khác nhau trên nền

công thức dinh dỡng giống nhau để nghiên cứu ảnh hởng của các chất điều

tiết sinh trởng đến sự sinh trởng của chồi invitro.

Các chất điều tiết sinh trởng và nồng độ ở các công thøc nh sau:

CT N1: 1,5 mg/l BAP

CT N2 : 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l IAA

CT N3 : 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l IAA

CT N4 : 1,5 mg/l BAP + 1,0 mg/l IAA

CT N5 : 5mg/l K + 0,5 mg/l IAA

CT N6 : 5mg/l K + 1,0 mg/l IAA

M«i trêng dinh dìng nền để nghiên cứu giai đoạn này là:

MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + 10% nớc dừa

Các chỉ tiêu cần nghiên cứu là:

_ Số lá/ cây

_ Số chồi / cây sau thời gian nuôi cấy

_ Hệ số nhân nhanh

_ Hình thái cây

Thời gian nghiên cứu giai đoạn này là 4 tuần

2.3.4 Giai đoạn ra rễ- tạo cây hoàn chỉnh

Các công thức nghiên cứu giai đoạn ra rễ bao gồm thành phần cơ bản là

môi trờng nền MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + than ho¹t tÝnh + 10% nớc

dừa; các môi trờng khác nhau ở nồng độ các chất điều tiết sinh trởng bổ sung

để nghiên cứu ảnh hởng của các chất điều tiết sinh trởng đến sự ra rƠ cđa

chåi invitro.

15

Các chất điều tiết sinh trởng và nồng độ sử dụng nh sau:
CT R1: 0,5mg/l NAA
CT R2: 1,0mg/l NAA
CT R3: 1,5mg/l NAA

Các chỉ tiêu cần theo dõi:
_ Số rễ trên 1 cây
_ ChiỊu dµi rƠ
_ Hình thái cây, rễ
Điều kiện nuôi cấy:ở cả ba giâi đoạn cấy gây, nhân nhanh và ra rễ các
chồi invitro đều đợc nuôi cấy trong điều kiện ổn định về nhiệt độ, ánh sáng:
-Nhiệt độ: 250C 2 20C
-¸nh s¸ng: 2000-2500 lux
-Thời gian chiếu sáng 12h/ngày
2.3.5 Giai đoạn huÊn luyÖn

ë giai đoạn này chúng tôi bố trí các cây exvitro vào các giá thể khác
nhau trong cùng điều kiện nuôi cấy để nghiên cứu ảnh hởng của các giá thể
khác nhau đến tỷ lệ và sức sống của cây exvitro.

Các công thức giá thể:
CT H1 : C¸t
CT H2 : TrÊu hun
CT H3 : C¸t + trÊu hun
§iỊu kiƯn hn lun:

_ §é Èm kh«ng khÝ: 80-85%
_ §é Èm gi¸ thĨ: 65-80%
_ Ngn kho¸ng bỉ sung là dung dịch NPK với tỷ lệ 1:1:1 với nồng độ
2% phun trực tiếp lên lá.
Các chỉ tiêu theo dõi:
_ Tỷ lệ cây sống thích nghi với môi trờng.
_ Các chỉ tiêu về hình thái: chiều cao cây, số lá/cây, màu sắc lá, sự phát
triển của rễ, ...
2.3.6 Phơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đợc xử lý bằng toán thống kê:

- Giá trị trung bình:

16

X = xi (i là số lần thực hiÖn thÝ nghiÖm)

n

- Độ lệch chuẩn:



Chơng III: kết quả nghiên cứu và bàn luận

2.3 Kết quả nghiên cứu giai đoạn vào mẫu

Chồi đỉnh ngọn đồng tiền đợc lấy từ cây giống trồng ở nhà lới vào thời

điểm râm mát, trớc đó 3 ngày không có ma để hạn chế sự nhiễm khuẩn. Mẫu

đợc làm sạch sơ bộ bằng chất tẩy rửa, rồi rửa sạch dới vòi nớc chảy. Sau khi

xö lý b»ng cån 700 trong thêi gian 3 phút, các mẫu đợc khử trùng bằng các

loại hoá chất có nồng độ và thời gian khác nhau.

Kết quả giai đoạn khử trùng mẫu và cấy gây thể hiện ở bảng 1

Bảng 1: Kết quả xử lý mẫu đồng tiền

Công Hoá Nồng độ Thêi gian Tæng Sè mÉu Sè mÉu

thøc chÊt xö lý sè nhiÔm bËt

mÉu chÕt(%) chåi(%)

M1 H2O2 15% 10 phót 30 28(93,3%) 2(6,7%)

HgCl2 0,1% 10phót 17(57%) 13(43%)
M2 H2O2 15% 15 phót 30

HgCl2 0,1% 10phót

M3 H2O2 15% 15 phót 30 25(83,3%) 5(16,7%)

HgCl2 0,1% 15phót 25(83,3%) 5(16,7%)
M4 NaOCl 10% 10 phót 30

17

NaOCl 5% 8phót
NaOCl 1% 3 phót

Môi trờng đợc sử dụng để cấy gây là môi trờng dinh dỡng MS + 50g/l
sacaroza + 6g/l ©gar + 2mg/l BAP.

KÕt qu¶ b¶ng 1 cho thÊy:
_C«ng thøc khư trïng M1 : H2O2 15 % trong 10 phót vµ HgCl2 0,1%

trong 10 phót, trong 30 mÉu xö lý, chØ cã 2 mÉu sèng( chiÕm tû lệ 6,7 %),
còn 28 mẫu còn lại đều chết và nhiƠm nÊm,trong sè 28 mÉu cã 20 mÉu
nhiƠm nÊm vµ vi khuÈn ( chiÕm tû lÖ 66,7 % ) chøng tỏ hiệu quả khử trùng
của công thức này yếu, không loại trừ hết các nấm và vi khuẩn trên mẫu cấy
gây.

_ Công thức khử trïng M2 : H2O2 15% trong 15 phót vµ HgCl2 0,1 %
trong 10 phút, kết quả thông kê cho thấy công thức này cho kết quả khử
trùng tốt nhất. Trong 30 mÉu xư lý cã 13 mÉu sèng, n¶y chåi đẹp(43%),
công thức này cho tỷ lệ mẫu bật chồi cao nhÊt(22 mÉu bËt chåi chiÕm tû lƯ
73%), trong ®ã cã nhiỊu mÉu bËt 2-3 chåi.Sè mÉu nhiƠm vµ chÕt chiÕm tỷ lệ
57%, trong đó số mẫu chết là 8 mẫu chiÕm tû lƯ 27%, 9 mÉu bÞ nhiƠm(30%)

_ C«ng thøc khư trïng M3: H2O2 15% trong 15 phót vµ HgCl2 0,1 %
trong 15 phút, kết quả cho thấy trong 30 mẫu cấy gây có 10 mẫu nảy chồi
( 33,3%)trong đó chỉ có 5 mẫu không bị nhiễm (16,7%) ,20 mẫu bị hoá nâu
sau 2-3 ngày nuôi cấy(66,7%).Nh vậy tăng thời gian xử lý HgCl2 có ảnh h-
ởng xấu đến chồi invitro,làm chết mẫu cấy gây, thpì gian các mẫu nảy chồi
chậm ( sau 2 tuần mới có dấu hiệu nảy chồi).Xử lý HgCl2 lâu sẽ ảnh hởng
không tốt đến chất lợng của mẫu cấy gây.

_ Công thức khử trùng M4 : Thay đổi hoá chất khử trùng bằng NaOCl , với 3
lần khử trùng với nồng độ và thời gian xử lý giảm dần , sau mỗi lần xử lý
mẫu sẽ đợc rửa sạch và bóc dần các lớp bao bọc phía ngoài, sau 3 lần xử lý
chỉ còn lại đỉnh sinh trởng thì sẽ tiến hành cấy vào môi trờng.Kết quả cho
thấy trong 30 mÉu xö lý chØ cã 5 mÉu sèng và phát triển tốt(16,7%), số mẫu
nảy chồi nhiều(17 mẫu chiếm tỷ lệ 57%) nhng đều bị nhiễm nấm, vi
khuẩn.Nh vậy NaOCl có tính khử trùng yếu, không đủ để tiêu diệt hết các vi
khuẩn và nấm trên mẫu cấy gây, cho nên không thích hợp để khử trùng chồi
đỉnh ngọn ®ång tiÒn.

NhËn xÐt:

18

Khi khư trïng b»ng H2O215% trong 10 phót vµ HgCl2 0,1 % trong 10 phút
cho kết quả không tốt, nhng khi tăng nồng độ H2O2 15% lên 15 phút cho kết
quả tốt hơn hẳn,chứng tỏ H2O2 thích hợp để khử trùng chồi đỉnh ngọn đồng
tiền,còn khi tăng thời gian xử lý HgCl2 0,1 % lên 15 phút thì co nhiều mẫu
chết, do đó xử lý HgCl2 quá lâu sẽ ảnh hởng không tốt đén sức sống và khả
năng phát triển của chồi invitro vì tinh năng khử trùng của HgCl2 quá mạnh
sẽ làm chết chồi.

Qua các công thức khử trùng với những hoá chất khử trùng có nồng độ
và thời gian khác nhau, chúng tôi nhận thấy công thức khử trùng cho hiệu
quả tốt nhất là công thức khử trùng kép:

H2O2 15% trong 15 phót
HgCl2 0,1 % trong 10 phút
3.2 Kết quả nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh
ở giai đoạn này, chúng tôi nghiên cứu sự ảnh hởng của các loại chất điều

tiết sinh trởng khác nhau đến tỷ lệ phát triển của chồi invitro thông qua hệ số
nhân nhanh và hình thái chồi invitro
sè chåi sau thêi gian nu«i cÊy
HƯ sè nh©n chåi =
số chồi ban đầu
Môi trờng nền nuôi cây trong giai đoạn nhân nhanh là môi trowngf dinh
dỡng MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + 10% níc dõa. C¸c công thức khác
nhau ở loại chất điều tiết sinh trởng và nồng độ của chúng.Kết quả nghiên
cứu giai đoạn này đợc thể hiện ở bảng 2:
Bảng 2 : ảnh hởng của chất điều tiết sinh trởng lên sự phát triên của
chồi invitro

Công Nồng độ Số Sau 1 tuần Sau 2 tuần Sau 3 tuần
thức chất ĐTST mÉu

Sè HÖ sè Sè HÖ sè Sè HÖ sè

chåi nh©n chåi nh©n chåi nh©n

chåi chåi chåi

N1 1,5mg/lBAP 50 90 1,80 120 2,4 140 2,80

N2 1,5mg/ 50 71 1,42 102 2,04 136 2,72

lBAP+0,2mg/

lIAA

19

N3 1,5mg/ 50 90 1,80 131 2,62 150 3,00

lBAP+0,5mg/

lIAA 50 78 1,56 104 2,08 114 2,28
N4 1,5mg/

lBAP+1,0mg/

lIAA 50 87 1,74 112 2,24 128 2,56
N5 5mg/lK

+0,5mg/lIAA

N6 5mg/lK 50 103 2,06 110 2,20 114 2,28

+1,0mg/lIAA
Nhận xét

_ Công thức nhân nhanh N1: Chỉ dùng BAP 1,5 mg/l là chất ĐTST , kết quả

cho thấy cây chịu ảnh hởng tốt từ BAP, thể hiện ở hệ số nhân chồi tơng đối

cao, tăng đều qua các thời điểm nghiên cứu.BAP là loại chÊt kÝch thÝch sù

ph©n chia chåi, ngän, thÝ nghiƯm víi công thức N1 cho thấy đối với chồi

đỉnh ngọn đồng tiền đà sinh trởng và phát triển tốt trong môi trờng có BAP.

_ Công thức nhân nhanh N2: Kết hợp BAP 1,5mg/l và 0,2 mg/l IAA nhằm

nghiên cứu ảnh hởng tổng hợp của BAP và IAA đến sự phát sinh và phát

triển của chồi invitro.Kết quả cho thấy ở tuần đầu, các chồi phát triển rất

chậm, hệ số nhân chồi chỉ đạt 1,42, thấp nhất trong tất cả các môi trờng bố

trí.Sang tuần 2 và 3, hệ số nhân chồi đà tăng đáng kể (2,04 và 2,73 ), chứng

tỏ IAA cũng đà có tác dụng tốt đối với sự phát triển của chồi invitro,song sự

ảnh hởng này chỉ thể hiện sau một thời gian nhất định.

_ Công thức nhân nhanh N3: 1,5mg/l BAP và IAA 0,5 mg/l, kết quả cho thấy

công thức này đạt kết quả tốt nhất, hệ số nhân chồi cao với các giá trị 1,81;

2,63; và 3,00 tơng ứng với các thời điểm nghiên cứu, và hệ số nhân chồi này

cũng là hệ số nhân chồi cao nhất so với các công thức còn lại.Chứng tỏ việc

tăng nồng độ IAA trong môi trờng là rất phù hợp đối với sự phát triển của

chồi invitro.

_ Công thức nhân nhanh N4: 1,5 mg/l BAP và 1,0 mg/l IAA.Kết quả cho

thấy việc tiếp tục tăng lợng IAA trong công thức này lại ảnh hởng không tốt

đến sự phát triển của chồi invitro, hệ số nhân chồi thấp hơn so với công thức

N3( qua các thời điểm thống kê là 1,56; 2,08; 2,28). Nh vậy nồng độ 1,0

mgl/l IAA đợc đánh giá là không cao, không thích hợp để sử dụng trong môi

trờng nhân nhanh chồi đồng tiền invitro.

20