Những chiến lược hứa hẹn trong sử dụng bacteriocin, bacteriophage, endolysin

Trường đại học Mở Tp.HCM
Khoa công nghệ sinh học
Môn: Seminar chuyên ngành

Tổng quan:
BẢO QUẢN THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SINH HỌC:
NHỮNG CHIẾN LƯỢC HỨA HẸN TRONG SỬ
DỤNG BACTERIOCIN, BACTERIOPHAGE,
ENDOLYSIN.

GVHD: Th.S Nguyễn Văn Minh

1


•
Sự quan tâm đến chất bảo quản sinh học đã thúc đẩy tìm kiếm những hợp chất chống
khuẩn tự nhiên từ nhiều sinh vật khác nhau. Bacteriocin đã được biết đến rộng rãi như là
chất bảo quản thực phẩm tự nhiên, gần đây những tiến bộ trong nghiên cứu bacteriocin đã
mở ra hướng nghiên cứu mới. Trái lại, việc sử dụng bacteriophage và endolysin chỉ được
xem xét trong 5 năm gần đây và đã cho thấy những viễn cảnh hứa hẹn. Bài điểm báo này
cung cấp một cái nhìn tổng quát về những ứng dụng trong hiện tại, tương lai của
bacteriocin, bacteriophage, endolysin dọc theo chuỗi thực phẩm và nhấn mạnh những đề
tài nghiên cứu cần chú trọng trong tương lai.
INTRODUCTION
Ngộ độc thực phẩm là vấn đề nghiêm trọng và gây tốn kém cho y tế cộng đồng, là mối
quan tâm trên toàn thế giới, trở thành nguyên nhân chính của bệnh tật. Mặc dù với công
nghệ kỹ thuật hiện đại, thực tiễn sản xuất tốt, quản lí chất lượng và vệ sinh và khái niệm
an toàn cũng như đánh giá sự rủi ro và hệ thống quản lí an toàn thực phẩm (HACCP),
nhưng số lượng của các ca ngộ độc thực phẩm vẫn gia tăng trong thập kỉ qua. Ở các nước

liên minh Châu Âu (EU), nguyên nhân ngộ độc thực phẩm phổ biến nhất là do vi khuẩn,
cụ thể là Campylobacter, Salmonella, Listeria và virus. Chúng ảnh hưởng đến hơn
380,000 người dân Châu Âu mỗi năm (EFSA, 2009).
Toàn cầu hóa thị trường thực phẩm, giới thiệu các thực phẩm mới lạ, quy trình sản xuất
mới, nhu cầu ít phải chế biến ngày càng gia tăng, thực phẩm sống và sản phẩm thức ăn
sẵn có thể đòi hỏi một dây chuyền thực phẩm dài hơn, phức tạp hơn, điều này làm tăng
nguy cơ nhiễm vi sinh. Theo đó, công nghệ bảo quản thực phẩm mới lạ và được bổ sung
tuân theo những yêu cầu từ “farm to fork” (“từ trang trại đến sản phẩm”) vẫn đang được
tìm kiếm. Một trong các công nghệ bảo quản thực phẩm, đặc biệt chú ý đến sự bảo quản
bằng phương pháp sinh học để nâng cao chất lượng sản phẩm và thời hạn sử dụng, giảm
thiểu các tác động đến giá trị dinh dưỡng và tính chất cảm quan của các sản phẩm dễ bị
hư hỏng. Bảo quản bằng phương pháp sinh học hợp lí khai thác được các tiềm năng
kháng khuẩn của vi sinh vật tự nhiên trong thực phẩm và/hoặc các chất chuyển hóa của
chúng giúp cho việc sử dụng an toàn trong một thời gian dài (nâng cao thời gian sử
dụng). Bacteriocin, bacteriophage và những enzyme do bacteriophage mã hóa được xếp
vào nhóm chất bảo quản này. Bài điểm báo này sẽ tóm tắt kiến thức cơ bản và ứng dụng
hiện tại của các kháng sinh tự nhiên theo dây chuyền thực phẩm. Dựa trên state-of-theart, các xu hướng trong tương lai và lĩnh vực nghiên cứu cần được quan tâm và đề cập
nhiều hơn.
A. BACTERIOCIN
1. Cấu tạo và phương pháp hoạt động của Bacteriocin
2


Cấu tạo:
Bacteriocins có bản chất là peptide hay là các protein có hoạt tính kháng khuẩn được tổng
hợp từ vi khuẩn. Chúng được mô tả đầu tiên ở Escherichia coli (colicins). Hầu hết các colicins là
các protein tương đối lớn (lên đến 80 kDa), chúng có thể giết chết vi khuẩn liên quan khi kết hợp
với màng tế bào bên trong hoặc các bào tương mục tiêu khác (Cascales và ctv., 2007). Ngày nay,
thuật ngữ bacteriocin chủ yếu được sử dụng để mô tả các cation peptide nhỏ, bền nhiệt được tổng
hợp bởi vi khuẩn Gram dương, cụ thể là vi khuẩn lactic (LAB), vi khuẩn này có sự ức chế khá

rộng (phổ ức chế rộng) (Cotter, Hill, & Ross, 2005). Từ khi sản phẩm lên men truyền thống sử
dụng vi khuẩn LAB để lên men thì người ta chú trọng đến công dụng bảo quản thực phẩm bằng
phương pháp sinh học của bacteriocin do vi khuẩn LAB sinh ra.
Bacteriocin là một nhóm không đồng nhất về cấu trúc tiền thân, thành phần và tính chất
hóa lý. Việc phân loại bao quát bacteriocin vẫn là một vấn đề cần bàn luận. Một hệ thống được
đề xuất gần đây bởi Heng và Tagg (2006) được suy ra từ các hệ thống phân loại trước đó sẽ đưa
vào bản mô tả bản chất của colicins. Theo đó, bacteriocin được chia thành bốn lớp chính :
• Lớp 1 hay là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa), bền nhiệt và tác động lên
cấu trúc màng. Một thành viên nổi tiếng của nhóm này là nisin (Parada và ctv,
2007). Bao gồm post-translationally peptide có thể biến đổi đặc trưng bởi các
thioether đặc biệt, với nền tảng là nội phân tử vòng lanthionine và beta-methyllanthionine (Xie & van der Donk, 2004).
o Phân lớp Ia
Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thuôn dài, linh hoạt và tích điện dương, chúng
hoạt động bằng cách hình thành các lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi
khuẩn nhắm đến (Ouwehand và Vesterlund, 2004)
o Phân lớp Ib
Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linh động, tích điện
âm hoặc không tích điện. Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây nhiễu với các
phân tử enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm (Parada và ctv, 2007).
•

Lớp II Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng
lượng phân tử nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine không biến
đổi và là lớp lớn nhất trong số các bacteriocins gram dương. Nói chung, chúng là
các cation peptide ngắn với điểm đẳng điện cao. Sự liên quan đặc biệt cho sự bảo
quản thực phẩm bằng phương pháp sinh học là có hoạt tính kháng Listeria tiềm
năng thể hiện bởi các bacteriocins có cấu trúc giống như pediocin (hạng IIa).
o Lớp IIa
Lớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide hoạt động chống Listeria, đại diện đặc
trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 và sakacin P. Các bacteriocin nhóm này

hứa hẹn cho nhiều ứng dụng công nghiệp nhờ vào hoạt động kháng Listeria mạnh
của chúng. Thậm chí chúng còn là các tác nhân kháng Listeria được chú ý nhiều
hơn là bacteriocin lớp I (nisin) vì chúng không có phổ ức chế rộng và vì vậy,
chúng không tiêu diệt các giống khởi động (Ouwehand và Vesterlund, 2004).
o Lớp IIb
3


Lớp IIb hình thành bởi một phức hợp của 2 peptide riêng biệt, những peptide này
ít hoặc không hoạt động. Các bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là lactococcin
G, plantaricin EF và plantaricin JK (Parada và ctv, 2007).
o Lớp IIc
Lớp IIc là những peptide nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacteriocin không đồng
nhất nên phương thức hoạt động của chúng cũng khác nhau. Trong phân lớp này
chỉ tìm thấy các bacteriocin như divergicin A và acidocin B (Parada và ctv, 2007).
•

Lớp III này bao gồm phần lớn các protein không bền nhiệt có tiềm năng khiêm tốn
trong bảo quản thực phẩm bằng phương pháp sinh học. Ngoại trừ colicin V và
microcin thì các bacteriocin Gram âm đều nằm trong lớp này.

•

Cuối cùng, các peptide dạng vòng do các peptide liên kết giữa C - và N tận cùng
tập trung tại lớp IV. Chẳng hạn, các bacteriocin mà đặc tính dựa trên các hoạt
động phối hợp của hai peptide độc lập thì được tìm thấy trong cả hai lớp I và II.
Hầu hết bacteriocins LAB đã được áp dụng trong bảo quản thực phẩm bằng
phương pháp sinh học thuộc lớp Ia, II và IV (bảng 1).

4

Cũng như ribosomally tổng hợp peptide, bacteriocin được mã hóa bởi một plasmid hoặc
nhiễm sắc thể tạo cấu trúc gen mà thường được nhóm với gen mã hóa cho các protein miễn dịch
và vận chuyển. Một ví dụ đặc biệt là gen chỉ định cho việc biến đổi enzyme và gen điều hòa có
thể cùng hiện diện.
Những vi khuẩn lactic này tạo ra các protein miễn dịch đặc hiệu để tự bảo vệ, chống lại
tác động kháng khuẩn của bacteriocin do chúng tiết ra.
Phương thức hoạt động của bacteriocin
Bacteriocin do vi khuẩn LAB tổng hợp đã được nghiên cứu rộng rãi, nghiên cứu tiên
phong thực hiện chủ yếu với các nisin- bacteriocin gram dương được mô tả đầu tiên. Dựa trên
bản chất cation và tính kỵ nước, hầu hết các peptide hoạt động như màng tế bào thấm. Sự hình
thành lỗ chân lông khiến toàn bộ hoặc một phần proton động lực bị hao mòn, cuối cùng làm chết
tế bào. Sự hình thành lỗ chân lông bacteriocin dường như là đích trung gian. Nisin và các
lantibiotic khác sử dụng vách tế bào tiền thân của lipid II như một phân tử bám (Breukink và
ctv., 1999). Bằng cách đó, hai chế độ hoạt động gồm sự ức chế sinh tổng hợp vách tế bào và hình
thành lỗ chân lông, được kết hợp trong một phân tử có hoạt tính kháng sinh vật (Wiedemann và
ctv., 2001). Cách thức này cũng được sử dụng bởi các lantibiotic và bacteriocin không tạo lỗ
chân lông như non- lantibiotic Lcn972 (Martı´nez và ctv., 2008). Gần đây, một số bacteriocin lớp
II đã được nghiên cứu để sử dụng thành phần liên kết màng của hệ thống mannosephosphotransferase như là thụ thể cụ thể trong các tế bào mục tiêu. (Diep, Skaugen, Salehian,
PeterCartwright, & Nes, 2007)
Nhiều bacteriocin LAB có hoạt tính chống lại việc tạo vi sinh vật và các vi khuẩn gram
dương gây hỏng trong thực phẩm, kể cả các vi khuẩn kháng kháng sinh. Vi khuẩn gram âm có
khả năng kháng cự nhờ vai trò bảo vệ của màng tế bào bên ngoài. Tuy nhiên, một số có thể hoạt
động khi kết hợp với tác chất làm bất ổn màng tế bào( như EDTA).
2. Các ứng dụng hiện tại của Bacteriocin trong thực phẩm
Vai trò của LAB là sinh ra bacteriocin trong thực phẩm và thực phẩm lên men truyền
thống, là nhân tố chính trong bảo quản thưc phẩm bằng phương pháp sinh học. LAB và
bacteriocin thu hút sự chú ý trong một thời gian dài. Phổ ức chế, diệt khuẩn, khả năng tác động,
phụ thuộc các điều kiện: pH, NaCl, nhiệt độ; nhưng nó không đủ hoạt tính để tác động lên các tế

bào eukaryote nên có thể sử dụng nó như chất bảo quản sinh học. Thời gian đầu nisin được dùng
trong 50 giây để ức chế sự phát triển của Clostridium tyrobutyricum trong phomat, đã có nhiều
báo cáo về nhiều ứng dụng của LAB bacteriocin, hầu hết trong chế biến thực phẩm.
Một số ví dụ về ứng dụng của bacteriocin trong sản xuất thực phẩm được tìm thấy đầu tiên
trong lĩnh vực thú y, nông nghiệp và nuôi trồng thuỷ sản. Nisin và Lacticin 3147 đã được kết hợp
chặt chẽ vào trong sản phẩm sữa thương mại để chống lại bệnh viêm vú. Bacteriocin đã được đề
xuất như một sự thay thế kháng sinh và đã thành công trong việc làm giảm sự lây lan của các tác
nhân gây bệnh trong hệ tiêu hoá của động vật (Calo-Mata et al., 2008; Diez-Gonzalez, 2007;
Line et al.,2008).Trong nuôi trồng thuỷ sản, hầu hết các tác nhân gây bệnh là gram âm và
bacteriocin colicin-like là biện pháp tốt nhất để phòng bệnh bằng biện pháp sinh học. Một số vi
5


khuẩn trên cây trồng có khả năng tổng hợp Bacteriocin để hạn chế sự đầu độc của các tác nhân
gây bệnh thực vật (Holtsmark, Eijsink, and Brurberg,2008).
Ứng dụng của bacteriocin là lĩnh vực lớn, nghiên cứu sự ức chế các tác nhân gây bệnh và
các vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm trong suốt quá trình chế biến (Hình 1). Bacteriocin đã được
khảo sát triệt để là Lantibiotic nisin và Lacticin 3147, một số lớp IIa của bacteriocin pediocinlike. Trong số các peptide vòng, Enterocin AS-48 đã được chứng minh rất hiệu quả chống lại sự
gây hư hỏng với phạm vi rộng của các tác nhân gây bệnh trong một số thực phẩm bao gồm cả
sữa, thịt và sản phẩm rau củ. Về cơ bản bacteriocin được ứng dụng trong 3 dạng khác nhau:
1.Trong sản xuất tại chỗ và bảo vệ mẻ nuôi cấy.
2. Như một thành phần (một giống vi khuẩn được dùng để lên men).
3.Như một chất phụ gia trong khâu tinh sạch hoặc bán tinh sạch.
Trong sản xuất in situ, bacteriocin thì phù hợp về mặt công nghệ sản xuất và dễ sinh lợi
nhuận. Staphylococcus aureus trong phomat đông tụ acid và C. tyrobutyricum trong phomat bán
cứng bị ức chế bởi nisin trong sản xuất sữa (Rilla, Martinez, Delgado, Rodriguez, 2003; Rilla,
Martinez Rodriguez, 2004). Có thể bảo vệ mẻ nuôi cấy vi khuẩn, nó không góp phần vào tính
cảm quan của thực phẩm mà chủ yếu được ứng dụng để nâng cao chất lượng vệ sinh của thịt
chưa qua xử lí và sản phẩm cá (Devlieghere, Vermeiren, and Debevere, 2004). Việc sử dụng
bacteriocin như một thành phần hay chất phụ gia đòi hỏi phải có chiến lược mới để sản xuất quy

mô lớn phù hợp với chi phí thấp. Một ví dụ, Lacticin 3147 và Enterocin AS-47 đã được sản xuất
trong sữa gầy như là một thành phần sữa (Ananou et al., 2008; Morgan, Galvin, Kelly, Ross, and
Hill, 1999). Việc sử dụng whey như một cơ chất là một sự lựa chọn hấp dẫn bởi vì nó cũng góp
phần tái sử dụng sản phẩm phụ của ngành công nghiệp sữa.
Bên cạnh bảo quản thực phẩm, Bacteriocin còn đẩy nhanh sự chín phomat bằng cách thúc đẩy
giải phóng enzyme trong tế bào vào khối phomat và sau đó sự bay hơi làm gia tăng nồng độ các
hợp chất làm phomat chín và tăng tính cảm quan (Martinez-Cuesta, Requena and Pelaez, 2006).
Bacteriocin tạo ra cũng đã giữ lại hệ vi sinh vật tự nhiên và đảm bảo các sản phẩm lên men đồng
nhất (Ryan, Ross, and Hill, 2001). Thực phẩm được đánh dấu dựa trên protein miễn dich
Bacteriocin có khả năng thay thế kỹ thuật gen để chon lọc các kháng sinh của thực phẩm liên
quan đến Bacteriocin.

6


(theo thứ tự từ trên xuống: bacteriocin, bacteriophage, endolysin)
B. BACTERIOPHAGE
1. Thể thực khuẩn và chu kỳ kháng khuẩn của chúng

Thể thực khẩn hoặc thực khuẩn là các vi sinh vật khá phổ biến trên thế giới (10 31 hạt) và
lan truyền rộng rãi trong các loại thực phẩm có nguồn gốc khác nhau (Brussow & Kutter, 2005).
Thể thực khuẩn là virus lây nhiễm đặc biệt và nhân lên trong vi khuẩn. Vì vậy, chúng vô hại cho
con người, động vật và thực vật. Các thực khuẩn phân thành 13 họ dựa trên các hình dạng, kích
thước, loại axít nucleic và sự hiện diện/vắng mặt của màng hoặc lipid trong cấu trúc. Hầu hết
chúng thuộc về trình tự Caudovirales (5360 hoặc 5568 báo cáo đến nay) với một đầu là
icosahedral (cấu trúc đa diện) bọc bộ gene, một đuôi và một DNA sợi đôi (hình 2a). Theo các
tính năng hình thái của đuôi, chúng được phân chia thành ba họ: Myoviridae (đuôi co được),
Siphoviridae (đuôi dài không co), và Podoviridae (đuôi rất ngắn). Phần còn lại của thực khuẩn là
các khối, các sợi, hoặc thực khuẩn đa kiểu hình với xoắn đôi DNA, DNA xoắn đơn, RNA xoắn
đôi, hoặc RNA xoắn đơn (Ackermann, 2007).

7


Tùy thuộc vào điều kiện sống, thể thực khuẩn được chia ra thành thực khuẩn độc hại và
ôn hòa (hình 2b). Thể thực khuẩn gây độc tuân theo chu kỳ sinh tan (lytic cycle) theo đó chúng
nhân lên trong tế bào vi khuẩn để giải phóng các thực khuẩn con. Ngược lại, các thể thực khuẩn
ôn hòa có thể đi vào chu kỳ tiềm tan bằng cách chèn DNA của nó vào nhiễm sắc thể của vi
khuẩn (tiền thực khuẩn) để sao chép như một phần bộ gen của vật chủ cho đến khi nó được tác
động để nhập các chu kỳ sinh tan.
Lưu ý, vi khuẩn lysogenic trở nên miễn dịch chống lại sự nhiễm khuẩn lần 2 (bội nhiễm)
với cùng một thể thực khuẩn giống nhau hoặc tương tự nhau.
Chu kỳ sinh tan được chia thành nhiều giai đoạn (hình 2b). Trước tiên, phage bám vào tế
bào chủ ở các điểm nhận, phần trung gian của đuôi liên kết protein (protein này nhận biết thụ thể
đặc trưng của vi khuẩn). Sau đó, thể thực khuẩn sẽ tiêm axit nucleic vào tế bào chủ và nó được
sao chép nhờ RNA polymerase của các tế bào chủ. Nhờ bộ máy di truyền của tế bào chủ, bộ gen
của thể thực khuẩn được nhân lên nhiều bản sao và tổng hợp protein mới để sản xuất các protein
cấu trúc nên thể thực khuẩn, lắp ráp vào virion mới, và ly giải protein đó, cuối cùng, vi khuẩn
chủ sẽ bị tan.
Bước ly giải cuối cùng là chính xác, nơi cư trú các hoạt động kháng khuẩn của thể thực
khuẩn. Trong thực tế, thể thực khuẩn đã được sử dụng rộng rãi ở Liên Xô cũ để điều trị nhiễm
trùng của con người. Kết quả của họ chắc chắn chỉ ra rằng thể thực khuẩn là phù hợp với điều trị
lâm sàng hay dự phòng bệnh truyền nhiễm gây ra vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Hanlon,
năm 2007; Sulakvelidze & Kutter, 2005)
2. Các ứng dụng hiện tại của thực phẩm dựa trên vi khuẩn
Khái niệm về cuộc chiến chống tác nhân gây bệnh trong thực phẩm bằng cách sử dụng thể
thực khuẩn chỉ xuất hiện gần đây, nhưng một vài ứng dụng dọc theo chuỗi thức ăn đã được tiếp
cận (bảng 2) và một số công ty đã bắt đầu đầu tư vào công nghệ thể thực khuẩn (Garcı ´a, Martı
´nez, Obeso, & Rodrı ´guez, 2008)

8

Hình 2:Cấu trúc của một vi khuẩn có đuôi điển hình (a) và các bước trong chu kỳ ly giải vi
khuẩn và chu kỳ tiềm tan (b). Các thể thực khuẩn ôn hòa có thể thực hiện theo các chu kỳ
lysogenic bằng cách tích hợp vào hệ gen của vật chủ. Sau khi nhiễm trùng, hoặc prophage kích
hoạt.

Thể thực khuẩn rất thích hợp i) để ngăn ngừa hoặc giảm bớt sự tạo dòng và bệnh trong
chăn nuôi ( liệu pháp thể thực khuẩn) ii) để làm sạch xác và các sản phẩm thô khác, chẳng hạn
như hoa quả tươi và rau quả, và khử trùng thiết bị và liên hệ với bề mặt (phage vệ sinh sinh học),
và iii) tăng thời hạn sử dụng, sản xuất loại thực phẩm như chất bảo quản tự nhiên (phage kiểm
soát sinh học )
Thể thực khuẩn đã được áp dụng để giảm mầm bệnh chuyển trong chăn nuôi và cũng sau
khi giết mổ hay vắt sữa. Một số nghiên cứu đã được thực hiện để chữa trị bệnh ở gà với thể
kháng khuẩn chống lại Salmonella (Fiorentin, Vieira, & Barioni, 2005) và Campylobacter
(Atterbury và ctv., 2005); để chữa trị cho động vật nhai lại với thể kháng khuẩn nhằm mục tiêu
chống lại E. coli gây bệnh (Raya và ctv., 2006). Sau khi sử dụng thể thực khuẩn thì vi khuẩn
giảm đáng kể, đặc biệt là sử dụng trước khi giết mổ. Thể thực khuẩn cũng đã tác động trên sản
phẩm cắt tươi (Leverentz và ctv., 2003). Các thể thực khuẩn khác được dùng để chống lại các
bệnh thực vật do vi khuẩn, ví dụ như AgriPhage thương phẩm (Intralytix) để chống lại bệnh đốm
cà chua và tiêu. Trong cùng một dòng, thể kháng khuẩn dựa trên biosanitation đã được đề xuất
9


để giảm sự hình thành màng sinh hoc (Azeredo & Sutherland, 2008) hoặc để xóa bỏ hoặc giảm
thiểu S. aureus mũi hoặc da trong xử lý thực phẩm (Mann, 2008).
Bằng chứng thực nghiệm các hoạt tính kháng khuẩn của thể thực khuẩn trong chế biến
thực phẩm và lưu trữ vẫn khan hiếm nhưng kết quả đáng khích lệ. Các đặc trưng chính của thể
thực khuẩn, đôi khi bị giới hạn đến một vài chủng, đặt ra một gánh nặng cho việc sử dụng rộng
rãi thể thực khuẩn như là chất bảo quản sinh học. Việc kết hợp thể thực khuẩn vào sữa nhiễm

Salmonella để sản xuất phô mai dày giảm khả năng sống của tế bào sau khi lưu trữ (Modi, Hirvi,
Hill, & Griffiths, 2001). Tương tự, S. aureus tăng trưởng trong sữa và trong thời gian sản xuất
curd (sữa đông tụ) bị ức chế bằng thể thực khuẩn (Garcı ´a, Madera, Martı ´nez, & Rodrı ´guez,
năm 2007; Garcı ´a, Madera, Martı ´nez, Rodrı ´guez & Sua ´rez, 2009) và ức chế quá trình chín,
và lưu trữ của các axit coagulated (đông tụ) và phomát bán cứng (chưa được công bố kết quả
của mình). Ứng dụng trên bề mặt của phage P100 gây độc diệt trừ hoàn toàn Listeria
monocytogenes, tùy thuộc vào liều lượng và cách xử lý bề mặt pho mát chín (Carlton,
Noordman, Biswas, de Meester, & Loessner, 2005). Ví dụ khác của phage trong bảo quản sinh
học là sự ức chế Enterobacter sakazakii trong hoàn nguyên sữa bột cho trẻ sơ sinh (Kim,
Klumpp, & Loessner, 2007) và Salmonella typhimurium trên xúc xích gà mỏng của Đức
(frankfurters) (Whichard, Sriranganathan, & Pierson, 2003)).
Gần đây,hỗn hợp hai thể thực khuẩn kháng L. monocytogenes, Listex (EBI Food Safety,
www.ebifoodsafety.com) và LMP 102 (Intralytics, www.intralytics.com) đã được Cục Quản lý
Dược và quản lý Thực phẩm (FDA) phê duyệt trên thịt. Năm 2007, OmniLytics Inc
(www.omnilytics.com) đã nhận được FDA chấp thuận cho thể thực khuẩn kháng-E. coli và
kháng -Salmonella xử lý các động vật sống trước khi giết mổ.
Một sự đóng góp của thể thực khuẩn trong an toàn thực phẩm là sử dụng trong việc phát
hiện tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm. Thể thực khuẩn từ lâu đã được sử dụng để phân
loại vi khuẩn và một số phương pháp dựa trên thể thực khuẩn đã được phát triển để phát hiện
các vi khuẩn trong thực phẩm (Hagens & Loessner, 2007). Những phương pháp này về cơ bản
khai thác các đặc trưng thể thực khuẩn.
C. ENDOLYSIN:
1. Cấu tạo và phương pháp hoạt động:
Bacteriophage có hai cách để giải phóng những virion mới từ tế bào vi khuẩn bị nhiễm. Ở
bacteriophage dạng sợi đẩy vật chất di truyền của nó vào tế bào vi khuẩn mà không làm chết tế
bào chủ (lysogenic cycle). Nhưng ngược lại, Bacteriophage không có dạng sợi xâm nhập vào tế
bào tiết enzyme để phá hủy màng (lytic cycle). Những đoạn RNA, DNA nhỏ mã hóa những
protein cản trở enzyme chịu trách nhiệm sinh tổng hợp. Ở phần lớn DNA phage, endolysin (cũng
là yếu tố phá hủy tế bào có giới hạn) được sản xuất trong suốt giai đoạn truyền đạt gene thuộc
pha trễ trong chu trình lytic và chịu trách nhiệm của enzyme chia cắt lớp petidoglycan. Endolysin

cũng có khả năng làm tan rã lớp peptidoglycan cuả vi khuẩn G(+) khi nó tác động bên ngoài tế
bào vi khuẩn, bẳng cách đó, nó tác động như tác nhân diệt khuẩn.
10


Phần lớn Endolysin thiếu tín hiệu kích thích bài tiết và sự xâm nhập vào lớp peptidoglycan
của chúng vào tế bào thì phụ thuộc vào những protein kỵ nước, holins giới hạn (term holins),
chất cho phép phân tử endolysin vượt qua màng tế bào chất và vào được màng tế bào. Một số
endolysin khác thì có những tín hiệu peptide có khả năng xâm nhập vào tế bào chủ.
Tùy thuộc vào enzyme đặc trưng, endolysin được chia thành 5 loại chính:
 N-acetylmuramidases (lysozymes)
 Endo-b-N-acetylglucosaminidases
 Lytic transglycosylases, chia đôi toàn bộ khung đường của peptidoglycan
 Endopeptidase, chia đôi peptide.
 N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase, cắt liên kết amide giữa 2 nửa.
Đáng chú ý là muramidase và amidase thủy phần hầu hết các liên kết bảo tồn (conserved
bond) trong peptidoglycan dường như phổ biến nhất. Peptidoglycan bị hư hại dẫn đến tế bào bị
phá vỡ trong môi trường nhược trương. Vài endolysin chứa trình tự C-terminus giống với vài
loại peptide (tích điện +) chống khuẩn bằng cách phá màng tế bào vi khuẩn.
Endolysin Gram(+) thể hiện cấu trúc phân tử gồm có ít nhất là 2 vùng chức năng rõ ràng.
Vùng N-terminal chứa hoạt tính xúc tác, phần lớn là hoạt tính muralytic nhưng với cả hai chức
năng cũng đã được miêu tả. Tại đầu C-terminus, một vùng nối vách tế bào (CBD- cell wall
binding domain) đưa ra vài mức độ đặc trưng đối với enzyme. Bên cạh đó, CDBs duy trì sự kết
dính chất nền của endolysin một khi tế bào chủ bị ly giải. Bằng cách này, endolysin không được
giải phóng tự do vào môi trường. CDBs thì không thường thấy từ endolysin của phage Gram(-).
Hầu hết endolysin thể hiện phổ hoạt tính lytic hẹp thường có số lượng loài vi khuẩn chủ
thể của phase khá hạn chế, ngoại trừ một vài giống đặc biệt. Một ngoại lệ là yếu tố tiêu hủy
(lysin) phase cầu khuẩn không những tiêu giải cầu khuẩn ruột mà còn cả Streptococus pyogenes,
streptococci nhóm B và S. aureus, vì thế nó là lysin có hoạt tính rộng nhất được biết cho đến nay.
Những ứng dụng trong công nghệ thực phẩm của endolysin:

Hầu hết các công trình chứng minh vai trò của endolysin như là một chất diệt khuẩn mạnh
mẽ đều tập trung vào phòng ngừa và điều trị mẫu động vật nhiễm khuẩn. Nghiên cứu trong lĩnh
vực bảo quản thực phẩm vẫn còn ở những bước khởi đầu. Tuy nhiên, số lượng endolysin hoạt
động chống lại mầm bệnh xâm nhập thực phẩm và động vât đã được phân lập và mô tả ngày
càng tăng và thấy được khả năng ứng dụng trong tương lai. Sự đề cập đáng giá cho đến bây giờ
là chưa có sự kháng endolysin được báo cáo dù nó có được cho tiếp xúc với điều kiện môi
trường lặp đi lặp lại hay bị kích thích đột biến. Mặc dù hơi sớm để hoàn toàn tin chắc, nhưng khi
không bị kháng lại thì đó (endolysin) thực sự là một lợi thế so với các yếu tố kháng khuẩn khác.
Một vài báo cáo được phát biểu gần đây về tiềm năng kháng khuẩn tại chỗ (in situ) của
endolysin trong chuỗi thực phẩm. Ở những bước sản xuất đầu tiên, sự bảo vệ để chống lại tác
nhân gây bệnh trên thực vật Erwinia amylovora đã được chứng minh trong việc chuyển gene T4
lysozyme ở khoai tây hoặc bằng ứng dụng bề mặt của endolysin phiEa1h tái tổ hợp trên trái lê.
11


Việc chuyển gen biểu hiện hoạt tính endolysin ở bò cũng có thể hạn chế bệnh viêm vú và giảm
nhiễm S. aureus trong sữa. Như là một thước đo phòng bệnh (as a prophylactic measurement),
endolysin PlyC bay hơi góp phần tiêu diệt hoặc giảm Streptococcus equi của nhiều vật liệu khác
nhau thậm chí nó có mặt trong chất tẩy không ion hóa (non ionic detergent), nước cứng, hoặc vật
liệu hữu cơ. Tương tự, một endolysin của tụ cầu khuẩn có thể loại bỏ lớp màng sinh học
S.aureus.
Trong chế biến thực phẩm, kiểm soát các mối nguy sinh học bằng endolysin gần như là
bước cơ bản trong sản xuất. Pioonering đã tiến hành thí nghiệm với phage endolysin LysH5 của
tụ cầu. Endolysin tinh khiết diệt S.aureus trong sữa thanh trùng, mặc dù tổng số cao hơn so với
kết quả in vitro cần thiết. LAB tái tổ hợp có thể tiết ra endolysin Listeria nhưng hoạt tính trong
sữa của chúng hoặc trong các thực phẩm khác thì chưa được đánh giá.
Một vai trò của endolysin trong bảo quản thực phẩm là nhờ CBDs (vùng nối vách tế bào).
Những vùng nhận biết này thường phát triển nhanh chóng, dễ dàng định danh và phát hiện.
CBDs tái tổ hợp được cố định trong các hạt Magnetic và có thể được thu hồi hơn 90% của
L.monocytogenes trong mẫu thực phẩm.

D. CHỦ ĐỀ CHO TƯƠNG LAI:

Mặc dù với những kiến thức về chất kháng khuẩn (bacteriocin), thể thực khuẩn (bacteriophage)
và sự quan tâm ngày càng tăng dành cho nội tiêu tố (endolysin), vẫn còn nhiều điều cơ bản và
vấn đề ứng dụng liên quan đến khai thác đầy đủ tiềm lực kháng khuẩn của chúng trong an toàn
thực phẩm cần tìm hiều thêm. ( Bảng 3 ).

Đề tài nghiên cứu trên hoạt chất kháng khuẩn, thể thực khuẩn và endolysins được hướng đến trong
tương lai.
Đề tài
Nghiên cứu cơ bản
Cơ chế đề kháng

Chất kháng khuẩn mới
Tính an toàn

Vấn đề cụ thể
Bacteriocin

Phage/endolysin

Truyền của miễn dịch; kháng chéo; Hoạt hoá thực khuẩn (lysogeny), cơ sở
thụ quan hoạt chất kháng khuẩnphân tử của vật chủ tính đặc hiệu và tần
(receptor)
số đột biến
Kỹ thuật protein

Protein không rõ phage với hoạt tính
kháng siêu vi /vùng dao động.

Ảnh hưởng trong phức hợp sinh thái Vai trò của phage trong DNA trao đổi và
(GT,
thực
phẩmvật chủ độc lực ; độc tính.
lên men) ; độc tính.
12


Nghiên cứu ứng dụng

Bacteriocin/bacteriophage/endolysin

Chế biến thực phẩm

Ảnh hưởng của khung thức ăn và chế biến thực phẩm ( tạo mô hình ); Sử dụng
công nghệ rào chắn; Diệt màng sinh học và hệ thống vệ sinh sinh học.

Lĩnh vực chưa được khai Sự ủ xilô, sản xuất hữu cơ.
thác
GT, đường dạ dày - ruột.

Nhu cầu đặc biệt trong nghiên cứu cơ bản có thể là tập hợp lại trong ba lĩnh vực chính :
i)
ii)
iii)

Cơ chế đề kháng
Mới hoặc cải tiến tính kháng khuẩn
Mối quan tâm về vấn đề an toàn khi sử dụng chất bảo quản sinh học này.

Sự đề kháng là mối quan tâm chính trong ngiên cứu chất bảo quản sinh học mới. Trong điều kiện
thí nghiệm, sự mô phỏng bacteriocin có thể thực hiện dễ dàng.Tuy nhiên, người ta chưa biết
nhiều về sự miễn dịch chất kháng khuẩn và khả năng chuyển gene. Đáng chú ý là, mặc dù nisin
được sử dụng rộng rãi như chất bảo quản thực phẩm bằng phương pháp sinh học, nhưng vẫn
chưa xảy ra vấn đề kháng. Tuy vậy, hậu quả của việc thích nghi bacteriocin cần phải được xem
xét khi sử dụng kết hợp, hiện tượng kháng chéo có thể xảy ra. Số lượng lớn vật liệu công nghệ
( omics ) sẽ làm rõ cách tế bào đáp lại bacteriocin như thế nào. Tính kháng cũng ảnh hưởng đến
bacteriophage. Tuy nhiên, sức đề kháng phage có thể giảm khả năng sống hoặc độc lực của vi
khuẩn và việc sử dụng hỗn hợp thực khuẩn thể giảm khả năng đề kháng. Hơn nữa, tần số biến
đổi của phage cao hơn đáng kể so với vi khuẩn và sự chọn lọc phage mới có thể dễ dàng thắng
được sức đề kháng vi khuẩn. Khả năng tạo phage phân huỷ vi khuẩn (lysogeny) cũng khiến cho
vi khuẩn chống lại sự nhiễm lần hai, do đó các phage chịu nhiệt cần phải ngăn ngừa.
Kỹ thuật sinh học phân tử và khả năng di truyền đã đưa ra hướng mới để phát triển chất kháng
khuẩn: bacteriocin, bacteriophage, endolysin. Bacteriocin và endolysin phù hợp cho DNA thay
đổi (DNA shuffling) và kỹ thuật protein có khả năng tạo ra biến thể rất hiệu quả với phổ hoạt
tính mở rộng. Thể thực khuẩn cũng có thể biến đổi gen để thoả mãn yêu cầu mở rộng phổ kí chủ.
Ngoài ra, thực khuẩn thể được mã hoá bởi các protein hoặc peptide khác ức chế sự sinh trưởng
của vi khuẩn khi bị nhiễm trùng cũng như virion-liên kết enzym thủy phân peptidoglycan, một
hợp chất chịu trách nhiệm về " sự phân giải từ bên ngoài " và enzym liên quan đến sự thoái biến
của polysaccarit bề mặt. Tất cả chúng có thể là được xem như kháng khuẩn tương lai.
Nếu xét về việc sử dụng bacteriocin, bacteriophage, endolysin như là chất phụ gia thực phẩm,
điều quan trọng là phải chú ý đến hiệu quả hấp thu qua đường miệng. Thể vùi của dòng tạo
13


bacteriocin trong probiotic có vai trò như sinh thái học, hoạt động phức hợp ở đường dạ dày ruột. Công cụ phân tử mới để nghiên cứu vi sinh vật đường ruột sẽ rất hữu ích. Nghiên cứu chi
tiết hơn về các chất độc đối với tế bào và sự tạo miễn dịch cũng rất cần thiết ( Jasniewski,
Cailliez - Grimal, Chevalot, Milliere, & Revol - Junelles, 2009 ). Cho đến nay, không thấy sự mô
tả ảnh hưởng ngược của thể thực khuẩn đường ruột-dạ dày ( Bruttin & Bru ¨ssow, 2005 ). Trái
lại, không có dữ liệu có giá trị về endolysin, cho dù không có dấu hiệu của sốc mẫn cảm sau khi

vào cơ thể nói chung và màng nhầy( Fischetti, 2008 ). Vấn đề an toàn khác liên quan đến sử
dụng bacteriophage là phải phân tích cẩn thận trước khi chọn chất bảo quản sinh học. Điều này
bao gồm sự hiểu biết sâu về vai trò của thể thực khuẩn gây độc và trao đổi DNA. Thể thực khuẩn
có thể mang gien có hại và thậm chí một số có thể thúc đẩy chuyển gene.( Novick & Cheng,
2009 ).
Căn cứ theo thực tế, sự nỗ lực chủ yếu để cải tiến hiệu quả của chất bảo quản sinh học trong
khung thức ăn như: chất có hoạt tính kháng khuẩn tại chỗ (in situ). Thành phần thức ăn, khối
lượng vi khuẩn, và công nghệ đã được trình bày để gây trở ngại lớn với hoạt tính bacteriocin (reviewed by Ga ´lvez et al., 2007). Nó cũng áp dụng cho thể thực khuẩn khi bị nhiễm liên quan với
vật chủ, gây cản trở trong môi trường bán rắn hay rắn như là thức ăn. Nhiều biến số khác như là
tỉ lệ sự hấp thụ, cỡ phá, thời kỳ tiềm tàng, liều lượng thực khuẩn ban đầu, nồng độ vi trùng, v.v
cũng là được nêu ra . Tất cả tham số tới hạn này có thể là mô hình mẫu (Cairns, Timms, Jansen,
Connerton, &Payne, 2009). Tuy nhiên, sự hiểu biết sâu sắc về động lực học của nhiễm trùng
thực khuẩn thể trong chuổi thức ăn khác nhau vẫn còn thiếu sót.
Hiện nay, cải thiện công nghệ bảo quản chủ yếu tập trung vào công nghệ tấm rào. Hoạt chất
kháng khuẩn bacteriocin đã được kết hợp thành công với công nghệ khác. Chúng đã được kết
hợp chặt chẽ vào màng bao gói và kết hợp với điều chỉnh khí(MAP). Bacteriocin cũng giúp tạo
điều kiện ít khắc nghiệt hơn so với phương pháp bảo quản truyền thống ( nghĩa là dùng ít hoá
chất chất bảo quản hoặc xử lý nhiệt thấp ) giúp tiết kiệm năng lượng và chi phí. Chúng cũng hỗ
trợ công nghệ bảo quản mới như là áp suất thủy tĩnh cao và xung điện trường cho thấy ảnh
hưởng điều phối ( Ga ' al lvez et., 2007 ). Trái lại, sử dụng bacteriophage và endolysin trong
công nghệ tấm rào ( hurdle technology) hầu như không được tìm hiểu nhưng nó rất có triển
vọng. Bacteriophage và endolysin đã được kết hợp thành công với nisin và áp suất thủy tĩnh cao
cải tiến hoạt tính endolysin bằng làm peptidoglycan của Gram âm dễ tiếp cận (Briers et al.,
2008). Bacteriophage và endolysin đã được đề nghị như là thuốc khử trùng trong môi trường
thực phẩm, bao gồm nhà sản xuất thức ăn, nhưng chiến lược phân phối phải được triển khai.
Trong chuỗi thức ăn, có nhiều lĩnh vực chưa được khai thác trong đó có chất kháng khuẩn tự
nhiên. Chẳng hạn như, lên men xi-lô (silage) khởi xướng sử dụng bacteriocin. Hơn nữa, hoạt
chất kháng khuẩn tự nhiên này phù hợp với sản xuất thực phẩm nuôi trồng tự nhiên, do đó
khuyến khích ngành công nghiệp thực phẩm bảo vệ môi trường.
Hy vọng tương lai gần cơ sở phân tử của bacteriocin- bacteriophage- endolysin được hiểu biết

sâu và tốt hơn giúp thức ăn an toàn hơn. Dựa trên nền tảng tri thức tiếp cận được, chiến lược về
14


chất bảo quản sinh học mới cũng như ứng dụng công nghệ sinh học kháng khuẩn tự nhiên được
vạch ra.

15