SỬ DỤNG ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC: TRIỂN VỌNG VÀ VẤN ĐỀ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ

KHOA SINH HỌC

TIỂU LUẬN
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
SỬ DỤNG ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN TRONG CÔNG NGHỆ
SINH HỌC: TRIỂN VỌNG VÀ VẤN ĐỀ

Giảng viên hướng dẫn
PGS. TS. Trần Quốc Dung

Học viên thực hiện
Nguyễn Thị Hoài Phương
Hà Thị Nghĩa
Lớp: Động vật học và lý luậnphương pháp – K24

1


SỬ DỤNG ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC:
TRIỂN VỌNG VÀ VẤN ĐỀ
O. G. Maksimenko1, A.V. Deykin1, Yu. M. Khodarovich2, P. G. Georgiev1 *1
Viện Gene Sinh học của Viện khoa học Nga, Vavilov St., 34/5, Moscow, Nga,
119.3342
Shemyakin - Ovchinnikov Viện Bioorganic Hóa học của Viện khoa học Nga,
Miklucho - Maklai St., 16/10, Moscow, Nga, 117.997
* E - mail:
Đã nhận 2012/06/28
TÓM TẮT : Trong hai thập kỷ qua, đã có nhiều nỗ lực sử dụng động vật để sản
xuất tái tổ hợp protein của con người và các kháng thể đơn dòng. Tuy nhiên, gần

đây chỉ có hai thuốc Thera - peutic đầu tiên được phân lập từ sữa của động vật biến
đổi gen, chất ức chế C1 ( Ruconest ) và antithrombin ( ATryn ), xuất hiện trên thị
trường. Điều này tạo cảm hứng hy vọng rằng một số lượng đáng kể của protein tái
tổ hợp mới tạo sử dụng công nghệ như vậy có thể trở thành có sẵn cho sử dụng
thực tế trong tương lai gần. Trong bài đánh giá này, mô tả các phương pháp áp
dụng để tạo ra động vật chuyển gen và thảo luận những lợi thế và hạn chế liên
quan đến việc sử dụng chúng cho sản xuất protein tái tổ hợp của con người và các
kháng thể đơn dòng.
TỪ KHÓA: bioreactor ; sản xuất protein sữa ; sản xuất kháng thể đơn dòng ;
protein

tái

tổ

hợp

;

thuốc

chữa

bệnh;

động

vật

biến

đổi

gen.

VIẾT TẮT: mAbs - kháng thể đơn dòng ; MI - vi tiêm trong nhân của DNA ; NT
- chuyển nhân ; RP - protein tái tổ hợp ; RHA - albumin tái tổ hợp người; rhBChE 2


butyrylcho - linesterase tái tổ hợp người; TA - động vật chuyển gen ; FDA - Thực
phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ; EMEA - Cơ quan thẩm đinh y học Châu Âu; CHO tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc ; tế bào ES - tế bào gốc phôi ; UTR –
vùng gen chưa dịch mã.
Sau khi biểu hiện thành công protein tái tổ hợp (RPs ) đầu tiên ở vi khuẩn và nấm
men, rõ ràng là với một số lượng lớn như vậy các protein tái tổ hợp của con người
không

thể

sản

xuất

có

hiệu

quả

bằng

hệ

thống

đó.

Như vậy, protein của con người không trải qua những sửa đổi sau phiên mã
như ở tế bào vi khuẩn, và bản chất sự sửa đổi trong tế bào nấm men so với sự diễn
ra ở tế bào người là khác nhau. Ngoài ra, các hệ thống biểu hiện có thể không phù
hợp của một số protein tái tổ hợp phức tạp của con người. Do đó, cộng đồng nghiên
cứu phải đối mặt với những thách thức của việc phát triển các hệ thống biểu hiện
thay thế có khả năng đảm bảo sửa đổi chính xác trong protein tái tổ hợp. Kết quả là
sự phát triển đồng thời của hai mô hình công nghệ ( dựa trên biến đổi gen động vật
và nuôi cấy tế bào động vật có vú) được bắt đầu.
Sự sản xuất thành công động vật có vú chuyển gen đầu tiên bằng các vi tiêm
của biến đổi gen cấu trúc vào nhân con ở hợp tử chuột được thực hiện hơn 20 năm
trước. Một số lượng lớn động vật biến đổi gen (TAs) đã được tạo ra nhằm mục đích
khoa học, để cải thiện vật nuôi và sản xuất protein tái tổ hợp. Cho đến cuối thế kỷ
trước, chuyển gen ở động vật đã được coi là mô hình triển vọng nhất cho sản xuất
protein tái tổ hợp người và các kháng thể đơn dòng (MAbs ). Cho đến bây giờ, nuôi
cấy tế bào động vật có vú (tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc (CHO) đóng
một vai trò thống lĩnh trên thị trường sản xuất protein tái tổ hợp.
Như vậy, 312 sản phẩm điều trị đã tạo ra, sử dụng các sinh vật sống được đưa vào
thị trường Hoa Kỳ năm 2012 [10]. Trong số đó có 193 sản phẩm đã thu được từ sử
3


dụng nuôi cấy tế bào động vật có vú, và 42 sản phẩm đã được sản xuất bằng cách
sử nuôi cấy tế bào chuột túi Trung Quốc. Cho đến năm 2006, cơ quan thẩm định y
học Châu Âu (EMEA) đã chấp thuận chất chống đông máu, các protein tái tổ hợp

đầu tiên có nguồn gốc từ sữa dê chuyển gen [11]. Sau đó, protein này được cục
Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận cho thương mại
hóa, như một loại thuốc ngăn ngừa đông máu ở những bệnh nhân thiếu hụt chất
chống đông máu di truyền. Năm 2011, EMEA đã phê duyệt sử dụng các chất ức
chế tái tổ hợp C1-esterase, lấy từ thỏ để điều trị phù mạch di truyền.
Sự xuất hiện trên thị trường các sản phẩm điều trị đầu tiên sản xuất sử dụng
công nghệ chuyển gen động vật và sự tán thành sử dụng protein tái tổ hợp cho y
học, cho thấy có thể tạo ra chỗ đứng đáng kể công nghệ sinh học trong tương lai
gần.

Một số công ty công nghệ sinh học (PPL Therapeutics (Anh ), GTC
Biotherapeutics (USA ) (được mua lại bởi LFB công nghệ sinh học, Pháp, năm
4


2010), Hematech (Mỹ ), Genzyme (Mỹ ), ZymoGenetics (Mỹ ), Nexia Công nghệ
sinh học (Canada), Pharming (Hà Lan), BioProtein Technologies (Pháp), Avigenics
(Mỹ), Viragen (Mỹ), và TranXenoGen ( USA) đang tích cực phát triển công nghệ
này. Những đánh giá này bàn về các vấn đề chung đằng sau việc tạo ra động vật
chuyển gen để sản xuất protein tái tổ hợp người và các kháng thể đơn dòng.
CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÍNH ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ SẢN XUẤT ĐỘNG
VẬT CHUYỂN GEN
Các phương pháp hiện đại cho phép nhận được protein tái tổ hợp trong sản
xuất chăn nuôi có chứa các yêu cầu gen chuyển trong tất cả các tế bào của cơ thể
của chúng và chuyển qua cho con cái của chúng gồm vi tiêm DNA trong nhân của
hợp tử (MI) và chuyển nhân tế bào soma (NT). Ngày nay, vi tiêm DNA vào tiền
nhân của một hợp tử là phương pháp thường được sử dụng nhất[12] (Hình. 1). Khi
nó đi vào nhân tế bào, DNA là tuyến tính có khả năng tích hợp vào hệ gen của các
dòng tế bào hoặc các sinh vật sống [13]. ADN thường được tích hợp vào vùng gen
nghèo không hoạt động phiên mã và vào dị nhiễm sắc.Từ một đến một số hoặc

thậm chí hàng trăm bản cấu trúc tiêm có thể tích hợp vào một vị trí gen.
Công nghệ này ban đầu được thử nghiệm trên chuột, và nó vẫn còn là một
phương pháp đáng tin cậy cho sản xuất các động vật biến chuyển gen. Phương
pháp này đã được sử dụng đầu tiên để sản xuất động vật chuyển gen trong nông
nghiệp. Tuy nhiên, vi tiêm (MI) hiện được sử dụng chủ yếu để sản xuất một số loài
chuyển gen như chuột, thỏ và lợn. Phương pháp này hiệu quả chưa cao do sự kết
hợp của DNA tái tổ hợp vào hệ gen và sự sẵn có của hợp tử ở hai giai đoạn tiền
nhân. Kết quả phụ thuộc vào việc thực hiện các quy trình phẫu thuật với số lượng
lớn, trong đó đòi hỏi sự cần thiết phải giữ một số lượng đáng kể (200-300) của vật
nuôi thử nghiệm và thực hiện các kỹ năng xử lý động vật. Hơn nữa, cách duy nhất
5


để xác định mức độ biểu hiện của gen chuyển tích hợp là xem xét động vật chuyển
gen ban đầu và con cái của chúng. Các chu kỳ sinh sản ở động vật lớn (bao gồm cả
thời gian trước khi chúng trưởng thành sinh lý và nhu cầu để có được cái sản xuất
protein tái tổ hợp trong sữa từ bản gốc con đực biến đổi gen) là khoảng 0,9 / 2,3
năm đối với dê cái / đực, 1,0 / 2,3 năm cho lợn, và 2,3 / 4,5 năm cho bò. Những hạn
chế này làm tăng chi phí thu thập các động vật chuyển gen ban đầu và thời gian cần
thiết để tổ chức công việc.
Năm 1997, cừu vô tính được sản xuất bởi chuyển nhân (NT) của một tế bào
tuyến vú soma vào một noãn bào [14]. Thành tựu này mở ra khả năng phát triển
sản xuất động vật chuyển gen trong nông nghiệp rẻ hơn và dễ dàng hơn (Hình. 1),
vì hầu hết các thao tác trong trường hợp này được chuyển từ một trang trại đến
phòng thí nghiệm, nơi gây nhiễm của các tế bào soma được thực hiện và nhân bản,
đặc trưng bởi sự tích hợp của gen chuyển vào hệ gen được chọn. Nhân của tế bào
soma sau đó được tiêm vào tế bào trứng đã phá bỏ nhân, được cấy vào cơ thể nhận
cái, tế bào nguyên bào sợi thường được sử dụng cho chuyển nhân. Đa số vật nuôi
lớn được tạo ra gần đây bằng chuyển nhân.
Tuy nhiên, các tế bào chuyển trong trường hợp này được lựa chọn sử dụng

các gen kháng chất kháng sinh, làm phức tạp sự chấp thuận của sản xuất protein tái
tổ hợp bởi FDA và EMEA [15]. Các ptotein màu xanh huỳnh quang (EGFP)
thường được sử dụng tăng cường như là một tác nhân chọn lọc bổ sung để tăng
hiệu quả trong lựa chọn đó. Hệ thống dựa trên vị trí tái tổ hợp đặc hiệu được sử
dụng bổ sung để loại bỏ dấu chọn từ bộ gen của các dòng tế bào được lựa chọn.
Các tác dụng bất lợi của kỹ thuật chuyển nhân bao gồm tỷ lệ sống trong tử
cung thấp và sức khỏe kém các động vật sơ sinh [12]. Điều này làm cho nhân soma
tái lập trình chưa hoàn chỉnh, dẫn đến biểu hiện suy giảm nhiều của các gen cần
6


thiết cho sự tiến triển đúng đắn của phôi. Hơn nữa, quá trình thu thập tế bào trứng
phù hợp và kích hoạt trứng đòi hỏi đáng kể chi phí thời gian và nguồn lực tài chính
Kết quả là, công ty AgroResearch ( New Zealand ) một trong những công ty
lớn trên thế giới chuyên về sử dụng chuyển nhân để sản xuất động vật chuyển gen
trong nông nghiệp đã bác bỏ phương pháp này. Các Công ty hiện đang phát triển
các phương pháp thay thế cho sản xuất động vật biến đổi gen trong nông nghiệp.
Sử dụng công nghệ chuyển gen vào vị trí đặc hiệu của phôi tế bào gốc (ES)
có thể là một thay thế cho các phương pháp vi tiêm và phương pháp chuyển nhân
[18]. Phương pháp này liên quan đến việc chèn của một gen chuyển vào hệ gen của
tế bào gốc phôi, tiếp theo là lựa chọn các dòng vô tính kết hợp đúng đắn với một
số bản sao theo yêu cầu, trước khi các tề bào gốc phôi được đưa vào trong khoang
của một phôi nang, được cấy vào một cơ thể nhận cái.
Sau khi những tế bào được cấy vào buồng trứng của chuột trưởng thành, đến
30% những con chuột sơ sinh có thể mang gen chuyển. Tất cả các xử lý động vật
có thể được thực hiện bằng phương pháp không phẫu thuật, được sử dụng rộng rãi
trong chăn nuôi. Việc sản xuất của gen đòi hỏi một số lượng phôi nang và bầy đàn
thử nghiệm tương đối nhỏ. Tuy nhiên, phương pháp này có chỉ được hoàn thiện cho
chuột nhắt và chuột trưởng thành; dòng tế bào gốc phôi cho vật nuôi vẫn chưa thể
đạt được. Một cách tiếp cận tương tự liên quan đến việc chuyển đổi các tế bào gốc,

tiền thân của tế bào tinh trùng, và tiếp theo họ ghép vào ống sinh tinh của con đực
bị vô sinh [19].
Các phương pháp khác để có được động vật chuyển gen là tương đối hiếm khi
sử dụng. Vì vậy, các động vật chuyển gen có thể được sản xuất một cách hiệu quả
là sử dụng retrovirus có chứa các gen cần thiết [12].Để đạt được mục tiêu này, các
hợp tử đã được loại bỏ màng trong được nuôi cấy trong môi trường bổ sung với các
7


hạt lentivirus, tiếp theo là cấy ghép vào con cái. Sự tích hợp của một đến nhiều bản
sao của gen chuyển xảy ra tùy thuộc vào titer lentivirus; gần như 100% của các con
có thể được biến đổi gen trong trường hợp này [12].
Những lợi thế của phương pháp này bao gồm việc sản xuất hiệu quả của bất
kỳ loài động vật chuyển gen nào và cơ hội để sản xuất động vật chuyển gen chỉ
mang một bản sao gen chuyển, mà đôi khi cần thiết để cho mục đích khoa học.
Những nhược điểm chính của phương pháp này bao gồm không có khả năng sử
dụng các intron hiện diện trong cấu trúc của gen và sự hạn chế chiều dài của các
gen chuyển (khoảng 8000 bp), được xác định bởi kích thước của các hạt virus. Kết
quả là, nó là rất khó khăn để đạt được một mức độ cao về biểu hiện gen chuyển khi
sử dụng phương pháp này.
Một phương pháp đầy hứa hẹn cho việc thu thập động vật chuyển gen là việc
sử dụng vector dựa trên các yếu tố di truyền di động, đó là tích hợp vào hệ gen của
gen nhảy [12]. Các gen mã hóa gen nhảy và gen chuyển hai bên bởi lặp đoạn cuối
của transposase được tiêm vào hợp tử. Phản ứng được xúc tác bởi enzim
transposase trong quá trình tích hợp một bản duy nhất của gen chuyển vào một
hoặc một số vị trí của bộ gen của động vật, phương pháp này đã được sử dụng để
sản xuất vật nuôi lớn (Ví dụ lợn [20] ). Hiệu quả của sự gắn của gen chuyển trong
trường hợp này phụ thuộc vào loại gen nhảy, chiều dài gen chuyển, vị trí của DNA
tiêm, và có thể cao tới 50 % [ 20 ]. Tuy nhiên, không có dữ liệu về mức độ biểu
hiện của gen trong mục tiêu sản xuất các động vật chuyển gen bằng phương pháp

này đã được thu được cho đến nay.
Các nhóm phương pháp dựa trên lây nhiễm các cơ quan hoặc các mô của cơ
thể sinh vật với một bản sao bị lỗi adenovirus có chứa các gen của protein mục tiêu
nên được đề cập cụ thể. Kết quả là việc sản xuất các prooteein tái tổ hợp ngắn hạn
8


không di truyền trong cơ quan hoặc mô đang được xem xét.Hiện nay, nó vẫn rất
khó để so sánh hiệu quả các phương pháp mới và phương pháp truyền thống để
sản xuất động vật biến đổi gen.
CÁC VECTO BIỂU HIỆN ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ TẠO RA ĐỘNG VẬT
BIẾN CHUYỂN GEN
Các vectơ biểu được sử dụng để sản xuất RP trong sữa chứa vùng điều hòa
của gen có protein sản phẩm bao gồm các phần chính của sữa. nhất ví dụ phổ biến
về sau này bao gồm các quy định vùng của gen lactoglobulin cừu, các axit gen
protein của động vật gặm nhấm (chuột, chuột) và thỏ, α-lactalbumin và α-S1-casein
gen của con bò, và các gen β-casein dê [5]. Một vector biểu hiện thường bao gồm
một vùng 5' dài (1-7 kb) trong đó bao gồm một promoter, chất hỗ trợ mô đặc biệt
có thể làm tăng biểu hiện ở tuyến vú, các phi mã hóa đầu tiên exon và intron nằm
giữa chúng (Hình. 2A).

9


Hình 2: Sử dụng vectơ để sản xuất protein tái tổ hợp.
A. Cấu trúc của vectơ được sử dụng trong việc sản xuất protein tái tổ hợp ở động vật
biến đổi gen và các dòng tế bào.

Các intron đầu tiên của gen có khả năng chứa các yếu tố quy định mà có
thể tăng cường phiên mã gen. Các vector biểu hiện cũng bao gồm các khu vực 3'(UTR) chưa được dịch của một gen, có kích thước có thể thay đổi từ 0,5 đến 10 kb

và thậm chí nhiều hơn. Các 3'-UTR thường bao gồm cuối cùng không mã hóa exon
và intron, một vị trí polyadenin hóa và các trình tự liền kề, trong đó có tiềm năng
để tăng cường thúc phiên mã. các khu vực 5' và 3' trong một vector có thể thuộc về
một hoặc gen khác nhau.
Trong số các promoter đã sử dụng để biểu hiện trong tuyến vú, các gen
promoter β-casein là hiệu quả nhất và được sử dụng cho việc sản xuất các protein
trong tuyến vú của chuột, dê,
bò (Bảng 1).
Các vector thương mại phổ biến nhất để sản xuất protein tái tổ hợp trong sữa
của động vật biến đổi gen là pBC1 (Invitrogen) - được sản xuất bằng cách sử dụng
promoter nói trên (Hình. 2B). Vector này cho phép để nhận được hầu hết các dòng
dê chuyển gen đặc trưng bởi một mức độ cao của sự sản xuất protein mục tiêu. khu
vực quy định của gen β-casein với chiều dài 6.2 kb và bao gồm một promoter và

10


một hormone phụ thuộc tăng cường kích thích các promoter chỉ có trong các tế bào
tuyến vú được sử dụng trong vector này [31].
Cấu trúc của vector cũng bao gồm một 3'-khu vực của gen β-casein dài 7,8kb, đảm bảo hiệu quả chấm dứt phiên mã. Sau đó là cần thiết cho sự hình thành của
một mRNA ổn định mã hóa các mục tiêu protein và để phòng ngừa sự phiên mã
của các vùng gen liền kề có khả năng gây ra hình thành các nhiễm sắc dồn nén bởi
sự can thiệp RNA. Để tích lũy protein mục tiêu trong sữa, vùng mã hóa của gen
phải có các trình tự tín hiệu peptide cần thiết cho sự tiết. Trình tự này có thể được
lấy từ bất kỳ gen mã hóa protein được tiết ra.
Tùy thuộc vào mục đích, hoặc là một gen hoàn chỉnh với intron hoặc cDNA
(gen bổ trợ) của nó hoặc một mini-gen chỉ chứa một số các intron được chèn vào
vector. Việc sử dụng của một gen với một cấu trúc exon-intron chưa sửa đổi cho
phép một để nhận được mức cao hơn nhiều protein mục tiêu trong sản xuất động
vật biến đổi gen so với việc sử dụng cDNA [32, 33]. Ví dụ, lactoferrin gen con

người được thể hiện bằng cách sử dụng vector pBC1, trong một số nghiên cứu độc
lập (Hình. 2B). nồng độ lactoferrin tái tổ hợp không quá 4 mg / ml sữa chuột và 0,7
mg / ml sữa dê biến đổi gen nếu cDNA đã được sử dụng để sản xuất các động vật
biến đổi gen (Bảng 1). Chuột chuyển gen này được sản xuất bằng cách sử dụng
lactoferrin bản địa gen với intron (dài 50 kb). nồng độ lactoferrin tái tổ hợp trong
sữa của chúng là cao160 mg / ml (Bảng 1). Dê chuyển gen mang một bản sao cấu
trúc nhưng hiện lên đến 10 mg / ml các lactoferrin con người tái tổ hợp trong sữa
của chúng được sản xuất [22]. Sự khác biệt trong biểu thức lactoferrin tái tổ hợp
bằng cách sử dụng αS1-casein promoter của bò là tương tự (Bảng 1). Ví dụ này
chứng minh rằng sự hiện diện của intron trong mã hóa khu vực của các kết quả gen
chuyển trong một gia tăng gấp hai lần lượng protein mục tiêu trong sữa.
11


Bảng 1. So sánh sản xuất protein tái tổ hợp sữa mẹ ( RP ) ở động vật biến đổi gen
(

TA)

sử

dụng

biến

thể

khác

nhau

của

cấu

trúc

gen

Các vị trí mà tại đó các cấu trúc được tích hợp vào gen đóng một vai trò rất
quan trọng trong việc bảo đảm hiệu quả gen chuyển biểu hiện. DNA tiêm thường
được kết hợp vào các vùng nghèo gen, được đặc trưng do gẫy DNA thường xuyên [
13 ]. Các nhiễm sắc thể trong các vùng thường tạo nên một ảnh hưởng tiêu cực về
sự biểu hiện của gen chuyển tích hợp gần đó. Ngoài ra, nhiều bản sao của các cấu
trúc thường được tích hợp vào vị trí của bộ gen giống nhau dẫn đến đàn áp của
phiên mã do sự hình thành các chất dị nhiễm sắc trong các trình tự lặp đi lặp lại.
Một số yếu tố điều tiết được sử dụng để bảo vệ sự biểu hiện gen chuyển và
duy trì các mối quan hệ trực tiếp giữa số lượng bản sao và mức độ biểu hiện gen
chuyển ở động vật có vú nuôi cấy tế bào : vùng giàu A / T của ADN ; yếu tố điều
12


hòa ( UCOE ) kích hoạt các gen " hộ gia đình" [ 36 ] ; STAR - yếu tố có thể ngăn
chặn sự lây lan của dị nhiễm sắc thể [37 ]; và chất cách điện [38, 39 ].
Trong số các yếu tố điều đã đề cập, chất cách điện được sử dụng trong vector
cấu trúc để sản xuất động vật biến đổi gen. Chất cách điện là những yếu tố quy
định chặn sự tương tác giữa yếu tố tăng cường và một promoter nếu nằm giữa
chúng [40, 41]. Hơn nữa, một số chất cách điện có thể hoạt động như một ranh giới
giữa hoạt động phiên mã nhiễm sắc thể và chất dị nhiễm sắc. Các chất cách điện
từ một cụm gen β-globin của gà (chất cách điện HS4 ) là một trong những chất

cách điện có xương sống được nghiên cứu mạnh mẽ nhất. Nó dài 1200 bp và nằm
ở cuối 5'- β-globin locus [42]. Một khu vực lõi 250-bp dài đặc trưng bởi hoạt động
cách điện hoàn toàn đã được tìm thấy ở trong đó.
Phân đoạn này chứa các vị trí liên kết với các protein CTCF, mà chỉ là chất cách
điện có xương sống đặc trưng protein [43]. Các protein CTCF chịu trách nhiệm cho
khả năng của các chất cách điện HS4. Nó cũng hỗ trợ các protein USF1 và USF2
liên kết với các chất cách điện [44]. Các chất cách điện HS4 trình tự cũng liên kết
với các BGP1 / Vezf1 protein [45], trong đó bảo vệ các trình tự GC-phong phú của
chất cách điện chống methyl hóa, dẫn đến một sự gián đoạn của việc gắn protein
chất cách điện cho ADN và kết quả là, để bất hoạt của các chất cách điện. Theo mô
hình hiện tại, BGP1 / Vezf1 cũng chấm dứt các phiên mã yếu bắt đầu ở vùng dị
nhiễm sắc, mà có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các β-globin
locus chống lại sự lan truyền của nhiễm sắc thể không hoạt động [46]. Các vector
pBC1 xây dựng bởi Invitrogen (USA) cho sản xuất động vật chuyển gen có chứa
hai bản 1.2-kb-dài chất cách điện HS4 tại 5'-cuối của vectơ (Hình. 2B)
Một phân tích toàn diện về tác động của các chất cách điện HS4 về các hoạt
động phiên mã của nhiều nhà tổ chức, bao gồm các promoter β - casein của dê và
13


WAP – promoter của thỏ, chứng minh rằng các chất cách điện đáng kể làm tăng
mức độ biểu hiện gen chuyển và số lượng các dòng biến đổi gen có đặc điểm bởi
một sản đáng kể của protein mục tiêu [22, 47-50]. Trong khi đó, chất cách điện
HS4 không ảnh hưởng đến sự thay đổi của các biểu hiện gen chuyển và biểu hiện
ngoài tử cung của nó ở các mô khác của cơ thể cũng không đảm bảo một tương
quan trực tiếp giữa số bản sao gen chuyển và mức độ biểu hiện. Như vậy, chất cách
điện HS4 hoạt động như một bộ điều chỉnh phiên mã phổ mà có thể được sử dụng
để làm tăng hoạt động của các promoter yếu. Tuy nhiên, nó không cho phép để đạt
được hiệu quả biểu hiện gen chuyển độc quyền trong một tuyến vú, đó là quan
trọng đối với việc sản xuất nhiều protein mục tiêu có thể ảnh hưởng xấu đến sức

khỏe của động vật chuyển gen. Tăng kích thước của các trình tự trong cấu trúc
gen chuyển có thể là một thay thế cho chất cách điện và các yếu tố quy định khác.
Nhiều loài chứng tỏ gen protein sữa có mở rộng và khu vực 5'- 3' trong đó có thể
chứa cả chất hỗ trợ mô đặc biệt và cách điện có khả năng cung cấp bảo vệ chống lại
sự ảnh hưởng của gen liền kề. Ví dụ, một cấu trúc 50 - kb dài đã được tổng hợp
trong đó mã vùng (3kb) của gen chuột WAP gồm 24 kb đã được thay thế bằng một
phần cấu trúc của con người gen lactoferrin (29 kb ) [21]. Kết quả là, chuyển gen
những con chuột đã được thu được có tuyến vú là đặc trưng bởi biểu hiện gen
chuyển mô đặc biệt, và sản xuất của lactoferrin con người tái tổ hợp trong sữa của
họ đã lên tới 30 mg / ml (Bảng 1 ).
Một phương pháp để có được động vật chuyển gen là sự tích hợp của lớn
phân đoạn DNA (lên đến 250 kb) vào hệ gen. Vectors dựa trên nhiễm sắc thể nhân
tạo của vi khuẩn (bacmids), cho phép nhân bản của chuỗi dài lên đến 400 kb, có thể
được sử dụng để chuẩn bị các cấu trúc gen mở rộng[51, 52]. Các vùng điều hòa của
mô gen đặc biệt có thể chiếm vùng gen lớn và là một phần của gen lân cận. Ví dụ,
14


một số chất hỗ trợ mà kích thích các gen lợn WAP được tìm thấy 140 kb đi từ gene
mà họ điều chỉnh và được tách ra từ nó bởi các gen khác [53]. Khi các mảnh ADN
lớn được sử dụng, tất cả các yếu tố quy định của gen này có trong các gen chuyển.
Phương pháp cho phép để nhận được một động vật chuyển gen mà các gen
chuyển biểu hiện tương ứng chặt chẽ với các biểu hiện của các đối tác nội sinh. Ví
dụ, con bò biến đổi gen thể hiện các gen của con người và lactoferrin con người α lactalbumin đã được sản xuất (Bảng 1 ).
Nhìn chung, phương pháp này cho phép để đạt được mức độ biểu hiện gen
chuyển ở một ổn định tương tự như của gen gốc. Như vậy, mức sản xuất của
lactoferrin và alpha - lactalbumin ở bò chuyển gen là 3,4 và 1,55 mg/ml, tương ứng
(Bảng 1). Vấn đề liên quan với các gen khác, mà là một phần của cấu trúc bacmid
và biểu hiện có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của các động vật chuyển gen. Nó
cũng cần được đề cập rằng việc sử dụng một bacmid không hoàn toàn ngăn chặn

tác động của các gen xung quanh: các biểu hiện là một phần phụ thuộc vào các vị
trí tích hợp bộ gen [54, 55]. Trong trường hợp này, không có mối quan hệ có thể
quan sát trực tiếp giữa số lượng các bản sao bacmid và mức độ biểu hiện. Điều này
có thể là do thực tế là sự can thiệp RNA bắt đầu ảnh hưởng xấu đến biểu hiện gen
trong một bacmid.
SỬ DỤNG ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN SẢN XUẤT PROTEIN TÁI TỔ HỢP
NGƯỜI
Kể từ đầu những năm 1990, các nỗ lực đã được thực hiện để sản xuất tổng
hợp một loạt các protein của con người. Hiện nay, protein được tạo từ nhiều nguồn
gốc khác nhau (vi khuẩn, nấm men, các tế bào động vật có vú). Hầu hết các protein
tái tổ hợp người được sản xuất từ nuôi cấy tế bào động vật có vú là các protein
huyết tương. Việc sử dụng các protein huyết tương tái tổ hợp phát triển mỗi năm,
15


phạm vi ứng dụng của nó càng mở rộng và việc sử dụng các mô người để cô lập
các protein có nguồn gốc đang còn miễn cưỡng bởi các nguy cơ còn tồn tại của
virus gây nhiễm, nguồn tài trợ ít và vấn đề về đạo đức con người.
Các yếu tố đông máu VII, VIII và IX được sử dụng để điều trị lâu dài các
bệnh di truyền. Sự đáp ứng miễn dịch cho các tác nhân trị liệu phát triển ở hầu hết
các bệnh nhân theo thời gian, mặc cho sự thanh lọc protein sản xuất ở vi khuẩn
hoặc nấm men có hiệu quả cao. Thực tế nó tạo ra nhu cầu cần thiết cho việc thay
thế thuốc với một loại thuốc tương tự ở một cách thức khác nhau. Vì thế, việc sản
xuất các yếu tố đông máu tái tổ hợp trong sữa của động vật chuyển gen có tầm
quan trọng đáng kể trong y học.
Bảng 2 cho thấy một số ví dụ về sữa động vật chuyển gen có chứa các yếu
tố đông máu của con người. Điều trị bệnh máu trong nhiều trường hợp đòi hỏi phải
có một tương đối số lượng nhỏ (tính bằng gam ) của protein tái tổ hợp. Kết cục là,
một con thỏ biến đổi gen là tối ưu cho sản xuất protein tái tổ hợp : mỗi
thỏ cái chuyển gen có thể sản xuất khoảng 5 lít sữa hoặc 20 g protein tái tổ hợp

mỗi năm.
Các kết quả thu được chứng minh rằng sự hiện diện của các yếu tố đông máu
không ảnh hưởng đến sức khỏe động vật và khả năng tiết sữa [74, 75].
Protein tái tổ hợp/ Yếu tố điều hòa
Cấu trúc

Albumin
gốc)

(gen Chất hoạt
casein (dê)
cô lập
α-fetoprotein (gen Chất hoạt
gốc)
casein (dê)
cô lập

Động
vật
chuyển gen/
phương pháp
sản xuất

hóa β+ chất

Bò/NT

hóa β+ chất

Dê/NT

16

Hàm lượng tối Tài liệu
đa của sản xuất tham
protein
TTH khảo
trong
sữa,
mg/ml
40
[15]
1.1

[58]


Butyrylcholineste
–“–
Dê/NT
5
[59]
rase (cDnA)
Nhân tố kích
–“–
Dê/MI
0.05
[60]
thích khuẩn lạc tế
bào hạt (gen gốc)

Hóc môn tăng Chất hoạt hóa βDê/NT
0.07
[61]
trưởng (gen gốc) casein (dê)
Chất chống đông Chất hoạt hóa βDê/MI
2
[62]
máu (cDNA)
casein (dê)
Nhân tố gây đông
–“–
Chuột/MI
0.026
[63]
IX (gen nhỏ)
Chất hoạt hóa mô
–“–
Dê/MI
3
[64]
sinh
plasmin
(cDNA)
Nhân tố gây đông Chất hoạt hóa βDê/MI
9.5 × 10^-5
[65]
IX (gen nhỏ)
casein (bò)
Hóc môn tăng Chất hoạt hóa βBò/NT
5

[66]
trưởng (gen gốc) casein (bò)
Nhân tố kích Chất hoạt hóa α- Chuột/MI
0.04
[67]
thích khuẩn lạc tế S1- casein (dê)
bào hạt (gen gốc)
Erythropoietin
Chất hoạt hóa Β- Chuột/Thỏ/
0.3(chuột)
[68]
(cDnA)
lactoglobulin (bò) MI
0.5(thỏ)
Lysostaphin (gen Chất hoạt hóa ΒBò/NT
0.014
[69]
gốc)
lactoglobulin (cừu)
Lysostaphin
Chất hoạt hóa Β- Chuột/MI
1.3
[70]
(cDnA)
lactoglobulin (cừu)
Chất ức chế C1- Chất hoạt hóa
Thỏ/MI
1.8
[71]
esterase (gen gốc) WAP- (chuột)

Nhân tố gây đông Chất hoạt hóa
Lợn/MI
4
[72]
tụ IX (cDnA)
WAP- (chuột)
Nhân tố gây đông Chất hoạt hóa
Thỏ/MI
0.1
[73,74]
tụ VIII (cDnA)
WAP- (chuột)
Không giống như các yếu tố đông máu VII, VIII và IX, nhu cầu đối với
albumin tái tổ hợp được tính bằng tấn, albumin không chỉ được dùng trong y học,
còn dùng trong công nghệ sinh học để làm ổn định điều hòa các protein khác.
17


Albumin là protein huyết thanh chính trong máu, nó thường được phân lập từ huyết
tương. Sự sản xuất albumin tái tổ hợp tốn kém hơn việc cô lập từ huyết tương trong
máu, vì trong các ứng dụng y học thì khả năng tinh chế nó đòi hỏi rất cao. Ngày
nay, albumin tái tổ hợp được sản xuất chủ yếu ở nấm men Saccharomyces
cerevisiae (recombumintM) và Pichia pastoris (AlbrectM). Nhu cầu lớn của
albumin tái tổ hợp đã xác định là chọn lựa những con bò biến đổi gen để sản xuất
ra nó. Do đó, GTC Biotherapeutics (Mỹ) gần đây vừa tạo ra những con bò chuyển
gen, nó sở hữu albumin tái tổ hợp người (rhAB) trong sữa ở mức độ trung bình là
1-5 mg/ml [15] hoặc lên đến 30 kg bò tạo ra mỗi năm. Nghiên cứu tương tự được
mô tả ở dòng bò chuyển gen có nồng độ RHA trong sữa cũng cao 48 mg/ml, nó
tương ứng với sự tích hợp của 250 bản sao chép trong cấu trúc. Bò chuyển gen ở
dòng này được đặc trưng bởi thời gian tiết sữa ngắn hơn và sự sụt giảm sản lượng

của sữa. Do đó, nó có thể được giả định rằng sự tạo ra rhAB trong sữa bò biến đổi
gen phải ở mức dưới 48 mg/ml.
Một vài protein chẳng hạn như hocmon và các cytokine, có ảnh hưởng tiêu
cực đến sự tiết sữa và tình trạng của động vật chuyển gen. Nó làm cho sự duy trì
của đàn vật nuôi chuyển gen không chắc chắn. Hầu hết các dự án có tiếng được
đảm nhận bởi các công ty PharmAthene Inc (Mỹ) dưới chỉ thị của Bộ Quốc phòng,
được liên kết với việc sản xuất butyrylcholinesterase (Bảng 2), enzyme có hoạt tính
cao thì nó có hiệu quả trong việc bảo vệ chống lại các chất độc phosphate hữu cơ.
Kết quả là, đàn dê đã tạo ra có hàm lượng butyrylcholinesterase tái tổ hợp người ở
trong sữa là 1-5 mg/ml [59].
Vấn đề chủ yếu của công ty gặp phải là do bị ảnh hưởng của rhBche tiết sữa.
Năng suất sữa của dê có gen biến đổi bị giảm xuống một cách đáng kể. Chính vì

18


vậy, câu hỏi liên quan đến tính khả thi kinh tế trong việc sử dụng dê chuyển gen để
thu rhBche đã được đặt ra.
Có rất nhiều cách tiếp cận cho phép sản xuất protein tái tổ hợp nhưng điều
đó ảnh hưởng bất lợi đến sự tiết sữa và sức khỏe của động vật biến đổi gen; Tuy
nhiên, họ chỉ giải quyết vấn đề một phần. Trước hết, vùng hoạt hóa chức năng ổn
định trong tuyến vú ở mức tương đối thấp có thể được chọn lựa. Chẳng hạn như,
nhân tố kích thích khuẩn lạc tế bào hạt tái tổ hợp người (rHG-CSF) được sản xuất
bằng cách sử dụng gen hoạt hóa β-casein không có yếu tố tăng cường phiên mã ở
dê chuyển gen (Bảng 2) [60]. Tuy nhiên, nồng độ rHG-CSF trong sữa dê không
vượt quá 0,05 mg/ml. rHG-CSF được sản xuất trong sữa của chuột chuyển chứa
0,02-0,04 mg/ml. Vectơ biểu hiện chứa các vùng điều hòa 5’ của gen CSN1S1 ở dê
(3387 bp), bao gồm các intron đầu tiên và vùng 3' của gen CSN1S1 ở bò (1518 bp)
với exon không mã hóa 18 và 19, cũng được sử dụng [67]. Kết quả chứng minh
rằng những con chuột chuyển gen mang vector biểu hiện rHG-CSF chuyên biệt

trong sữa, chứ không phải ở các mô khác. Tuy nhiên, ở phương pháp tiếp cận này,
mức protein tái tổ hợp trong sữa thấp làm giảm sự hấp dẫn về kinh tế.
Phương án thay thế để sản xuất ra RPs, nó ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản
phẩm của TAS, chính là sự nhiễm khuẩn của tuyến vú với vectơ sao chép bất hoạt
ở adenovirus. Do đó, vector adenovirus được tạo ra để biểu hiện erythropoietin
người tái tổ hợp, được sản xuất tại các phòng thí nghiệm chuyển gen và động vật
nhân bản (Havana, Cuba). Nồng độ erythropoietin trong sữa của dê bị nhiễm
adenovirus này khoảng 2 mg/ml, nhưng nó biểu hiện hoạt tính sinh học thấp,
nguyên nhân có thể do thiếu sự glycosyl hóa sản phẩm protein ở phương pháp tiếp
cận này [77]. Sự sản xuất hormone tăng trưởng tái tổ hợp của con người từ chuột (2
mg/ml) và dê (0,3 mg/ml) sử dụng các vector adenovirus đã được mô tả [78].
19


Một phương pháp tiếp cận tương tự đã được sử dụng trong trường hợp của
lactoferrin tái tổ hợp ở người, có nồng độ trong sữa dê cũng cao 2 mg/ml [79]. Mặc
dù sử dụng vectơ adenovirus động vật để tạo TAS biểu hiện các protein đích trong
sữa đơn giản, nhưng phương pháp này không cho phép nhận được sự biểu hiện ổn
định của protein tái tổ hợp ở một mức độ đầy đủ cho việc sản xuất thương mại của
nó. Mức độ biểu hiện cao (1,5-2 mg/ml) đã được quan sát riêng trong 25 ngày đầu
tiên của chu kỳ, có thể được giải thích bởi một trong hai cái chết tự nhiên của tế
bào được chuyển nạp hoặc các phản ứng miễn dịch với nhiễm trùng.
Cuối cùng, sản xuất các dạng không hoạt động của protein được coi là một
cách tiếp cận đầy triển vọng. Ví dụ, một vector biểu hiện chứa erythropoietin
cDNA tích hợp vào các exon thứ năm của gen lactoglobulin ở một con bò [68] theo
cách này, có một vùng có thể phân ra bởi IgA-protease giữa vùng mã hóa của hai
gen cấu trúc để mà sản xuất erythropoietin người tái tổ hợp. Kết quả là, chuột
chuyển gen và thỏ được sản xuất mà trong sữa nồng độ của protein khảm tương
ứng đạt là 0,3 và 0,5 mg/ml. Sau khi phân cắt protein khảm bởi IgA-protease, các
hoạt tính của erythyropoietin đã được phục hồi và tiết sữa và sức khỏe của TAS

không bị ảnh hưởng. Nó cũng có khả năng sử dụng đồng biểu hiện của RPS và một
chất ức chế chặn hoạt động của nó. Do đó, các prourokinase tái tổ hợp ở người thể
hiện trong sữa gần như ngay lập tức biến đổi thành dạng chủ động, Urokinase nó
làm cho phản ứng sinh học này không hi vọng đối với việc sản xuất dạng protein
therapeutic(prourokinase). Prourokinase được đồng biểu hiện với chất kìm hãm vi
khuẩn serine protease trong sữa của những con chuột chuyển gen để phân giải [80].
Điều này cho phép tinh chế sữa của những con chuột chuyển gen từ quá trình
prouroki- Nase (Urokinase) và làm tăng đáng kể hiệu suất của dạng trị liệu của
protein.
20


Điều này nên được đề cập rằng protein sialylation tái tổ hợp trong sữa của
thỏ chuyển gen và lợn là giống với sialylation trong các tế bào của con người nhất,
nó là điều cần thiết cho sự giảm miễn dịch của các loại thuốc sử dụng trong điều trị
lâu dài [81, 82]. Sự sửa đổi sau phiên mã không chính xác làm giảm hoạt tính của
protein tái tổ hợp, có thể xảy ra trong sữa dê biến đổi gen và bò. Cách dễ nhất để
loại bỏ các sửa đổi không chính xác là đột biến ở vị trí protein, nơi sự sửa đổi
không mong muốn xảy ra. Ví dụ, alpha-fetoprotein, một chuỗi đơn glycosyl hóa
protein nguyên sinh chất với trọng lượng phân tử 68 kDa, được sử dụng để điều trị
các bệnh tự miễn dịch. Sự yêu cầu cho alpha-fetoprotein tái tổ hợp của người gấp
nếp đúng (rh-AFP) là rất cao (kilo- gram protein cần thiết); do đó, công ty
Merrimack Pharma (Mỹ), cùng với peutics Biothera- GTC (Mỹ), đã đưa ra một dự
án cho các trình sản xuất của dê chuyển gen để sản xuất rh-AFP trong sữa của
chúng. alpha-fetoprotein con người bị cô lập từ sữa dê biến đổi gen đã được
glycosyl hóa ở các dư lượng agine aspar- nằm ở vị trí 233, trong đó tái giảm đáng
kể hoạt tính của nó. Do đó, dư lượng glutamine lại đặt cặn asparagin trong rh-AFP,
là nguyên nhân gây bất hoạt của vị tr glycosyl hóa [58, 83]. Nó đã được chứng
minh rằng các hoạt tính sinh học và cokinetics pharma của các biến thể đột biến
của alpha-fetoprotein là tương tự như của các protein có nguồn gốc.

Kháng thể liên Các nhân tố Động
vật Hàm lượng tối Tài liệu tham
kết
kháng điều hòa
chuyển
đa của sản khảo
nguyên
gen/sản phẩm xuất kháng thể
trong
sữa,
mg/ml
CDs- thụ thể
WAP-chất
Chuột/ 2 gen
0.4
[90]
hoạt hóa (thỏ)
gốc
Màng
WAP-chất
Chuột/2 gen
5
[89]
glycoprotein
hoạt
hóa
gốc
S(virut viêm (chuột)
dạ dày, ruột)
21

Màng
glycoprotein
S(virut viêm
dạ dày, ruột)
Br96
chống
-Lewis Y
Br96
chống
-Lewis Y
cD20-thụ thể

Chất hoạt hóa
βlactoglobulin
(cừu)
Chất hoạt hóa
β-casein (dê)

Chuột/ 2
cDNA

6

[91]

Chuột/2 gen
gốc
Chuột/2 gen

gốc
–“–

14

[86]

4

[86]

Chất hoạt hóa
22.3
[92]
β-casein (dê) +
chất ức chế
Bề mặt kháng Chất hoạt hóa
–“–
32
[93]
nguyên (Bệnh β-casein (dê) +
virut viêm gan ức chế
A)
Bề mặt kháng
–“–
–“–
17.8
[94]
nguyên (Bệnh
virut viêm gan

B)
Thị trường mAb là giai đoạn phát triển nhanh nhất của ngành công nghiệp
dược phẩm. mAbs trị liệu, hầu hết trong số đó được sử dụng để điều trị ung thư và
các bệnh tự miễn dịch.
Hiện nay, mAbs đã sử dụng trong y học là sản phẩm độc quyền trong nuôi
cấy tế bào động vật có vú, sự sửa đổi phù hợp sau phiên mã được yêu cầu để đảm
bảo hiệu quả trong điều trị. Sự sửa đổi quan trọng nhất bao gồm sự gắn kết
oligosaccharides và acid sialic, làm tăng đáng kể thời gian mAbs lưu thông trong
máu và giảm kháng nguyên. Tuy nhiên, các sản phẩm RPs trong nuôi cấy tế bào chi
phí tương đối cao. Do đó, sự nỗ lực sử dụng TAs để sản xuất các kháng thể đã
được sản xuất vào cuối những năm 1990 [85, 86]. mAbs gồm hai chuỗi
polypeptide, hai cấu trúc có chứa các gen mã hóa tiểu đơn vị lớn và ánh sáng được
sử dụng cho các biểu hiện của nó trong TAs. Khi sản xuất TAs, một số cấu trúc mã
hóa các chuỗi nặng và nhẹ của kháng thể thường được kết hợp vào vị trí của bộ gen
22


giống nhau. Trong các thí nghiệm ban đầu, mAbs biểu hiện vùng hoạt hóa gen khác
nhau trong protein sữa, ví dụ, cừu β-lactoglobulin [87] và chuột WAP. Sữa của
những con chuột chuyển gen có chứa mAbs ở nồng độ tương đối cao khoảng 0,4-5
mg/ml đã được sản xuất, kết quả ở (Bảng 3). mAbs dùng cho việc sản xuất dược
phẩm được lấy từ dê biến đổi gen sau này; mAbs dùng cho việc kiểm tra biểu hiện
của vectơ, đánh giá chất lượng của mAbs, và cải tiến các phương pháp đã sử dụng
cho sự phân lập của nó được lấy từ những con chuột chuyển gen. Các vector pBC1
mô tả ở trên đã được sử dụng rộng rãi cho sự biểu hiện của mAbs (Hình 2B). Mức
biểu hiện cao nhất của mAbs ở chuột chuyển gen (cao tới 32 mg/ml of milk) được
thu từ sử dụng vector này (Bảng 3). Tuy nhiên, dữ liệu được công bố về mức độ
biểu hiện của mAbs trong sữa dê biến đổi gen là hầu như có. Những con dê chuyển
gen, một trong số đó cho thấy mức độ biểu hiện gần 14 mg/ml, nó đã được đề cập
chỉ trong một bài đánh giá [86].

Theo số liệu được cung cấp bởi các công ty trị liệu GTC sinh học (Mỹ),
mAbs được phân lập từ sữa dê chuyển gen thường ổn định và hiệu quả cao; thậm
chí mức độ cao của biểu mAbs không bị ảnh hưởng sức khỏe và sự tiết sữa của dê
chuyển gen. Công ty đã phát triển phương pháp tương đối đơn giản để thu được
lượng mAbs tinh chế cao rất thích hợp cho các ứng dụng trong y tế [95, 96]. Các
công cuộc nghiên cứu dẫn đầu được diễn ra đối với dê chuyển gen như các mô hình
tối ưu cho việc sản xuất các mAbs [97]. Sự hấp dẫn của dê chuyển gen được cho là
do thực tế nó hiếm khi bị nhiễm độc BSe như ở cừu và bò. Gần đây, dê chuyển gen
từ New Zealand hoặc Úc hiện đang được sử dụng cho việc sản xuất protein tái tổ
hợp trong sữa, vì nó chính thức cho rằng không có dịch bệnh từ bò ở các nước này.
Nhu cầu mAbs gần đây đã đạt mốc hàng trăm kg/mỗi năm. Ví dụ, nhu cầu
trên thế giới về vấn đề chống thụ thể CD20 mAbs vượt quá 600 kg mỗi năm.
23


Người ta ước tính rằng một đàn gồm 210 dê chuyển gen có chứa sữa mAbs ở một
nồng của 8 g/l hoàn toàn có thể đáp ứng các nhu cầu trên thế giới trong việc chống
CD20 mAbs có chi phí khoảng $ 100/g [85]. Trong khi đó, 51.000 lít nuôi cấy tế
bào với dung tích 1g/l và chi phí gần $ 300/g được yêu cầu để lấy được mAbs
ngang với giá trị của nó.
Mặc dù chi phí tạo ra mAb ở loài dê chuyển gen thấp, tuy nhiên người ta
cũng nhận thấy một số nhược điểm trong việc sử dụng mAb được lấy từ dê chuyển
gen so với việc tận dụng kết quả của việc nuôi cấy tế bào ở động vật có vú. Trước
tiên, các kháng thể được lấy từ dê chuyển gen phải được gắn kết và kết dính
(glycosylated and sialylated) một cách chính xác, một yếu tố rất quan trọng để có
thể đạt được mức độ cân bằng hợp lý, tạo khả năng miễn dịch cho cơ thể và hoạt
động sinh hóa. Qúa trình glycosyl hóa và sialylat diễn ra ở các tuyến vú của loài dê
biến đổi gen nhưng chưa hoàn thiện. Ngoài ra, sự gia tăng biểu hiện gen mAb được
kết hợp với việc giảm hiệu quả ở quá trình glycosylat hóa). Do đó, 2 - 4mg/ml
được xem là một tỷ lệ phù hợp mAb chứa trong sữa. Vấn đề thứ 2 đó là khi kết hợp

với thực tế thì acid sialic trong loài dê chuyển gen tồn tại dưới dạng acid nacetylneuraminic

(NANA),

trong

khi

kháng

thể

ở

người

lại

chứa

glycolylneuraminic aci (NGNA). Trong một số trường hợp các kháng thể chứa acid
sialic “Nhầm” này lại có tác dụng tạo nên các chất miễn dịch cho cơ thể bệnh nhân.
Các proteins tái tổ hợp trong quá trình nuôi cấy tế bào cũng trải qua quá trình
glycosylat hóa và sialylat hóa không đồng nhất. Những quá trình này thường
không giống nhau đối với các cá thể trong cùng một loài. Để vượt qua được trở
ngại này, các gen bổ sung mã hóa vận chuyển và các enzymes thúc đẩy các phản
ứng của tế bào góp phần làm tăng mức độ glycosylat hóa và sialylat hóa hoặc các
gens RNA với khả năng vô hiệu các gen được mã hóa các proteins có ảnh hưởng
24

xấu tới quá trình glycosyl hóa, sẽ được đưa vào trong các chuỗi tế bào tạo ra
proteins tái tổng hợp. Thời cơ để làm bất hoạt các gen liên quan đến sự glycosyl
hóa của protein tái tổ hợp trong dòng tế bào, nó khác nhau từ sự glycosylat hóa
trong các tế bào của con người, gần đây đã trở nên phổ biến do sự phát triển của
các công nghệ mới của phương pháp gây đột biến định hướng (site-direct- ed
mutagenesis). Những cách tiếp cận tương tự không thể áp dụng cho động vật, do sự
thay đổi trong gen có thể có ảnh hưởng xấu tới khả năng phát triển của động vật
chuyển gen. Sự lựa chọn tiềm tàng duy nhất là tạo ra các động vật chuyển gen
mang vector chịu sự kiểm soát chặt chẽ của biểu hiện gen bên ngoài tuyến vú. Các
vector này phải biểu hiện các gen bổ sung để tăng hoặc sửa đổi quá trình
glycosylate hóa và các gen mã hóa nhóm RNA có khả năng vô hiệu các gen mà
theo đó các chuỗi proteins tạo ra từ gen này chịu trách nhiệm cho quá trình
glycosylate hóa không bình thường của protein tái tổ hợp. Cuối cùng, xấp xỉ 0,3
đến 0,5 mg/ml globulin- chất miễn dịch nội sinh trong sữa dê đặt ra thêm một vấn
đề nữa trong suốt quá trình tinh chế mAb, do đó sự phân tách trong sắc ký lỏng có
hiệu quả ở loài dê và các chất globulin tạo khả năng miễn dịch ở người là những
yếu tố quyết định đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc tạo ra các mAb có độ
tinh khiết cao. Trong khi đó, việc nuôi cấy tế bào được công bố rộng rãi đã đơn
giản hóa một cách đáng kể giai đoạn thanh lọc proteins tái tổ hợp này, điều này đôi
khi làm giảm được chi phí để tạo nên các mAbs có độ tinh khiết cao.
Gần đây, người ta đã chỉ ra rằng, sự thiếu hụt fucose trong chuỗi glycol của
kháng thể làm giảm cytotoxicity trong kháng thể đến 10 lần thấp hơn lượng kháng
thể thông thường được sử dụng. Một mô hình nghiên cứu khác dựa trên cơ thể loài
thỏ chuyển gen có thể là một phương án hiệu quả trong việc tạo ra các kháng thể
defucosylated này. Thú vị hơn là, không một fucose nào được tìm thấy trong chất
25