Khảo sát quy trình thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ việc nuôi cấy tế bào hai loài drosera

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những kết quả trong
nghiên cứu này hoàn toàn chưa được công bố bởi bất kỳ tác giả nào khác.

NCS. Quách Ngô Diễm Phương

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang i


LỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn
Công trình này là kết quả hơn 3 năm học tập và nghiên cứu của tôi tại Bộ môn
Công nghệ Sinh học Thực vật và Chuyển hoá Sinh học thuộc Khoa Sinh, trường
Đại học Khoa học Tự nhiên với rất nhiều sự dạy bảo, quan tâm và giúp đỡ.
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến
PGS. TS. Bùi Văn Lệ, người đã đề ra hướng nghiên cứu thu nhận hợp chất thứ cấp

trên đối tượng cây bắt ruồi ở Việt Nam bằng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật và
tận tình chỉ dạy cũng như đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được thực hiện, hoàn
thành luận án này.
Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến GS. TS. Nguyễn
Kim Phi Phụng – Khoa Hóa, trường ĐH Khoa học Tự nhiên. Cô là người đã

đặt nền móng đầu tiên cho khối kiến thức Hóa học mà tôi có được để ứng dụng trong
luận án này. Mặc dù không là người hướng dẫn, nhưng Cô luôn ở bên cạnh, đốc thúc,
hỗ trợ tinh thần cho tôi trong lúc thực hiện luận án.

Thời gian làm thực tập sinh ở nước ngoài đã giúp tôi trưởng thành hơn trong
chuyên môn, trong tác phong học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cám ơn Bộ Giáo
dục Đào tạo và Chương trình trao đổi hợp tác Danida (ENREKA). Bên cạnh

đó, cho phép tôi được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS. TS. Ole
Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang ii


LỜI CẢM ƠN

Vang, người đã hướng dẫn, dạy bảo tôi, luôn tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên

cứu trong suốt quãng thời gian tôi ở Đan Mạch. Cho tôi được nói lời cám ơn đến tất
cả Thầy Cô, bạn bè ở Lab Molecular Mechanisms of Dietary Components; Khoa
Science, Systems and Models; Trường ĐH Roskilde, Đan Mạch đã hướng dẫn
những thao tác đầu tiên khi tôi vàoLab cũng như đã tạo nên những tình cảm ấm áp,
thân thiện. Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến các bạn du học sinh Việt Nam ở
Roskilde; đặc biệt là chị Thảo Trân, Tuyết Phương, Thu An, Như Ngọc, Thành
Tâm đã chia sẽ cuộc sống và giúp đỡ tôi như gia đình ở nơi xa xứ.

Cho tôi được gửi lời cám ơn đến Thầy Cơ GS. Trần Thanh Vân và học bổng
Odon Vallet.
Cám ơn các Thầy Cơ Bộ mơn Sinh hóa đã quan tâm tìm hiểu và xét duyệt ngay
khi ý tưởng của luận án được hình thành.
Trân trọng cám ơn các Thầy Cơ tham gia Hội đồng, Thầy Cơ tham gia phản
biện kín đã dành thời gian xem xét, đánh giá cũng như góp ý để luận án được chỉnh

chu, hoàn thiện hơn.

Cám ơn toàn thể Thầy Cơ đồng nghiệp của tôi tại Khoa Sinh, Trường ĐH
Khoa học Tự nhiên, TP. HCM đã dạy dỗ từ những ngày tôi mới chập chững bước
vào giảng đường đại học cho đến ngày hôm nay cũng như đã cổ vũ tinh thần và hỗ trợ
khi cần thiết để tôi hoàn thành luận án. Đặc biệt xin được cám ơn Cơ Phượng, anh
Huy, KPNam đã góp ý và sữa chữa bài vở giúp tôi.

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang iii


LỜI CẢM ƠN

Cám ơn toàn thể các em đang học tập và làm việc tại phòng Công nghệ Sinh học
Thực vật B23. Cho tôi được đặc biệt cám ơn: Lan Anh, Cẩm Tú, Vòng
BínhLong, Lưu Ly, Xuân Sơn, Hữu Hoàng, Minh Tuấn, Thanh Minh,
Hiền đã hỗ trợ bất cứ lúc nào tôi cần.
Gửi lời cám ơn đến: Bích Chiêu, Bích Tuyền, Hoàng Thò Thu, Phương Thy,
Thanh Minh, Bích Thùy, Phi Yến, những “người bạn học trò” của Cô đã dốc hết
tâm huyết để cùng Cô nghiên cứu luận án này.
Gửi lời cám ơn đến các bạn cùng khóa Cao học Sinh hóa K13 đã thường xuyên
quan tâm và động viên tôi cho đến giờ phút này. Đặc biệt, cho tôi nói lời cám ơn đến
Thiên Hoàng, chò Như, anh Nhứt.
Cuối cùng, tôi xin phép được dâng tặng thành quả của công trình này cho gia đình
tôi, chỗ dựa vững chắc nhất của tôi trong những năm qua. Cám ơn Ba Mẹ đã tạo mọi
điều kiện tốt nhất về vật chất và tinh thần để tôi có thể học tập, nghiên cứu khoa học
và đạt được kết quả này. Cám ơn anh chò hai và vợ chồng út đã luôn ở bên cạnh, giúp
đỡ, cổ vũ. Gia đình thực sự đã giúp tôi có thể toàn tâm toàn ý với luận án này.
Chân thành cám ơn.

Quách Ngô Diễm Phương.

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang iv


DANH MỤC

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
Lôøi caûm ôn .......................................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................................... v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ........................................................... x
DANH MỤC BẢNG....................................................................................................... xiii
DANH MỤC HÌNH........................................................................................................ xvi
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1
1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................ 3

1.1 Đặc điểm giống thực vật Drosera ..................................................................... 3
1.1.1 Đặc điểm phân loại...........................................................................................3
1.1.2 Đặc điểm phân bố.............................................................................................5
1.1.3 Đặc điểm hình thái ...........................................................................................6
1.1.4 Đặc tính sinh học ............................................................................................11
1.1.5 Hiện trạng của Drosera trên thế giới [112] ....................................................13
1.1.6 Thành phần hóa học .......................................................................................14
1.1.7 Giá trị và tầm quan trọng ...............................................................................17

1.1.8 Tình hình nghiên cứu .....................................................................................20
1.2 Tăng năng suất thu nhận hợp chất trong nuôi cấy tế bào thực vật ............ 22
1.2.1 Nuôi cấy tế bào thực vật (plant cell cultures) ................................................22
1.2.2 Tối ưu khả năng tích lũy hợp chất của tế bào thực vật ..................................24
Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang v


DANH MỤC

1.2.3 Can thiệp vào con đường sinh tổng hợp hoạt chất .........................................29
2

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP ............................................................................... 35

2.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu ....... 35
2.1.1 Vật liệu ...........................................................................................................35
2.1.2 Phương pháp...................................................................................................35
2.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn
nguyên liệu in vitro của Drosera ............................................................................. 38
2.2.1 Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học được sử dụng để sàng lọc phân
đoạn cao chứa hoạt chất .................................................................................38
2.2.2 Các bước tiến hành sàng lọc để cô lập hoạt chất từ nguồn nguyên liệu in vitro
của hai loài Drosera .......................................................................................41
2.2.3 Kiểm tra hoạt tính sinh học của hợp chất cô lập được ...................................42
2.2.4 Xác định cấu trúc và hàm lượng hợp chất......................................................49
2.2.5 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu
tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này ...................................................51
2.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt

chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh ........................................................... 51
Vật liệu ......................................................................................................................51
Phương pháp..............................................................................................................52
2.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng ở Drosera
........................................................................................................................52
2.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và tích lũy hoạt
chất của cây con .............................................................................................52
2.3.3 Khảo sát tác động của NAA lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây
con ..................................................................................................................53
Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang vi


DANH MỤC

2.3.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng trưởng và tích lũy
hoạt chất của cây con .....................................................................................54
2.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên sự tăng
trưởng và sự tích lũy hoạt chất .......................................................................54
2.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và
tích lũy hoạt chất ............................................................................................55
2.3.7 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống
nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thuật đã khảo sát ..................................55
2.4 Khảo sát ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất
lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào ........................................................ 56
Vật liệu ......................................................................................................................56
Phương pháp..............................................................................................................56
2.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào .............................................................................56
2.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống

nuôi cấy dịch huyền phù tế bào ......................................................................59
2.5 Xử lý thống kê .................................................................................................. 62
3

KẾT QUẢ -THẢO LUẬN ..................................................................................... 63

3.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu ....... 63
3.1.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy .....................................................................63
3.1.2 Nhân giống bằng chồi bên..............................................................................63
3.1.3 Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào .................................66
3.1.4 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước (Improved 2-step Liquid Culture
System) trong việc cải thiện khả năng nhân chồi và phát triển thành cây con
hoàn chỉnh [24]..............................................................................................69
3.1.5 Tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh ........................................................72
Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang vii


DANH MỤC

3.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn
nguyên liệu in vitro của Drosera ............................................................................. 72
3.2.1 Xử lý mẫu và điều chế các loại cao chiết .......................................................72
3.2.2 Sàng lọc và cô lập hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa ...............................74
3.2.3 Sàng lọc và cô lập hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào in vitro .....84
3.2.4 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu
tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này .................................................100
3.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt
chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh ......................................................... 101

3.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng của D.
burmanii .......................................................................................................102
3.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin trong cây con tái sinh .................................................................104
3.3.3 Khảo sát tác động của NAA lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất .........109
3.3.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất (phenylalanine và tyrosine) lên
sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin ......................................................111
3.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên sự tăng
trưởng và tích lũy hoạt chất ..........................................................................113
3.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và
tích lũy hoạt chất ..........................................................................................120
3.3.7 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống
nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thuật đã khảo sát ................................122
3.4 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt
chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào ............................................. 123
3.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào ...........................................................................123
Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang viii


DANH MỤC

3.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống
nuôi cấy dịch huyền phù tế bào ....................................................................134
4

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ...................................................................................... 14

4.1 Kết luận ........................................................................................................... 14

4.2 Đề nghị ............................................................................................................ 1
DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ....................................................... 15
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 15
PHỤ LỤC ............................................................................................................................ a

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang ix


DANH MỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

4E-BP1

: the Eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) Binding Protein 1

ABS

: Absorbent

AFM

: Atomic Force Microscopy

AI

: hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất (%)

AOS

: Active oxide species

BA

: 6-benzylaminopurine

BHA

: butylate hydroxy aldehyde

BSA

: Bovine Serum Albumine

COSY

: COrelation SpectroscopY

DEPT

: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DLD-1

: dòng tế bào ung thư ruột kết ở người

DMSO

: Dimethyl sulphoxide

DTT

: 1, 4-DiThioTreitol

DW

: Dry weight (trọng lượng khô)

FBS

: Fetal Bovine Serum

FTC

: Ferric thyociante

FW

: Fresh weight (trọng lượng tươi)

GB5

: Gamborg B5

HMBC

: Heteronuclear Multiple Quantum Correlation.

HMQC

: Heteronuclear Multiple Bond Correlation.

HPLC

: High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp)

I

: tỷ lệ ức chế sự tăng sinh tế bào (%)

IAA

: indoleacetic acid

IBA

: 3-indolebutyric acid

IC50

: Inhibitory Concentration of 50% growth

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang x


DANH MỤC

IR

: Infrared

KN

: Kinetine

LB

: Luria – Bertani

MS

: Murashige & Skoog, 1962

mTOR

: mammalian Target Of rapamycin

mTORC1/2

: mammalian TOR Complex 1/ 2

NAA

: Naphthalene Acetic Acid

NMR

: Nuclear Magnetic Resonance

OD

: Optical Density

PAL

: Phenylamine ammonia lysase

PBS

: Phosphate Buffer Saline

PDK

: Protein Dependent Kinase

PDK1/ 2

: Phosphoinositide-Dependent Kinase 1/ 2

PI

: Protease Inhibitor

PI3K

: PhosphoInositide 3-Kinase

PIP2

: PhosphatidylInositol (4,5)-BiPhosphate

PIP3

: PhosphatidylInositol (3,4,5)- TriPhosphate

PKB

: Protein Kinase B

PKC

: Protein Kinase C

pmTOR

: phosphor mTOR

PTEN

: Phosphatase and TENsin homolog

PVDF

: PolyVinylidene DiFluoride

PVP

: Poly Vinyl Pyrrolidone

Raptor

: Regulatory Associated Protein of mTOR

Rheb

: Ras Homolog Enriched in Brain

Rictor

: rapamycin-Insensitive Companion of mTOR

ROS

: Reactive Oxygen Spices

S6K1

: p70-S6 Kinase 1

SAR

: Systemic Acquired Resistance

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang xi


DANH MỤC

SRB

: SulfoRhodamine B

TAL

: Tyrosine ammonia lyase

TBA

: ThioBarbituric Acid

TBS

: Tris Buffered Saline

TCA

: Trichloroacetic acid

TMS

: TetraMethylSilane

TSC1/ 2

: Tuberous Sclerosis Complex1/ 2

TTC

: TriphenylTetrazolium Chloride

UV

: Ultra Violet

vitE

: Vitamin E

KÍ HIỆU
J

: Hằng số ghép cặp

MHz

: Megahertz

s, d, t

: Singlet (mũi đơn), Doublet (mũi đôi), Triplet (mũi ba)

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang xii


DANH MỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone .......15
Bảng 1.2. Các loài Drosera in vitro chứa plumbagin và 7-methyljuglone .............15
Bảng 1.3. Các naphthoquinone vi lượng được tách chiết từ Drosera .....................15
Bảng 1.4. Dược tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera ......18
Bảng 1.5. Hoạt tính chống thụ thai công bố gần đây nhất của D. burmanii ..........19
Bảng 1.6. Những nghiên cứu về nhân giống in vitro giống Drosera .......................20
Bảng 1.7. Những nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong
thu nhận hoạt chất từ các loài thực vật cùng họ với Drosera .......................21
Bảng 2.1. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy 2 bước với 2 kiểu nuôi cấy rắn và lỏng 37
Bảng 2.2. Các nghiệm thức được bố trí việc bổ sung hay không bổ sung 2,4-D .....61
Bảng 3.1 . Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự nhân chồi bên .....................................64
Bảng 3.2 . Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự tạo chồi bất định từ phát hoa .............67
Bảng 3.3. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy 2 bước với 2 kiểu nuôi cấy rắn, lỏng .....70
Bảng 3.4. Phần trăm nước của hai loại nguyên liệu tươi Drosera in vitro ............72
Bảng 3.5. Thu suất các loại cao từ bột cây Drosera ................................................73
Bảng 3.6. Năng lực khử thể hiện qua giá trị OD ở bước sóng 700nm của các loại
cao theo phương pháp Yen và Duh (1993) ....................................................74
Bảng 3.7 . Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao chloroform của D. indica ............76
Bảng 3.8. Năng lực khử thể hiện qua giá trị OD ở bước sóng 700nm của các phân
đoạn theo phương pháp Yen và Duh (1993) ..................................................77
Bảng 3.9. Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp FTC ..............80

Bảng 3.10. Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp TBA ............81
Bảng 3.11. Tỷ lệ % hoạt tính kháng oxy hóa AI (%) của các hoạt chất khảo sát ....82
Bảng 3.12. Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau
khi cảm ứng 48 giờ của các cao chiết (100µg/ml).........................................84
Bảng 3.13. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao chloroform của D. burmanii ......86
Bảng 3.14. Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau
khi cảm ứng 48 giờ của các phân đoạn (100µg/ml) ......................................86
Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang xiii


DANH MỤC

Bảng 3.15. Kết quả sắc ký cột phân đoạn 3 của bảng 3.14......................................87
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của hợp chất ở các nồng độ khác nhau lên sự tăng sinh của
tế bào DLD-1 sau 24, 48 giờ cảm ứng ...........................................................89
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của hợp chất ở các nồng độ khác nhau lên kích thước của tế
bào DLD-1 sau 24, 48 giờ cảm ứng...............................................................91
Bảng 3.18. Nồng độ protein tổng của sinh khối tế bào khi bị cảm ứng bởi hợp chất
B và rapamycin theo thời gian .......................................................................94
Bảng 3.19. Ảnh huởng của hợp chất B và rapamycin lên sự biểu hiện của protein
mTOR, pmTOR, S6K theo thời gian ...............................................................96
Bảng 3.20. Phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HMBC của hợp chất B ..............................99
Bảng 3.21. Kết quả định lượng quercetin và plumbagin trong Drosera bằng HPLC
......................................................................................................................101
Bảng 3.22. Các giai đoạn tăng trưởng của D. burmanii ........................................102
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của cây ..........................................................................104
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin

trong cây con ................................................................................................105
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của cây .......................................................................................107
Bảng 3.26. Ảnh hưởng mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của cây con....................................................................108
Bảng 3.27. Ảnh hưởng NAA lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây
con ................................................................................................................109
Bảng 3.28. Ảnh hưởng của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của cây con ................................................................................111
Bảng 3.29. Ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của cây con ................................................................................113
Bảng 3.30. Ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tích lũy plumbagin ở hai bộ phận rễ
và lá D. burmanii .........................................................................................116
Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang xiv


DANH MỤC

Bảng 3.31. Ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của cây con ................................................................................117
Bảng 3.32. Ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tích lũy plumbagin ở lá và rễ của
D. burmanii ..................................................................................................119
Bảng 3.33. Ảnh hưởng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và tích lũy
plumbagin của D. burmanii .........................................................................120
Bảng 3.34. Kết quả định lượng plumbagin trong cây con D. burmanii in vitro đã
được ứng dụng các kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận plumbagin bằng
HPLC............................................................................................................123
Bảng 3.35. Ảnh hưởng của nền khoáng, nồng độ đường lên khả năng sống của

lớp mỏng tế bào ............................................................................................123
Bảng 3.36 . Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá và rễ D. burmanii.....................................125
Bảng 3.37. Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA ......127
Bảng 3.38. Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ rễ dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA ......128
Bảng 3.39. Hàm lượng plumbagin tích lũy trong các loại mô khác nhau..............134
Bảng 3.40. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu đến thời gian tăng
trưởng của dịch huyền phù tế bào rễ Drosera .............................................135
Bảng 3.41. Ảnh hưởng ánh sáng và tốc độ lắc lên sự tăng trưởng và tích lũy
plumbagin.....................................................................................................137
Bảng 3.42. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của
dịch huyền phù tế bào ..................................................................................139
Bảng 3.43. Ảnh hưởng của phenylalanine và tyrosine lên sự tăng trưởng và sự tích
lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào D. burmanii ...............................142
Bảng 3.44.Ảnh hưởng của acid salicylic lên lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của dịch huyền phù tế bào .........................................................145
Bảng 3.45. Kết quả định lượng plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D. burmanii
đã được ứng dụng kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận plumbagin bằng
HPLC............................................................................................................146

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang xv


DANH MỤC

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây phát sinh loài trong các phân giống thuộc giống Drosera dựa trên
trình tự DNA chloroplast rbcL và DNA nhân 18S ribosome ..........................4
Hình 1.2. Sự phân bố Drosera trên thế giới (vùng có màu xanh lá) .........................5

Hình 1.3. Các dạng cấu trúc thân của Drosera .........................................................6
Hình 1.4. Các hình dạng khác nhau của lá và lông tuyến Drosera ..........................7
Hình 1.5. Màu sắc đa dạng của hoa Drosera ...........................................................9
Hình 1.6. Mặt cắt ngang của hoa Drosera.................................................................9
Hình 1.7. Các dạng nang chứa hạt của Drosera ....................................................10
Hình 1.8. Hình thái hạt Drosera .............................................................................10
Hình 1.9. Phương tiện và cơ chế bắt côn trùng của D. indica L. ............................12
Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinoneglucoside tách chiết từ các loài Drosera . .....................................................16
Hình 1.11. Một số flavonoid và flavonoid glucoside có trong Drosera ...................16
Hình 1.12. Một số hình thái lạ mắt của Drosera ....................................................19
Hình 2.1 . Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bên .......................................36
Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bất định ................................37
Hình 2.3. Con đường truyền tín hiệu mTOR và những cơ chất có liên quan .........46
Hình 2.4. Phương pháp Western Blot ......................................................................46
Hình 2.5. Buồng đếm tế bào và quy tắc đếm trong 1 ô lớn có thể tích 0,1mm3 .......59
Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của Drosera ..64
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi bên từ đốt thân D. indica L. sau 5
tuần .................................................................................................................65
Hình 3.3. Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi bên từ đốt thân D. burmanii sau 5
tuần .................................................................................................................65
Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của Drosera ..67
Hình 3.5 . Sự tái sinh chồi bất định từ ngọn phát hoa D. indica sau 5 ngày ...........68
Hình 3.6. Sự tái sinh chồi bất định từ ngọn phát hoa D. burmanii ..........................68
Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang xvi


DANH MỤC

Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của việc ứng dụng quy trình nuôi cấy lỏng 2
bước lên khả năng tạo chồi của Drosera (trái: D. indica, phải: D. burmanii)
........................................................................................................................70
Hình 3.8. Cây con Drosera hoàn chỉnh với đầy đủ các bộ phận, kể cả rễ trên môi
trường MS lỏng (trái: D. indica, phải: D. burmanii) ....................................72
Hình 3.9. Biểu đồ biễu diễn năng lực khử của các loại cao chiết theo phương pháp
của Den và Duh (1993) ..................................................................................74
Hình 3.10. Năng lực khử của các loại cao chiết theo phương pháp của Den và Duh
........................................................................................................................74
Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn năng lực khử của các phân đoạn trong thử nghiệm
Yen & Duh ......................................................................................................77
Hình 3.12 Năng lực khử của các phân đoạn trong thử nghiệm Yen & Duh ............77
Hình 3.13 .Tinh thể hình kim của hợp chất A ...........................................................78
Hình 3.14. Đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ ở 500nm để theo dõi động
học của phản ứng ...........................................................................................80
Hình 3.15. Đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ ở 532nm để theo dõi động
học của phản ứng ...........................................................................................81
Hình 3.16. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất cô lập so
với vitE và BHA ở cả hai phương pháp FTC và TBA ....................................82
Hình 3.17. Biều đồ thể hiện tỷ lệ % ức chế tăng sinh tế bào DLD-1 của các loại cao
chiết ................................................................................................................85
Hình 3.18. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ (%) ức chế tăng sinh dòng tế bào DLD-1sau khi
cảm ứng 48 giờ của các phân đoạn ...............................................................86
Hình 3.19. Cô lập và thu nhận hoạt chất B ..............................................................88
Hình 3.20. Đường cong tăng sinh tế bào DLD-1 theo thời gian dưới ảnh hưởng của
hợp chất B ở các nồng độ khác nhau .............................................................89
Hình 3.21. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ ức chế tăng sinh tế bào của hợp chất ở các nồng
độ khác nhau (trái: sau 24 giờ cảm ứng, phải: sau 48 giờ cảm ứng) ...........89

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang xvii


DANH MỤC

Hình 3.22. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hoạt chất lên kích thước của tế bào
DLD-1 ............................................................................................................92
Hình 3.23. Tế bào DLD-1 dưới ảnh hưởng của hợp chất B sau 48 giờ cảm ứng
được quan sát dưới kính hiển vi đối pha, độ phóng đại 10x..........................93
Hình 3.24. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hợp chất B (4µM) và rapamycin
(0,5µM) lên hàm lượng protein tổng của lysate tế bào DLD-1 .....................95
Hình 3.25. Biều đồ thể hiện ảnh huởng của hợp chất B và rapamycin lên sự biểu
hiện của protein mTOR, pmTOR, S6K theo thời gian ...................................97
Hình 3.26. Tín hiệu phát quang của kháng thể bắt cặp với các protein mTOR,
pmTOR, và S6K ..............................................................................................98
Hình 3.27. Biểu đồ thể hiện các giai đoạn tăng trưởng của D. burmanii..............102
Hình 3.28. Các giai đoạn tăng trưởng của D. burmanii nuôi cấy in vitro ............102
Hình 3.29. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của cây ..........................................................................104
Hình 3.30. Ảnh hưởng hàm lượng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự tích
lũy plumbagin của cây. Trong đó, ở MS1/8 và MS0 các chồi con không có
dấu hiệu tăng sinh và chết............................................................................104
Hình 3.31. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng trưởng và sự tích
lũy plumbagin của cây .................................................................................105
Hình 3.32. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự tăng trưởng của D. buramnii in vitro
......................................................................................................................106
Hình 3.33. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của cây ..........................................................................107
Hình 3.34. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tăng trưởng của D. buramnii in

vitro. Từ trái sang phải: pH5,2; pH5,8; pH6,4 ...........................................107
Hình 3.35. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu lên sự
tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con ......................................108
Hình 3.36. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của NAA lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của cây con ................................................................................109
Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang xviii


DANH MỤC

Hình 3.37. Ảnh hưởng của NAA lên sự phát triển của rễ và sự tăng trưởng của cây
in vitro ..........................................................................................................110
Hình 3.38. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc bổ sung tiền chất lên sự tích lũy
plumbagin của cây con ................................................................................112
Hình 3.39. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của salicylic acid lên khả năng tăng trưởng
và sự tich lũy plumbagin ..............................................................................114
Hình 3.40. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và nồng độ cảm ứng
của salicylic acid đến sự tích lũy plumbagin trong cây con D. burmanii ...114
Hình 3.41. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của D.burmanii .............................................................117
Hình 3.42. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và nồng độ cảm ứng
của cao nấm men lên sự tích lũy plumbagin trong cây con D. burmanii ....118
Hình 3.43. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của việc gây stress nitrogen lên khối lượng
cây tươi .........................................................................................................120
Hình 3.44. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của việc gây stress nitrogen lên hàm lượng
plumbagin.....................................................................................................120
Hình 3.45. Biều đồ thể hiện ảnh hưởng của nền khoáng và nồng độ đường lên khả
năng sống của lớp mỏng tế bào ...................................................................124

Hình 3.46. Hình thái mô sẹo được tạo thành từ lá D.burmanii .............................126
Hình 3.47. Hình thái mô sẹo được tạo thành từ rễ D.burmanii .............................126
Hình 3.48. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo dưới ảnh hưởng của 2,4-D, NAA,
KN ................................................................................................................128
Hình 3.49. Hình thái mô sẹo dưới tác động kết hợp của 3 loại hormone ..............129
Hình 3.50. Dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo ................................131
Hình 3.51. Dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp mỏng tế bào ..132
Hình 3.52. Tế bào D. burmanii bắt màu hồng khi nhuộm TTC. ...........................133
Hình 3.53. Đường cong tăng trưởng của các dịch huyền phù tế bào D. burmanii có
mật độ tế bào ban đầu khác nhau ................................................................135

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang xix


DANH MỤC

Hình 3.54. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của ánh sáng và tốc độ lắc lên sự tăng
trưởng và sự tích lũy plumbagin ..................................................................137
Hình 3.55. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tăng trưởng và tích lũy
plumbagin.....................................................................................................140
Hình 3.56. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của phenylalanine và tyrosine lên sự tăng
trưởng và tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào D. burmanii .......143
Hình 3.57. Con đường tổng hợp plumbagin từ tiền chất tyrosine thông qua các đơn
vị acetate .....................................................................................................144
Hình 3.58. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào ............................................145
Hình 3.59. Sinh tổng hợp plumbagin ở Drosera và một số yếu tố tác động lên quá
trình sinh tổng hợp .......................................................................................147

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang xx


LỜI MỞ ĐẦU

MỞ ĐẦU
Từ ngàn xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ thiên nhiên để chữa bệnh, tuy nhiên,
nguồn dược liệu khai thác từ thiên nhiên cho đến nay vẫn không đủ để đáp ứng nhu
cầu sử dụng. Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học hiện đại, các nhà
khoa học đã phải tìm nhiều biện pháp để tổng hợp các dược phẩm có cơ cấu tương
tự các hợp chất mà người xưa đã khai thác từ thiên nhiên. Song, các dược phẩm
tổng hợp thường gây ra không ít những tác dụng phụ như giảm khả năng trị liệu,
gây độc tố…Do đó, việc nghiên cứu cây cỏ thiên nhiên nhằm tìm ra các hợp chất có
giá trị trị liệu để cung cấp thêm nguồn khai thác dược liệu là việc làm hết sức cần
thiết. Hơn nữa, nghiên cứu áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học dựa trên các
phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro nhằm đảm bảo được một cách chủ động số
lượng cần thiết các hợp chất có giá trị trị liệu là điều mà các nhà khoa học luôn đề
cao hàng đầu và đang tích cực hướng đến.
Drosera, một loài thực vật bắt mồi mang nhiều đặc điểm khác lạ so với các loài
thực vật khác: có khả năng cảm ứng; có khả năng tiết ra nhiều loại hợp chất thơm,
ngọt ngào để thu hút côn trùng; có nhiều loại enzyme thủy phân để tiêu hóa côn
trùng làm nguồn dinh dưỡng…Đặc biệt, chúng có một giá trị dược tính rất to lớn
trong điều trị các căn bệnh hiểm nghèo như: lao, ung thư, HIV, tim mạch, ho gà,
hen suyễn…kể cả những căn bệnh do đột biến. Thế nhưng, theo kết quả từ bộ sưu
tập thực vật của Juniper và cộng sự [58], Drosera trong thiên nhiên hiện nay tương
đối hiếm. Loài cây này đang được đánh giá là loài có nguy cơ tuyệt chủng cao trên
thế giới, nhiều quốc gia đã phải ban hành luật để bảo vệ chúng [20], [21]

Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ [5], có tất cả 3 loài Drosera. Tuy nhiên, cho đến
nay, người dân chỉ thường thấy 2 loài trong số đó là: D. indica L. và D. burmanni
Vahl. Theo Đỗ Tất Lợi [6], chưa loài nào được nghiên cứu về thành phần hóa học,
dược tính, song dân gian không ít người sử dụng chúng để chữa bệnh: ho gà, kiết lị,
lao hạch, cam tích, viêm loét, chai chân, nám…

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang 1


LỜI MỞ ĐẦU

Trước những ghi nhận đó, nhằm hướng đến mục tiêu tìm kiếm nguồn nguyên liệu
chủ động cung cấp hoạt chất có giá trị trị liệu cho ngành dược, luận án:

KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN
CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
TỪ VIỆC NUÔI CẤY TẾ BÀO HAI LOÀI DROSERA
Đã được hình thành với 3 nội dung chính:
¾ Thiết lập quy trình vi nhân giống 2 loài Drosera thu hái ở Việt Nam
¾ Sàng lọc, thu nhận và xác định một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn
nguyên liệu nuôi cấy in vitro của hai loài Drosera.
¾ Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất
có tiềm năng trên hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro Drosera:
Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp
Bổ sung tiền chất
Sử dụng những nhân tố cảm ứng con đường sinh tổng hợp (elicitor, stress)

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang 2


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm giống thực vật Drosera
1.1.1 Đặc điểm phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, Drosera thuộc: [9]
Giới:

Plantae (Thực vật)

Ngành:

Magnoliophyta (Ngọc Lan)

Lớp:

Magnoliopsida (Ngọc Lan)

Phân lớp: Rosidae (Hoa Hồng)
Bộ:

Caryophyllales

Họ:

Droseraceae

Giống:

Drosera

Tên tiếng Anh: Sundew, Sondou, Doublom
Drosera là giống thực vật chiếm số lượng loài nhiều nhất trong nhóm thực vật ăn
thịt, với hơn 188 loài [77]. Năm 1994, Seine và Barthlott đã chia các loài thuộc
giống Drosera vào 11 nhóm (section) thuộc 3 phân giống (subgenus) (hình 1.1)
− Phân giống Drosera: là phân giống lớn nhất, các loài thuộc phân giống này
được chia thành 7 section gồm Drosera, Ptycnostigma, Thelocalyx,
Phycopsis, Bryastrum, Lasiocephala, Coelophylla
− Phân giống Ergaleium: các loài thuộc phân giống này được chia thành 3
section gồm Stoloniferae, Erythrorhizae, Ergaleium
− Phân giống Regiae: chỉ gồm 1 loài duy nhất là D. regiae thuộc section
Regiae

Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang 3


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1. Cây phát sinh loài trong các phân giống thuộc giống Drosera dựa trên trình
tự DNA chloroplast rbcL và DNA nhân 18S ribosome [122]
Luận án Tiến sĩ Sinh học

Trang 4


N TÀI LIỆ
ỆU
TỔNG QUAN

1..1.2 Đặc điểm
đ
phân
n bố
1..1.2.1 Trênn thế giới
C loài Droosera phânn bố rộng rãi
Các
r khắp nơ
ơi trên thế giới
g (hình 1.2). Trong
g đó, đa sốố
cáác loài Droosera có nhiều
n
ở Úc (trong hơn
n 188 loài thì có hơnn 115 loài được phátt
hiiện ở Úc), Châu Phii (28 loài),, Brazil vàà một số nư
ước khác ở Bắc Mỹ
ỹ (17 loài),,
V
Venezuela
( loài), Châu
(17

C
Á (chhủ yếu ở Đông
Đ
Nam Á) phát hhiện khoảng 3-4 loài,,
C
Châu
Âu (Phháp, New Zealand...)
Z
) có khoảng
g 2-3 loài [31].
[

Hình
h 1.2. Sự phhân bố Droosera trên thế
t giới (vùùng có màuu xanh lá) [121]
1..1.2.2 Trong nước
Thheo sách Phạm
P
Hoànng Hộ, ngư
ười ta đã từn
ng tìm thấyy 3 loài Drrosera ở Việt
V Nam làà
D indica L, D. peltatta, D. burm
D.
manii Vahll [4]. Tuy nhiên,
n
choo đến nay, người dânn
chhỉ tìm thấyy và sử dụnng 2 trong số
s 3 loài nàày (D. indiica, D. burrmanii) như
ư những vịị

thhuốc dân gian [5]. Haai loài Droosera này xuất
x
hiện nhiều
n
ở cácc tỉnh miền
n Bắc, Bắcc
Trrung Bộ (T
Thái Nguyyên, Thanh Hóa, Ngh
hệ An, Hà Tĩnh), khuu bảo tồn th
hiên nhiênn
Bình Châu-P
Phước Bửuu thuộc tỉnnh Bà Rịa Vũng Tàuu và khu ddu lịch sinh
h thái Bắcc
T
Bình, Bình Thuận.

Luuận án Tiếến sĩ Sinh học
h

Trang 5