Quy trình sản xuất enzyme pectinase và ứng dụng trong làm nước quả

GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

MỤC LỤC
MỤC LỤC..............................................................................................................................................................................1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VÈ ENZYME PECTINASE............................................................................................4

1.4.Đặc điểm của Enzyme pectinase:.................................................................................................................................7

1.7.Lợi ích khi sử dụng enzyme pectinase.......................................................................................................................15

CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME....................................................................................................20

PECTINEASE.....................................................................................................................................................................20

Thuyết minh quy trình:.....................................................................................................................................................21

2.3.Tách và làm sạch..........................................................................................................................................................23

2.4. Phương pháp tinh sạch...............................................................................................................................................27

2.4.1.Giới thiệu chung........................................................................................................................................................27

2.4.2.Phương pháp kết tủa.................................................................................................................................................29

Kết tủa enzyme bằng dung môi hữu Ctf.........................................................................................................................31

2.4.4.Phương pháp sắc ký..................................................................................................................................................35

2.4.5.Phương pháp thẩm tích............................................................................................................................................38

2.4.6.Kết tủa ái lực..............................................................................................................................................................39

2.5. Thu chế phẩm từ ASP.NIGER 72-32.......................................................................................................................39

Nhóm 20Trang 1


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang
2.5.1.Ảnh hưởng thời gian nuôi........................................................................................................................................39

2.5.2.Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi..........................................................................................................................................39

2.5.3.Ảnh hưởng độ ầm ban đầu của môi trường nuôi cấy..........................................................................................41

2.6.Xác định hoạt tính enzyme..........................................................................................................................................43

2.6.1.Phương pháp nhớt kế...............................................................................................................................................43

2.6.2.Phương pháp đông chung(Cu-pectat)....................................................................................................................43

2.6.3.Phương pháp so màu:...............................................................................................................................................44

CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG ENZYME PECTINEASA TRONG LÀM......................................................................45

NƯỚC QUẢ.........................................................................................................................................................................45

3.1. Giói thiệu về ứng dụng enzyme pectinase................................................................................................................45

3.2.ứng dụng enzyme pectinase sản xuất nước quả 3.2.1. Các chế phẩm enzyme....................................................46

3.2.2.ứng dụng chế phẩm pectinase trong sản xuất nước quả.....................................................................................48

♦♦♦ Sản xuất nước quả uống ngay từ dâu tây, anh đào và phúc bồn tử....................................................................51

♦> Sản xuất nước quả từ nho............................................................................................................................................54

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................................................................56

Nhóm 20Trang 2


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay nước ta đang trong thời kỳ phát triển mạnh, cùng với xu thế hội
nhập nền kinh tế quốc tế, thì các ngành khoa học kỹ thuật và dịch vụ ngày
càng phát triển, theo đó ngành công nghệ thực phẩm cũng từng bước được cải
tiến để cung cấp các sản phẩm đầy đủ chất dinh dưỡng, đẹp mắt, tiện lợi đáp
ứng những nhu cầu ngày càng cao của con người.
Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống đã trở thành phổ biến trong
ngành sản xuất thực phaamt và mang lại lợi ích khá lớn.
Trước đây, nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật. Ngày
nay, người ta nghiên cứu tìm ra nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú và đa
dạng và rẻ tiền. Và được ứng dựng rộng rãi trong các ngành sản xuất khác
nhau.
Đe hiểu sâu hon về nguồn enzyme này nhóm em thực hiện đề tài tiểu
luận quy trình sản xuất enzymepectínase và ứng dụng trong sản xuất nước
quả.
Vì thòi gian hoàn thành báo cáo không nhiều, cũng như kiến thức còn hạn
chế nên không tránh khỏi những sai sót, em kính mong nhận được sự đóng góp

ý kiến của cô, các bạn để bài báo cáo của em được hoàn thiện horn và giúp em
tiến bộ horn trong những bài làm sắp tới.

Nhóm 20Trang 3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VÈ ENZYME PECTINASE
1.1.

Enzyme là gì?
Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân pectin , sản
phẩm của quá trình này là acid galactưronic, galactose, arabinose,
methanol... đây là một nhóm ezyme được ứng dụng ĩộng rãi trong cồng
nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease. Enzyme này ban đầu được
phát hiện trong cảc dịch chiết trái cây như cà rốt, cà chua hay đại mạch.
Đầu tiên phải kể đến lầ phát hiện
của E.fremi (1840) trên đối tượng cà
rốt.

1.2.

PiírtinasỂ

Cấu tạo
Pectin là polysaccharide dị
thề, chủ yếu là một mạch chính gầm
các gốc acid -a-D-1,4 galacturonic,
liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-0
glucozic

còn

gọi

là

acid

F'ct’liiDttSe là nhúm CIIÍVIII UIL’ tác 1’liei MC til
JV plnìỉi pectin

P «tinsse

P edi MU

polygalacturonic hay acỉd pectic.
Pectine hòa tan trong tự nhiên là
ester metylic của acid pectic.

EMto-iMairi

Trong thực tế không phải tất cả các
nhóm -COOH ở C6 của đường galactose cũng bị metyl hóa (tạo ester
metylic), mà đôi khi một số nhóm -COOH bị decacboxyl hóa (khử C02),
một số nhóm -COOH thay thế -H bằng kim loại, cũng có lúc giữ nguyên
dạng -COO. Người ta cho rằng protopectine là hợp chất giữa pectine và
arában, galactose hay tinh bột.
Trọng lượng phân tử từ 20.000 - 200.000 đvC.
1.3.

Phân loại
Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng:


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase
Enzym (tên gọi theo hệ Enzym(tên
stt

thống)

thường gọi)

1

Pectin-pectinhydrolase

pectinesterase

2

-

Poly- -l,4 galacturonidglycano hydrolase-PG

Poly-"-l,4-D3

4

Endopoly
galacturonase
(endo-PG)

Exopoly

galacturonidgalacturon- galacturonase
hydrolase

(exo-PG)

Poly-'-l,4-D-

Endopolymetil-

galacturonidmetilester-

galacturonase

glycanohydrolase

(Endo-PMG)

Phản ứng xúc tác

Pectin + H20 = n metanol +
pectic acid
Thủy phân liên kết '-1,4-Dgalacturonid

trong

galacturonid không theo một
trật tự nào
Thủy phân liên kết '-1,4-Dgalacturonid

trong

pectat,

trong galacturonic với sự đứt
mạch của acid galacturonic
Thủy phân liên kết "-1,4-Dgalacturonid

trong

pectin

không theo một trật tự nhất
định.
Thủy phân liên kết '-1,4-D-

Poly-"-l,4-D5

galacturonid
digalacturonoliase

Exo-pectatliase
(exo-PKTE)

galacturonid trong pectat với

sự

tạo

thành

aciddegalacturonic

'-4,5
không

theo một trật tự nhất định.
Thủy phân liên kết '-1,4-D6

Endopectatliase galacturonid trong pectat,
trong galacturonic với sự tạo
galacturonid glicanoliase (PETE)
Poly- ■ -1,4-D-

thành nối đôi không theo một

Nhóm 20Trang 5


GVHD: Th. S Nguyen Thị Thu Sang

trật tự nhất định
Poly-"-l,4-D7

galacturonid

glicanoliase

Thủy phân liên kết '-1,4-DEndopectinliase galacturonid trong pectin với
metylester
(Endo-PTE)
sự tạo thành nối đôi không
theo một trật tự nhất định

4- Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester.
Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đon vị
galaturonate nằm kề đon vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm
methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm -COOH tự do, tạo thành acid
pectinic hoặc acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các
nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau. Nếu thu từ nguồn vsv
thì PH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ
5,0-8,5. Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-40°C và bị
vô hoạt ở 55-62°C. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion
Ca2+ và Mg2+.
4- Polygalacturonase:

còn có tên gọi là poly -1,4-

galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết -1,4glycosid.

Các

exo-PG

(exo-poly

1,4—D-galacturonide)

galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG
(endo-polyl ,4-D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên
vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có
chủ yếu ở một số nấm mốc và vi khuẩn. Polygalacturonase là một phức
hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối vởi
cơ chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất, enzym
polygalacturonase được chia làm bốn loại:
4- Polymethylgalacturonase

hay còn gọi là -1,4-galacturonite-

methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalactorunic acid đã được
methoxyl hoá (tức là pectin). Enzyme này lại được phân thành hai nhóm
nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân
tử pectin, đó là endo-glucosidase-polymethyl galacturonase kiểu I và
Nhóm 20Trang 6


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

exo-glucosidase- polymethylgalaturonase kiểu II.
4- Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic,
cũng

được

chia

thành

hai

nhóm

nhỏ

là

endo-glucosidase-

polygalacturonase kiểu II và exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu IV.
Enzyme endo- glucosidase-Polymethyl-galacturonase kiểu I là enzyme
polymethylgalacturonase dịch hoá pectin có mức độ methyl hoá càng
cao thì bị thủy phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả.
Trong dung dịch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của
enzyme này thường bị giảm. Enzyme này rất phổ biến trong các vsv, đặc
biệt là nấm mốc A. nỉger, A, awamorl
T Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate
không bị ester hoá. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(l,4—D-galac
turonide) lyase) và endo-PEL (endo-poly(l,4—D-galacturonic lyase) đều
tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích
hợp hơn cả cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có
khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca 2+ để hoạt
động. Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi
khuẩn và nấm. Các enzyme vsv ngoại bào này đóng một vai trò rất quan
trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của
thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật.
Ngoài ra còn có:

1- Pectin-transelỉminase hay còn được gọi là poly -1,4-galaturonite
methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid.
4- Polygalactorunate-transelỉminase còn được gọi là poly -1,4Dgalaturonite -glucanoliase, là enzyme tác dựng trên pectic acid và
pectinic acid.
Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị
ester hoá. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme.
1.4. Đặc điểm của Enzyme pectinase:
1.4.1. Enzym pectinase từ nguồn thực vật:

Nhóm 20Trang 7


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

> Pectìnesterase:
Trong thực vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enyme
PE.Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm
trong
phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng
pH hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca 2+ chẳng hạn,
có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme.
Cà chua chứa ít nhất hai loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong
giai đoạn đầu của quá trình chm. Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ
enzyme PE1 giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có
màu đặc trưng của trái chín. PE2 có khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu
7,6. Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67°c. Các ion Ca2+ và
Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và
0,05M, theo thứ tự.
PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt
động tối ưu tại pH gần 8. Polygalacturonic acid, là sản phẩm được hình

thành do quá trình để methyl hoá các phân tử galacturonic acid.
Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối
lượng phân tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3.
Các enzyme này hoạt động ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên
khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dịch
về 6,0. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại.
Polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose,
maltose và galactose.
PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối
lượng phân tử 36,kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là
10,05 và 11,0, theo thứ tự. pH tối ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0.
Trong thành phần của nhiều thịt quả khác cũng chứa hai
isoenzyem, một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, còn enzyme
kia thì ít mẫn cảm hơn khi bị tác động của protease. Độ ổn định của
enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân tử
Nhóm 20Trang 8


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

enzyme. Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lượng là
51kD và 36kD, theo thứ tự.

Nhóm 20Trang 9


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

Hình 2.1: cấu trúc của pectỉnesterase từ carrot
Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme của

kiwi có cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đằng điện là 7,3.
Tuy nhiên, chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt > Polygalacturonase:
Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn vsv. PG
thường được lìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của cảc loài nấm và
vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như Sacchromyces gragỉtís, Aspergillus
nig er, Lactobacillus plantarum, Cochỉlioboỉus carbonum, Neurospora
crassa, các loài Ascomycete, Phizopus arrchtzus, và Fusarium osyporum.
Tuy nhiên, trong thực tế, Pỡ của thực vật bậc cao được nghiên cứu rất
nhiều ở cà chua chỉn.
Các enzyme PG trong cà chua chm tồn tại dưới hai dạng, và cả hai
đều là endo-enzyme.PGl có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50%
bị bất hoạt ở nhiệt độ 78°C.PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có
khoảng 50% bi bất hoạt ở 57°c. PG1 có độ ổn định tối đa ở pH 4,3, trái
lại PG2 ổn định tối đa ởpH 5,6.
Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic,
tạo ra galacturonic acid là sản phẩm thủy phần chiếm ưu thế.Sự thủy
phân polymer này bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong
cơ chất Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với
mức polymer hoá 20 đối với các exo-PG ở cà rốt và đào. Hoạt động của
Nhóm 20Trang
10
các exo-enzyme

làm tầng nhanh


GVHD: Th. s Nguyễn Thị Thu Sang

sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ
chất. Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chửi không gây ra sự tích

lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có liên quan.
1.4.2. Enzym pectinase từ vi sinh vật
Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn.
Nấm mốc: pénicillium glaucum, p.ehrlỉchỉỉ, p.chrysogenum, p.expanam,
p.cỉlrỉmỉm, aspergỉllus awamori, a.foetidus, a.nỉger, a.terrus, a.saỉtoỉ,
a.aureus, a.oryzae, a.wentii, fusarium moniliforme,...
Nấm men: Saccharomyces fragilis
Yi khuẩn: bacillus polymyxa, flavobacterium pectinovorum, klebsiella
aerogenes...
Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả,
các bộ phận khác của thực vật. khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết,
chứng sẽ cùng các loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh quả và các bộ
phận của thực vật. Người ta thường thu pectinase từ canh trường bề mặt
hoặc từ canh trường bề sâu của nấm mốc.
Các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzime này a.nỉger
chủ yếu tổng họp ra pectinnesterase. con.dỉplodỉella, pen.cỉtrỉmỉn tạo ra
chủ yếu là polygalacturonase.
Nấm men sacch.fragỉlỉs dường như chỉ tạo ra endopectintraseliminase.
Yi khuẩn bac.polymyxa, bac.specỉes lại chủ yếu tạo ra transeliminase.
> Pectinesterase:
Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị PH tối
ưu khác nhau: PH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến
5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzime polygalacturonase sẽ có PH tối
ưu từ 2,0 đến

Nhóm 20Trang 11


GVHD: Th. s Nguyễn Thị Thu Sang

6,5. Trái lại ph tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật thượng đẳng
là từ 6 đến 7,5-8.
Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 45°c.từ 55 đến
62°c thì enzime bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzime
pectinesterase từ thực vật thượng đẳng cao horn: từ 55 - 60°c
Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger
có nhiệt độ tối ưu là 30 - 45°c, PHopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62°c và
từ thực vật (phopt=7,5-8, t°opt= 55-60°C). khả năng hoạt động của chúng
phụ thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin. Ion natri và
đặc biệt là ion canxi, cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa
pectinesterase từ nấm mốc conỉthyrỉum dỉplodỉella và từ a.niger.trái lại
các cation hóa trị 3 và 4 (thủy ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt
clorua) sẽ kìm hãm tác dựng của pectinesterase
Ngoài ra, người ta đã thu được enzime pectinesterase ở trạng thái
đông thể. và người ta cũng đã xác lập được rằng n-axit cuối trong phân
tử enzime là phenylalanin.
Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm
methylester nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do. và enzime sẽ thủy
phân lần lượt cắt liên kết ester dọc theo phân tử pectin, hoạt động của
pectìnesterase phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hóa của pectin và tỷ lệ
thuận vào mức độ ester hóa. Chẳng hạn, đối với tác động của
pectinesterase từ nấm mốc a.nỉger, cần thiết phải có pectin ester hóa ở
mức độ cao không ít horn 70%.
> Polygalacturonase:
Hầu hết các nghiên cứu về Polygalacturonase đều trên cơ sở các
nguồn Yi sinh vật. Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các
phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn
như: saccharomyces fragilis, asperigiỉỉus niger, lactobacillus pỉantarum,
cochlibolus carbonum, neurosrora crassa, các loài as corny cete,
Nhóm 20Trang 12

GVHD: Th. s Nguyễn Thị Thu Sang

rhizopus arrchizus và fusarium oxysrorum.
PH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc
vào nguồn thu và cơ chất. Chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa
(endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì ph tối ưu
nằm trong khoảng từ 4,0 - 5,5. cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên
pectin thì lại có ph tối ưu trong khoảng 5,5-6. còn polygalacturonase
đường hóa khi tác dụng trên pectin thì ph tối ưu từ 3 - 4 nhưng khi tác
dựng trên acid pectinic thì ph tối ưu cao hơn một ít ở vừng 4,4- 6
Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 - 6
Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.nỉger nếu được hoạt
hóa bằng thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5
Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40 45°C.trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vô
hoạt hóa khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 65°c.
1.5. Trung tâm hoạt động của pectinase
Enzyme pectinase chứa vùng có 8 - 10 vòng xoắn kép về phía
phải với 2 vòng tạo thành khe liên kết với cơ chất.
Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa axit amin Aspartate và
Lysine. Có 1 Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến
khả năng xúc tác của enzyme
Nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinase khoảng từ 45 - 55°c.
1.6. Cơ chế tác dụng của enzyme pectinase
Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm enzym nhằm
hai mục đích cơ bản.
- Phá vỡ thành tế bào thực vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả.
Làm trong và ổn định chất lượng nước.
•S Phá vỡ thành tế bào. Tế bào thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào

(thành tế bào). Yỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rất hữu hiệu và tạo
Nhóm 20Trang 13


GVHD: Th. s Nguyễn Thị Thu Sang

hình cho tế

Nhóm 20Trang 14


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

bào. Ở vỏ tế bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem
như chất ciment gắn các tế bào với nhau. Phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo
điều kiện cho các vật chất trong tế bào thoát ra khỏi tế bào. Các chế
phẩm enzym có chứa không chỉ pectinase mà còn chứa các enzym trong
nhóm cellulase. Các loại enzym này sẽ làm phá vỡ thành tế bào và giúp
quá trình thu nhận dịch tế bào tốt horn.
Làm trong nước quả. Nước quả sau khi được tách khỏi tế bào
thường chứa nhiều chất khác nhau. Trong đó chất pectin chiếm lượng
đáng kể và pectin thường gây hiện tượng độ nhớt cao và gây đục nước
quả.
Các chất protein có trong bào tưorng, màng tế bào và gian bào. Pectin
chứa polygalacturonic acid, araban và galactan.Trong đó lượng
polygalacturonic acid chiếm tới 40-60%. Khi bị thủy phân, pectin tách
thành hai phần:
- Phần trung tính - phức chất galactanoraban
- Phan acid - acid pectic.
Trong bào tưomg, pectin nằm ở dạng hòa tan. Trong màng tế bào

và gian bào, chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin.
Protopectin ở màng gian bào có chứa lượng kim loại khá lớn và một
lượng nhóm metocyl đủ để làm protopectin bền vững. Còn protopectin ở
màng tế bào chứa một lượng kim loại không nhiều, có độ metocyl hóa
cao. Vì thế, tế bào thực vật có khả năng trưorng nở tốt.
Neu enzym tham gia phân giải pectin ở gian bào sẽ làm các tể bào khó
liên kết với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra.Pectin thường có mối
liên kết hydro và liên kết nguyên tử yếu horn so vởi cellulose. Tham gia
phân hủy pectin gồm nhiều loại enzym : cellulose, pectinase,...
1.7.

Lợi ích khi sử dụng enzyme pectinase
Từ khi phát hiện ra enzym và khả năng chuyển hóa của enzym
loài người đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzym trong
công nghiệp, số lượng enzym phát hiện ngày càng nhiều và số lượng
enzym được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều.

Nhóm 20Trang 15


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm
pectinase dưới dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới
dạng canh trường nấm mốc sấy khô. Tỉ lưởng chế phẩm pectinase cô đặc
trên lượng nguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ 0.03 - 0.05 đến
0.10%.
Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiếp thực phẩm
sau:
Sản xuất rượu vang.

Sản xuất nước quả và nước uống không có cồn;
Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt
đông,.. Sản xuất nước giải khát.
Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan.
ị Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các
nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách rất hiệu
quả. Nhờ tác dựng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và lọc
dịch quả rất dễ dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa
pectinase vào khâu nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi
ép lên tới 15 - 25%. Bởi lẽ khi có pectin thì khối quả nghiền sẽ có trạng
thái keo, do đó khi ép dịch quả không thoát ra được. Nhờ pectinase phân
giải các cơ chất pectin, làm các chất chiết trong dịch bào dễ thoát ra
ngoài hơn, làm tăng hiệu suất chất chiết, hơn nữa dịch quả trong suốt
không bị vẩn đục và lọc rất dễ dàng. Không những vậy, enzym pectinase
còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và những chất hòa tan
nữa, do đó làm tăng thêm chất lượng của thành phẩm.
Các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất phải có những yêu cầu
sau:
Chế phẩm không được làm giảm chất lượng của vang, không
được gây ảnh hưởng xấu đến hương vị và màu sắc của sản phẩm; nghĩa
là chế phẩm phải được làm sạch tới mức tối đa khỏi các tạp chất có ảnh
hưởng xấu đến chất lượng vang.
Nhóm 20Trang 16


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

Chế phẩm được đưa vào dịch hay bã nghiền để tăng cường quá trình sơ
chế quả, tăng nhanh và làm trong dịch, nâng cao tốc độ lọc, tăng hiệu
suất

chung và đặc biệt là hiệu suất của phần tự chảy có chất lượng cao. Để
tăng nhanh và tốt quá trình làm trong dịch thì tương quan hoạt độ của
các enzym chính như endo - PMG là 55,0.10 2 đơn vị/mg protein chứa
trong chế phẩm, còn enzym Cx là 57,5 đơn vị/mg protein trong 1 lít
dung dịch. Trong trường hợp này không cần có mặt PE. Nhưng nếu hoạt
độ của endo - PMG ở trong chế phẩm là 31,0.10 2 đơn vị/mg protein thì
cần có mặt PE với hoạt độ là 4,1 đơn vị/mg protein. Trong sản xuất vang
nho giữa hàm lượng enzym endo - PMG va Cx phải có sự tương quan
nhất định. Khi chế phẩm có hoạt độ endo - PMG là 28,2.10 2 đơn vị/mg
protein và Cx là 28,7 đơn vị/mgP quá trình làm trong sẽ xảy ra nhanh
hơn khi có hoạt độ endo - PMG là 25,4.10 2 đơn vi/mg p và Cx là 55,0
đơn vị/mgP.
Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn định của vang nghĩa là
phải chứa enzym proteinase với hoạt độ không thấp hơn 120 đơn vị/g
theo globulin và 140 đơn vị/g theo anbumin.
Để tránh gây tổn thất các chất màu cùa vang đỏ và tránh xuất hiện
màu tối trong vang trắng thì hoạt độ của các enzym oxy hoá trong chế
phẩm không được vượt quá 0,1 đơn vị/mg axit ascorbic trong một phút
trên một gam chế phẩm.
Chế phẩm pectinase dùng trong vang quả phải bảo toàn được hoạt
độ trong điều kiện có chứa rượu (10-12%) và phải tác dụng có hiệu quả
trong điều kiện có độ pH nhất định.
Đe xử lý dịch hoặc bã nghiền ở trạng thái dòng có thể dùng chế
phẩm pectinase có hoạt độ cao (12000đv/g) hoặc dừng chế phẩm
pectinase không tan.
Chẳng hạn trong sản xuất vang nho, khi sử dựng chế phẩm
pectawamorin PM10x, người ta thấy có thể tăng hiệu suất dịch tự chảy lên
Nhóm 20Trang 17

GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

32%. Trung bình thể tích của phần dịch tự chảy có thể tăng được 10%,
còn hiệu suất chung của dịch tăng lên 1-2%. Hoặc khi ép bã nghiền nho
trắng đã được xử lý bằng pectinol thì thấy quá trình ép tiến hành nhanh
hơn. Hiệu suất dịch khi đó tăng lên 9,6%. Yậy dùng chế phẩm pectinase
sẽ làm tăng tốc độ làm trong và tốc độ lọc của dịch.
Khi sử dụng chế phẩm pectinase, các polime của dịch như protein,
pectin ... sẽ thủy phân làm giảm độ nhớt do đó làm tăng tốc độ lọc.
Trong 1 giờ dịch thu được từ bã nghiền của nho có xử lý bằng chế phẩm
pectinase sẽ qua lọc 7 lần nhanh hơn từ bã không được xử lý.
Khi dịch không được xử lý bằng enzym thì trong quá trình lắng,
các hạt vẩn đục lớn và nhỏ sẽ bị kết tủa xuống. Khi sử dụng enzym thì
các chất cao phân tử của dịch sẽ bị thủy phân từng phần, độ nhớt bị
giảm, kết quả là tốc độ làm trong đều tăng.
Sử dụng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng chất lượng của dịch quả và của
vang.
Trong quá trình xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase, thành
phần hóa học của bã thay đổi rất đáng kể mà trước tiên là hàm lượng
chất phenol. Người ta thấy rằng khi xử lý bã nghiền bằng chế phẩm
pectinase sẽ làm tăng hàm lượng catesin ở trong dịch. Khi đó quá trình
trích ly sẽ vượt lên trước quá trình oxy hoá catesin ngay cả khi nhiệt độ
tăng. Điều này rất quan trọng, vì các hợp chất phenol đặc biệt là catesin
có các nhóm hydroxil ở vị trí octo thường có họat tính của vitamin p.
Như vậy xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng giá trị
sinh học của dịch quả và vang.
Không những vậy vang được pha chế từ dịch và bã nghiền có xử
lý bã bằng chế phẩm pectinase sẽ chín nhanh hơn do đó cần chiết sớm
hơn. Người ta cho thấy rằng chế phẩm thu được từ nấm mốc, Botrylis
cinerea gây ảnh hưởng rất tốt đến chất lượng của vang, vang có hương

thơm mạnh và dịu do hàm lượng glyxerin và ester ở trong vang cao.
Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta thường sử dụng chế
Nhóm 20Trang 18


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

phẩm enzym bao gồm pectintrancelinutase, hemicellulase, cellulase.
Trong đó, enzym pectintrancelinutase đóng vai trò quan trọng nhất.
Trong hỗn hợp chế phẩm enzym trên, tuyệt đối không được có mặt
enzym polygalacturonase,

đặc

biệt không được

chứa

enzym

endopolygalacturonase. Những enzym này thường làm giảm độ nhớt của
nước quả và phá vỡ độ đồng nhất của nước quả.

Nhóm 20Trang 19


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

Cấy
Hấpvào

khửmôi
trùng
trường

Nhân
eiốne

Để nguội

HấpGiống
khử trùng
vi sinh
vật
Để nguội

CHƯƠNG
2:
CÔNG
NGHỆ
SẢN
XUẤT
ENZYME

PECTINEASE
2.1.

Nguồn gốc thu nhận
• Từ vi sinh vật: Neu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme thì
ở vi sinh vật là một loại enzyme rất phong phú.Vi sinh vật phân giải
pectine hầu như có mặt ở các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như:

s Nấm mốc:

Asp.niger, Asp.oryase, Asp.terreus, Asp.saito,

Asp.japonicus...
■S Nấm men: sac.ellipsoideus, sac.fragilis, sac.ludwigii...
S Vi khuẩn: Bac.polymixa, Bac.felseneus, Clostridium roseum...
2.2.

Phương pháp nuôi
Môi trường

cấy bề mặt ♦♦♦ Quy trình
sản xuất
Dựng cụ nuôi
cẩv

Phối vào dụng cụ

Nuôi cấy trong 36h

Thu nhận enzyme
thô

Nhóm 20Trang 20


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

•

Thuyết minh quy trình:

•

Môi trường nuôi cấy
Là môi truồng rắn, gồm các thành phần tự nhiên: cám mì, cám gạo,

ngô mảnh, bột đậu tương... pha thêm muối khoáng. Môi trường rắn
thường dùng nhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các
chất dinh dưỡng và khi làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc
phát triển, sinh ra nhiều enzyme. Có thể bổ sung những thành phần giàu
pectin như bã củ cải đường, bột cà rốt làm chất cảm ứng để thu được hàm
lượng pectinase cao. Bên cạnh đó, chứng ta cần bổ sung thêm trấu để tạo
môi trường thoáng khí tốt, giúp cho sự phát triển của nấm. Yậy môi
trường hoàn chỉnh để nuôi cấy gồm có: 70% cám mì + 23% trấu + 5%
chất cảm ứng + chất dd khác ( mầm mạ, nước khoai tây, ... để cung cấp
thêm nguồn Nitơ, Photphat, Kali, ... ). Môi trường rắn cần được làm ẩm
đến khoảng 60%, nếu độ ầm quá cao thì nhiều loại vi khuẩn phát triển gây
tạp nhiễm, nếu độ ẩm quá thấp sẽ làm môi trường nhanh khô, sinh bào tử
mạnh.
•

Nuôi cấy: Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng

nuôi có sẵn các giá.
•

Dụng cụ: Dụng cụ và môi trường cần được khử trùng ở

121°C/latm/30 phút để tránh tạp nhiễm.
•

Đe nguội, phối vào dụng cụ: Môi trường được trải mỏng ra các

khay đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2 - 2,5cm và để nguội đến
30°c thì tiến hành cấy giống.
•
Giống
Sử dụng nấm mốc.Nấm mốc được nhân và nuôi cấy trong môi trường vô
trùng để tránh nhiễm tạp .giống được nhân theo phương pháp bề mặt và
cũng trên môi trường trên để giống quen với điều kiện sản xuất. Khi nhân
giống thường để cho nấm mốc mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử, bào
tử được thu theo phương pháp tách bào tử khỏi môi trường và chứa trong
các bình có nút kín. Tỉ lệ nhân giống vào khoảng 0,2 - 2%. Mỗi gam bào
tử mốc có thể cấy vào 10kg môi trường.
Nhóm 20Trang 21


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

•

Nuôi cấy
Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có

sẵn các giá.Phòng nuôi có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được
thổi gió.Nhiệt độ thích hợp với đa số mốc là 30-32°C.Nếu nhiệt độ
xuống dưới 24°c thì nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian
nuôi cấy dài như vậy sẽ làm giảm khả năng sinh tổng hợp Enzyme.

Qúa trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi truờng được chia thành 3
giai đoạn:
• Giai đoạn 1: Khoảng 10 - 14h đầu: giai đoạn này có những thay
đổi sau: S Bào tử nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu
sữa.
■S Bắt đầu hình thành enzym, không đòi hỏi phải thông khí nhiều
chỉ cần làm thoáng khoảng 2-3 thể tích không khí / thể tích phòng /
giờ. s Khối môi trường còn rời rạc, các thành phần dinh dưỡng bắt
đầu có sự thay đổi.
•

Giai đoạn 2: kéo dài khoảng 14 - 18h: giai đoạn này có những

thay đổi sau:
Mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát bằng mắt
thường, lúc đầu là lớp lông tơ màu trắng - xám và ngày càng rõ, làm môi
trường kết bánh lại, độ ẩm môi trường giảm dần. Các chất dinh dưỡng
trong môi trường tiêu hao nhanh để phục vụ cho các quá trình trao đổi
chất trong tế bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh
80 - 90kcal/giờ. Làm nhiệt độ môi trường tăng lên 40° - 45°c. Thời kì
này cần phải thông khí mạnh tới 60 thể tích khí/lthể tích phòng/giờ để
cung cấp 02 cho mốc thở và đuổi C0 2 ra khởi môi trường, đồng thời làm
giảm nhiệt độ buồng nuôi. Nhiệt độ buồng nuôi ở giai đoạn này cần giữ
ở 28 - 30° c và độ ầm trong phòng khoảng 90%.
Các loại Enzyme được hình thành trong giai đoạn này, pectinase được
hình thành nhiều nhất vì có cơ chất cảm ứng.
•

Giai đoạn 3: kéo dài trong khoảng 10 - 20h: giai đoạn này có

những biến đổi
Nhóm 20Trang 22


Quá trình trao đổi chất yếu dần vì do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng
sẽ chậm lại. Lượng nhiệt tạo ra giảm, khoảng 15 - 30kcal/kg/giờ.Thông
khí không quá 20 - 25 thể tích không khí/thể tích phòng/giờ, giữ nhiệt độ
buồng nuôi duy trì ở 30° c.
Tùy thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian nuôi cấy có
thể kết thúc tại điểm mà lượng enzyme tạo thành tối đa, Enzyme vẫn
được hình thành ở giai đoạn này.
Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô tới độ ẩm dưới 12%, nghiền
nhỏ, đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm. Sản phẩm này
là chế phẩm enzyme thô.
2.3.

Tách và làm sạch
2.3.1. Phương pháp thu nhận
Có 2 loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có
phưomg pháp tách và thu nhận riêng:
•

Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong

môi trường nuôi cấy ngoài tế bào, thường hoà tan trong nước do đó dễ
trích ly và tinh sạch.
•

Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi

sinh vật và không được tiết ra môi trường bên ngoài. Những tế bào vi
sinh vật sau khi được nuôi cấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào. Mục
đích của việc này là giải phóng toàn bộ các chất có trong tể bào gồm cả
enzyme nội bào. Hỗn họp thu được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những
chất có phân tử lượng lớn; còn enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay
muối. Enzyme sau đó sẽ được đem tinh sạch.


GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang

Enzyme nội bào

Enzyme ngoại bào

Khó tách

Dễ tách

Phài phá vỡ thành tế bào

Không cần phá vỡ thành tế bào

Thường lẫn chung zới các chất khác
của tế bào sau khi bị phá vỡ (acid
nucleic, chất nguyên sinh, lipid...)

KHông lẫn chung với các thành phần
nội bào, nếu có chỉ là một vài
enzyme ngoại bào khac
Bền cững hơn

Chỉ bần vững trong môi trường nội bào
Phương pháp tình sạch khó thực hiện, Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ hơn
quy trình công nghệ phức tạp, giá
thành đắt
Từ môi trường nuôi cấy bề mặt
Để chiết rút enzyme từ môi trường rắn người ta dùng nước, các
dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, axeton).Nhiều kết
quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này có kết quả tốt và
dể được dùng rộng rãi trong sản xuất.Theo phương pháp khuếch tán
bằng nước có thể chiết được lượng enzyme trên 90-95% và trong nước
chiết không chứa các tạp chất không tan. Nước thường dung khuếch tán
ở nhiệt độ 25 - 28°c. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một ít
focmalin hoăc chất sát trùng khác. Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm,
khá trong, chứa 10 - 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời
xuống 10 - 12°c.
Phương pháp tách chiết và làm sach enzyme được sử dụng rộng
rãi nhất hiện nay là phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ
(etanol, izopropanol và axeton). Các dung môi hữu cơ này làm giãm
hằng có điện môi của môi trường, như ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỉ lệ
nghịch với hằng số điện mới. Vì vậy các enzyme, các chất protein cũng
như các chất có phân tử thấp
Nhóm 20Trang 24

2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.

2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.
2.3.2.


GVHD: Th. S Nguyen Thị Thu Sang

trong hệ dung dịch nước - dung môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống.
Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn - nước phụ thuộc vào nồng
độ cồn, nhiệt độ, lực hút ỉon của dung dịch và tính chất protein của
enzyme. Đề tránh mất họat tính của enzyme tất cả phải được làm lanh
xuống 3 - 5*c. Khi trộn phải khuấy mạnh, khỉ các enzyme kết tủa và
lắng xuống dưới cần tách ly ngay.

Sơ đồ tinh sạch Enzyme từ canh trường nấm mốc:
Nhóm 20Tiang 25