Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THU DUNG

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN
GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO
(Pseudapocryptes elongatus)

Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản
Mã số: 62620301
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN

Cần Thơ, 2015


Công trình được hoàn thành tại: Khoa Thủy Sản, Trường Đại
học Cần Thơ

Người hướng dẫn khoa học:

PGs.TS Đặng Thị Hoàng Oanh

Phản biện 1:…………………………………………………………...
Phản biện 2:…………………………………………………………...
Phản biện 3:…………………………………………………………...

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường
Họp tại………………………………………………………………...
Vào ……..giờ………, ngày………tháng……..năm……………….

Có thể tìm luận án tại:
1. Trung tâm học liệu Trường Đại học Cần Thơ
2. Thư viện Quốc gia


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THU DUNG

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN
GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO
(Pseudapocryptes elongatus)

Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản
Mã số: 62620301
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

Cần Thơ, 2015



Chương 1. TỔNG QUAN VỀ LUẬN ÁN
1.1 Giới thiệu
Cá bống kèo (Pseudapocryptes elongates) là loài thủy đặc sản có giá
trị kinh tế cao, được tiêu thụ rộng rãi trong nước và có giá trị xuất khẩu. Cá
bống kèo được nuôi tập trung ở các tỉnh vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long,

tuy nhiên trong thời gian gần đây cá bống kèo nuôi thương phẩm bị bệnh
với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên thân, tại các vi và hậu môn với tỉ lệ
chết cao và chết trên diện rộng.
Tác nhân gây xuất huyết được mô tả nhiều nhất là do vi khuẩn. Điển
hình như Streptococcus agalactiae là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá
rô phi (Oreochromis sp.) (Phạm Hồng Quân và ctv., 2013), trên cá điêu
hồng (Oreochromis sp.) (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương,
2012). Vi khuẩn S. iniae là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm
(Latex calcarifer) (Trần Vĩ Hích và Nguyễn Hữu Dũng, 2011), cá bơn Nhật
Bản (Paralichthys olivaceus), cá đù đỏ (Sciaenops ocellates) (Eldar et al.,
1999). Ngoài ra, bệnh xuất huyết trên cá còn do vi khuẩn S. dysgalactiae ở
cá đối (Liza alata, Liza haemotocheila) (Qi et al., 2013), cá tầm (Acipencer
schrenckii) (Yang và Li, 2009), cá nâu (Mugil cephalus) và cá bớp
(Rachycentron canadum) (Abdelsalam et al., 2009).
Tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá còn được tìm thấy do nhiều loài
vi khuẩn khác như Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Loan và
ctv., 2009), Vibrio parahaemolyticus và V. alginolyticus gây bệnh trên cá
mú giống và cá mú thịt, (Somkiat Kanchanakhan, 1996; Nguyễn Thị Thanh
Thùy và ctv., 2009 được trích dẫn bởi Võ Văn Nha, 2012).
Do tác nhân gây bệnh đa dạng, nên việc phòng trị bệnh xuất huyết ở
động vật thủy sản chỉ có hiệu quả khi tác nhân và nguyên nhân gây bệnh
được xác định chính xác. Hiện nay, chưa có một nghiên cứu chính thức nào
về bệnh xuất huyết ở cá bống kèo, nhằm cung cấp thông tin khuyến cáo
người nuôi phòng, trị bệnh một cách hiệu quả, đề tài “Xác định tác nhân
vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes
elongatus)” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu tổng quát của luận án
Khảo sát và đánh giá tình hình xuất hiện bệnh xuất huyết trên cá
bống kèo nuôi tại tỉnh Bạc Liêu. Xác định đặc điểm bệnh học của tác nhân
gây bệnh ở cá bống kèo từ đó đề xuất giải pháp phòng và trị bệnh hiệu quả.

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Thông tin từ kết quả khảo sát hiện trạng bệnh trên cá bống kèo và qui
trình phòng trị bệnh sẽ góp phần hạn chế thiệt hại trong quá trình nuôi cá

1


bống kèo mang lại hiệu quả về năng suất và kinh tế, tăng thu nhập cho
người nuôi.
1.4 Những điểm mới của luận án
Xác định được tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo là vi
khuẩn S. dysagalactiae và các thời điểm bệnh thường xuất hiện ở cá bống
kèo nuôi trong ao.
Thực hiện và chuẩn hóa qui trình phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae
để ứng dụng chẩn đoán sớm, nhanh và đặc hiệu tác nhân gây bệnh xuất
huyết ở cá bống kèo bằng phương pháp PCR.
Đề xuất một số loại kháng sinh điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống
kèo.
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Trong phần tổng quan tài liệu, luận án đã nêu và phân tích những vấn
đề liên quan đến tình hình nuôi cá bống kèo cũng như tình hình nghiên cứu
về một số loại vi khuẩn gây bệnh trên cá với những nội dung chính:
- Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới và trong nước.
- Tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo.
- Tổng quan bệnh xuất huyết ở cá.
- Tổng quan về đặc điểm vi khuẩn gây bệnh trên cá.
- Tổng quan về tình hình vi khuẩn Streptococcus gây bệnh trên cá
nước lợ, mặn.
- Xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết.
- Chẩn đoán bệnh xuất huyết.

- Phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá.
Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2011 đến tháng 12/2014
3.2 Đối tượng nghiên cứu: Cá bống kèo
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Điều tra phỏng vấn
3.3.1.1 Số liệu thứ cấp
Thu thập từ báo cáo của các cơ quan chức năng tỉnh Bạc Liêu. Số
liệu thứ cấp gồm: Tình hình nuôi trồng thủy sản và tình hình nuôi thương
phẩm cá bống kèo trong tỉnh Bạc Liêu.
3.3.1.2 Số liệu sơ cấp
Tiến hành điều tra 90 hộ nuôi cá bống kèo thương phẩm ở thành phố
Bạc Liêu, huyện Hòa Bình và huyện Đông Hải tỉnh Bạc Liêu. Số liệu sơ

2


cấp gồm: Thông tin cơ bản, kinh nghiệm, kỹ thuật nuôi, thông tin về bệnh
trên cá nuôi và cách phòng trị khi cá bống kèo bệnh của người nuôi.
3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá
- Mẫu cá: thu 254 con cá bống kèo còn sống trong 34 ao nuôi (11 ao
cá khỏe, 23 ao cá đang có biểu hiện cá bị xuất huyết).
- Điều kiện thu mẫu: thu mẫu ao cá bống kèo nuôi thương phẩm giai
đoạn cá nuôi được 2 - 3 tháng tuổi, cá đạt từ 15 – 25 g/con. Thời gian thu
mẫu là 7 - 8 giờ sáng.
3.3.3 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng
Số lượng mẫu kiểm tra ký sinh trùng là 120 mẫu cá ở 12 ao gồm 04
đợt thu mẫu, mỗi đợt 03 ao, mỗi ao 10 con. Kiểm tra da, mang và ruột cá.
Mức độ cảm nhiễm của ký sinh trùng được tính:

Tỷ lệ cảm nhiễm = (Số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu đã kiểm tra) x 100
Cường độ cảm nhiễm = (Số trùng/Con cá, cơ quan, lame, thị trường)
3.3.4 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn
3.3.4.1 Phương pháp nhuộm Giemsa
Phết mẫu thận lên lame. Mẫu được cố định qua dung dịch Methanol
trong 1 phút. Phương pháp nhuộm mẫu theo Humason, 1979 trích dẫn bởi
Rowley, 1990. Đọc kết quả dưới kính hiển vi ở vật kính 100X có giọt dầu.
3.3.4.2 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn
- Dùng dao mổ tiệt trùng rạch một đường trên thận. Đặt que cấy vào,
xoay nhẹ để lấy mẫu bệnh phẩm và cấy trên đĩa agar. Ủ các đĩa môi trường
này trong tủ ấm ở nhiệt độ 28°C. Sau 24 – 48 giờ, đọc kết quả.
- Kiểm tra tính ròng của vi khuẩn, phản ứng oxidase, catalase, O/F,
khả năng phát triển của vi khuẩn trong môi trường TSB (+ 6,5%NaCl), khả
năng tan huyết của vi khuẩn.
d. Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep
(Biomérieux, Pháp)
Định danh ngẫu nhiên 32 chủng vi khuẩn trong bộ sưu tập vi khuẩn
được thu qua 06 lần thu mẫu bằng kit API 20 Strep.
3.3.5 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự
3.3.5.1 Phương pháp chiết tách DNA vi khuẩn
Qui trình chiết tách DNA từ vi khuẩn áp dụng theo phương pháp của
Bartie et al. (2006). Vi khuẩn được nuôi tăng sinh từ 16 - 18 giờ trong 5 ml
môi trường NB (+ 1,5% NaCl) ở nhiệt độ 28ºC, ly trích DNA bằng cách
cho 1,5 ml dung dịch vi khuẩn vào ống ly tâm cùng với 100 µl 10 mM TrisHCL, 1 mM EDTA, pH 8.0 (TE). Hỗn hợp được đun nóng ở 95ºC trong 15
phút, rồi được làm lạnh trong nước đá và ly tâm 2 phút ở vận tốc 14.000
vòng/phút để tách dung dịch DNA và trữ ở -20ºC cho đến khi sử dụng.

3

3.3.5.2 Phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA của vi
khuẩn
10 mẫu vi khuẩn được chọn từ kết quả phân lập được định danh bằng
phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA gồm: B1-6T; B2-5G; B2-3TT;
B6-9TT; A1F1; A1F2; A1F4; A1F6; A1F9; A5F4. Sản phẩm PCR mẫu
được gởi đến phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty
Nam Khoa giải trình tự gen 16S rRNA. Sản phẩm giải trình tự được chạy
điện di giải trình tự trên máy giải trình tự ABI 3130XL 16 capillar. Kết quả
giải trình tự đoạn gen 16S được so chuỗi bằng chương trình Blast search
trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen của NCBI.
3.3.6 Phương pháp mô bệnh học
Số lượng mẫu phân tích mô học gồm 127 mẫu cá. Lấy mẫu mô ở
mang, gan, thận của cá bệnh và cá khỏe. Mẫu được cắt với độ dày từ 5 – 7
mm, sau đó xử lý bằng máy xử lý tự động qua các giai đoạn loại nước, làm
trong mẫu và tẩm paraffin. Đúc khối và cắt mẫu với độ dày 4-6 μm, nhuộm
mẫu bằng dung dịch Haematocyline và Eosin (H&E). Tiêu bản được quan
sát dưới kính hiển vi, đọc kết quả dựa theo tài liệu của Ferguson (2006)
(trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011).
3.3.7 Phương pháp huyết học
3.3.7.1 Phương pháp phân tích mẫu máu cá
Số lượng mẫu phân tích huyết học gồm 102 mẫu cá. Máu được lấy ở
động mạch chủ ở đuôi cá (Houston, 1990). Phết mẫu máu. Mẫu máu sau
được cố định bằng cách ngâm trong methanol 1-2 phút (Rowley, 1990).
3.3.7.2 Định lượng hồng cầu
Hồng cầu được đếm qua buồng đếm hồng cầu ở vật kính 40X.
Công thức tính mật độ hồng cầu:
R = C x 10 x 5 x 200
Trong đó: R: mật độ hồng cầu (tb/mm3); C: tổng số hồng cầu trên 5
vùng đếm; 10: khoảng cách giữa lamelle và buồng đếm là 0,1mm; 5: diện
tích của mỗi vùng đếm là 0,2 mm2; 200: độ pha loãng hồng cầu.

3.3.7.3 Định tính và định lượng bạch cầu
Phương pháp nhuộm mẫu: mẫu được nhuộm theo phương pháp
Wright’s & Giemsa (Humason, 1997 trích dẫn bởi Rowley, 1990). Quan sát
dưới kính hiển vi ở vật kính 100X (Supranee et al., 1991).
Tổng bạch cầu (TBC)= (Bạch cầu trong 1500 tế bào x mật độ hồng cầu trên
buồng đếm)/ Số hồng cầu trong 1500 tế bào trên mẫu nhuộm.
Mật độ từng loại (tb/mm3) = Số lượng mỗi loại bạch cầu x mật độ TBC/200
3.3.8 Phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh xuất huyết
3.3.8.1 Phương pháp chiết tách DNA từ vi khuẩn: (giống 3.3.5.1)

4


3.2.8.2 Phương pháp chiết tách DNA từ mô thận cá
Dựa trên phương pháp chiết tách Phenol chloroform của Taggart et
al. (1992) (được điều chỉnh bởi Đặng Thị Hoàng Oanh và Đặng Thụy Mai
Thy, 2009) để chiết tách DNA thận cá.
3.3.8.3 Phương pháp khuếch đại DNA
Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA được thực hiện dựa theo
qui trình của Nunan et al. (2003). Trọng lượng phân tử đoạn DNA của S.
dysgalactiae cần phát hiện là 1500 bp. Cặp mồi sử dụng trong phản ứng
PCR khuếch đại gen 16S rRNA được thiết kế bởi Zinniel et al., (2002) mồi
1: p515FPL 5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’,
mồi 2: p13B 5’AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3’.
3.3.8.4 Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae
Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 cho phản ứng PCR theo
Hassan et al. (2003): STRD-DyI: “5′ TGGAACACGTTAGGGTCG 3′”
dys-16S–23S-2: “5′ CTTAACTAGAAAAACTCTTGATTATTC 3′”
Thực hiện qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae dựa trên
phương pháp của Hassan et al. (2003), đối chứng dương sử dụng trong phản

ứng PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae là vi khuẩn đã được giải mã
định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S là có ký hiệu B2-5G.
3.3.8.5 Phương pháp điện di
Sử dụng 10 l sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel 1.5%
agarose (ABgene, UK) trong dung dịch đệm  1 TAE (10 mM Tris, 5 mM
acetate, 0,1 mM EDTA).
3.3.8.6 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR phát
hiện S. dysgalactiae
Lấy 0,5 g mô thận cá trộn với các mật độ vi khuẩn 25 ng, 50 ng, 100
ng, 200 ng, 400 ng, 800 ng, 1.600 ng và 3.200 ng được dùng cho phản ứng
PCR phát hiện S. dysgalactiae để xác định độ nhạy của qui trình.
3.3.8.7 Phương pháp xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR
phát hiện S. dysgalactiae
Dùng cặp mồi trong phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae để phát
hiện 5 loại vi khuẩn khác bao gồm: Vibrio parahaemolyticus, Edwardsiella
ictaluri, Aeromonas hydrophilla, Streptococcus agalactiae, Flavobacterium
columnare. Đối chứng dương sử dụng là S. dysgalactiae đã được giải mã
định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S có ký hiệu B2-5G.
3.3.8.8 Khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn
S. dysgalactiae
Khả năng ứng dụng của qui trình ở nhiều dòng vi khuẩn S.
dysgalactiae khác nhau và trực tiếp trên thận cá.

5


3.3.9 Phương pháp lập kháng sinh đồ
Phương pháp lập kháng sinh đồ theo Geert Huy, 2002.
3.3.9.1 Phương pháp phục hồi vi khuẩn
Vi khuẩn trữ ở -80oC được phục hồi trên môi trường TSA có bổ sung

1,5% NaCl và ủ sau 48 giờ ở 30oC.
3.3.9.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ
Dùng pipet hút lần lượt 0,1 ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi
trường thạch MHA (+ 1,5% NaCl) và trãi đều, dùng pen lấy đĩa kháng sinh
đặt vào đĩa petri. Mỗi đĩa petri dán 4 đĩa kháng sinh. Đặt đĩa vào tủ ấm ở
30oC. Đọc kết quả sau 48 giờ.
3.3.9.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của
thuốc kháng sinh
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn
được xác định theo phương pháp của Geert Huys (2002).
3.3.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.3.10.1 Chuẩn bị bể thí nghiệm
Các dụng cụ thí nghiệm như: bể nhựa 500 L, xô nhựa 60 L, ống sục
khí, vợt, đá bọt... được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorine 200 ppm, phơi
khô. Sau đó cấp nước vào khoảng 2/3 bể, có sục khí. Cấp nước vào 1/3 xô
nhựa thí nghiệm. Nguồn nước sử dụng là nước máy có độ mặn 10‰.
3.3.10.2 Nguồn cá thí nghiệm
Cá bống kèo đồng cỡ, khỏe mạnh, linh hoạt, da sáng, trọng lượng
khoảng 15 - 20 g/con. Cá được nuôi dưỡng trong bể nhựa 500 L, có sục khí
khoảng 1 tuần. Kiểm tra sức khỏe của cá (chọn ngẫu nhiên 5 con) trước khi
tiến hành bố trí thí nghiệm.
3.3.10.3 Chuẩn bị vi khuẩn gây cảm nhiễm
Vi khuẩn trữ được phục hồi trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl
(TSA+), ủ ở 28oC. Nuôi tăng sinh vi khuẩn, sau đó, vi khuẩn được ly tâm
với tốc độ 5.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút. Đếm mật độ vi khuẩn bằng
máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm. Dung dịch vi khuẩn được pha
loãng 10 lần (1ml dung dịch vi khuẩn 1 x 109 CFU/ml + 9 ml nước muối
sinh lý) để được các mật độ 108, 107, 106, 105, 104, 103 CFU/ml.
3.3.10.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm cảm nhiễm
Thí nghiệm cảm nhiễm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4

nghiệm thức là 4 chủng vi khuẩn B1-6T, B2-3TT, B2-5G, B6-9TT với mật
độ tiêm là 108 CFU/cá và tiêm nước muối sinh lý ở nghiệm thức đối chứng.
Cá được tiêm 0,1 ml/cá tại gốc vi ngực. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với
mật độ 10 con cá/bể. Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục

6


trong 7 ngày. Kết thúc thí nghiệm, ở mỗi nghiệm thức tiến hành thu mẫu
mô (3 con/nghiệm thức) ở các cơ quan mang, gan và thận.
3.3.10.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm xác định LD50
Thí nghiệm xác định LD50 được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên sử dụng
02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G. Cá thí nghiệm được tiêm 0,1 ml/cá tại
gốc vi ngực. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 20 con cá/bể.
Nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7: cá được tiêm vi khuẩn với mật độ 102,
3
10 , 104, 105, 106, 107, 108 CFU/cá.
Nghiệm thức 8: nghiệm thức đối chứng cá tiêm nước muối sinh lý.
Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 14 ngày.
Nồng độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) được xác định
theo công thức của Reed và Muench (1938):
LD50 = 10 a – p.d
Trong đó: p.d = (L% - 50%) / (L% - H%)
a: Số lũy thừa mà ta ̣i đó vi khuẩ n gây chế t cá thấ p nhấ t (trên 50%)
H%: Tỷ lê ̣ cá chế t cao nhấ t (dưới 50%); L%: Tỷ lê ̣ cá chế t thấ p nhấ t
(trên 50%).
3.3.10.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm điều trị bệnh xuất huyết
ở qui mô phòng thí nghiệm
- Vi khuẩn gây cảm nhiễm là B1-6T, mật độ tiêm là 104 CFU/cá.
- Thuốc kháng sinh: DO và FFC sử dụng trong thí nghiệm là thuốc

kháng sinh của công ty UV trong đó: DO và FFC ở dạng nguyên liệu; DO
thành phẩm có tên thương mại là Rydoxyne và FFC thành phẩm có tên
thương mại là UV-Flo.
- Thuốc được trộn vào thức ăn cho cá ăn, hàm lượng 20 mg thuốc/kg
trọng lượng cá. Cho cá ăn theo nhu cầu.
- Thí nghiệm phòng trị gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức bố trí
30 con, lặp lại 3 lần: Cá ở nghiệm thức 1, 2, 3, 4 được gây bệnh ngày 1 và
cho ăn thức ăn trộn thuốc vào ngày 3. Cho ăn liên tục trong 5 ngày.
+ Nghiệm thức 1: dùng thuốc kháng sinh DO ở dạng nguyên liệu.
+ Nghiệm thức 2: dùng thuốc kháng sinh DO ở dạng thành phẩm.
+ Nghiệm thức 3: dùng thuốc kháng sinh FFC ở dạng nguyên liệu.
+ Nghiệm thức 4: dùng thuốc kháng sinh FFC ở dạng thành phẩm.
+ Nghiệm thức 5: đối chứng 1: cá được gây bệnh ngày 1 và cho ăn
thức ăn không trộn thuốc.
+ Nghiệm thức 6: đối chứng 2: cá được tiêm muối sinh lý và cho ăn
thức ăn không trộn thuốc.
+ Nghiệm thức 7: đối chứng 3: cá không được gây bệnh, không tiêm
nước muối sinh lý, cho ăn thức ăn không trộn thuốc.

7


- Thời gian thí nghiệm là 21 ngày. Theo dõi tỷ lệ cá chết hàng ngày,
ghi nhận và chụp hình dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong. Kết thúc thí
nghiệm tiến hành thu mẫu vi khuẩn, mô học (3 cá/nghiệm thức).
- Hiệu quả điều trị bệnh trong phòng thí nghiệm được đánh giá bằng
tỉ lệ sinh tồn tương đối (RPS) (%) theo công thức (Ellis, 1996):
% cá chết ở nghiệm thức sử dụng thuốc
x 100
Giá trị RPS (%) = 1% cá chết ở nghiệm thức đối chứng dương

4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu luận án được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft
Excel, phần mềm thống kê SPSS version 20. Kết quả giải trình tự đoạn gen
16S được so chuỗi bằng chương trình Blast search trên cơ sở dữ liệu ngân
hàng gen của NCBI trực tuyến. Luận án được trình bày bằng phần mềm
Microsoft Word.
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá
bống kèo nuôi thương phẩm
4.1.1 Điều tra tình hình nuôi và khảo sát hiện trạng bệnh trên cá
4.1.1.1 Kinh nghiệm của người nuôi cá bống kèo
Các hộ nuôi được điều tra có kinh nghiệm nuôi cá bống kèo thương
phẩm tập trung ở 2 năm (chiếm 23,3%) và 3, 4 năm (20%) (Bảng 4.1).
Bảng 4.1 Kinh nghiệm của người nuôi cá bống kèo
Kinh nghiệm nuôi (năm)
1
2
3
4
5
6
7

Số hộ
8
21
18
18
12
11

2

Tỷ lệ (%)
8,9
23,3
20
20
13,3
12,2
2,3

4.1.1.2 Diện tích nuôi
Diện tích nuôi phổ biến từ 1.000 - 5.000 m2 (chiếm 34,5%). Số hộ
nuôi có diện tích lớn chiếm tỷ lệ khá cao cho thấy người nuôi có xu hướng
mở rộng diện tích nuôi (Bảng 4.2).
Bảng 4.2 Diện tích nuôi cá bống kèo
Diện tích nuôi (m2)
≤ 5.000
≤ 10.000
≤ 15.000
≤ 20.000
> 20.000

Số hộ
31
25
12
11
11

8

Tỷ lệ (%)
34,5
27,8
13,3
12,2
12,2


4.1.1.3 Mùa vụ nuôi và thời gian nuôi
Mùa vụ nuôi cá bắt đầu từ tháng 6 kéo dài đến tháng 2, 3 năm sau.
4.1.1.4 Kỹ thuật nuôi
a. Chuẩn bị và cải tạo ao
Đa số hộ cải tạo ao bằng cách phơi khô ao (86,7%), còn lại cải tạo ao
bằng cách để một ít nước trong ao và tiến hành bón vôi (13,3%) (Bảng 4.3).
Bảng 4.3 Các bước chuẩn bị ao
Các bước chuẩn bị ao
Có
Phơi ao
Không
Có
Bón vôi
Không
Có
Bón phân
Không
Có
Diệt cá dữ
Không

Có
Diệt khuẩn
Không
Có
Lọc nước
Không

Số hộ
78
12
64
26
7
83
55
35
45
45
15
75

Tỷ lệ (%)
86,67
23,33
71,11
28,89
7,78
92,22
61,11
38,89

50
50
16,67
83,33

b. Nguồn giống và mật độ thả nuôi
Nguồn cá bống kèo giống hiện nay phụ thuộc hoàn toàn vào nguồn
cá giống tự nhiên. Mật độ thả nuôi từ 50 – 200 con/m2, đa số các hộ thả
nuôi ở mật độ từ 100 - 150 con/m2 (chiếm 82,2%) (Bảng 4.4).
Bảng 4.4 Mật độ thả giống
Mật độ nuôi (con/m2)
< 100
100 - 150
> 150

Số hộ
5
74
11

Tỷ lệ (%)
5,56
82,22
12,22

c. Thức ăn và cách cho ăn
Tần suất cho ăn dao động từ 2 - 5 lần/ngày. Có 56,7% hộ điều tra cho
cá ăn 2 lần/ngày vào lúc sáng sớm và chiều mát. Lượng thức ăn cho cá ăn
phụ thuộc vào nhu cầu của cá, nên có hộ cho cá ăn liên tục trong ngày (cách
khoảng 2 đến 3 giờ cho ăn một lần) (chiếm 8,89%)(Hình 4.1).

Hình 4.1. Tần suất cho ăn

d. Quản lý chất lượng nước trong ao nuôi cá bống kèo
Tất cả (100%) các hộ nuôi cá bống kèo được phỏng vấn không sử
dụng hệ thống ao lắng, các hộ nuôi không thay nước mà chỉ cấp thêm nước
(96,7%), xử lý hóa chất và vi sinh nhằm cải thiện môi trường nuôi.

9


e. Quản lý sức khỏe cá nuôi
Số hộ sử dụng kháng sinh phòng trị bệnh cho cá bằng cách trộn vào
thức ăn và cho cá ăn liên tục trong suốt thời gian nuôi, trong đó số hộ nuôi
sử dụng thuốc kháng sinh amoxicillin chiếm 81,1%, các hộ còn lại (3,3%)
sử dụng các loại kháng sinh khác (Hình 4.2).

Hình 4.2. Tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi cá bống kèo ở Bạc Liêu
4.1.1.5 Tình hình bệnh ở cá bống kèo nuôi thương phẩm
Cá bị bệnh tập trung ở giai đoạn 2 tháng tuổi và thường mắc các bệnh
xuất huyết (78,9%), lở loét và chướng bụng (50%), gan (25,6%). (Hình
4.3).

Hình 4.3. Tỷ lệ xuất hiện bệnh trong ao nuôi cá bống kèo thương phẩm

Tỷ lệ chết ở các ao nuôi trung bình là 18,04±12,17 (%) (Bảng 4.5).
Bảng 4.5. Tỷ lệ cá chết
Tỷ lệ cá chết (%)
≤ 10
10 – 20

20 – 30
≥30
Không xác định

Số hộ
25
35
17
12
1

Tỷ lệ (%)
27,78
38,89
18,89
13,33
1,11

Kết quả điều tra cho thấy đa phần cá chết tập trung ở tỷ lệ từ 10% 20% (chiếm 38,9%), tuy nhiên tỷ lệ cá chết trên 30% cũng chiếm tỷ lệ khá
cao, chiếm 13,33%. Kháng sinh được trộn vào thức ăn cho cá ăn định kỳ.
Có 81,1% các hộ điều tra chọn kháng sinh amoxicillin trộn vào thức ăn (2 –
4 g/kg thức ăn) cho cá ăn định kỳ. Khi cá phát bệnh thì tăng lượng thuốc (3
– 5 g/kg thức ăn) cho ăn liên tục từ 3-5 ngày.
4.1.2 Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá bống kèo
Qua các đợt thu mẫu cho thấy thành phần giống loài ký sinh trùng
xuất hiện ít, chủ yếu là các ký sinh trùng thuộc ngoại ký sinh (bảng 4.6).

10

Bảng 4.6 Cường độ và tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng trên cá kèo qua các đợt thu mẫu
Da
CĐN
(Trùng/lame)
8
8
2

Ký Sinh Trùng
Chilodonella
Epistylis
Trichodina
Ergasilus

TLN
(%)
27,24
33,33
20

Mang
CĐN
(Trùng/lame)

6
2

TLN
(%)

33,81
20

Có 04 loài ký sinh trùng được tìm thấy có hình thái, cấu tạo phù hợp
với mô tả của Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007) đó là Chilodonella, Epistylis,
Trichodina và Ergasilus. Các loài ký sinh trùng này hiện diện trên cơ thể cá
với cường độ cảm nhiễm (2 – 8 trùng/lame) và tỷ lệ cảm nhiễm rất thấp
(20% – 33,81%). Với kết quả này chứng tỏ sự hiện diện của ký sinh trùng
không ảnh hưởng đến tình hình sức khỏe cá trong ao nuôi.
4.1.3 Phân lập vi khuẩn trên cá bống kèo bệnh xuất huyết
4.1.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn
Kết quả phân lập đã thu được số mẫu khuẩn lạc trong những lần phân
lập là 252, tỷ lệ khuẩn lạc thu được từ các cơ quan tập trung nhiều ở thận
của cá chiếm 38,1% (Bảng 4.7)
Bảng 4.7 Số lượng vi khuẩn phân lập từ các cơ quan
Thu mẫu
Cơ quan
Thận
Gan
Tỳ tạng
Tổng cộng

Đợt
1
13
15
6
34

Đợt

2
13
17
12
42

Đợt
3
6
5
6
17

Đợt
4
11
0
0
11

Đợt
5
26
30
6
62

Đợt
6
27

23
36
86

Tổng cộng
Số lượng
Tỷ lệ (%)
96
38,1
90
35,7
66
26,2
252
100

4.1.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa
Các chủng vi khuẩn có hình tròn, màu trắng đục, kích thước dao
động từ 0,4 – 0,8 µm/khuẩn lạc. Đa số bắt màu Gram (+), có dạng hình cầu,
ghép với nhau tạo thành chuỗi dài có dạng song cầu, liên cầu (Hình 4.4).
Trong 252 chủng vi khuẩn thu được có 249 chủng vi khuẩn có hình cầu,
gram (+), không di động, đa số vi khuẩn âm tính với oxidase (231/249
chủng) và catalase (174/249 chủng).

Hình 4.4 Hình dạng vi khuẩn Gram (+) hình liên cầu (100X)

Kết quả kiểm tra cho thấy 15/15 chủng vi khuẩn không gây tan huyết,
15/15 chủng vi khuẩn không phát triển trong môi trường TSB có bổ sung
6,5% NaCl (TSB+) (Hình 4.5).

11


Hình 4.5 Kết quả kiểm tra tan huyết và khả năng phát triển trong TSB+
A: Vi khuẩn không gây tan huyết trên môi trường chứa 5% máu cừu
B: Vi khuẩn không phát triển trong môi trường TSB (+6,5%NaCl)

4.1.3.3 Kết quả định danh bằng kit API 20 Strep
Kết quả định danh cho thấy các chủng dương tính 100% với Alkaline
phosphatase, Leucine AminoPeptidase, Ribose, Trehalose, hầu hết dương
tính với Amygdalin (90,6%), Arginine Dihydrolase (chiếm 93,7%), βglucuronidase (chiếm 93,7%), âm tính với các chỉ tiêu còn lại (Hình 4.6).

Hình 4.6 Kết quả test API 20Strep 02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G

4.1.4 Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự
Vi khuẩn sau khi giải mã tiến hành so sánh với ngân hàng dữ liệu gen
của NCBI, dựa vào mức độ tương đồng trình tự đoạn gen 16S rRNA ở các
chủng cho thấy, cả 10 chủng vi khuẩn đều trùng khớp với chủng vi khuẩn
được xác định là S. dysgalactiae. (Bảng 4.8).
Bảng 4.8 Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự của các chủng vi
khuẩn với các loài vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu gen của NCBI
STT
1
2
3
4
5
6
7
8

9
10

Kí hiệu
chủng
B1-6T
B2-5G
B6-9TT
B2-3TT
A1F1
A1F2
A1F4
A1F6
A1F9
A5F4

Các loài vi khuẩn từ ngân
hàng dữ liệu gen NCBI
S. dysgalactiae
S. dysgalactiae
S. dysgalactiae
S. dysgalactiae
S. dysgalactiae
S. dysgalactiae
S. dysgalactiae
S. dysgalactiae
S. dysgalactiae
S. dysgalactiae

Mã số lưu trữ

trong NCBI
KM077497.1
KM077497.1
KM077497.1
KM077497.1
NR043661.1
NR043661.1
NR043661.1
HE858529.1
NR043661.1
NR043661.1

Mức độ
tương đồng
99%
100%
99%
99%
99%
98%
99%
99%
99%
97%

Tỉ lệ nucleotide
tương đồng
1003/1004
1005/1005
996/997

971/972
618/624
537/546
608/612
597/602
573/575
336/345

( />
4.2 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống
kèo
4.2.1 Xác định đặc điểm bệnh học bệnh xuất huyết trên cá
4.2.1.1 Dấu hiệu bệnh lý
Cá bị xuất huyết có dấu hiệu bệnh lý bất thường như bơi lờ đờ, tấp
mé, bỏ ăn, không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với tiếng động.

12


Dấu hiệu bệnh lý biểu hiện bên ngoài của cá bệnh xuất huyết như
màu sắc nhợt nhạt, xuất huyết trên thân, ở vi ngực, vi bụng, vi lưng, vi hậu
môn, các khối u trên bề mặt cơ thể, mắt lồi, mờ đục và phù ra. (Hình 4.7).

Hình 4.7. Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài của cá bống kèo bệnh xuất huyết
(A) cá bống kèo tấp mé
(B) (C): Cá bống kèo bị xuất huyết trên các vây và toàn thân

Dấu hiệu bệnh lý bên trong được ghi nhận là xoang bụng cá chứa đầy
dịch nhờn, gan bị xuất huyết hoặc tái nhạt, tỳ tạng bị sưng to hoặc teo nhỏ
và xuất huyết, thận xuất huyết và bị nhũn (Hình 4.8).

Hình 4.8: Dấu hiệu bệnh lý bên trong của cá bống kèo bệnh xuất huyết
(A) Cá bống kèo khỏe. (B) Tỳ tạng sưng to và xuất huyết. (C) Gan cá sưng to và xuất huyết. (D) Gan cá
xuất huyết, tỳ tạng sưng to, thận bị nhũn.

4.2.1.2 Kết quả quan sát tiêu bản mẫu tươi thận phết kính
Kết quả quan sát cho thấy vi khuẩn tấn công phá vỡ màng tế bào
hồng cầu, tập trung chung quanh vách tế bào hồng cầu (Hình 4.9).

Hình 4.9. Mẫu thận cá bống kèo phết kính (Wright & Giemsa, 100X)
(A): Mẫu thận cá khỏe. (B): Vi khuẩn phá vở tế bào, tập trung thành cụm;
(C): Mẫu đại thực bào. (D): Vi khuẩn bao quanh và phá vỡ màng tế bào hồng cầu

Trên mẫu cá khỏe không có hoặc có rất ít vi khuẩn khi tiến hành
quan sát mẫu thận phết kính.
4.2.2 Đặc điểm mô bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo
4.2.2.1 Biến đổi cấu trúc mô học ở mang
Kết quả quan sát cho thấy có 127/127 mẫu mang cá bống kèo bị
bệnh xuất huyết có hiện tượng phình to tơ mang và sự dính lại của các sợi
mang. Tơ mang phình to và bị xuất huyết, các sợi mang bị dính lại hoặc
mất cấu trúc cả phiến mang, sợi mang ngắn lại hoặc thoái hóa, động mạch
vào mang bị xuất huyết và có hiện tượng bị nhiễm khuẩn. (Hình 4.10)

13


Hình 4.10 Mô mang cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X)
(A) Mang cá bống kèo khỏe: tơ mang (), sợi mang (); (B) Sợi mang phình to, có hiện tượng tăng sinh
biểu mô (), động mạch vào sợi mang bị nhiễm khuẩn (); (C) Sợi mang dính lại và mất cấu trúc phiến
mang (), các tế bào biểu mô tăng kích thước (). (D) Mang bị mất cấu trúc

4.2.2.2 Biến đổi cấu trúc mô học ở thận
Quan sát mô thận cá bệnh cho thấy chủ yếu là hiện tượng xuất huyết,
sung huyết các mao mạch và tĩnh mạch, ống thận xơ hóa và lòng ống giãn
nở, quản cầu thận phình to kèm theo biến đổi cấu trúc, và hoại tử. Hiện
tượng sung huyết ở mô thận cá được ghi nhận ở hầu hết các mẫu cá bị
bệnh, ngoài ra hiện tượng xuất huyết và hoại tử hạt hay hoại tử hóa lỏng
cũng được tìm thấy trên mẫu mô thận của cá bệnh (Hình 4.11).

Hình 4.11 Mô thận cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X)
(A): Thận cá bống kèo khỏe, ống thận (↓); (B) Mô thận bị xuất huyết (↓), trung tâm đại thực bào sắc tố
(↓); (C): Mô thận bị hoại tử (↓), biến đổi cấu trúc; (D): Mô thận bị nhiễm khuẩn (↓); (E): Quản cầu thận
phình to và biến đổi cấu trúc (↓) (100X); (F): Mô thận có hiện tượng sung huyết (↓), Quản cầu thận
phình to và biến đổi cấu trúc (↓)

4.2.2.3 Biến đổi cấu trúc mô học ở gan
Kết quả quan sát các mẫu mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết
cho thấy gan có hiện tượng bị nhiễm khuẩn (Hình 4.12E), tĩnh mạch gan bị
sung huyết (Hình 4.12C), không bào lipid phình to, không đồng nhất tạo
nên vùng mô gan bị biến đổi cấu trúc (Hình 4.12E & F). Gan hoại tử gần
như hóa lỏng, những vùng sung huyết tế bào máu phân hủy thành dịch
viêm, tế bào chất trở nên đồng nhất bắt màu Eosin (Hình 4.12B & D).

14


Hình 4.12 Mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E) (40X)
(A): Gan cá khỏe, tĩnh mạch gan (↓), không bào lipid (↓); (B) Dịch viêm giữa các tế bào (↓); (C): Tĩnh
mạch gan bị sung huyết (↓); (D): Vùng tế bào gan bị sung huyết (↓); (E): Gan bị nhiễm khuẩn (↓),
không bào lipid phình to (↓), biến đổi cấu trúc tế bào gan (↓); (F): Vùng mô gan bị biến đổi cấu trúc (↓)

4.2.3 Đặc điểm huyết học trên cá bống kèo bệnh
4.2.3.1 Hình thái tế bào
Quan sát máu cá bống kèo cho thấy tế bào hồng cầu có dạng hình
oval hay elip và nhân hình tròn ở giữa. Bốn loại bạch cầu cũng được tìm
thấy gồm tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu
cầu.

Hình 4.13. Hình dạng tế bào máu ở cá bống kèo (100X)
(A): Hồng cầu (↓), (B): Tiểu cầu (↓); (C): Bạch cầu đơn nhân (↓), Tiểu cầu (↓), Bạch cầu trung tính (↓),
Tế bào Lympho (↓), (D): Bạch cầu đơn nhân (↓)

Kết quả quan sát tế bào máu trên mẫu phết kính ở cá bống kèo bị
bệnh xuất huyết cho thấy xuất hiện nhiều cụm vi khuẩn trong máu cá và tế
bào máu bị biến đổi hình dạng (Hình 4.14). Vi khuẩn tấn công làm màng tế
bào hồng cầu bị phá vỡ, bên trong tế bào chất có nhiều khoảng không bào
hay không còn tế bào chất. Bên cạnh đó các loại tế bào bạch cầu cũng thay
đổi hình dạng, cá bệnh cũng tìm thấy bốn loại tế bào bạch cầu.

15


Hình 4.14 Máu cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (100X)
(A): Vi khuẩn hình cầu tấn công màng tế bào hồng cầu (↓); (B): vi khuẩn tấn công
màng tế bào (↓) và tạo khoảng không bào trong tế bào chất (↓)

4.2.3.2 Huyết học
Số lượng hồng cầu trong máu cá dao động từ 6,8 x 106 CFU/ml đến
28,6 x 106 CFU/ml, có sự khác biệt về số lượng hồng cầu ở cá bống kèo
khỏe và cá bệnh xuất huyết, ở những mẫu cá bệnh số lượng hồng cầu giảm

so với cá khỏe, khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Bảng 4.9).
Bảng 4.9 So sánh mật độ hồng cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bệnh
Mật độ hồng cầu (tế bào x 106/ml)
Ao 4
21,45 ± 2,79b
Ao cá bình
Ao 5
19,49 ± 0,56b
thường
Ao 8
19,80 ± 0,37b
Ao 1
17,06 ± 4,49ab
Ao 2
14,89 ± 1,57a
Ao 3
16,99 ± 3,04ab
Ao 6
14,42 ± 1,74a
Ao cá bệnh
Ao 7
12,73 ± 3,21a
Ao 9
13,16 ± 2,93a
Ao 10
14,23 ± 1,92a
Ao 11
16,23 ± 3,61a
Các giá trị trong cùng một cột (a, b) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê
(P<0,05) và ngược lại.

Ao

4.2.3.3 Bạch cầu
Kết quả quan sát được 4 loại tế bào bạch cầu ở cá bống kèo là tế bào
lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu (Hình 4.15).

Hình 4.15 Các loại bạch cầu
(A): Tiểu cầu (↓); (B): Bạch cầu trung tính (↓);(C): Bạch cầu đơn nhân (↓), Tế bào lympho (↓)

a. Số lượng tổng bạch cầu
Số lượng bạch cầu trong máu cá dao động từ 290.000 – 990.000 tế
bào/ml. Đối với ao cá khỏe có tổng số lượng bạch cầu trung bình 34,2 x 10 4
tế bào/ml thấp so với các ao nuôi cá đang có dấu hiệu bệnh xuất huyết có
tổng lượng bạch cầu cao trung bình 81,8 x 104 tế bào/ml. Số lượng bạch cầu

16


ở các ao nuôi cá có dấu hiệu bệnh xuất huyết khác biệt mang ý nghĩa thống
kê (P<0,05) so với các ao nuôi bình thường (Bảng 4.10).
Bảng 4.10 Số lượng bạch cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bống kèo bệnh xuất huyết
Ao

Mật độ bạch cầu (tế bào x 104/ml)

Ao 4
45,8 ± 8,97c
Ao 5
50,25 ± 6,27c
Ao 8

34,28 ± 5,05d
Ao 1
82,5 ± 7,25ae
Ao 2
73,4 ± 11,64b
Ao 3
76,7 ± 9,09ab
Ao 6
82,9 ± 5,93ae
Ao cá bệnh
Ao 7
84,9 ± 6,33e
Ao 9
85,42 ± 5,74e
Ao 10
84,4 ± 6,39e
Ao 11
85,5 ± 7,42e
Các giá trị trong cùng một cột (a, b, c, d) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống
kê (P<0,05) và ngược lại.
Ao cá
bình thường

b. Bạch cầu đơn nhân
Kết quả định lượng cho thấy, bạch cầu đơn nhân trong các ao nuôi cá
bống kèo dao động từ 10.800 – 211.500 tế bào/ml. Số lượng bạch cầu đơn
nhân ở các ao nuôi có dấu hiệu bệnh cao hơn so với ao nuôi cá khỏe và có
sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Bảng 4.11).
Bảng 4.11 Kết quả so sánh các loại bạch cầu ở cá bống kèo khỏe và
cá bống kèo bị bệnh xuất huyết

Mật độ các loại bạch cầu (tế bào x 104/ml)
BC Đơn nhân
BC Trung tính
Tiểu cầu
Lympho
Ao
4
6,18 ± 2,66cd
11,23 ± 6,11bc
15,98 ± 3,47b
12,40 ± 8,51a
cá bình
5
8,21 ± 4,61abcd
7,80 ± 4,38b
14,61 ± 2,32b
19,61 ± 7,06ac
thường
8
3,16 ± 1,07d
3,28 ± 2,31b
11,25 ± 1,21ab 16,58 ± 2,43a
1
13,25 ± 4,53a
36,27 ± 5,22a
17,32 ± 7,94ab 15,66 ± 6,90a
Ao cá
2
8,94 ± 6,35abcd
27,7 ± 13,35acd

12,85 ± 4,13ab 23,88 ± 14,87ab
bệnh
3
9,84 ± 7,05abcd
19,07 ± 11,88bd
13,50 ± 6,73ab 34,28 ± 10,91bc
6
15,29 ± 5,26a
27,74 ± 7,12ad
16,62 ± 4,52b
23,23 ± 7,58ad
7
12,06 ± 2,75a
30,54 ± 6,43ad
9,81 ± 1,65a
32,47 ± 5,37bd
9
10,79 ± 2,97ac
23,14 ± 6,34cd
11,04 ± 1,12a
40,44 ± 5,75b
10
8,80 ± 2,98ac
24,89 ± 6,53d
11,09 ± 4,08ab 39,60 ± 6,46b
11 10,43 ± 3,92ac
24,39 ± 11,86d
14,50 ± 5,96ab 36,15 ± 6,46b
Các giá trị trong cùng một cột (a, b, c, d) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống
kê (P<0,05) và ngược lại.

Ao

c. Bạch cầu trung tính
Kết quả phân tích, mật độ bạch cầu trung tính của cá bống kèo dao
động khoảng 0,61x104 tb/ml đến 54 x104 tb/ml. Số lượng bạch cầu trung
tính ở ao cá khỏe khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với ao cá bệnh
(Bảng 4.11).

17


d. Tế bào lympho
Qua Bảng 4.11 cho thấy, tế bào lympho ở các ao dao động từ 2,2 x
104 đến 47,5 x 104 tế bào/ml, kết quả các tế bào lympho ở các ao cá khỏe
(4,5 và 8) khác biệt so với các ao cá bệnh (3, 7, 9, 10 và 11) ở mức ý nghĩa
P<0,05.
e. Tiểu cầu
Kết quả định lượng cho thấy, hai ao cá khỏe 4 và 5 khác biệt so với
hai ao cá bệnh 7 và 9 (p<0,05) (Bảng 4.11). Ở ao cá khỏe có mật độ tế bào
tiểu cầu thấp hơn so với các ao cá có dấu hiệu bệnh.
4.3 Phát triển qui trình chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá bống kèo
bằng phương pháp sinh học phân tử
4.3.1 Kết quả chiết tách DNA trực tiếp từ mô thận cá
Kết quả chiết tách, đo hàm lượng DNA và độ tinh sạch DNA từ 16
mẫu thận cá cho thấy độ tinh sạch ở bước sóng 260 nm là 1,57 – 1,78 và
hàm lượng DNA thận cá nằm trong khoảng 1.675 – 3385 ng/µl.
4.3.2 Kết quả chiết tách DNA vi khuẩn
Kết quả chiết tách cho thấy hàm lượng DNA chiết tách từ vi khuẩn
dao động từ 2.765 - 4.855 ng/µl và độ tinh sạch dao động từ 1,7 - 2 ng/µl.
4.3.3 Kết quả khảo sát cặp mồi cho qui trình PCR phát hiện

Streptococcus dysgalactiae
Kết quả điện di sản phẩm PCR dương tính, phát hiện S. dysgalactiae
khi sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 ở vị trí 259 bp thể hiện qua
Hình 4.16.

Hình 4.16 Kết quả điện di sản phẩm phát hiện Streptococcus dysgalactiae
bằng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2
(M: thang DNA; 1: B1-6T; (+): đối chứng dương (B2-5G); (-): đối chứng âm)

4.3.4 Kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của qui trình PCR phát
hiện vi khuẩn S. dysgalactiae
4.3.4.1 Kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện vi
khuẩn S. dysgalactiae
Kết quả cho thấy, qui trình khuếch đại chỉ hiện vạch đặc hiệu ở 259
bp của vi khuẩn S. dysgalactiae mà không hiện vạch sản phẩm đối với các
chủng vi khuẩn khác thể hiện tính đặc hiệu của qui trình (Hình 4.17).

18


Hình 4.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tính đặc hiệu
(M): thang DNA, (1): Vibrio parahaemolyticus; (2): Streptococcus dysgalactiae; (3): Edwardsiella
ictaluri; (4): Aeromonas hydrophilla; (5): Streptococcus agalactiae; (6): Flavobacterium columnare

4.3.4.2 Kiểm tra độ nhạy của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn
S. dysgalactiae
Kết quả xác định độ nhạy của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S.
dysgalactiae là 50 ng DNA vi khuẩn/0,5g mô thận. (Hình 4.18).

Hình 4.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ nhạy của qui trình

(M): thang DNA, (1): 25 ng; (2): 50 ng, (3): 100 ng, (4): 200 ng, (5): 400 ng, (6): 800 ng, (7): 1.600 ng,
(8): 3.200 ng

4.3.5 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện
vi khuẩn S. dysgalactiae
4.3.5.1 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình từ mẫu vi
khuẩn
Kết quả cho thấy cả 10/10 chủng (100%) nhạy với cặp mồi STRDDyI/ dys-16S–23S-2 ở 259 bp (Hình 4.19).

Hình 4.19 Kết quả PCR 10 chủng vi khuẩn
(M): thang DNA; (+): đối chứng dương; (1): A1F1-T; (2): A2F3-G; (3): B3K1F2-T; (4): B1K2F1-G;
(5): B3F2-T; (6): F7-T; (7): B1-10TT; (8): B5-8T; (9): B4-6G; (10): B5-3T; (-): đối chứng âm.

4.3.5.2 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình từ mẫu thận cá
bống kèo bệnh
Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu cho vi khuẩn S. dysgalactiae có kích
thước 259 bp không xuất hiện ở các mẫu DNA thận cá (Hình 4.20).

19


Hình 4.20 Kết quả PCR từ mẫu thận cá bống kèo bệnh xuất huyết
M: thang DNA; (-): đối chứng âm; (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9): mẫu thận cá; (+): đối chứng dương

Như vậy, qui trình PCR chẩn đoán S. dysgalactiae chưa thể ứng dụng
để phát hiện trực tiếp loài vi khuẩn này trên mẫu cá bệnh. Trong một số kết
quả nghiên cứu của Nomoto et al. (2004), Nomoto et al. (2008) và
Abdelsalam et al. (2009) đều sử dụng trực tiếp DNA của vi khuẩn phân lập
được, chưa có kết quả nào được đưa ra về khả năng phát hiện vi khuẩn này
trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm.

4.4 Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ở qui
mô phòng thí nghiệm
4.4.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu
(MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá
bống kèo
4.4.1.1 Kết quả kháng sinh đồ
Kết quả cho thấy, 8/12 loại kháng sinh nhạy với 4 chủng vi khuẩn
khảo sát, trong đó có 4 loại kháng sinh có tính nhạy cao gồm có FFC, DO,
TE và SXT với tỷ lệ 75%. Tuy nhiên FFC, TE và SXT đều có tỷ lệ kháng là
25%, còn DO không có tỷ lệ kháng ở 4 chủng khảo sát.
4.4.1.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Kết quả cho thấy, có 2 chủng B1-6T và B6-9TT thể hiê ̣n tính kháng
ma ̣nh với AML (256 ppm). Riêng B1-6T kháng với FFC (4 ppm), DO với
nồ ng đô ̣ (4 ppm) đã ức chế đươ ̣c vi khuẩ n (Bảng 4.12).
Bảng 4.12 Kế t quả MIC của 4 dòng vi khuẩn S.dysgalactiae trên 3
loại kháng sinh FFC, DO và AML
Vi khuẩn

Kết quả MIC (ppm)

Kháng sinh
B1.6T
B6.9TT
B2.5G
AML
256
256
128
FFC
4

4
4
DO
4
8
4
Ghi chú: S: Nhạy; I: trung bình; R: kháng

B2.3TT
128
4
4

Điểm tới hạn
CLSI, 2012 (M100-S22)
S
R
≤8
≥ 32
≤2
≥8
≤4
≥ 16

4.4.2 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm
Chủng vi khuẩn B2-5G cho tỷ lê ̣ cá chế t cao nhấ t là 86,7%; kế đến là
chủng B1-6T có tỷ lê ̣ cá chế t là 76,7%; chủng B2-3TT và chủng B6-9TT có
tỷ lê ̣ chế t bằng nhau 73,3%; (Bảng 4.13 và Hình 4.21).

20

Bảng 4.13: Tỉ lệ chết của 4 chủng vi khuẩn S. dysgalactiae ở thí
nghiệm cảm nhiễm
STT
1
2
3
4
5

Chủng vi khuẩn
B1-6T
B2-3TT
B2-5G
B6-9TT
ĐC

Tỉ lệ chết (%)
76,7
73,3
86,7
73,3
13,3

Hình 4.21 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm

4.4.3 Kết quả thí nghiệm xác định giá trị LD50
Kết quả thí nghiệm cho thấy, vi khuẩn B1-6T gây tỉ lệ chết thấp nhất
(38,3%) ở mật độ vi khuẩn 4,25 x 102 CFU/ml và gây tỉ lệ chết cao nhất

(88,3%) ở mật độ vi khuẩn 4,25 x 108 CFU/ml. Tương tự ở chủng B2-5G,
tỷ lệ gây chết thấp nhất ở mật độ vi khuẩn 3,5 x 102 CFU/ml là 48,3% và
3,5 x 108 CFU/ml là 90% (Bảng 4.14 và Hình 4.22).
Bảng 4.14 Kết quả xác định tỉ lệ gây chết của hai chủng B1-6T và B2-5G
Mật độ
Vi khuẩn
vi khuẩn (CFU/ml)
102
103
104
105
106
107
108
LD50

Chủng B1-6T
38,3
48,3
50
73,3
78,3
81,7
90
4,25 x 104

Tỉ lệ gây chết (%)
Chủng B2-5G
48,3
58,3

63,3
71,7
75
81,7
88,3
3,5 x 103,17

Đối chứng
11,67

Qua kết quả thí nghiệm xác định được nồng độ gây chết của chủng
vi khuẩn B1-6T là LD50 = 4,25 x 104 CFU/ml và chủng B2-5G = 3,5 x
103,71CFU/ml.

21