Phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật (biofilm) và bước đầu định hướng ứng dụng xử lý ô nhiễm nước thải

Khóa luận tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Quang Huy,
người thầy đã trực tiếp hướng dẫn em rất tận tình trong quá trình thực hiện đề tài,
giúp em vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt khóa luận này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh
học, trường Đại Học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và
cung cấp cho em những kiến thức bổ ích trong suốt bốn năm học vừa qua và giúp
đỡ em rất nhiều trong việc nắm bắt kiến thức cũng như động viên em rất lớn về mặt
tinh thần.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Phạm Bảo Yên cùng các anh chị, các
bạn, các em thuộc phòng Enzyme học và phân tích hoạt tính sinh học - Phòng thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ Protein và Enzyme và phòng thí nghiệm bộ môn Sinh
lý thực vật và Hóa sinh đã luôn chia sẻ, giúp đỡ và tạo điều kiện rất lớn để em có
thể thực hiện được đề tài khóa luận này.
Khóa luận được thực hiện có sự hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Đại học Quốc
gia Hà Nội mã số QG11-16 và đề tài Nghiên cứu phát triển công nghệ màng sinh
học trong xử lý nước thải giàu nitơ, photpho của Bộ Công thương. Nhân dịp này em
xin cảm ơn sự hỗ trợ của các đơn vị tài trợ.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên, động
viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận, giúp em
trưởng thành hơn khi sắp bước đi trên những con đường mới.

Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2012.
Sinh viên

Đoàn Diệu Linh

Đoàn Diệu Linh

i

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
BẢNG MỘT SỐ KÍ HIỆU VIẾT TẮT

ADH

L- arginine

ADI

Adipic acid

ARA

L-arabinose

CAP

Capric acid

CIT

Trisodium citrate

EPS

Hợp chất ngoại bào (Extracellular Polymeric Substances)

ESC

Esculin ferric citrate

GEL

gelatine

GLU

D-glucose

GNT

Potassium gluconate

LB

Môi trƣờng Luria – Bertani

MAL

D-maltose

MAN

D-mannitol

MLT

Malic acid

MNE

D-mannose

NAG

N-acetyl-glucosamine

OD

Mật độ quang học (Optical Density)

PAC

Phenylacetic acid

PNPG

4-nitrophenyl-βD-Galactopyranoside

TRP

L- tryptophan

URE

Urea

w/v

Khối lƣợng (g)/thể tích (ml)

Đoàn Diệu Linh

ii

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
MỤC LỤC
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM ...............................................................2
1.1.

Giới thiệu về Biofilm .................................................................................2

1.2.

Khả năng tồn tại của màng sinh vật ...........................................................3

1.2.1.

Trong môi trƣờng tự nhiên ..................................................................3

1.2.2.

Trong các vật liệu, hệ thống ................................................................4

1.2.3.

Trong y tế và cơ thể sinh vật ...............................................................4

1.3.

Thành phần của màng sinh vật ...................................................................5

1.3.1.

Thành phần các hợp chất ngoại bào (EPS) .............................................5

1.3.2.

Thành phần tế bào ...................................................................................7

1.4.

Quá trình hình thành màng sinh vật ...........................................................7

1.5.

Vai trò của màng sinh vật đối với vi sinh vật ..........................................10

1.5.1.

Bảo vệ tế bào trƣớc những điều kiện bất lợi của môi trƣờng ...............10

1.5.2.

Mối quan hệ hợp tác giữa các loài ........................................................10

1.6.

Ứng dụng của màng sinh vật ....................................................................11

1.6.1.

Ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại ở cây trồng ..................................11

1.6.2.

Ứng dụng trong xử lý nƣớc thải ...........................................................11

1.7.

Vấn đề xử lý nƣớc thải .............................................................................12

1.7.1.

Quá trình nitrate hóa .............................................................................13

1.7.2.

Quá trình phản nitrate hóa ....................................................................13

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .............................................15
2.1.

Chủng vi sinh vật nghiên cứu...................................................................15

2.2.

Hóa chất, thiết bị ......................................................................................15

2.2.1.

Môi trƣờng nuôi cấy ..........................................................................15

2.2.2.

Thuốc thử...........................................................................................16

2.2.3.

Máy móc, thiết bị...............................................................................17

2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................18

2.3.1.

Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn ........................................................18

2.3.2.
Phƣơng pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của
các chủng vi sinh vật ........................................................................................18

Đoàn Diệu Linh

iii

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
2.3.3.

Tối ƣu hóa các điều kiện của môi trƣờng ..........................................19

2.3.4.

Khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ...........................................19

2.3.5.

Phƣơng pháp nhuộm Gram nhận dạng chủng nghiên cứu ................20

2.3.6.
Quan sát cấu trúc màng sinh vật bằng kỹ thuật ảnh chụp trên kính
hiển vi điện tử quét ...........................................................................................21
2.3.7.

Phƣơng pháp đo phân tích hàm lƣợng nitrate N-NO3-. .....................21

2.3.8.

Phƣơng pháp đo phân tích hàm lƣợng nitrite N-NO2-. ......................22

2.3.9.

Phƣơng pháp đo phân tích hàm lƣợng nitrite N-NH4+. .....................22

2.3.10.

Phƣơng pháp thống kê sinh học ........................................................23

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................24
3.1.

Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng tạo biofilm.............24

3.2.

Đánh giá khả năng hình thành biofilm .....................................................25

3.2.1.

Chủng vi sinh vật phân lập trên môi trƣờng Winogradsky 1 ............25

3.2.2.

Chủng vi sinh vật phân lập trên môi trƣờng Winogradsky 2 ............27

3.3.
Ảnh hƣởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng hình thành màng
sinh vật của một số chủng vi khuẩn phân lập .......................................................28
3.3.1.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ ....................................................................28

3.3.2.

Ảnh hƣởng của độ pH .......................................................................28

3.3.3.

Ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl..................................................29

3.4.

Cấu trúc màng sinh vật .............................................................................30

3.4.1.

Hình thái vi khuẩn phân lập ..............................................................30

3.4.2.

Hình thái màng sinh vật.....................................................................31

3.4.3.

Cấu trúc hiển vi của màng biofilm nổi ..............................................32

3.5.

Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ ...................................................33

3.6.

Hoạt tính chuyển hóa nitơ ........................................................................34

3.6.1.

Khả năng chuyển hóa phân giải amoni ............................................34

3.6.2.

Khả năng chuyển hóa nitrite thành nitrate ........................................35

KẾT LUẬN ...............................................................................................................37
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................38

Đoàn Diệu Linh

iv

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
Hiện nay vấn đề ô nhiễm môi trƣờng đặc biệt là ô nhiễm nƣớc thải đang
ngày càng gia tăng gây ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời và môi trƣờng sinh
thái. Nƣớc thải có hàm lƣợng nitơ cao quá mức cho phép khi đƣợc thải ra sông, hồ,
sẽ gây ra hiện tƣợng phú dƣỡng làm nƣớc có màu và mùi khó chịu đặc biệt là

lƣợng ôxy hòa tan trong nƣớc giảm mạnh gây ảnh hƣởng đến hệ sinh thái thủy sinh.
Những nghiên cứu về vi sinh vật học ngày nay đóng một vai trò quan trọng
trong nhiều lĩnh vực từ công nghiệp, nông nghiệp, y học và đặc biệt là trong vấn đề
xử lý ô nhiễm môi trƣờng. Việc áp dụng các phƣơng pháp sinh học để xử lý nƣớc
thải hiện nay đang đƣợc quan tâm đặc biệt là phƣơng pháp sử dụng vi sinh vật, chủ
yếu là vi khuẩn để phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ. Trong phần lớn những
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, các vi sinh vật thƣờng đƣợc xem xét đánh giá
dƣới góc độ là những tế bào đơn lẻ. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy
rằng hầu hết các tế bào vi sinh vật thƣờng liên kết với nhau tạo thành một cộng
đồng và bám dính trên các bề mặt giá thể thông qua mạng lƣới các hợp chất ngoại
bào, hình thành nên cấu trúc gọi là màng sinh vật (biofilm).
Biofilm là một dang cấu trúc sống tồn tại khá phổ biến trong tự nhiên. Chúng
đƣợc hình thành khi các tế bào tiết ra các polymer ngoại bào tạo điều kiện thuận lợi
cho việc bám dính, hình thành mạng lƣới. Cấu trúc biofilm giúp cho vi sinh vật tồn
tại và chống chịu đƣợc trong những điều kiện bất lợi của môi trƣờng đồng thời
thông qua mối quan hệ hợp tác giữa các loài khác nhau trong hệ thống màng sinh
vật, các vi sinh vật có thể tận dụng đƣợc nguồn dinh dƣỡng.
Nghiên cứu về màng sinh vật giúp chúng ta có cái nhìn mới về mối tƣơng tác
của vi sinh vật trong điều kiện tự nhiên. Những phát hiện nghiên cứu mới giúp
chúng ta kiểm soát đƣợc sự phát triển của vi sinh vật, từ đó ứng dụng vào nhiều
ngành công nghiệp khác nhau trong đó có xử lý ô nhiễm môi trƣờng. Xuất phát từ
thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh
vật có khả năng tạo màng sinh vật (biofilm) và bƣớc đầu định hƣớng ứng dụng
xử lý ô nhiễm nƣớc thải”.

Đoàn Diệu Linh

1

K53A Sinh học

Khóa luận tốt nghiệp
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM
1.1.

Giới thiệu về Biofilm

Vi sinh vật là những cấu trúc vô cùng nhỏ bé mà ta không thể quan sát thấy
bằng mắt thƣờng. Chúng phân bố ở khắp mọi nơi trong đất trong nƣớc, trong
không khí. Sự phân bố của chúng tùy thuộc vào các yếu tố đặc trƣng của môi
trƣờng. Chúng tham gia vào việc chuyển hóa vật chất nhƣ các chu trình chuyển hóa
các hợp chất cacbon nitơ và các chất khoáng khác. Mối quan hệ giữa các nhóm vi
sinh vật với nhau cũng rất phức tạp cũng có các quan hệ ký sinh, cộng sinh, hỗ
sinh, kháng sinh. Trong quá trình sống, gặp những môi trƣờng khác nhau, các chủng
vi sinh vật này có những biến đổi thích nghi để phù hợp với điều kiện sống [3].
Vi sinh vật tồn tại dƣới hai hình thức chủ yếu là dạng tế bào sinh vật phù du
trôi nổi tự do và dạng liên kết với nhau trên bề mặt giá thể tạo thành cấu trúc màng
sinh vật (biofilm). Nghiên cứu vi sinh vật học trong lịch sử có truyền thống tập
trung vào các kết quả nghiên cứu thực nghiệm về vi sinh vật trôi nổi tự do trong môi
trƣờng chất lỏng. Tuy nhiên, các nghiên cứu ngày nay cho thấy rằng phần lớn các tế
bào vi sinh vật tồn tại trong một cộng đồng không gian riêng biệt đƣợc gọi là
biofilm. Trên thực tế có đến 99% vi khuẩn sống trong màng biofilm, và chỉ có 1%
sống trong trạng thái phù du, tự do [10, 32].

Hình 1. Màng biofilm của Bacillus subtilis dƣới kính hiển vi điện tử quét [25]
Trong lịch sử nghiên cứu vi sinh vật, Leeuwenhoek là ngƣời đầu tiên quan
sát các chủng vi khuẩn qua kính hiển vi vào năm 1684 [24]. Với việc tự chế ra rất
nhiều kính hiển vi, Leeuwenhoek đã phát hiện ra những dạng sinh vật sống mà ông
gọi chúng là “những động vật vô cùng nhỏ bé”. Ông là ngƣời đã phát hiện ra hiện

tƣợng bám dính và phát triển phổ biến của vi khuẩn trong các mảng bám răng một

Đoàn Diệu Linh

2

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
dạng của màng biofilm [1]. Đến những năm 1940, những nghiên cứu đầu tiên về sự
phát triển của vi sinh vật thành các lớp đƣợc thực hiện, khi Zobell mô tả những đặc
điểm cơ bản về sự gắn kết quần thể vi sinh vật. Ban đầu, màng sinh vật đƣợc cho là
một hệ thống đồng nhất các tế bào bám dính trong lớp chất nhờn. Tuy nhiên, những
nghiên cứu sau này cho thấy màng sinh vật thƣờng là tập hợp nhiều các loài vi
khuẩn tạo thành quần thể phức tạp riêng biệt có khả năng phát triển các cấu trúc
phức tạp [35]. Trong suốt những năm 1960 đến 1970 đã có rất nhiều nghiên cứu về
sự phát triển màng sinh vật, tuy nhiên thuật ngữ màng sinh vật (biofilm) chỉ mới
đƣợc công nhận từ năm 1984 [7].
Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về màng sinh vật đã đƣợc đề xuất trong
những năm qua. Theo bách khoa toàn thƣ Wikipedia màng sinh vật đƣợc định
nghĩa là: “một cấu trúc tập hợp của vi sinh vật đƣợc bao quanh bởi mạng lƣới ngoại
bào do chính nó tạo ra và đƣợc gắn kết trên bề mặt trên bề mặt hữu sinh hoặc vô
sinh” [40]. Nhìn chung, màng sinh vật là một quần thể sinh vật có cấu trúc phức tạp
liên kết với nhau bởi một hệ thống mạng lƣới ngoại bào. Mạng lƣới này có chứa các
polysaccharide ngoại bào, protein và ADN có nguồn gốc từ vi sinh vật. Giữa các
cấu trúc của chúng có các kênh dẫn chất lỏng cho phép các tế bào tƣơng tác với
nhau và hợp tác trao đổi chất. Màng sinh vật có thể đƣợc hình thành do một loài vi
sinh vật song đa số màng sinh vật là sự cộng sinh của nhiều loài vi sinh vật khác
nhau [9].

Sự hình thành màng sinh vật đƣợc coi là một trong số những cơ chế tồn tại
của vi sinh vật, tại đó vi khuẩn tận dụng đƣợc các nguồn dinh dƣỡng và nhận đƣợc
sự bảo vệ trong các điều kiện bất lợi nhƣ khô hạn, bức xạ cực tím hoặc những chất
độc hại. Mặt khác có thể coi hệ thống màng sinh vật là một mạng lƣới nhiều gen, tại
đó các vật liệu di truyền có thể dễ dàng đƣợc trao đổi qua lại giữa các tế bào vi sinh
vật [32].
1.2.

Khả năng tồn tại của màng sinh vật
Màng sinh vật phát triển mạnh ở những nơi có nƣớc, chẳng hạn nhƣ trong

nhà bếp, kính áp tròng và thậm chí trong cơ thể sinh vật. Khi hệ thống mạng lƣới
sinh vật phát triển đầy đủ, có thể quan sát thấy bằng mắt thƣờng.
1.2.1. Trong môi trƣờng tự nhiên
Trong các rừng mƣa nhiệt đới điều kiện độ ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho
sự phát triển phong phú của màng sinh vật nhƣ rêu và những cặn bám dƣới đáy ao

Đoàn Diệu Linh

3

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
hồ, hay những mảng rêu địa y bám trên thân cây, hay những váng nổi trên bề mặt
ao, hồ… (Hình 2A)
Màng sinh vật còn có thể đƣợc tìm thấy ở sa mạc. Một trong những hình
thức phổ biến của dạng màng sinh vật sa mạc đƣợc gọi là vec-ni sa mạc (varnish
desert), một thuật ngữ mô tả hiện tƣợng những hòn đá vách núi có màng sinh vật

phát triển xuất hiện những vết màu.
Màng sinh vật cũng có thể đƣợc tìm thấy phát triển trong môi trƣờng cực trị
nhƣ sông băng ở Nam Cực, hay các mạch suối nƣớc nóng…
Đối với thực vật, một số loài thực vật cộng sinh với vi khuẩn có trong màng
sinh vật bám ở rễ cây. Rễ cây tiết ra một lƣợng đáng kể các loại đƣờng, axit amin,
vitamin… nhƣ là chất dinh dƣỡng cho các màng sinh vật. Ngƣợc lại, màng sinh vật
tạo điều kiện thuận lợi cho khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng của thực vật [39].
1.2.2. Trong các vật liệu, hệ thống
Trong khi màng sinh vật đối với tự nhiên mang nhiều yếu tố tích cực thì đối
với công nghiệp, màng sinh vật lại là nguyên nhân của nhiều vấn đề tiêu cực nhƣ sự
ô nhiễm và tắc nghẽn màng sinh vật (biofouling) xảy ra gần nhƣ ở tất cả những
khâu xử lý trong công nghiệp có liên quan đến việc sử dụng nƣớc nhƣ hoạt động
làm mát, sản xuất bột giấy… Màng sinh vật là nguyên nhân gây ra hiện tƣợng tắc
ống dẫn ăn mòn ống dẫn và làm ô nhiễm nguồn nƣớc.
Trong các vật dụng hàng ngày cũng có sự xuất hiện của màng sinh vật.
Những mảng bám trên vòi hoa sen, bồn rửa mặt, sự tắc nghẽn đƣờng ống nƣớc là
những ví dụ cho sự có mặt của màng sinh vật (Hình 2B) [39].
1.2.3. Trong y tế và cơ thể sinh vật
Trên thực tế cơ thể con ngƣời và các sinh vật nói chung là nơi tồn tại của hệ
thống rất đa dạng các loài vi sinh vật. Tuy nhiên đôi khi sự mất cân bằng về hệ vi
sinh vật trong cơ thể là nguyên nhân gây ra các vấn đề về nhiễm trùng. Trong đó
màng sinh vật là một trong số những nguyên nhân gây ra một số bệnh nhiễm trùng
mãn tính viêm tai hay thƣờng gặp nhất là trên những mảng bám răng. Thậm chí bề
mặt của những dụng cụ y tế đặt trong cơ thể nhƣ van tim niệu quản nhân tạo cũng
có thể là nơi phát triển của biofilm (hình 2C) [38].

Đoàn Diệu Linh

4

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp

A

B

C

Hình 2. Một số vị trí tồn tại của màng sinh vật
A: Màng sinh vật phát triển trên mặt hồ
B: Màng sinh vật phát triển trong hệ thống ống dẫn
C: Màng sinh vật phát triển trong một số bộ phận cơ thể ngƣời
1.3.

Thành phần của màng sinh vật
Mạng lƣới màng sinh vật nói chung bao gồm 97% nƣớc, 2-5% là các tế bào

vi khuẩn, 3-6% các hợp chất ngoại bào và các ion [36].
1.3.1. Thành phần các hợp chất ngoại bào (EPS)
Việc hình thành các hợp chất ngoại bào là điều kiện tiên quyết cho sự hình
thành màng sinh vật. Mạng lƣới ngoại bào (EPS) có độ dày từ 0 2 đến 1µm. Ở một
vài loài vi khuẩn độ dày của lớp EPS mỏng hơn không vƣợt quá 10 đến 30nm.
Ngoài những đặc tính cấu trúc, bảo vệ và thẩm thấu EPS còn là nơi dự trữ chất dinh
dƣỡng cho tế bào phát triển trong điều kiện thiếu chất dinh dƣỡng [21] .
Sự phân bố của EPS trong màng sinh vật thay đổi theo không gian và thời
gian. Hàm lƣợng EPS tăng theo độ dày và độ già của màng sinh vật. Màng sinh vật
mỏng có lƣợng EPS thấp và giàu protein. Thành phần EPS phong phú hơn khi vào

sâu trong cấu trúc màng sinh vật. Hầu nhƣ lƣợng EPS đƣợc sản sinh trong màng
sinh vật cũng có nhiều điểm khác so với các vi sinh vật phù du [19]. Thành phần
EPS thay đổi theo thành phần vi sinh vật và điều kiện môi trƣờng hình thành nên
màng sinh vật. EPS thông thƣờng bao gồm 40-95% polysaccharide, 1-60% protein,
1-10% axit nucleic và 1-40% lipid [12].

Đoàn Diệu Linh

5

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
Bảng 1. Vai trò của các thành phần trong EPS [13]
Chức năng của hợp
chất ngoại bào

Thành phần của EPS

Chức năng trong biofilm

Polysaccharide trung tính
Cấu trúc

Cấu tạo nên biofilm
Amyloid

Kênh dẫn

Polysaccharide tích điện
hoặc kị nƣớc

Kênh dẫn ion, kênh dẫn nƣớc

Các enzym ngoại bào

Phân hủy các hợp chất hữu cơ

Amphiphlic

Tƣơng tác bề mặt

Màng bao

Xuất bào, kênh dẫn nƣớc

Lectin

Đặc trƣng nhận dạng

Axit nucleic

Thông tin di truyền, cấu trúc

Hoạt hóa quá trình oxi
hóa khử

Hợp chất hữu cơ chịu
nhiệt của vi khuẩn

Thu nhận electron

Chất dinh dƣỡng

Các loại polymer

Nguồn cung cấp cacbon, nitơ,
photpho

Hoạt hóa
Hoạt hóa bề mặt

Thông tin di truyền

1.3.1.1.

Vai trò của protein ngoại bào

Nhìn chung, thành phần protein trong EPS là tƣơng đối lớn, song vai trò của
chúng trong màng sinh vật chƣa đƣợc biết đến một cách rõ ràng. Đối với một số
loại vi khuẩn protein đóng vai trò là pili roi curli và sợi amyloid đƣợc cho là yếu
tố quan trọng cho sự hình thành màng sinh vật. Ngoài ra, những enzym ngoại bào,
thông thƣờng là protease và glycosidase trong màng biofilm, đóng vai trò trao đổi
chất [33].
1.3.1.2.

Vai trò của polysaccharide ngoại bào

Polysaccharide là thành phần quan trọng để tạo nên cấu trúc hoàn chỉnh

biofilm. Các polysaccharide có thể rất đa dạng về các đặc tính sinh lý, sinh hóa
thông qua dạng liên kết glycoside giữa các phân tử (β-1 4 β-1 3 hay α-1 6) hay đơn
vị monomer cấu tạo nên. Polysaccharide có thể là các đồng phân tử cấu tạo bởi một
đơn phân monosacharide duy nhất nhƣ cellulose dextran hay dị phân tử cấu tạo bởi
2 đến 4 dạng đơn phân khác nhau nhƣ alginate emulsan gellan. Các

Đoàn Diệu Linh

6

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
monosaccharide phổ biến trong biofilm là D-glucose, D-galactose, D-mannose, Lfucose nhóm axit uronic nhƣ axit D-glucuronic, axit D-galacturonic. Thành phần
các đƣờng đơn có ảnh hƣởng đến đặc tính của polysaccharit và qua đó ảnh hƣởng
đến tính chất của biofilm [7].
1.3.2. Thành phần tế bào
Cấu trúc màng sinh vật bao gồm thành phần tế bào liên kết với nhau một
cách có trật tự đảm bảo cho sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào.
Mạng lƣới chất ngoại bào quy định sự sắp xếp tế bào và tạo nên những kênh dẫn
truyền nƣớc bên trong màng sinh vật. Chính nhờ cấu trúc này mà các chất dịch,
nƣớc có thể lƣu thông qua màng sinh vật tạo điều kiện cho các chất dinh dƣỡng
đƣợc khuếch tán, phân phối đến khắp các tế bào trong màng đồng thời loại đi
những chất thải không cần thiết [23].
Màng sinh vật có thể đƣợc hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc
nhiều loài vi sinh vật khác. Trong biofilm các tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu
trúc là các vi khuẩn lạc. Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình
hình thành biofilm đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó qui định đặc tính hình thành
biofilm cho từng loài vi sinh vật đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào

cũng nhƣ có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào nhƣ lông roi lông nhung hỗ trợ cho việc
bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể. Giữa các tế bào trong hệ thống
mạng lƣới màng sinh vật có các kênh dẫn, cho phép di truyền ngang các tính trạng
mới trong quần thể sinh vật [6].
1.4.

Quá trình hình thành màng sinh vật

Dựa trên các phƣơng pháp phân tích di truyền học, proteomics và sinh học
phân tử, cùng với những phân tích về mặt cấu trúc, hóa học màng sinh vật, các nhà
khoa học đã đƣa ra một mô hình cấu trúc màng sinh vật cơ bản [8]. Trong mô hình
này, vi khuẩn hình thành nên các vi khuẩn lạc và đƣợc bao quanh bởi một mạng
lƣới chất ngoại bào giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự
đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nên
những kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật. Nhờ đó dịch tế bào
có thể đi qua màng sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh
dƣỡng đến khắp các tế bào trong màng cũng nhƣ loại bỏ các chất thải [34].
Sự tạo thành màng sinh vật cũng giống nhƣ một quá trình phát triển của vi
sinh vật và cần phải trải qua một số bƣớc bao gồm: sự gắn kết của các tế bào vi

Đoàn Diệu Linh

7

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
sinh vật trôi nổi tự do lên một bề mặt, sự tăng trƣởng và liên kết các tế bào thành vi
khuẩn lạc, sự tạo thành màng sinh vật trƣởng thành (hoàn chỉnh), và cuối cùng là sự

tách rời của các tế bào vi sinh vật thành dạng dịch lỏng tế bào (Hình 3).

Hình 3. Các giai đoạn chính hình thành màng biofilm [11]
1.Giai đoạn gắn kết lên bề mặt, 2. Hình thành lớp tế bào trên bề mặt, 3. Hình thành
mạng lƣới ngoại bào, 4. Hình thành biofilm hoàn chỉnh, 5. Quá trình tách rời
Giai đoạn 1: Gắn kết thuận nghịch
Các bề mặt trong môi trƣờng thủy sinh thƣờng đạt đƣợc điều kiện cho sự hấp
thụ của các chất vô cơ và hữu cơ. Dƣới một số điều kiện nhất định và tùy thuộc đặc
tính lý hóa, các vi khuẩn có thể di chuyển hƣớng đến bề mặt bởi chuyển động
Brown hay hóa ứng động và hình thành mối tƣơng tác tạm thời với bề mặt thông
qua các lực tƣơng tác yếu nhƣ lực Van der Waals, lực hút tình điện, liên kết hydro.
Nhờ khả năng di chuyển độc lập bằng các cử động co rút tế bào hay sử dụng các
tiêm mao, và khả năng tiết các chất ngoại bào giúp các tế bào riêng rẽ đƣợc bao bọc
trong một mạng lƣới và bắt đầu sự hình thành màng sinh vật [30].
Tuy nhiên, các tế bào này chƣa hẳn đã đi vào quá trình hình thành màng sinh
vật và có thể rời bề mặt để tiếp tục đời sống tự do riêng lẻ.
Giai đoạn 2: Gắn kết không thuận nghịch

Đoàn Diệu Linh

8

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
Sau khi gắn kết thuận nghịch ban đầu lên một bề mặt, vi sinh vật không
những phải giữ liên kết với bề mặt giá thể mà còn phải tăng trƣởng để hình thành
một màng sinh vật hoàn chỉnh. Vì vậy giai đoạn tiếp theo là sự sản xuất các chất
ngoại bào nhằm làm tăng tính bám dính ổn định thông qua các cầu nối hữu cơ giữa

tế bào và giá thể. Việc chuyển từ giai đoạn bám dính thuận nghịch sang giai đoạn
bám dính không thuận nghịch đƣợc thực hiện nhờ lông roi, tiêm mao vào các sợi
bám dính. Trong khi sự vận động thông qua trung gian lông roi đƣợc đánh giá là
quan trọng trong bƣớc đầu thiết lập sự bám dính của vi sinh vật lên bề mặt thì vận
động co rút đƣợc chỉ ra là cần thiết cho sự trƣởng thành của màng sinh vật trong
điều kiện tĩnh.
Cụ thể nhu động co rút giúp cho sự hình thành nên các vi khuẩn lạc trong
màng sinh vật bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho tƣơng tác giữa các vi khuẩn với
bề mặt để hình thành nên các nhóm tế bào qua đó giúp tăng cƣờng mức độ bám
dính với bề mặt [30].
Giai đoạn 3: Hình thành mạng lƣới ngoại bào
Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục đƣợc tạo ra bởi các tế bào để liên
kết các tế bào với nhau một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các vi
khuẩn lạc. Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể
là từ nhiều loài khác nhau) trong môi trƣờng. Kết quả là mật độ tế bào trong một
màng sinh vật cũng nhƣ lƣợng các polymer ngoại bào tạo ra tăng lên. Một mạng
lƣới màng sinh vật dần đƣợc hình thành [34].
Giai đoạn 4: Hình thành một biofilm hoàn chỉnh
Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình
trƣởng thành của màng sinh vật bắt đầu. Trong suốt quá trình này, sự phân chia của
các tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch là nguyên nhân giúp các tế bào
phân chia để lan rộng và phát triển dần lên từ các điểm gắn kết để hình thành các vi
khuẩn lạc hay các cụm tế bào. Từ một phạm vi ban đầu biofilm có thể mở rộng về
không gian cũng nhƣ độ phức tạp tùy thuộc vào điều kiện môi trƣờng. Một biofilm
hoàn chỉnh có cấu trúc giống nhƣ tháp hình nấm đƣợc bao quanh bởi các kênh vận
chuyển nƣớc có tính thẩm thấu cao tạo điều kiện cho việc vận chuyển chất dinh
dƣỡng và oxy vào bên trong biofillm cũng đƣợc quan sát. Các biofilm phát triển khá
chậm thƣờng cần vài ngày để đạt đƣợc cấu trúc hoàn chỉnh. Một biofilm trƣởng
thành đƣợc coi nhƣ một tổ chức tiên tiến luôn có sự thích nghi liên tục với môi

Đoàn Diệu Linh

9

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
trƣờng bao quanh điều này cũng có nghĩa là khi điều kiện môi trƣờng bất lợi vi
khuẩn có thể tách rời khỏi biofilm để tìm một môi trƣờng mới phù hợp hơn [18].
Giai đoạn 5: Tách rời
Khả năng phát triển của màng sinh vật giới hạn trong điều kiện dinh dƣỡng
của môi trƣờng nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào. Các
phân tử này đƣợc giải phóng ra nhằm đáp ứng với những hạn chế về dinh dƣỡng,
sự tích tụ các sản phẩm độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu tố pH,
nguồn cung cấp cacbon, oxy. Trong một số trƣờng hợp, khi màng sinh vật đạt đến
khối lƣợng và một mức cân bằng động tối đa thì các tế bào trong đó sẽ tự tách rời và
cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các vi khuẩn lạc [29].
1.5.

Vai trò của màng sinh vật đối với vi sinh vật

1.5.1. Bảo vệ tế bào trƣớc những điều kiện bất lợi của môi trƣờng
Mạng lƣới ngoại bào của màng sinh vật là nơi khu trú cho các vi khuẩn tồn
tại. Mạng lƣới ngoại bào đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và chức năng của
các màng sinh vật. Chất nền ngoại bào này cũng có khả năng ngăn chặn sự xâm
nhập của các tác nhân kháng khuẩn vào trong màng nhờ hoạt tính trao đổi anion
đồng thời làm hạn chế sự khuếch tán của một số hợp chất từ môi trƣờng xung quanh
vào bên trong màng sinh vật.
Mạng lƣới chất ngoại bào cũng đƣợc ghi nhận là có khả năng giúp tế bào

chống lại tác động của một số kim loại nặng, các cation và chất độc; đồng thời bảo
vệ tế bào tránh khỏi nhiều yếu tố stress từ môi trƣờng nhƣ sự thay đổi độ pH, bức xạ
tia cực tím, áp suất thẩm thấu và sự khô hạn. Thành phần chính của màng sinh vật
chiếm tới 97% là nƣớc. Khả năng giữ nƣớc cao của mạng lƣới ngoại bào thông qua
các liên kết hydro trong cấu trúc màng giúp bảo vệ màng chống lại sự khô hạn trong
môi trƣờng tự nhiên [20].
1.5.2. Mối quan hệ hợp tác giữa các loài
Màng sinh vật đƣợc hình thành nhờ sự hợp tác cùng chung sống của nhiều
loài vi sinh vật tạo nên một quần xã vi sinh vật phức tạp. Khả năng tồn tại với
những điều kiện dinh dƣỡng khác nhau giúp các loài vi sinh vật tận dụng đƣợc tối
đa nguồn dinh dƣỡng trong môi trƣờng cũng nhƣ hỗ trợ nhau theo hƣớng cùng có
lợi trong chu trình chuyển hóa vật chất. Các loài vi sinh vật cũng có thể phối hợp
các cơ chế trao đổi chất để cùng phân giải một hợp chất hữu cơ thúc đẩy quá trình
tuần hoàn các nguyên tố trong tự nhiên.

Đoàn Diệu Linh

10

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
Môi trƣờng nội bào trong cấu trúc màng sinh vật cung cấp phƣơng tiện trao
đổi dinh dƣỡng và chuyển hóa chất hiệu quả thông qua các pha dung dịch lớn tăng
cƣờng khả năng hấp thụ dinh dƣỡng cũng nhƣ loại bỏ những sản phẩm trao đổi chất
có nguy cơ độc hại. Màng sinh vật cung cấp một môi trƣờng lý tƣởng cho sự thiết
lập mối quan hệ hợp dƣỡng giữa các loài vi sinh vật [14].
Các vi khuẩn tồn tại trong màng sinh vật, liên kết với nhau qua mạng lƣới
chất ngoại bào, sẽ có hiện tƣợng trao đổi gen từ tế bào này sang tế bào khác, giúp

cộng đồng vi sinh vật trong mạng lƣới tiếp nhận đƣợc vật liệu di truyền mới đẩy
mạnh sự tiến hóa và đa dạng di truyền trong cộng đồng các vi sinh vật [20].
1.6.

Ứng dụng của màng sinh vật

1.6.1. Ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại ở cây trồng
Trong một vài năm gần đây hƣớng nghiên cứu sử dụng các chủng vi khuẩn
có khả năng hình thành màng sinh vật làm tác nhân phòng trừ bệnh hại cây trồng
cũng đã đƣợc lƣu tâm. Bais và cộng sự cũng đã ghi nhận quá trình ức chế
P.syringae bởi chủng Bacillus subtilis 6051 có liên quan đến việc hình thành chất
hoạt động bề mặt surfactin tại vùng rễ cây [16]. Theo một công trình khác của
Haggag công bố năm 2007 đã phân lập đƣợc 2 chủng Paenibacillus polymyxa có
khả năng đối kháng với Aspergillus niger gây bệnh thối rễ ở đậu trên mô hình cây
trồng và chứng minh cơ chế đối kháng này có liên quan đến sự hình thành biofilm
trên bề mặt rễ cây bằng phƣơng pháp chụp ảnh hiển vi điện tử quét [37].
1.6.2. Ứng dụng trong xử lý nƣớc thải
Trong cấu trúc màng sinh vật, các vi sinh vật liên kết với nhau chặt chẽ, tạo
ra một cấu trúc bền vững, hoạt động có hiệu quả hơn trong việc xử lý nƣớc thải.
Trong mạng lƣới màng sinh vật thƣờng sản phẩm của chủng này lại là cơ chất cho
một chủng khác cũng giúp cho quá trình phân hủy các chất diễn ra hiệu quả hơn.
So sánh với việc sử dụng các chủng vi sinh vật trôi nổi để xử lý nƣớc thải thì
công nghệ xử lý sinh học nƣớc thải bằng màng sinh vật mang lại nhiều lợi ích đáng
kể. Một là, mật độ các chủng vi sinh vật trong màng sinh vật cao hơn nhiều, tạo
điều kiện xử lý tối đa nguồn nƣớc thải. Hai là, ngoài việc loại bỏ các chất không
mong muốn trong nƣớc thải thì quá trình tiếp theo là loại bỏ các vi sinh vật này khỏi
môi trƣờng. Đối với các tế bào trôi nổi, việc khử trùng nguồn nƣớc sẽ tốn một chi
phí lớn, do vậy việc áp dụng màng sinh vật trên các giá thể cố định thể hiện ƣu thế

Đoàn Diệu Linh

11

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
lớn. Với những ƣu điểm này, các nhà khoa học đã đề xuất công nghệ xử lý nƣớc
thải ứng dụng màng sinh vật đƣợc xem là giải pháp thân thiện môi trƣờng [22].
1.7.

Vấn đề xử lý nƣớc thải
Ngày nay, vấn đề ô nhiễm nƣớc thải là một vấn đề lớn trong bối cảnh toàn

cầu nhƣ là một hệ quả của tiến trình công nghiệp hóa đô thị hóa, kết hợp với sự
tăng trƣởng dân số và sự thay đổi về lối sống. Việc xử lý nƣớc thải môi trƣờng
trong tình hình thực tiễn hiện nay là một vấn đề mang tính thời sự cấp thiết. Bởi lẽ
xử lý nƣớc thải không chỉ nhằm mục đích cải thiện điều kiện vệ sinh môi trƣờng
sống của con ngƣời mà còn nhằm duy trì cân bằng sinh thái, tạo điều kiện phát triển
bền vững lâu dài cho loài ngƣời.
Đặc trƣng của nƣớc thải sinh hoạt là hàm lƣợng chất hữu cơ lớn, chứa nhiều
vi sinh vật trong đó có các vi sinh vật gây bệnh. Khi xây dựng các công trình xử lý
nƣớc thải phải đạt đƣợc các yêu cầu về chất lƣợng nguồn nƣớc xả ra. Một trong
những chỉ tiêu cần đạt đƣợc là hàm lƣợng nitơ trong nƣớc thải. Hàm lƣợng nitơ
trong nƣớc thải cao làm ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời đến môi trƣờng và các
quá trình xử lý khác trong trạm xử lý nƣớc thải.
Có nhiều nguồn nitơ (từ tự nhiên và từ hoạt động của con ngƣời) có thể dẫn
dến ô nhiễm. Tuy nhiên, một trong số những nguồn ô nhiễm nitơ tiềm năng liên
quan đến cách hoạt động nông nghiệp, hoặc xử lý các rác thải sinh hoạt của con
ngƣời. Chẳng hạn nhƣ ở các hầm tự hoại cung cấp phân bón cho nông nghiệp, ở

những khu vực tập trung và xử lý rác thải [15]. Bên cạnh đó việc xử lý ô nhiễm
Nitơ còn có ý nghĩa trong nền nông nghiệp sinh thái nuôi trồng quảng canh. Với hệ
thống nuôi tôm công nghiệp, các trang trại nuôi tôm áp dụng hình thức nuôi với mật
độ dày đặc cả tôm giống lẫn lƣợng thức ăn. Vì nuôi trong những bể cô lập nên thức
ăn thừa tồn đọng trong bể dễ dàng bị phân hủy ra các hợp chất thứ cấp và cuối cùng
về amonia.
Trong nƣớc thải, các hợp chất của nitơ tồn tại dƣới 3 dạng: các hợp chất hữu
cơ amoni và các hợp chất dạng oxy hóa (nitrite và nitrate). Trong quá trình xử lý
nƣớc thải bằng phƣơng pháp sinh học, nitơ amon sẽ đƣợc chuyển hóa thành nitrite
và nitrate qua quá trình nitrate hóa. Khi môi trƣờng thiếu oxy, các loại vi khuẩn khử
nitrate sẽ tách oxy của nitrate và nitrite để oxy hóa chất hữu cơ. Nitơ phân tử (N2)
tạo thành trong quá trình này sẽ thoát ra khỏi nƣớc.

Đoàn Diệu Linh

12

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
1.7.1. Quá trình nitrate hóa
Nitrate hóa là một quá trình tự dƣỡng. Năng lƣợng cho sự phát triển của vi
khuẩn đƣợc lấy từ các hợp chất oxy hóa của nitơ. Nitrate hóa là sự kết hợp của quá
trình oxy hóa amoni và quá trình oxy hóa nitrite thành nitrate. Các vi khuẩn chuyển
hóa amoni nhƣ Nitrosomonas, Nitrosococcus chuyển hóa amoni thành nitrite theo
phƣơng trình (1). Các vi khuẩn oxy hóa nitrite nhƣ Nitrobacter, Nitrococcus sau đó
chuyển hóa nitrite thành nitrate theo phản ứng (2) [17].
15 CO2 + 13 NH4+  10 NO2- + 3 C5H7NO2 + 23 H+ + 4 H2O

(1)

5 CO2 + NH4+ + 10 NO2- + 2 H2O  10 NO3- + C5H7NO2 + H+

(2)

Các vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter sử dụng năng lƣợng lấy từ các
phản ứng trên để tự duy trì hoạt động sống và tổng hợp sinh khối. Cùng với quá
trình thu năng lƣợng, C5H7NO2 tạo thành dùng để tổng hợp nên sinh khối mới cho
tế bào vi khuẩn.
Quá trình nitrate hóa là giai đoạn cuối cùng của quá trình khoáng hóa các
chất hữu cơ có chứa nitơ. Nitrate hóa là quá trình hoàn thiện của các công trình xử
lý nƣớc thải bằng phƣơng pháp sinh học. Quá trình này tạo nên sự tích lũy oxy
trong các hợp chất nitơ để các quá trình oxy hóa sinh hóa các chất hữu cơ tiếp theo
có thể xảy ra khi lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc rất ít hoặc đã hết.
1.7.2. Quá trình phản nitrate hóa
Khi thiếu oxy và tồn tại nitrate hóa sẽ xảy ra quá trình ngƣợc lại: Tách oxy
khỏi nitrate và nitrite để sử dụng lại trong các quá trình oxy hóa các chất hữu cơ
khác. Quá trình này đƣợc thực hiện nhờ các vi khuẩn phản nitrate hóa (vi khuẩn
yếm khí tùy tiện). Trong điều kiện không có oxy tự do mà môi trƣờng vẫn còn chất
hữu cơ cacbon một số loại vi khuẩn khử nitrate hoặc nitrite để lấy oxy cho quá
trình oxy hóa các chất hữu cơ. Quá trình khử nitrate đƣợc biểu diễn theo phƣơng
trình phản ứng sau:
4 NO3- + 5Chữu cơ + 4 H+  5 CO2 + 2 N2 + 2 H2O
Trong những năm gần đây những nghiên cứu ứng dụng mạng lƣới màng
sinh vật trong xử lý nƣớc thải đang thu hút sự quan tâm trên thế giới. Đặc biệt việc
phân lập các chủng vi sinh vật vừa có khả năng phân hủy các hợp chất nitơ gây ô
nhiễm đồng thời vừa có khả năng tạo màng sinh vật là một hƣớng nghiên cứu hứa
hẹn đem lại nhiều tiềm năng cho việc xử lý nƣớc thải. Xuất phát từ thực tiễn đó

Đoàn Diệu Linh

13

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
trong quy mô đề tài khóa luận, chúng tôi phân lập các chủng vi sinh vật từ các mẫu
nƣớc thải có khả năng hình thành màng sinh vật nhằm bƣớc đầu nghiên cứu ứng
dụng trong vấn đề xử lý nƣớc thải giàu nitơ.

Đoàn Diệu Linh

14

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1.

Chủng vi sinh vật nghiên cứu

Với mục tiêu phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh
vật có khả năng tạo thành màng sinh vật và ứng dụng trong xử lý nƣớc thải, chúng
tôi đã tiến hành lựa chọn và lấy mẫu nƣớc thải tại nhiều khu vực khác nhau. Mẫu
đƣợc lấy và phân tích trong ngày. Các địa điểm thu mẫu cụ thể nhƣ sau:
Nƣớc thải từ khu tập trung rác thải làng Vạn Phúc, Hà Đông, Hà Nội.

Nƣớc thải từ hầm Biogas làng Phú Bến, Thụy Hƣơng, Chƣơng Mỹ, Hà Nội.
Nƣớc thải từ khu vực đầm nuôi tôm ấp Xẻo Rừng, xã Ninh Thành Lợi, huyện
Hồng Dân, tỉnh Bạc Liêu.

A

B

Hình 4. Một số địa điểm, khu vực lấy mẫu trong đề tài
A. Nƣớc thải khu tập trung rác thải làng Vạn Phúc
B. Nƣớc thải đầm nuôi tôm Bạc Liêu
2.2.

Hóa chất, thiết bị

2.2.1. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng LB (Luria – Bertani broth hay Luria broth) (g/l)
Tryptone

10g

Cao nấm men

5g

NaCl

10g

Nƣớc cất

1 lít

Đoàn Diệu Linh

15

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
Môi trƣờng LB là môi trƣờng thƣờng đƣợc sử dụng cho việc nuôi cấy các
chủng vi khuẩn hiếu khí. Môi trƣờng có đầy đủ các chất dinh dƣỡng, nguồn cacbon,
nitơ cho vi sinh vật sinh trƣởng và phát triển
Môi trƣờng phân lập Nitrosomonas: môi trƣờng Winogradski 1(g/l)
(NH4)2SO4

2g

K2HPO4

1g

MgSO4.7H2O

0,5 g

FeSO4.7H2O

0,4 g

NaCl

2g

CaCO3

0,01g

Nƣớc cất

1 lít

pH = 7
Môi trƣờng phân lập Nitrobacter: môi trƣờng Winogradki 2 (g/l)
K2HPO4

1g

MgSO4.7H2O

0,5 g

FeSO4.7H2O

0,03 g

NaCl

0,3g

NaNO2

1g

Na2CO 3

1g

Nƣớc cất

1 lít

pH = 7,3
Các môi trƣờng đều đƣợc khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 120
phút. Các hoác chất khác sử dụng trong nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng
sinh vật đều đạt độ tinh sạch cho mục đích nghiên cứu
2.2.2. Thuốc thử
Thuốc thử Brucice sulfanil:
Brucide

1g

Axit sunfanyl

0,1g

Đoàn Diệu Linh

16

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
HCl

3 ml

Nƣớc cất nóng

70 ml

Các hóa chất đƣợc hòa tan, làm lạnh về nhiệt độ phòng rồi định mức
đến 100ml với nƣớc khử ion
Dung dịch Sunfanilamide:
Hòa tan 0,6 g sunfanilamide (H2NC6H4SO2NH2) trong 50 ml nƣớc cất
khử ion nóng, làm lạnh, thêm 40ml dung dịch HCl đặc và định mức
đến 100ml
Dung dịch Naphtylendiamide dihydrochloride đƣợc chuẩn bị:
Hòa tan 0,1g Naphtylendiamide dihydrochloride (C10H7NHCH2NH2.2HCl)
trong 100ml nƣớc cất khử ion.
Các dung dịch thuốc thử đều đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp và
tránh ánh sáng.
2.2.3. Máy móc, thiết bị
Nồi khử trùng (ALP - Nhật Bản)
Máy lắc ổn nhiệt (Satorius - Đức)
Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý)
Cân điện tử 2 số lẻ (Kern - Đức)
Cân phân tích (Presica - Thụy Sỹ)

Máy đo pH (Horiba - Nhật Bản)
Máy đo mật độ quang học (Bionate - Anh)
Tủ ấm (Memmert - Đức)
Tủ sấy (Memmert - Đức)
Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA RET - Đức)
Kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật)

Đoàn Diệu Linh

17

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn đƣợc phân lập từ các mẫu nƣớc thải bằng phƣơng pháp pha loãng
mẫu trong nƣớc cất hoặc nƣớc muối sinh lý đã khử trùng.
Mẫu sau khi pha loãng đƣợc cấy gạt dịch ở các nồng độ từ 10-1 đến 10-4 trên
các đĩa petri chứa môi trƣờng thạch phân lập Nitrosomonas và Nitrobacter. Các đĩa
sau khi cấy trải đƣợc nuôi cấy trong tủ ấm với nhiệt độ 37oC trong thời gian từ 24
đến 48 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện và đƣợc quan sát sau thời gian ít nhất là 24 giờ.
Sau khi phát triển, các khuẩn lạc sẽ đƣợc tách riêng rẽ và đƣợc nuôi cấy trong môi
trƣờng LB bổ sung thạch.
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các
chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi tĩnh trong điều kiện dinh dƣỡng thích hợp,
mạng lƣới màng sinh vật có thể đƣợc hình thành trên bề mặt các giá thể. Màng
biofilm đƣợc tạo thành có thể đƣợc phát hiện bằng cách nhuộm tím tinh thể
1%(w/v) [31]. Dung dịch tím kết tinh 1% có khả năng bắt màu với các tế bào sống.
Sự thay đổi về cƣờng độ màu thể hiện mức độ và số lƣợng các tế bào vi sinh vật.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Morikawa và cộng sự [26]
Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập đƣợc lắc kích hoạt với 15ml LB trong
bình tam giác ở 37oC trong 24 giờ. Hút một lƣợng thể tích dịch nuôi cấy bổ sung
vào 700 μl LB lỏng trong các ống eppendorf đã khử trùng sao cho mật độ tế bào xác
định bằng máy đo mật độ quang học OD620 đạt khoảng 0,3-0,4 và ủ trong điều kiện
tĩnh ở 37oC.
Sau khoảng thời gian từ 24 đến 48 giờ, các dịch nuôi cấy đƣợc loại bỏ khỏi
các ống eppendorf. Đánh giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trƣờng bằng
phƣơng pháp đo mật độ quang học ở bƣớc sóng 620nm (OD620) dịch nuôi cấy vi
khuẩn.
Quan sát khả năng tạo màng sinh vật: Mỗi ống eppendorf đƣợc rửa sạch 2
lần bằng nƣớc cất khử trùng. Sau đó mỗi ống eppendorf đƣợc bổ sung 1ml dung
dịch tím Gentian và giữ trong 25 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch nhuộm,
rửa sạch 2 lần bằng nƣớc cất và sau đó quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên
thành ống với tím kết tinh.

Đoàn Diệu Linh

18

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
Đánh giá mật độ tế bào trong biofilm: Các tinh thể tím bám trên thành

eppendorf đƣợc hòa tan trong 1ml etanol 70o. Mật độ tế bào trong biofilm đƣợc xác
định bằng cách đo độ hấp thụ OD570.
2.3.3. Tối ƣu hóa các điều kiện của môi trƣờng
Mỗi chủng vi sinh vật đều có thể tạo thành màng sinh vật tốt nhất ở những
điều kiện thích hợp về nhiệt độ độ pH và nồng độ muối NaCl khác nhau tùy theo
các đặc tính sinh học của chúng.
2.3.3.1.

Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Các chủng vi sinh vật có hoạt tính tạo màng sinh vật sau khi đƣợc lựa chọn
sẽ đƣợc nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau trong 24 giờ sau đó sẽ đƣợc quan sát,
đánh giá khả năng hình thành màng sinh vật bằng cách đo độ hấp thụ OD570 theo
phƣơng pháp của Morikawa và cộng sự [26]. Các nhiệt độ đƣợc lựa chọn nghiên
cứu là 25oC, 30oC, 37oC, 45oC, 50oC và 55oC.
2.3.3.2.

Ảnh hưởng của độ pH môi trường nuôi cấy

Các chủng vi sinh vật có hoạt tính tạo màng sinh vật sau khi đƣợc lựa chọn
sẽ đƣợc nghiên cứu khả năng phát triển trong các điều kiện pH môi trƣờng khác
nhau. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành quan sát đánh giá khả năng tạo thành màng
sinh vật của các chủng vi sinh vật bằng cách đo độ hấp thụ OD570 theo phƣơng pháp
của Morikawa và cộng sự [26]. Các giá trị pH môi trƣờng đƣợc lựa chọn nghiên cứu
nằm trong khoảng từ 4 đến 9.
2.3.3.3.

Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl trong môi trường nuôi cấy

Tƣơng tự nhƣ thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của độ pH trong môi trƣờng

nuôi cấy, khả năng hình thành màng sinh vật của các chủng vi khuẩn đƣợc thực hiện
trong môi trƣờng có bổ sung các nồng độ muối NaCl khác nhau từ 0% đến 5%.
2.3.4. Khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ
Để kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ điển hình của các chủng
vi khuẩn, chúng tôi tiến hành thử với Kit thử API 20NE của hãng BioMérieus.
Hóa chất và thuốc thử cần thiết đƣợc cung cấp cùng với bộ kit. Các bƣớc tiến
hành đƣợc tóm tắt nhƣ sau
 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn không quá 24 giờ

Đoàn Diệu Linh

19

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
 Bổ sung khuẩn lạc vào nƣớc cất khử trùng sao cho giá trị hấp thụ ánh sáng
bƣớc sóng 600nm (OD600) đạt giá trị 0,132
 Bổ sung 200μl dịch vào các giếng thử từ NO3 đến 4-nitrophenyl-βDGalactopyranoside (PNPG) trong khay thử. Các giếng D-glucose
(GLU), L-arginine (ADH), Urea (URE) bổ sung thêm dầu khoáng.
 Bổ sung 200μl dịch vi khuẩn vào ống API AUX (đƣợc cung cấp trong kit
thử), rồi bổ sung 200μl dịch này vào các giếng còn lại
 Ủ khay thử trong 24 giờ ở 30oC
 Kiểm tra NO3: Thêm 1 giọt thuốc thử NIT1 và NIT2 (đƣợc cung cấp trong
bộ kit) vào giếng và so sánh kết quả với bảng đối chiếu kết quả. Nếu kết
quả âm tính thì bổ sung 2-3mg Zn để kiểm tra khả năng hình thành N2 rồi
so sánh kết quả sau 5 phút.
 Kiểm tra L-tryptophan (TRP): Thêm 1 giọt thuốc thử JAMES (đƣợc cung
cấp trong bộ kit) rồi so sánh kết quả

 Các giếng còn lại đƣợc so sánh với bảng đối chiếu kết quả
 Các kết quả đƣợc ghi lại và đối chiếu với phần mềm tƣơng ứng.
2.3.5. Phƣơng pháp nhuộm Gram nhận dạng chủng nghiên cứu
Nguyên tắc:
Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi
khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động nhƣ một hàng rào thẩm thấu ngăn cản
sự thất thoát của tím kết tinh. Ban đầu, vi khuẩn đƣợc nhuộm bằng tím kết tinh sau
đó đƣợc xử lý bằng iot để tăng độ giữ màu. Sau đó đƣợc tẩy màu bằng cồn làm co
các lỗ của lớp peptidoglican dày lại. Do vậy phức chất tím kết tinh và iot đƣợc giữ
lại, vi khuẩn có màu tím. Peptidoglican ở vi khuẩn Gram (-) rất mỏng, ít liên kết
chéo và có lỗ lớn. Do vậy, ở bƣớc rửa bằng cồn đã loại bỏ phức chất màu tím của
tím kết tinh - iot. Khi nhuộm lại bằng safranin thì vi khuẩn có màu hồng [2].
Phƣơng pháp tiến hành:
 Chuẩn bị vết bôi: Nhỏ một giọt nƣớc cất lên lam kính sạch, dùng que cấy
vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ đĩa thạch (thời gian cấy ít hơn 24 giờ) hòa
vào giọt nƣớc cất ở giữa phiến kính
 Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần

Đoàn Diệu Linh

20

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
 Cho một giọt tím kết tinh bao phủ bề mặt vết bôi, nhuộm trong 1 phút, rồi
rửa nƣớc, thấm khô
 Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút, rửa nƣớc,
thấm khô

 Nhỏ dịch tẩy màu (ethanol 95%), giữ khoảng 30 giây, rửa nƣớc, thấm khô
 Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2 - 3 phút, rửa nƣớc để
khô trong không khí
 Quan sát dƣới kính hiển vi quang học: dùng vật kính dầu với độ phóng đại
100 lần và đƣa ra kết luận
2.3.6. Quan sát cấu trúc màng sinh vật bằng kỹ thuật ảnh chụp trên kính hiển
vi điện tử quét
Chuẩn bị mẫu màng sinh vật nổi: dung dịch nuôi cấy lắc chủng vi khuẩn
đƣợc bổ sung vào bình tam giác chứa 20ml môi trƣờng LB lỏng. Nuôi cấy tĩnh ở
37oC trong 24 giờ.
Màng sinh vật đƣợc làm vết bôi trên kính sau đó hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn
cồn để cố định.
Rửa nhẹ mẫu gắn màng sinh vật bằng nƣớc cất khử trùng để khô tự nhiên.
Mạ phủ mẫu bằng vàng trên máy JFC – 1200 trong 5 phút ở 30mA
Quan sát và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật) tại
phòng chụp hiển vi điện tử quét thuộc Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trƣờng Đại
học Khoa học Tự nhiên.
2.3.7. Phƣơng pháp đo phân tích hàm lƣợng nitrate N-NO3-.
Nguyên tắc: Phản ứng giữa nitrate và brucide ở pH 2-3 tạo thành dung dịch
có màu vàng, nhận biết bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng
415nm (OD415) [4].
Phƣơng pháp tiến hành:
 Chuẩn bị 5ml mẫu
 Bổ sung 3ml dung dịch NaCl 30%
 Lắc trên máy lắc rung trong 5 giây

Đoàn Diệu Linh

21

K53A Sinh học