Xác Định Vi Khuẩn Pasteurella Multocida Gây Bệnh Tụ Huyết Trùng Ở Trâu, Bò Tại Một Số Huyện Có Dịch Trên Địa Bàn Tỉnh Cao Bằng Và Bước Đầu Thử Nghiệm Auto-Vaccine

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA
GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU, BÒ TẠI MỘT SỐ
HUYỆN CÓ DỊCH TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH CAO BẰNG
VÀ BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM AUTO-VACCINE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thái Nguyên, năm 2010


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA
GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU, BÒ TẠI MỘT SỐ
HUYỆN CÓ DỊCH TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH CAO BẰNG
VÀ BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM AUTO-VACCINE

Chuyên ngành: Thú y
Mã số: 60.62.50

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Đặng Xuân Bình

Thái Nguyên, năm 2010


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện
cùng với sự giúp đỡ của TS. Đặng Xuân Bình. Các số liệu, hình ảnh và kết quả
trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công
trình nào khác. Tôi xin đảm bảo rằng các thông tin, trích dẫn trong luận văn đã
được chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Kim Dung


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã luôn
nhận được sự giúp đỡ quý báu, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo trong
suốt quá trình thực hiện đề tài.
Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với
thầy: T.S Đặng Xuân Bình người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình
nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Sau đại học - Trường Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên, tập thể cán bộ nghiên cứu của Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Viện
Khoa học Sự sống, tập thể lãnh đạo và cán bộ Chi cục Thú y tỉnh Cao Bằng cùng
gia đình, bạn bè đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ tôi
trong quá trình hoàn thành luận văn này.

Thái Nguyên, ngày ... tháng ... năm 2010

Nguyễn Thị Kim Dung


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài...................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3
1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trong và ngoài nước ............... 3
1.1.1. Trên thế giới ........................................................................................ 3
1.1.2. Ở Việt Nam ......................................................................................... 4
1.2. Đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng................................................. 5
1.3. Mầm bệnh ................................................................................................ 10
1.3.1. Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu ....................................... 11
1.3.2. Đặc tính nuôi cấy ........................................................................... 12
1.3.3. Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Pasteurella multocida ................. 15
1.3.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida........ 16
1.3.5. Serotype của vi khuẩn P. multocida .............................................. 18
1.3.6. Độc lực của vi khuẩn P. multocida................................................ 21

1.3.7. Sức đề kháng.................................................................................. 22
1.4. Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P. multocida gây nên .......................... 23
1.4.1. Cơ chế sinh bệnh ............................................................................... 23


1.4.2. Biểu hiện đặc trưng của trâu bò mắc bệnh tụ huyết trùng ................ 23
1.5. Những hiểu biết về vắc xin phòng bệnh .................................................. 25
1.5.1. Một vài nét về lịch sử phát triển của vắc xin .................................... 25
1.5.2. Thành phần của vắc xin..................................................................... 26
1.5.3. Công nghệ lên men vi khuẩn trong chế tạo vắc xin .......................... 30
1.5.4. Phân loại vắc xin ............................................................................... 30
1.5.5. Vắc xin tại chỗ (autovaccine)............................................................ 33
Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 34
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................... 34
2.1.1. Đối tượng........................................................................................... 34
2.1.2. Thời gian và địa điểm........................................................................ 34
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 34
2.2.1. Điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao
Bằng............................................................................................................. 34
2.2.2. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi gia súc khoẻ ..... 34
2.2.3. Chế tạo vắc xin tại chỗ phòng bệnh tụ huyết trùng........................... 35
2.3. Vật liệu dùng cho nghiên cứu.................................................................. 35
2.3.1. Mẫu dùng phân lập vi khuẩn............................................................ 35
2.3.2. Động vật thí nghiệm.......................................................................... 35
2.3.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu ....................................................... 35
2.3.3.1. Hoá chất dùng để nhuộm Gram .................................................. 35
2.3.3.2. Hoá chất dùng để thử phản ứng sinh hoá ................................... 35
2.3.4. Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn ........................................... 36
2.3.5. Dụng cụ thí nghiệm .......................................................................... 36
2.4. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 36

2.4.1. Phương pháp điều tra dịch tễ............................................................. 36
2.4.2. Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn P. multocida ... 37


2.4.2.1. Nuôi cấy, phân lập ...................................................................... 37
2.4.2.2. Phương pháp xác định các đặc tính sinh vật, hóa học................ 38
2.4.3. Phương pháp thử độc lực trên chuột nhắt trắng ................................ 41
2.4.4. Phương pháp thử kháng sinh đồ........................................................ 42
2.4.5. Chế tạo vắc xin tại chỗ theo tiêu chuẩn ngành.................................. 42
2.4.5.1. Phương pháp tính LD50 của P. multocida trên chuột.................. 42
2.4.5.2. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn .................................. 43
2.4.5.3. Phương pháp chế tạo vắc xin...................................................... 43
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu................................................................. 45
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................... 46
3.1. Kết quả khảo sát tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao Bằng
từ năm 2006 – 2009 ........................................................................................ 46
3.1.1. Tình hình bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ năm 2006 – 2009.... 47
3.1.2. Tần suất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ
năm 2006 – 2009 ......................................................................................... 48
3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng ở các mùa vụ....... 50
3.1.4. Triệu chứng đặc trưng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng............... 53
3.1.5. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi gia
súc khoẻ tại tỉnh Cao Bằng.......................................................................... 54
3.1.6. Tỷ lệ mang trùng Pasteurella multocida của trâu, bò khỏe tại ổ dịch
theo lứa tuổi.................................................................................................. 56
3.1.7. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật – hoá học của các
chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được tại một số huyện
có dịch trên địa bàn tỉnh Cao Bằng ............................................................. 58
3.1.8. Xác định type giáp mô của vi khuẩn P. multocida bằng phương
pháp PCR (Polymerase chain reaction)....................................................... 59

3.1.9. Kết quả xác định độc lực của các chủng P. multocida phân lập được..... 59


3.1.10. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn Pasteurella
multocida phân lập được với một số loại kháng sinh ................................. 61
3.2. Nghiên cứu chế tạo vắc xin tụ huyết trùng trâu, bò................................. 62
3.2.1. Chọn chủng vi khuẩn P. multocida sản xuất vắc xin........................ 62
3.2.2. Xác định liều gây chết 50% chuột thí nghiệm (LD50) ..................... 64
3.2.3. Kết quả chế tạo và kiểm nghiệm autovaccine................................... 65
3.2.4. Kiểm tra an toàn và hiệu lực của autovaccine trên động vật thí nghiệm .. 66
3.2.5. Thử nghiệm lâm sàng autovaccine.................................................... 68
3.2.5.1. Thử nghiệm lâm sàng autovaccine ở trâu, bò 1 và 2 năm tuổi... 68
3.2.5.2. Thử nghiệm lâm sàng autovaccine ở trâu, bò 3 năm tuổi........... 68
3.2.6. Theo dõi sự biến động về chỉ tiêu thân nhiệt và tần số hô hấp ở
trâu, bò sau khi tiêm autovaccine................................................................ 71
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 74
1. Kết luận....................................................................................................... 74
2. Đề nghị........................................................................................................ 75
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN....................... 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 77


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BHI:

Brain Heart Infusion

Cs:

Cộng sự

DNA:

Deoxyribonucleic Acid

ĐC:

Đối chứng

FAO:

Food and Agriculture Oganization

LD50:

Lethal Dose 50 - Liều gây chết 50%

MR:

Methyl Red

PCR:

Polymerase Chain Reaction

P. multocida:

Pasteurella multocida

TN:

Thí nghiệm

VP:

Voges Proskauer

YPC:

Yeast extract Pepton - L - Cystin

370C/24h :

Bồi dưỡng trong tủ ấm 370C trong 24 giờ

+ Chú thích
CB6:

Mẫu nghiên cứu số 6 tại Cao Bằng


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tóm tắt danh pháp của P. multocida ................................................ 11
Bảng 1.2. Hệ thống phân loại P. multocida ...................................................... 20
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao
Bằng từ năm 2006 – 2009 ................................................................ 47
Bảng 3.2. Tần suất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại tỉnh Cao
Bằng từ năm 2006 - 2009................................................................. 49
Bảng 3.3. Tỷ lệ trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng ở các mùa vụ ...... 51

Bảng 3.4. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò mắc bệnh tụ
huyết trùng........................................................................................ 53
Bảng 3.5. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi gia
súc khoẻ............................................................................................ 55
Bảng 3.6. Tỷ lệ mang trùng Pasteurella multocida của trâu, bò khỏe tại ổ
dịch theo lứa tuổi.............................................................................. 57
Bảng 3.7. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật – hoá học của vi
khuẩn P. multocida phân lập............................................................. 58
Bảng 3.8. Kết quả thử độc lực của các chủng P. multocida phân lập .............. 60
Bảng 3.9. Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng P.
multocida phân lập ........................................................................... 62
Bảng 3.10. Kết quả chọn chủng vi khuẩn P. multocida để chế tạo autovaccine .. 63
Bảng 3.11. Kết quả xác định LD50................................................................... 64
Bảng 3.12. Kết quả chế tạo và kiểm nghiệm autovaccine trong phòng thí nghiệm 65
Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực của các lô autovaccine......... 67
Bảng 3.14. Kết quả thử nghiệm lâm sàng autovaccine ở trâu, bò 1 và 2 năm tuổi.. 69
Bảng 3.15. Kết quả thử nghiệm lâm sàng autovaccine ở trâu, bò 3 năm tuổi .. 70
Bảng 3.16. Kết quả theo dõi biến động về chỉ tiêu thân nhiệt và tần số hô hấp ...... 72


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Sơ đồ phân loại nhóm vi khuẩn gây bệnh theo tính chất sinh
vật học ............................................................................................ 37
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida ............................. 40
Hình 2.3. Sơ đồ chế tạo vắc xin ...................................................................... 44


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Bệnh tụ huyết trùng trâu, bò là bệnh truyền nhiễm thường diễn biến cấp
tính, xảy ra ở hầu hết các lứa tuổi gia súc. Hàng năm, trên địa bàn các tỉnh miền
núi phía Bắc nước ta, các báo cáo của cơ quan thú y địa phương về tình hình
bệnh tụ huyết trùng xảy ra ở trâu, bò đã cho thấy những thiệt hại kinh tế to lớn.
Để phòng bệnh, cho đến nay có nhiều loại vắc xin tụ huyết trùng trâu,
bò được các cơ quan nghiên cứu chế tạo, sử dụng tiêm phòng cho gia súc mẫn
cảm nhưng bệnh vẫn liên tục xảy ra. Vấn đề đặt ra là cần phải tiếp tục xác định,
làm rõ đặc điểm dịch tễ của bệnh, tìm ra quy luật lưu hành, tính gây bệnh... của
mầm bệnh để sản xuất và ứng dụng vắc xin phù hợp trong từng vùng, hạn chế
tiến tới thanh toán bệnh (Đinh Duy Kháng và cs, 2000) [13].
Về đáp ứng miễn dịch của một số loại vắc xin hiện đang được sử dụng
phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở nước ta, Hoàng Xuân Nghinh và cs
(2004) [21] trao đổi: Hiện nay, ở Việt Nam có hai loại vắc xin sản xuất trong
nước đang được các địa phương sử dụng. Tuy nhiên, tỷ lệ trâu bò mắc bệnh
và chết vẫn không giảm, vì vậy chúng ta phải suy nghĩ xem có phải chất
lượng kháng nguyên trong vắc xin chưa được chuẩn hoá hay đặc tính kháng
nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida ở mỗi vùng có sự khác nhau. Do
vậy, việc xác định vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tại ổ dịch từ đó
lựa chọn kháng nguyên phù hợp chế tạo vắc xin tại chỗ sẽ là một trong những
biện pháp có ý nghĩa góp phần giải quyết các vấn đề nêu trên đáp ứng yêu cầu
kiểm soát bệnh hiệu quả tại các tỉnh miền núi phía Bắc.
Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn của ngành chăn nuôi trâu bò các
tỉnh thuộc miền núi phía bắc, trên cơ sở kế thừa kết quả nghiên cứu của các
tác giả đi trước ở trong và ngoài nước. Căn cứ vào khả năng của cơ sở sản
nghiên cứu, điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam, chúng tôi đề xuất


2

được thực hiện đề tài: “Xác định vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh
tụ huyết trùng ở trâu, bò tại một số huyện có dịch trên địa bàn tỉnh Cao
Bằng và bước đầu thử nghiệm auto-vaccine”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò trên địa bàn
tỉnh Cao Bằng;
- Khảo sát sự lưu hành vi khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò;
- Xác định type giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida phân
lập được;
- Thử nghiệm hiệu quả bảo hộ và tính an toàn trên động vật thí nghiệm
của autovaccine phòng bệnh tụ huyết trùng.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
* Ý nghĩa khoa học:
- Bổ sung tư liệu về đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu bò, sự
lưu hành của vi khuẩn Pasteurella multocida;
- Bổ sung tư liệu về kết quả phân lập và giám định đặc tính sinh vật
học của vi khuẩn Pasteurella multocida, kết quả xác định type vi khuẩn
Pasteurella multocida bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).
* Ý nghĩa thực tiễn
- Là cơ sở để xác định biện pháp phòng bệnh có hiệu quả;
- Là cơ sở để nghiên cứu chế tạo vắc xin phòng bệnh đạt hiệu quả
phòng hộ cao.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trong và ngoài nước
1.1.1. Trên thế giới

Theo De Alwis (1992) [47], bệnh tụ huyết trùng được Bollinger phát
hiện đầu tiên năm 1878 ở Munich (Đức) và năm 1885, Kitt phân lập được vi
khuẩn gây bệnh. Năm 1880, Pasteur phát hiện vi khuẩn gây bệnh cho gà (Fowl
Cholera), bệnh ở lợn do Loeffer phát hiện năm 1886. Cùng năm 1886 nhận
thấy sự giống nhau về tính chất gây bệnh và có sự tương đồng về vi khuẩn gây
bệnh phân lập từ các loài động vật nói trên, Hueppe gọi chung là vi khuẩn gây
nhiễm trùng huyết, xuất huyết và đặt tên là Bacillus septicaemia. Năm 1887,
Oreste và Annani đã mô tả một bệnh ở trâu do một loại vi khuẩn tương tự gây
ra và gọi đó là bệnh “Barbone” (De Alwis, 1992) [47].
Để ghi nhớ công lao của Luis Pasteur, người có nhiều đóng góp
nghiên cứu phát hiện ra loại vi khuẩn này, năm 1887 Trevisan đã đề nghị đặt
tên cho vi khuẩn là Pasteurella (De Alwis, 1992) [47]. Do Pasteurella gây
bệnh cho nhiều loài gia súc nên tên của vi khuẩn, theo những năm trước đây
được gắn với tên của loài vật mà chúng gây bệnh:
Pasteurella suiseptica gây bệnh ở lợn
Pasteurella boviseptica gây bệnh ở bò
Pasteurella oviseptica gây bệnh ở dê, cừu
Pasteurella aviseptica gây bệnh ở gà…
Sau đó, tên của vi khuẩn còn một vài lần nữa được thay đổi và đến
năm 1939, Rosenbush và Merchant (1939) [75] đề nghị đặt tên cho vi khuẩn
này là Pasteurella multocida (P. multocida), tên này được sử dụng trong khoá
phân loại của Bergey’s và được dùng phổ biến trên toàn thế giới.


4
Theo Lignieres (1900) [58] bệnh tụ huyết trùng có ít nhất ở 6 loài vật
nuôi khác nhau. Hai thuật ngữ chỉ bệnh là Haemorrhagic septicaemia và
Pasteurellosis được xem là đồng nghĩa. Tuy nhiên, theo qui ước của tổ chức
FAO (FAO/WHO/CIF, 1970), trong các tài liệu quốc tế về súc sản, hai thuật
ngữ này được dùng phân biệt, Haemorrhagic septicaemia dùng chỉ bệnh do P.

multocida thuộc serotype I Roberts gây ra, còn Pasteurellosis dùng chỉ bệnh
do vi khuẩn Pasteurella gây ra.
Ngày nay, sau hơn một trăm năm kể từ khi phát hiện lần đầu, P.
multocida vẫn là nguyên nhân gây bệnh tụ huyết trùng cho nhiều loài gia súc
gia cầm. Tuy có tính thích nghi gây bệnh trên các loài vật khác nhau, nhưng
P. multocida đều có những đặc tính cơ bản giống nhau.
1.1.2. Ở Việt Nam
Theo Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh (1958) [3], bệnh tụ huyết
trùng trâu, bò được Cudamie phát hiện đầu tiên vào năm 1868 ở trâu thuộc
tỉnh Bà Rịa và Long Thành, sau đó Gemain (1869) phát hiện bệnh ở Gò Công,
Shein (1901) xác nhận có bệnh này ở Tây Ninh.
Theo Đoàn Thị Băng Tâm (1987) [30], tại Việt Nam bệnh thường xảy
ra ở Nam bộ và đặc biệt ở miền tây Nam bộ, vào những năm 1910, 1919,
1920, 1933, 1935 dịch xảy ra rất lớn và mạnh. Bệnh gây thiệt hại và lây lan
nhiều hơn ở những vùng đất trũng, thấp, khí hậu ẩm ướt. Bùi Quý Huy (1998)
[10] cũng cho biết: Trước đây bệnh tụ huyết trùng xảy ra mạnh ở các tỉnh phía
Nam và xảy ra lẻ tẻ ở các tỉnh phía Bắc. Trong những năm 70 có 80% số ổ
dịch tụ huyết trùng và 84% số thiệt hại gia súc do bệnh tụ huyết trùng thuộc
về các tỉnh ở phía Nam. Đến những năm 90 phân bố địa lý của bệnh nghiêng
về các tỉnh phía Bắc, số địa phương có dịch tụ huyết trùng cũng tăng lên
nhiều, hàng năm có 20 – 25 tỉnh thông báo có bệnh lưu hành.
Ở nước ta khí hậu nóng ẩm, mỗi miền Bắc – Trung – Nam có điều
kiện khí hậu và hệ sinh thái khác nhau. Các tác giả (Nguyễn Vĩnh Phước,


5
1978 [24], Nguyễn Ngã, 1996 [20], Nguyễn Thiên Thu, 1996 [32]) đã nhận
định bệnh tụ huyết trùng trâu, bò xảy ra thường trùng với những cơn mưa ở
từng vùng và kéo dài đến hết mùa mưa.
Ngoài các đặc điểm dịch tễ, nhiều tác giả cũng đã đi sâu nghiên cứu

đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn P. multocida, phương pháp chẩn đoán,
phân lập và chế tạo vắc xin phòng bệnh.
Phan Thanh Phượng (1986 – 2000) [27] tiến hành nghiên cứu, chế tạo
và sử dụng vắc xin nhũ hoá bằng công nghệ lên men sục khí để phòng chống
bệnh tụ huyết trùng trâu, bò, lợn và gia cầm có nhiều ưu việt hơn vắc xin cũ.
Dương Thế Long (1995) [17] đã phân lập được vi khuẩn P. multocida
gây bệnh cho các loài vật nuôi (trâu, bò, lợn và gà) tại tỉnh Sơn La.
Nguyễn Ngã (1996) [20], Nguyễn Thiên Thu (1996) [32] đã phân lập
được vi khuẩn P. multocida từ trâu, bò mang trùng ở khu vực miền Trung và
xác định tính tương đồng kháng nguyên của các chủng vi khuẩn phân lập
được với chủng vắc xin Iran.
Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2007) [7] tiến hành nghiên cứu một
số đặc tính của vi khuẩn P. multocida phân lập từ trâu, bò, lợn.
1.2. Đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng
- Loài vật và tuổi mắc bệnh:
Trong tự nhiên hầu hết các loài gia súc, gia cầm, loài có vú hoang dại
và chim đều mẫn cảm với bệnh. Theo Lignieres (1900) [58] ít nhất có 6 dạng
bệnh khác nhau: ở gà, cừu, trâu, bò, lợn, ngựa và chó, cả 6 dạng bệnh này đều
thấy ở thỏ.
Bệnh thấy ở trâu, bò, lợn, thỏ, chó, mèo, hươu, ngựa, chồn, khỉ, dê và
cừu (Carter, 1959) [41]. Bệnh còn thấy ở bò rừng, nai, sơn dương, lợn rừng,
thỏ rừng, voi, lạc đà và báo tuyết ở Hymalaya (De Alwis, 1982) [45]. Nhiều
tác giả đã khẳng định: Nơi nào có bệnh tụ huyết trùng trâu, bò thì ở đó người


6
ta cũng phát hiện bệnh này ở động vật hoang dã. Theo De Alwis (1984) [46]
loài vật cảm nhiễm mạnh nhất đối với bệnh tụ huyết trùng là trâu và bò trong
đó trâu mẫn cảm hơn bò, từ kết quả nghiên cứu các ổ dịch tụ huyết trùng trâu,
bò ở Sri Lanka ông đã khẳng định điều đó. Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết của

các loài vật với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố
như mức độ cảm nhiễm của vùng, mức độ bùng nổ của các vụ dịch trước đó,
mức độ miễn dịch toàn đàn, đặc biệt phụ thuộc vào lứa tuổi mắc bệnh.
De Alwis (1984) [46] cũng cho biết mức độ cảm nhiễm của động vật non
mạnh hơn động vật già, ở trâu và bò tỷ lệ mắc bệnh ở lứa tuổi dưới 6 tháng là
3,5%, trong khi đó trâu, bò ở lứa tuổi từ 6 tháng đến 2 năm là 30 – 32%, ngược
lại trâu, bò trên 2 năm tuổi tỷ lệ mắc bệnh chiếm từ 3 – 5% toàn đàn.
- Mùa vụ phát bệnh:
Bệnh tụ huyết trùng phụ thuộc rất lớn vào thời tiết, khí hậu. Mustafa
và cs (1978) [60] nghiên cứu về ảnh hưởng của mùa vụ tới bệnh tụ huyết
trùng đã nhận xét bệnh thường liên quan tới điều kiện khí hậu ẩm ướt.
Mùa phát bệnh tụ huyết trùng ở các nước Châu Á tập trung vào các
tháng và mùa khác nhau trong năm. Ở Lào bệnh phát ra từ tháng 4 đến tháng
8; Ở Pakistan bệnh xảy ra rải rác quanh năm song thường từ tháng 4 đến
tháng 6 hàng năm (FAO, 1991) [50]. Ở đảo Java (Indonesia) bệnh xuất hiện
vào cuối mùa khô, đầu mùa mưa (Natalia và cs, 1992) [67], bệnh xảy ra các
tháng 8, 9 ở Malaysia (Yeo và Mukhtar, 1992) [79].
Yeo và Mukhtar (1992) [79] theo dõi dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu,
bò ở đảo Sabah, Malaysia từ 1983 – 1991 cho biết số lượng ổ dịch và số
lượng trâu, bò chết hàng năm ở các huyện rất khác nhau: Một số huyện xảy ra
dịch từ tháng giêng đến tháng 3, trong khi phần lớn lại xảy ra dịch từ tháng 7
đến tháng 11. Từ số liệu theo dõi của mình, tác giả đã so sánh giữa 2 vùng
trong cùng một đất nước về loài vật mắc bệnh, tuổi mắc bệnh, thời gian xảy ra


7
bệnh và cho rằng sở dĩ có sự khác nhau này là do điều kiện thời tiết khí hậu
có sự khác nhau giữa 2 vùng, đồng thời phương thức chăn nuôi giữa 2 vùng
cũng khác nhau. Từ những kết quả nghiên cứu trên cho thấy tại từng địa
phương, từng quốc gia khi nghiên cứu về dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu,

bò phải quan tâm đến điều kiện thời tiết, khí hậu và địa lý của từng vùng, vì
những yếu tố này ảnh hưởng tới sự tồn tại, phát triển của mầm bệnh trong môi
trường sinh sống của động vật cảm nhiễm.
Ở nước ta bệnh xuất hiện khắp nơi, có khi chỉ là những ổ dịch nhỏ, lác
đác. Nhưng bắt đầu vào mùa mưa, khí hậu nóng ẩm thì bệnh lây lan thành
dịch, bởi nhiệt độ, ẩm độ của mùa mưa tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát
triển của mầm bệnh (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [24]. Đặc biệt là sau những
trận mưa đầu mùa mang đến những thay đổi về sức khoẻ do gia súc bị lạnh, ở
những vùng ngập lụt, sau khi nước rút đi, cỏ bị ô nhiễm nên bệnh thường phát
sinh vào các tháng có mưa nhiều và chuyển mùa. Đoàn Thị Băng Tâm (1987)
[30], Dương Thế Long (1995) [17], Nguyễn Xuân Bình (1996) [1], Nguyễn
Thiên Thu (1996) [32], Đỗ Quốc Tuấn (2008) [34] đều cho rằng vào thời gian
mưa, bệnh xảy ra nhiều hơn. Bùi Quý Huy (1998) [10] cho biết ở miền Bắc
bệnh xảy ra quanh năm nhưng tập trung vào các tháng mưa nhiều từ tháng 7
đến tháng 9, ở miền Nam, bệnh xảy ra mạnh sau khi mưa và nắng từ tháng 4
đến tháng 10 (từ tháng 7 đến tháng 9, số ổ dịch chiếm tới 78% số ổ dịch trong
năm). Bùi Xuân Đồng (2000) [4] khi nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trâu, bò
ở Hải Phòng cho biết bệnh bắt đầu vào tháng 4, đỉnh cao là tháng 6, 7. Theo
Bùi Văn Dũng (2000) [2] ở Lai Châu bệnh tụ huyết trùng xảy ra quanh năm
nhưng tập trung vào tháng 3, 4, 7, 8 hàng năm, vào cuối mùa khô, đầu mùa
mưa. Cao Văn Hồng (2002) [8] cho biết mùa dịch tụ huyết trùng ở Đăk Lăk
từ tháng 5 đến tháng 9, đây là những tháng mưa nhiều. Theo Hoàng Đăng
Huyến (2004) [11] bệnh tụ huyết trùng xảy ra ở Bắc Giang từ tháng 4 đến


8
tháng 9 hàng năm, thời gian này đang là mùa mưa. Nguyễn Đăng Minh
(2005) [19] cũng cho biết: Bệnh tụ huyết trùng xảy ra rải rác quanh năm tập
trung từ tháng 3 đến tháng 8, vào các tháng đầu mùa mưa của vụ hè thu, cao
nhất là tháng 5, 6, đây là các tháng nắng, nhiệt độ cao, mưa nhiều.

- Vùng phát bệnh
Các nghiên cứu đều cho thấy bệnh tụ huyết trùng thường xảy ra ở
những vùng đất trũng, khí hậu nóng và ẩm ướt. Theo Phan Đình Đỗ và Trịnh
Văn Thịnh (1958) [3] bệnh thường xảy ra ở vùng ẩm thấp, khí hậu nóng ẩm,
mưa nhiều. Đặc biệt ở những vùng đất trũng, ẩm thấp, lầy lội, bị ngập lụt, có
nhiều ruộng nước, nhiều kênh rạch, vùng có địa hình phức tạp, trình độ dân trí
thấp bệnh thường xảy ra và lây lan mạnh làm chết nhiều gia súc (Võ Văn
Hùng, 1997) [9]. Năm 1990 riêng ba tỉnh Sơn La, Hoàng Liên Sơn, Bắc Thái
số ổ dịch tụ huyết trùng gia súc chiếm 60% và trong đó có tới 70% số gia súc
chết so với toàn miền Bắc (Bùi Quý Huy, 1998) [10]. Đỗ Văn Được (2003)
[5] cho biết ở Lạng Sơn vùng núi đất, có độ dốc lớn, nhiệt độ thấp, ẩm độ cao,
tập quán chăn nuôi còn lạc hậu, chăn thả tự do thì tỷ lệ bị nhiễm bệnh và chết
cao. Theo Hoàng Đăng Huyến (2004) [11] ở Bắc Giang những vùng đồi núi
thấp tỷ lệ mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng cao. Nguyễn Văn Minh (2005)
[19] thông báo ở Hà Tây tỷ lệ trâu, bò ốm chết vì bệnh tụ huyết trùng ở vùng
đồi, bán sơn địa cao hơn so với vùng chiêm trũng và vùng đồng bằng.
Ở những vùng mà phương thức chăn nuôi còn thả rông, không có
người chăm sóc, không làm chuồng nuôi nhốt, để gia súc ở những nơi bùn
lầy, ngập nước, vệ sinh, chăm sóc, nuôi dưỡng kém thì khả năng xảy ra bệnh
cao. Ngoài ra, trình độ dân trí thấp, nhận thức của người dân về công tác
phòng chống bệnh chưa cao, việc áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào việc
phòng chống dịch bệnh còn nhiều khó khăn… cũng không tránh khỏi việc
dịch bệnh thường xuyên xảy ra.


9

- Cách lây lan
Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2008) [15], bệnh tụ huyết trùng trâu bò lây
truyền theo các con đường sau: Bệnh trực tiếp lây lan từ súc vật bệnh sang súc

vật khỏe thông qua tiếp xúc, chung đụng dụng cụ chăn nuôi, nguồn thức ăn,
nước uống, nhốt cùng chuồng, chăn cùng bãi chăn thả.
Bệnh có thể lây lan xa do việc mổ thịt súc vật ốm, phân tán thịt, da.
Chó, mèo, chuột và một số côn trùng hút máu như ruồi, mòng… cũng có thể
là vật môi giới truyền mầm bệnh đi xa.
- Hiện tượng mang vi khuẩn P. multocida ở đường hô hấp trên của
động vật khoẻ
Từ khi phát hiện bệnh tụ huyết trùng do P. multocida gây ra đến nay
đã hơn 100 năm, có khá nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn P.
multocida, về bệnh học Pasteurellosis và vắc xin tiêm phòng nhưng vẫn
không loại trừ và thanh toán được bệnh, đặc biệt là những nước nhiệt đới,
bệnh tụ huyết trùng vẫn là mối đe doạ người chăn nuôi.
Hiện tượng mang vi khuẩn P. multocida ở động vật đã được nhiều nhà
khoa học nghiên cứu. Mustafa và cs (1978) [60] đã tiến hành lấy dịch ngoáy
mũi trâu, bò để phân lập P. multocida và có nhận xét: Thường ở nơi không có
dịch tụ huyết trùng trâu, bò thì tỷ lệ trâu, bò khoẻ mang trùng là 3%, còn ở nơi
có dịch tụ huyết trùng thì tỷ lệ mang trùng là 44,4%.
Gupta (1980) [51] nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng tại Ấn Độ thấy tỷ lệ
mang trùng ở trâu, bò khoẻ ở vùng không có dịch là 0%, ở vùng ít xảy ra dịch
là 1,9% còn ở vùng dịch hay xảy ra là 5 – 6%. Ngay ở các vùng có dịch thì tỷ
lệ mang trùng ở đàn trâu, bò khoẻ mạnh cũng giảm dần theo thời gian sau khi
dịch chấm dứt.
Nguyễn Vĩnh Phước (1986a) [25] cho biết tỷ lệ mang trùng ở đường
hô hấp trên ở trâu, bò khoẻ các tỉnh phía Nam là 5,61%. Ở miền Trung, Tây


10
Nguyên là 1 – 9,4%, tương tự như ở trâu, bò thì có 4,1% tỷ lệ lợn khoẻ mang
vi khuẩn Pasteurella.
Theo Phan Thanh Phượng (1994) [28] khi gia súc mang vi khuẩn

Pasteurella hoặc nó sẽ gây bệnh ngay cho vật chủ khi vật chủ chịu tác động
của các yếu tố stress làm cho sức đề kháng của cơ thể giảm hoặc nó sẽ tồn tại
ở đường hô hấp của vật chủ.
Cao Văn Hồng (2002) [8] cho biết tỷ lệ trâu, bò và lợn khoẻ mang P.
multocida ở đường hô hấp khi điều tra ở Đăk Lăk là 14,79% và 11,61% và
sau 6 tháng có dịch thì tỷ lệ này lên tới 21,43%.
1.3. Mầm bệnh
Giống Pasteurella có nhiều loài, căn cứ vào tính chất gây bệnh cho
các loài động vật, người ta chia giống Pasteurella thành 3 loài, trong đó loài
gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là Pasteurella multocida và với
từng giống gia súc, gia cầm khác nhau bệnh tụ huyết trùng lại do các serotype
khác nhau gây ra.
Theo phân loại của Bergey (1984) [38 ], Pasteurella multocida thuộc:
- Bộ (order) Eubacteriales
- Họ (family) Parvobacteriaceae
- Tộc (tribe) Pasteurellaceae
- Giống (genus) Pasteurella
- Loài (species) Pasteurella multocida
Trước đây Pasteurella multocida có tên là Pasteurella boviseptica,
Pasteurella suiseptica, Pasteurella aviseptica,… tùy thuộc vào ký chủ đầu
tiên của vi khuẩn phân lập được. Và cuối cùng tên gọi đã được thống nhất là
Pasteurella multocida.


11
Bảng 1.1. Tóm tắt danh pháp của P. multocida
Tác giả

Năm

Tên

Bollinger

1879

-

Pasteur

1880

-

Burril

1883

Micrococcus gallicidus

Zopf

1885

Micrococcus Cholerae-gallinarum

Kitt

1885

Bacterium bipolare multocidium

Oreste and Armani

1887

Bacillus septicaemia

Trevisan

1887

Pasteurella Cholerae-gallinarum

Lehmann and Neumann

1889

Bacterium multocidium

Stemberg

1893

Bacterium septicaemia haemorrhagicae

Lignieres

1900

According to host species:
Pasteurella aviseptica
Pasteurella boviseptica
Pasteurella suiseptica
Etc

Topley và Wilson

1929

Pasteurella septica

Rosenbuch và Merchant

1939

Pasteurella multocida

Nguồn: Namioka (1978) [62].
1.3.1. Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu
P. multocida là vi khuẩn Gram âm, có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, hình
trứng hoặc hình bầu dục, với kích thước vào khoảng: 0,25-0,4 x 0,4-1,5 µm.
Mức độ đa hình thái của P. multocida cũng cần được chú ý trong các canh
khuẩn già: Vi khuẩn có dạng trực khuẩn với chiều dài rất khác nhau và có sự


12
thay đổi ở các loài ký chủ khác nhau 0,5–1 × 1–2 µm (lợn), 0,2—0,4 x 0,6—
2,5µm (gia cầm).
Theo Carter (1967) [43] có mối liên quan về tính đa dạng của vi khuẩn

khi phát triển trong điều kiện thiếu O2. Vi khuẩn thường đồng nhất trong máu
động vật. Trong môi trường nhân tạo vi khuẩn thường đa hình dạng, hình
trứng, hình cầu... Tác giả còn nhận thấy khi nuôi cấy nhiều lần trong môi
trường nhân tạo, chiều dài của vi khuẩn tăng lên.
Trong cơ thể gia súc mắc bệnh hoặc nuôi cấy trong môi trường có
huyết thanh hoặc máu vỡ, vi khuẩn hình thành giáp mô nhưng khi nhuộm khó
thấy. Khi nhuộm tiêu bản bệnh phẩm, P. multocida bắt màu xẫm ở hai đầu,
còn ở giữa không bắt màu hoặc bắt màu nhạt hơn so với hai đầu nên người ta
gọi P. multocida là vi khuẩn lưỡng cực. Nguyên nhân này là do nguyên sinh
chất của vi khuẩn dồn về 2 đầu.
Trong canh khuẩn vi khuẩn có hình trứng, hình cầu đứng riêng lẻ hay
thành chuỗi ngắn. Trong canh khuẩn già vi khuẩn suy yếu, biến dạng thay đổi
hình thái như hình gậy dài, dùi cui, quả đấm, kích thước lớn hơn bình thường,
có khi dài 2-3 µm. Vi khuẩn không có lông, không di động không hình thành
nha bào.
Pasteurella dễ nhuộm với thuốc nhuộm thông thường như Anilin,
Methylen Bleu, Fuchsine và Giemsa.
1.3.2. Đặc tính nuôi cấy
P. multocida là vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ tiện, ưa kiềm nhẹ
(PH = 7,2 – 7,4), có thể nuôi cấy ở nhiệt độ từ 13°C đến 38°C, thích hợp nhất
là ở nhiệt độ 37°C.
Trên các môi trường nuôi cấy thông thường vi khuẩn phát triển kém. Vi
khuẩn phát triển tốt hơn trên môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm 5-10%
huyết thanh hoặc máu động vật.


13
Trên môi trường nước thịt: Sau khi cấy 24 giờ ở nhiệt độ 37oC vi
khuẩn làm đục môi trường, đáy ống có cặn nhầy, lắc có hiện tượng vẩn như
sương mù rồi lại mất, có khi sinh ra một màng mỏng trên mặt môi trường.

Môi trường có mùi đặc biệt giống mùi tanh của nước dãi khô. Theo Carter,
(1952) [39] mùi tanh đặc trưng rõ nhất ở pha phát triển nhanh, để lâu mùi tanh
giảm dần (trong môi trường nước thịt P. multocida phát triển theo 4 pha: Pha
chậm, pha phát triển nhanh, pha cân bằng và pha suy thoái).
Trên môi trường thạch thường: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S,
nhỏ long lanh như giọt sương, mặt khuẩn lạc vồng. Nuôi cấy lâu khuẩn lạc có
màu trắng ngà dính vào môi trường.
Theo Carter (1955) [40], Namioka và Murata (1961a, b) [63], [64]
trên môi trường thạch P. multocida tạo thành 3 dạng khuẩn lạc:
+ Khuẩn lạc dạng S (Smooth): Có rìa gọn, bóng láng, có dung quang
mạnh và có độc lực mạnh.
+ Khuẩn lạc dạng M (Mucoid): Nhầy, ướt, có kích thước lớn nhất, bề
mặt khuẩn lạc ẩm ướt, có dung quang yếu, độc lực trung bình.
+ Khuẩn lạc R (Rough): Có rìa xù xì, thường không có dung quang,
độc lực yếu.
Tính biến dạng của vi khuẩn này rất lớn khi cấy chuyển qua môi
trường dinh dưỡng nhiều lần hoặc tiêm qua động vật. Từ dạng S chúng có thể
chuyển sang dạng R hoặc M và ngược lại. Tính biến dạng này đặc biệt rõ khi
nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng có các loại đường mà chúng
lên men. Trong những môi trường đó chúng xếp thành từng chuỗi.
Trên môi trường thạch máu hay BHI có bổ sung máu: Vi khuẩn phát
triển mạnh, không gây dung huyết, kích thước khuẩn lạc lớn hơn trên môi
trường thạch thường, có màu tro xám, hình giọt sương và có mùi tanh nước
dãi khô rất đặc trưng cho vi khuẩn tụ huyết trùng.


14
Theo Namioka và Murata (1961c) [65] YPC (Yeast extract Pepton - L
- Cystin) có thêm Sucrose và Sodium sulfite là môi trường nuôi cấy tốt nhất
cho vi khuẩn P. multocida, môi trường giúp cho sự tái tạo giáp mô của vi

khuẩn và cũng là môi trường phân lập, giữ giống và nhân giống.
Trên môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố: Đây là môi
trường đặc biệt dùng để phân lập, giám định và xác định độc lực của vi khuẩn
Pasteurella. Trên môi trường này vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc
đặc biệt, có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển
vi có hai thị kính với độ phóng đại thấp (khoảng 20 lần) và góc phản quang
của ánh sáng đèn điện là 45o. Những khuẩn lạc dạng S từ canh trùng thường
mới có tính dung quang. Khuẩn lạc dạng M và R không có đặc điểm nói trên.
Tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh quang của khuẩn lạc
khác nhau:
+ Nếu vi khuẩn có độc lực cao: Khuẩn lạc có màu xanh lơ, xanh lá mạ
chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 1/3 diện tích khuẩn lạc là màu
vàng kim loại, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent).
+ Nếu vi khuẩn có độc lực vừa: Khuẩn lạc màu xanh lơ ít hơn diện
tích màu vàng da cam, khuẩn lạc loại này là Fo (Orange Fluorescent).
+ Nếu vi khuẩn có độc lực yếu: Khuẩn lạc của chúng không có hiện
tượng phát quang, khuẩn lạc loại này là Nt (Not Fluorescent). Khuẩn lạc nhỏ
tròn trong.
Hiện tượng phát huỳnh quang của khuẩn lạc xem rõ khi nuôi cấy sau
24 giờ. Nếu để lâu sau 72 giờ thì huỳnh quang sẽ mất đi. Theo Smith (1990)
[77] đặc tính dung quang này còn có quan hệ chặt chẽ với sự tạo vỏ của vi
khuẩn tụ huyết trùng. Dựa vào tính chất này, có thể chọn những chủng tụ
huyết trùng có tính kháng nguyên và miễn dịch cao.
Như vậy, vi khuẩn tụ huyết trùng có thể phát triển trên nhiều loại môi
trường, song có một số loại môi trường được các tác giả cho là thích hợp để