khảo sát tập đoàn đậu tương kháng virus khảm vàng lá bằng chỉ thị phân tử dna

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐINH THỊ THU NGẦN

KHẢO SÁT TẬP ĐOÀN ĐẬU TƯƠNG KHÁNG VIRUS
KHẢM VÀNG LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60 42 02 01

Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phan Hữu Tôn

HÀ NỘI, NĂM 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự giúp đỡ tận tình
của thầy giáo hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực và
chưa được sử dụng trong bất kỳ công bố nào trước đây.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn đều đã được ghi rõ nguồn gốc,
đảm bảo trích dẫn theo đúng quy định.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!
Hà Nội, ngày

tháng năm 2015

Tác giả

Đinh Thị Thu Ngần

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS
Phan Hữu Tôn, người đã tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Sinh học phân tử
và Công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông Nghiệp
Việt Nam và các thầy giáo, các cô giáo Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông
Nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các bạn bè, gia đình và người thân đã nhiệt
tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn chỉnh luận văn
tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng năm 2015

Tác giả

Đinh Thị Thu Ngần

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục chữ viết tắt

v

Danh mục bảng

vi

Danh mục hình ảnh

vii

Trích yếu luận văn

viii

Thesis abstract

ix

Phần 1 Mở đầu

1

1.1

Tính cấp thiết của đề tài

1

1.2

Giả thiết khoa học

1

1.3

Mục tiêu nghiên cứu

2

1.4

Phạm vi nghiên cứu

2

1.5

Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn

2

Phần 2 Tổng quan tài liệu

4

2.1

Cây đậu tương

4

2.1.1

Nguồn gốc

4

2.1.2

Đặc điểm cây đậu tương

5

2.2

Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam

6

2.2.1

Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương trên thế giới

6

2.2.2

Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương tại Việt Nam

7

2.3

Bệnh trên cây đậu tương

9

2.4

Bệnh khảm vàng lá đậu tương

10

2.5

Nghiên cứu chọn tạo giống kháng bệnh virus khảm lá đậu tương

12

2.5.1

Các gen kháng bệnh khảm lá đậu tương

12

2.5.2

Các loại chỉ thị phân tử DNA

13

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

17

3.1

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

17

3.2

Thời gian nghiên cứu

17

3.3

Đối tượng nghiên cứu

17

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


3.4

Nội dung nghiên cứu

17

3.5

Phương pháp nghiên cứu

17

3.5.1

Phương pháp khảo sát tập đoàn

17

3.5.2

Đánh giá tính kháng bệnh và ứng dụng chỉ thị phân tử DNA xác định gen kháng.

22

3.5.3

Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR

23

Phần 4 Kết quả và thảo luận

26

4.1

Kết quả nghiên cứu

26

4.1.1

Đặc điểm nông sinh học các mẫu giống đậu tương

26

4.1.2

Kết quả PCR phát hiện gen kháng khảm lá Rsv1 và Rsv3

56

4.1.3

Đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu giống đậu tương

58

4.2

Thảo luận

60

Phần 5 Kết luận và đề nghị

62

5.1

Kết luận

62

5.2

Đề nghị

62

Tài liệu tham khảo

63

Phụ lục

69

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt
Amplified Fragment Length Plymorphism - Đa hình chiều dài các

AFLP

đoạn DNA được nhân bản chọn lọc

BYMV

Bean yellow mosaic virus

CNSH

Công nghệ sinh học

ĐC

Đối chứng

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

NN&PTNT

Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn

NSLT

Năng suất lý thuyết

NST

Nhiễm sắc thể

NSTT

Năng suất thực thu

PCR

Polymerase Chain Reaction - phản ứng khuếch đại gen
Randomly Amplified Polymosphic DNA - sự đa hình của các đoạn

RAPD

DNA khuyếch đại ngẫu nhiên
Restriction Fragme Length Polymorphism - Đa hình chiều dài đoạn

RFLP

cắt giới hạn

RNA

Axít ribonucleic

SMV

Soybean mosaic virus

SSR

Simple Sequence Repeats - Sự lặp lại của trình tự đơn giản

TB/cây

Trung bình/cây

TGST

Thời gian sinh trưởng

TT

Thứ tự

USDA

United States Department of Agriculture - Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

6

Bảng 2.2 Sản lượng đậu nành Việt Nam

8

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu giống đậu tương đánh giá đa dạng di truyền

24

Bảng 3.2 Các mồi của phản ứng SSR đánh giá đa dạng các giống đậu tương

24

Bảng 4.1 Một số đặc điểm hình thái các mẫu giống đậu tương

26

Bảng 4.2 Tỷ lệ mọc mầm và thời gian mọc của các mẫu giống đậu tương

33

Bảng 4.3 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển mẫu giống đậu tương

36

Bảng 4.4 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất

42

Bảng 4.5 Các chỉ tiêu chất lượng hạt của các mẫu giống đậu tương

49

Bảng 4.6 Mức độ sâu bệnh, khả năng chống chịu với điều kiện bất thuận

50

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1 Cây đậu tương

5

Hình 2.2 Các bệnh hại phổ biến trên cây đậu tương

9

Hình 2.3 Lá cây đậu tương bị khảm vàng

10

Hình 2.4 Potyvirus, SMV.

11

Hình 2.5 Rệp muội Aphis gossypii

11

Hình 3.1 Bộ chưng cất đạm Kjeldahl và Soxhlet

22

Hình 4.1 Màu sắc hoa các giống đậu tương

31

Hình 4.2 Màu sắc lá của các giống đậu tương

31

Hình 4.3 Màu sắc vỏ hạt và rốn hạt đậu tương

32

Hình 4.4 Lá cây đậu tương bị bệnh khảm lá

55

Hình 4.5 Điện di sản phẩm PCR với mồi Sat_154 phát hiện gen Rsv1, ladder. 1000 bp

57

Hình 4.6 Điện di sản phẩm PCR với mồi Satt569 phát hiện gen Rsv3, ladder. 1000 bp

58

Hình 4.7 Phổ điện di sản phẩm PCR của cặp mồi SSR

59

Hình 4.8 Sơ đồ hình cây phân loại các mẫu giống đậu tương.

59

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Bệnh virus khảm lá đậu tương (SMV) là một trong những bệnh nguy hại nhất
đối với ngành sản xuất đậu tương ở Việt Nam. Để phòng trừ bệnh hại thì biện pháp có
hiệu quả nhất là chọn tạo và sử dụng giống kháng. Để chọn tạo giống thành công thì
nguồn gen đóng vai trò quyết định. Trong nghiên cứu này, 150 mẫu giống đậu tương đã
được khảo sát, đánh giá về các đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng. Đồng
thời, phát hiện khả năng chứa gen kháng Rsv1 và Rsv3 của các mẫu giống đậu tương
bằng chỉ thị phân tử DNA. Sử dụng 5 cặp mồi đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống
đậu tương chứa gen kháng bệnh nhờ chỉ thị phân tử SSR. Kết quả, chúng tôi đã tuyển
chọn được 11 mẫu giống đậu tương triển vọng có thời gian sinh trưởng ngắn (81-83
ngày), cho năng suất cao như FC 31745 (20,7 tạ/ha), FC 31952 (15,1 tạ/ha), có hàm
lượng protein cao (từ 32,23 - 41,88%) và lipit cao (PI 88447 đạt 23,2%), đồng thời có
gen kháng bệnh khảm lá gồm: FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI 89471, PI 68706,
PI 171434, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449, FC 02109, để từ đó có thể dùng
làm vật liệu hoặc đưa ra sản xuất. Đã xác định được 25 mẫu giống mang gen Rsv1 trong
đó có mẫu giống FC 02109, PI 68706, PI 171434 và 47 mẫu giống mang gen Rsv3 trong
đó có FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI 89471, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI
86449. Nghiên cứu đa dạng di truyền 30 mẫu giống đậu tương chia thành hai nhóm lớn,

có khoảng cách di truyền giữa hai nhóm là 0,74. Trong đó, mẫu giống PI 567627B và PI
567767B có nguồn gốc gần nhau. Các mẫu giống PI 68706, PI 88447 và PI 89471, PI
86449 có quan hệ xa về mặt di truyền so với các giống khác. Đây chính là nguồn vật
liệu lai tạo quan trọng cho chương trình chọn giống trong tương lai.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii


THESIS ABSTRACT
Soybean mosaic virus (SMV) is one of the most dangerous diseases to soybean
production industry in Vietnam. In order to prevent this disease, selection, breeding and
use of resistant varieties are the most effective ways. For successful selection and
breeding, the gene plays a decisive role. In this study, 150 samples soybeans were
surveyed and assessed in terms of agricultural biological characteristics, yield and
quality. Also, Rsv1 and Rsv3 resistance genes of soybean samples were detected by
using DNA molecular markers. Five primers, which assess the genetic diversity of
soybean samples containing resistance genes thanks to molecular marker SSR, were
used. Finally, we have selected 11 potential soybean samples with short growth period
(81-83 days), high yields such as FC 31745 (20.7 kg / ha), FC 31952 (15.1 kg/ha), high
protein content (from 32.23 to 41.88%) and high lipid content (PI 88447 has 23.2%),
and containing mosaic disease - resistance genes such as FC 31745, FC 31952, PI
567767B, PI 89 471, PI 68706, PI 171434, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449,
FC 02109, which could be used as material or put into production. We has identified 25
samples containing Rsv1 gene such as FC 02109, PI 68706, PI 171434 and 47 samples
containing Rsv3 gene such as FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI 89471, PI 423740,
PI 88447, PI 157437, PI 86449.The study of genetic diversity of 30 soybean samples is
divided into two large groups withthe genetic distance between the two groups of 0.74.
Of which, PI 567627B and PI 567767B samples are close in term of origin. PI 68706, PI

88447 and PI 89471, PI 86449 samples showed the relatively difference ingenetics
compared with other breeds. This is an important source of breeding materials for future
selection and breeding.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ix


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Đậu tương (Glycine max), một loại cây họ Đậu (Fabaceae), là loài bản địa
của Đông Á. Đậu tương là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây
đậu ăn hạt, đứng trước lạc và đậu xanh. Đậu tương giàu hàm lượng chất đạm
protein, được trồng để làm thức ăn cho người và gia súc. Ngoài ra, đậu tương còn
là một trong những mặt hàng xuất khẩu, và cũng chính là cây trồng có vị trí quan
trọng trong nền nông nghiệp của nhiều nước, trong đó có Việt Nam. Cây đậu
tương là cây thực phẩm có hiệu quả kinh tế lại dễ trồng. Mặt khác, cây đậu tương
còn có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác. Điều này có được
là do hoạt động cố định N2 của loài vi khuẩn Rhizobium cộng sinh trên rễ cây họ
Đậu (Riaz and Mian N.,2006).
Tuy nhiên, hiện nay năng suất và sản lượng đậu tương ở nước ta thấp là do
nhiều giống hiện trồng có tính ổn định chưa cao, sức biến động khá lớn giữa các
vùng, miền. Khả năng kháng virus và sâu bệnh của các giống đậu tương đang
trồng là rất thấp.
Đậu tương là cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, như bệnh virus khảm
lá (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng hại đậu tương (Bean yellow
mosaic virus - BYMV), bệnh xoăn lá và một số bệnh virus trên lá khác. Theo kết
quả điều tra về bệnh của Cục Bảo vệ thực vật trên cây trồng, đã xác định 20 loài
bệnh hại, trong đó bệnh do nhiễm virus đã gây tổn thất lớn cho năng suất đậu

tương và hiện nay vẫn chưa có biện pháp hiệu quả để phòng trừ hiệu quả. Vì vậy,
nghiên cứu chọn tạo cây đậu tương kháng virus là rất cần thiết.
1.2. GIẢ THIẾT KHOA HỌC
Bệnh khảm lá đậu tương phân bố rộng khắp và gây thiệt hại lớn đến năng
suất và chất lượng sản phẩm. Bệnh do virus SMV gây lên, virus lan truyền qua
rệp muội, bọ trĩ làm môi giới. Sự lan truyền cây bệnh sang cây khoẻ do rệp muội
ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu, bệnh còn truyền qua hạt. Hiện nay các biện pháp
phòng bệnh phổ biến là: Chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh đồng
ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt trừ côn
trùng truyền bệnh.
Tuy nhiên, các biện pháp truyền thống thường phức tạp, tốn thời gian,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


hiệu quả không cao và kém bền vững. Biện pháp hiệu quả nhất để phòng virus là
chọn tạo giống kháng virus. Để chọn tạo giống thành công phải có nguồn gen,
đánh giá các đặc điểm nông sinh học, dùng chỉ thị phân tử DNA phát hiện khả
năng chứa gen kháng. Lai tạo và ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen
kháng trong quần thể phân ly để xác định giống có nguồn gen kháng hữu hiệu
nhanh và chính xác. Vậy, cần khảo sát tập đoàn đậu tương bằng chỉ thị phân tử
để chọn tạo giống kháng bệnh.
Từ những lí do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát tập đoàn đậu
tương kháng virus khảm vàng lá bằng chỉ thị phân tử DNA”.
1.3. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Chọn lọc ra các mẫu giống đậu tương vừa có năng suất cao, chất lượng tốt
vừa có khả năng kháng bệnh vius khảm lá để từ đó có thể dùng làm vật liệu hoặc
đưa ra sản xuất.

1.4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
-

Trồng và đánh giá các đặc điểm nông sinh học, năng suất và các yếu tố

cấu thành năng suất của 150 mẫu giống tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển
nguồn gen cây trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Đánh giá chất lượng 28
mẫu giống đậu tương.
-

Phát hiện sự có mặt gen Rsv1 và Rsv3 khánh bệnh khảm lá của các mẫu

giống đậu tương.
-

Đánh giá đa dạng di truyền 30 mẫu giống đậu tương có chứa gen kháng

bệnh nhờ chỉ thị phân tử SSR.
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1 đến tháng 12 năm 2015.
1.5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
1.5.1. Những đóng góp mới
-

Đề tài đã tuyển chọn được 11 giống đậu tương có năng suất cao, chất

lượng tốt, có gen kháng bệnh khảm lá là: FC 31745, FC 31952, PI 567767B, PI
89471, PI 68706, PI 171434, PI 423740, PI 88447, PI 157437, PI 86449, FC 02109.

-

Xác định được sự có mặt của gen kháng Rsv1 và Rsv3 của các mẫu giống

đậu tương.
-

Xác định được đa dạng di truyền, khoảng cách di truyền của các mẫu giống.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


1.5.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Kết quả đề tài là cơ sở cho việc chọn tạo được giống đậu tương có gen
kháng bệnh virus khảm lá và có năng suất cao, chất lượng tốt.
- Xác định được nguồn gen kháng bệnh virus khảm lá làm vật liệu cho
chọn tạo giống đậu tương.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG
2.1.1. Nguồn gốc
Đậu tương (tên khoa học Glycine max (L) Merrill) là một trong những cây
trồng loài người đã biết, sử dụng và trồng từ lâu. Đậu tương được thuần hóa từ
đậu tương dại Glycine Soja Sieb và Zucc, đậu tương có số NST 2n=40, thuộc họ

đậu Fabaceae, họ phụ Faboideae, tộc Phaseoleae, chi Glycine Willd, Glycine
bao gồm 2 chi phụ là Glycine và Soja. Cây đậu tương là loài bản địa của Đông Á,
có nguồn gốc từ Trung Quốc, được thuần hóa và trồng từ triều đại Shang (17001100 trước công nguyên). Sau đó, đậu tương được phát tán đến các nước Châu Á
như Hàn Quốc, Nhật Bản, Indonesia, Philipines, Ấn Độ, Thái Lan, Nepal và Việt
Nam. Đến thế kỷ 16-17, đậu tương được du nhập vào Châu Âu và Bắc Mỹ
(Singh, R.j and T Hymowitz, 1999).
Cây đậu tương là cây thực phẩm có hiệu quả kinh tế lại dễ trồng. Đây là
loại cây trồng quan trọng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị cải tạo đất. Đậu tương
giàu hàm lượng chất đạm protein, được trồng để làm thức ăn cho người và gia
súc. Trong hạt đậu tương có các thành phần dinh dưỡng cao như protein (3040%), lipid (12-25%), glucid (10-15%); có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K,
Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose. Protein
đậu tương có đủ các acid amin cơ bản isoleucin, leucin, lysin, methionin,
phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, đậu tương còn là một nguồn cung cấp
protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các amino acid không thay thế cần
thiết cho cơ thể người.
Sản phẩm đậu tương được lưu hành trên thế giới chủ yếu dưới 3 dạng: hạt,
dầu và bột. Đậu tương là loại cây lấy dầu giữ vai trò quan trọng hàng đầu trên thế
giới. Dầu đậu tương được sử dụng làm thực phẩm như dầu rán, salat. Trong công
nghiệp, dầu đậu tương còn được sử dụng làm xi, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo,
cao su nhân tạo, len nhân tạo, … Bên cạnh dầu đậu tương thì bột đậu tương cũng
là sản phẩm tham gia trong nhiều mặt hàng hóa khác nhau. Bột đậu tương là
thành phần quan trọng trong khẩu phần thức ăn. Hạt đậu tương có thể chế biến
thành nhiều loại thực phẩm khác nhau như các loại thức ăn như đậu phụ, tương,
sữa đậu nành…

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4

2.1.2. Đặc điểm cây đậu tương

Hình 2.1: Cây đậu tương
Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, lấy hạt và thuộc nhóm cây
hàng năm.Về thời gian sinh trưởng của đậu tương được chia làm 3 loại: nhóm
ngắn ngày thời gian sinh trưởng từ 75 - 85 ngày; nhóm trung ngày thời gian sinh
trưởng từ 85 - 100 ngày, nhóm dài ngày thời gian sinh trưởng từ 100 - 120 ngày.
Đậu tương là loại rễ cọc, gồm rễ chính và các rễ bên. Rễ tập trung ở tầng
đất mặt 30-40 cm, ăn lan khoảng 20-40 cm. Trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi
khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm (Ngô Thế Dân và
cs.,1999). Thân cây đậu tương ít phân cành, cây thảo, dạng bụi, có hình trụ, nhiều
lông, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi dạng bò hay nửa bò. Cành đậu
tương mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá mầm,
đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang một lá
kép. Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, hoa được phát sinh từ nách lá,
đầu cành hoặc đầu thân. Hoa thuộc hoa cánh bướm, mọc thành chùm, có màu tím
hay trắng, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào
giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ (Ngô
Thế Dân và cs., 1999; Nguyễn Danh Đông, 1971). Quả đậu tương là loại quả ráp,
bên ngoài vỏ quả thường có lớp lông bao phủ, màu sắc vỏ khi chín có màu vàng
hoặc xám đen. Quả thẳng hoặc hơi cong. Mỗi quả thường có từ 1 - 4 hạt nhưng
phổ biến là 2 hạt. Hạt đậu tương có nhiều hình dạng như bầu dục, tròn dài, tròn
dẹt. Vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen…

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


nhưng đa số là hạt màu vàng. Khối lượng hạt dao động từ 200 - 400 mg/hạt và

khối lượng 1000 hạt dao động trung bình 100-200g. Hình dạng và màu sắc rốn
hạt là dấu hiệu đặc trưng cho mỗi giống đậu tương (Ngô Thế Dân và cs., 1999;
Nguyễn Danh Đông, 1971).
2.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT ĐẬU TƯƠNG TRÊN
THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
2.2.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương trên thế giới
Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu
cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật (Tổng cục thống
kê, 2010). Bên cạnh đó cây đậu tương cũng được coi là một thành phần quan
trọng trong hệ thống canh tác về phương diện sinh thái. Do có khả năng cố định
đạm, đậu tương ít bị phụ thuộc vào phân đạm hơn so với các loài cây trồng khác.
Hơn thế, nó còn có khả năng cố định nitơ và cung cấp nguồn đạm cho cây trồng
vụ sau. Vì thế đậu tương trở thành cây trồng quan trọng trong luân canh và trồng
xen ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới.
Trên thế giới, diện tích và sản lượng đậu nành tăng lên rất nhanh trong
vòng 5 năm qua. Năm 2011, diện tích cây trồng ứng dụng công nghệ sinh học
trên toàn cầu đạt 140 triệu ha, trong đó đậu nành chiếm gần 60%. Theo FAO
2013, diện tích trồng đậu nành năm 2013 trên thế giới chiếm 111,27 triệu ha,
năng suất bình quân 24,84 tạ/ha, sản lượng đạt 276,41 triệu tấn, tăng 14,40 triệu
ha và 45,46 triệu tấn so với năm 2008 (Bảng 2.1).
Bảng 2.1: Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới
Năm

Diện tích (triệu ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

2008

2009
2010
2011
2012
2013

96,87
99,01
102,62
103,60
106,62
111,27

23,84
22,55
25,83
25,29
23,74
24,84

230,95
223,26
265,05
262,04
253,14
276,41

Nguồn: FAO Statistic Database, 2013.

Đây là một trong những cây trồng mang tính chiến lược đối với những

quốc gia có điều kiện phát triển vì có giá trị trao đổi rất cao trên thị trường do
nhu cầu sử dụng protein, dầu thực vật, thực phẩm chức năng và nguyên liệu thức
ăn chăn nuôi gia súc ngày càng gia tăng. Năng suất và hàm lượng protein là chỉ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


tiêu phản ánh tiến bộ nghiên cứu về đậu nành trên thế giới. Dự báo diện tích
trồng đậu nành trên thế giới có thể tăng nhiều vào cuối thập kỷ này do chính sách
quản lý và thương mại của các quốc gia, đặc biệt trong hoàn cảnh ngày càng có
nhiều quốc gia sử dụng các giống được cải tiến thông qua chỉ thị phân tử, biến
đổi gen (Clive James, 2011). Diện tích đậu nành trên thế giới, tập trung chủ yếu ở
Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Argentina, Ấn Độ, trong đó nước Mỹ thường chiếm 1/3
diện tích đậu nành hằng năm (31 triệu ha). Trong khu vực châu Á, diện tích đậu
nành Việt Nam đang được tăng dần, đã vượt qua Myanmar và đang đứng thứ 4
sau các nước Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên (Faostat, 2012).
Mặc dù chọn giống truyền thống đã góp phần tạo ra các giống đậu tương
mới làm tăng năng suất cải thiện chất lượng sản phẩm, nhưng quá trình chọn
giống quá dài, thời gian để tạo ra được giống đậu tương mới khoảng từ 8-10 vụ.
Ngày nay cùng với sự phát triển của di truyền phân tử và công nghệ sinh học,
việc ứng dụng chỉ thị phân tử DNA đã giúp các nhà chọn giống xác định nhanh
sự có mặt của các gen mục tiêu. Việc chọn lọc có thể được tiến hành ngay từ
các giai đoạn phát triển sớm của cây, không cần chờ đợi tới khi cây phát triển
thành thục. Hơn nữa, sử dụng chỉ thị DNA tạo điều kiện chọn lọc bố mẹ đúng
để lai tạo có hiệu quả hơn. Khi kết hợp với dữ liệu kiểu hình, chỉ thị DNA đánh
giá ở con lai thử sớm có thể sử dụng để dự đoán năng suất con lai ở các thể hệ
sau (Eathing ton, 1997).
2.2.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương tại Việt Nam

Với những giá trị kinh tế và sử dụng, đậu tương được xem là loại cây trồng
chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới, đứng thứ tư sau lúa, ngô và lúa mỳ. Ở
Việt Nam, cây đậu tương được trồng từ rất lâu và nhu cầu tiêu thụ đậu tương cũng
rất lớn, nên sản xuất đậu tương trong nước đang được chú trọng, diện tích gieo
trồng vì thế đã tăng lên đáng kể. Đậu tương được trồng ở cả 7 vùng sinh thái, ở 28
tỉnh thành trên khắp cả nước, trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam. Cây
đậu tương ở nước ta được trồng chủ yếu ở vùng cao, những nơi đất không cần màu
mỡ (khoảng 65%) và 35% được trồng ở những vùng đất thấp, ở khu vực đồng
bằng sông Hồng. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, từ năm 2008 đến nay, diện
tích trồng, năng suất và sản lượng đậu tương không có sự tăng đáng kể so với
những năm trước. Năm 2012, sản lượng đậu nành nước ta giảm 34,3% so với cùng
kỳ năm trước, xuống còn 175,2 nghìn tấn do thời tiết lạnh khác nghiệt vào cuối
năm 2011 và đầu năm 2012 khiến cho năng suất và diện tích gieo trồng giảm mạnh
(Bảng 2.2: Sản lượng đậu nành Việt Nam). Diện tích trồng đậu nành năm 2015

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


nước ta giảm khoảng 70 nghìn ha so với năm 2010 và sản lượng đạt ở mức 192,4
nghìn tấn. Theo số liệu thống kê chính thức, đậu nành đang được trồng tại 25 trong
số 63 tỉnh thành cả nước, với khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các
khu vực phía Nam. Theo số liệu dự báo của USDA, diện tích đất quy hoạch
khoảng 100 nghìn ha, tận dụng tăng vụ trên đất lúa để năm 2020 diện tích gieo
trồng khoảng 350 nghìn ha, sản lượng 700 nghìn tấn; vùng sản xuất chính là đồng
bằng sông Hồng, trung du miền núi phía Bắc, Tây Nguyên.
Bảng 2.2: Sản lượng đậu nành Việt Nam
Năm

Diện tích (nghìn ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (nghìn tấn)

2010
2011
2012

197,8
181,1
120,8

1,51
1,81
1,45

298,6
266,9
175,3

2013
2014
2015

117,8
120,0
130,0

1,43
1,47
1,48

168,4
176,4
192,4

Nguồn: Tổng cục thống kê (Cục xúc tiến thương mại).

Nhiều công trình nghiên cứu về nguồn gen đậu tương, chọn tạo giống đậu
tương đã được công bố. Phân tích chỉ thị ADN là một phương pháp được nhiều
nhà nghiên cứu quan tâm (Akkaya et al., 1992; Narvel et al., 2000; Chen and
Nelson, 2005). Phát hiện, hiểu biết và kiểm soát của virus khảm đậu tương
(SMV) (Xiaoyan Cui et al., 2011). Xác định và phân phối các chủng phân lập của
virus khảm đậu tương ở miền Nam Trung Quốc (K. Li et al., 2010).
Ở Việt Nam, nghiên cứu các giống đậu tương kháng khảm lá bằng chỉ thị
phân tử DNA ở Việt Nam đã được nghiên cứu bởi: Lò Thị Mai Thu và cộng sự
(2013, 2014). Đặc điểm của đoạn gen mã hóa coat protein phân lập từ SMV (Lò
Thị Mai Thu và cộng sự, 2014). Triệu Thị Thịnh và cộng sự, (2010) phân tích đa
dạng di truyền của đậu tương bằng chỉ thị SSR; Nguyễn Thị Lang và cs., (2007)
nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu nành bằng chỉ thị phân tử
RAPD và SSR… Cho đến nay đã có 31 giống đậu tương được công nhận chính
thức và tạm thời, những giống được giới thiệu ở miền Bắc qua công tác nghiên
cứu của nhiều Viện, Trường trong thời gian gần đây như ĐVN 5, DT 2001, ĐT
2006, AK 05 và các giống đậu tương đột biến như DT 96, ĐT 84, ĐT 10, ĐT 26,
ĐT 27 không những cho năng suất cao mà còn có khả năng chịu hạn, đã phát huy
tốt trong sản xuất (Nguyễn Văn Chương và cs., 2010).
Hiện nay, chính phủ đang có nhưng ưu tiên để nghiên cứu phát triển cây
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


trồng này thông qua nhiều chủ trương như: Chiến lược quốc gia sau thu hoạch
lúa gạo, ngô, đậu nành và lạc đến năm 2020 (Quyết định 20/2007/QĐ-BNN); đề
án tái cơ cấu ngành nông nghiệp theo hướng nâng cao giá trị gia tăng và phát
triển bền vững (Quyết định 899/QĐ-TTg). Theo đó, Bộ Nông nghiệp và PTNT
đã ban hành Quyết định 986/QĐ-BN-KHCN về việc thúc đẩy nghiên cứu và ứng
dụng phục vụ tái cơ cấu ngành nông nghiệp và gần đây nhất là Quyết định
3367/QĐ-BNN-TT phê duyệt Quy hoạch chuyển đổi cơ cấu cây trồng trên đất
lúa giai đoạn 2014 - 2020.
2.3. BỆNH TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG
Cây đậu tương có thể mắc một số bệnh do vi khuẩn, nấm hoặc virus, như
bệnh khảm do SMV hoặc BYMV, bệnh gỉ sắt hại đậu tương do nấm Phakopsora
pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) do nấm Peronospora manshurica, bệnh
lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc Fusarium solani fsp. Phaseoly, bệnh
đốm lá vi khuẩn hại đậu tương và một số bệnh hại khác. Thống kê trên thế giới
cho thấy có hơn 100 loại virus gây hại trên cây đậu tương. Bệnh virus đậu tương
phân bố rộng khắp và gây thiệt hại lớn đến năng suất và chất lượng sản phẩm.
Tại những nơi bị nhiễm bệnh nặng, năng suất có thể bị giảm đến 50% ở ngoài
đồng, mức giảm có thể lên đến 93% - 95% trong điều kiện lây nhiễm trong thí
nghiệm (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Một số nước có tỷ lệ thiệt hại lớn
do bệnh virus ở đậu tương, như vùng Georgia ở Mỹ (37%), Australia và Thái lan
(60%), New Zealand và khu vực Bắc Mỹ (40- 50%) (Afanasiev and
Morris,1952); Hartman et al., 1999).

A

B

C

Hình 2.2: Các bệnh hại phổ biến trên cây đậu tương
A: Bệnh gỉ sắt (Nguồn: www.apsnet.org)
B: Bệnh sương mai (Nguồn: www.nnptntvinhphuc.gov.vn)
C: Bệnh thối thân (Nguồn: www.plantmanagementnetwork.org)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


2.4. BỆNH KHẢM VÀNG LÁ ĐẬU TƯƠNG
Trong số 67 virus có khả năng lây nhiễm đậu tương, thì có tới 27 virus
được coi là một mối đe dọa cho các ngành công nghiệp dầu đậu tương (Tolin và
Lacy, 2004; Saghai Maroof et al., 2008). Virus khảm đậu tương- Soybean mosaic
virus (SMV) là virus phổ biến nhất và nghiêm trọng nhất trong sản xuất đậu tương
trên thế giới (Wang, 2009). Đây là một bệnh quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới
(Xiaoyan Cui et al., 2011). Tác hại của bệnh tùy thuộc vào giống và khí hậu. Ở
nhiệt độ cao, bệnh không biểu hiện triệu chứng bệnh. Năng suất có thể giảm trên
85% khi cây không được sử dụng các biện pháp bảo vệ (Silva et al., 2003). Bệnh
được ghi nhận đầu tiên ở Mỹ vào những năm đầu của thập niên 1900 (Hartman et
al., 1999). Bệnh hiện diện ở khắp các vùng trồng đậu tương trên thế giới, và khi
bệnh xuất hiện sớm sẽ dẫn đến thất thu nặng. Việt Nam cũng đã công bố phát hiện
loại virus này từ năm 1994, chủ yếu tập trung ở những vùng trồng đậu tương lớn,
như khu vực trung du, miền núi Bắc bộ, khu vực Đồng Bằng Sông Hồng và Tây
Nguyên (Ngô Thế Dân và cs., 1999; Vũ Triệu Mân, 2003). Bệnh có thể xuất hiện
khá sớm và gây thiệt hại nặng ở những ruộng không được trị bệnh kịp lúc.
Dấu hiệu và triệu chứng bệnh: Những cây đậu tương bị nhiễm SMV

thường sinh trưởng phát triển chậm, hình thái thân, lá, quả bị biến dạng (Hill,
1999). Lá bị mất màu, loang lổ, lá nhỏ lại, phát triển không đều, bìa lá cong
xuống làm lá biến dạng. Phiến lá bị xếp nếp nhăn nhúm, có màu loang lổ xanh
nhạt và xanh đậm và thường dày hơn lá bình thường. Dọc gân lá, mô tế bào nổi
rộp lên những mụn màu xanh đậm. Cây lùn xuống do các lóng thân phát triển
kém. Quả và hạt phát triển chậm lại, nhất là các quả ở phần trên của cây. Quả
chín chậm, hạt nhỏ, vỏ hạt bị đổi thành màu nâu nhạt và đậm không đều. Triệu
chứng bệnh bệnh được biểu hiện rõ ở 18,50C. Trên 29,50C triệu chứng bệnh sẽ ở
dạng tiềm ẩn (Hill et al., 1987).

Hình 2.3: Lá cây đậu tương bị khảm vàng
(Nguồn: />
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10


Tác nhân gây bệnh: Bệnh khảm lá đậu tương do virus Soybean mosaic
virus (SMV) gây ra. SMV thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae gây bệnh khảm lá
đậu tương. Chúng có dạng hình sợi mềm với đường kính khoảng 11-15nm, chiều
dài khoảng 750nm. Axit nucleic là RNA dạng sợi đơn, phân tử lượng 3,25x106
KDa, tổng kích thước bộ gen khoảng 10,4Kb. Thành phần bộ gen bao gồm
24,3% G; 29,9% A; 14,9% C và 30,9% U.

Hình 2.4: Potyvirus, SMV.
Photo: Rothamsted Experiment Station.
(Nguồn: www.soybeanresearchinfo.com)

Virus sinh ra thể vùi trong tế bào cây bệnh. Thể vùi có dạng hình múi khế
hay hình chong chóng. Thời gian tồn tại của virus trong cây bệnh là 2-5 ngày,

nhiệt độ mất hoạt tính Q10 là 55-700C. Khi bị chiếu tia cực tím virus bị mất hoạt
tính trong hai giờ. Độ pH thích hợp là 6. Nhiệt độ thích hợp để virus nhân lên
trong tế bào cây bệnh là 21-260C. Tại Hoa Kỳ, SMV đã được phân thành chín
chủng bằng cách sử dụng các phản ứng di truyền trên tám giống cây trồng đậu
tương. Các chủng hiện nay đang được biết đến là từ G1 đến G7, G7a, và C14
(Cho và Goodman 1979, 1982).
SMV có thể tồn tại và lan truyền qua hạt giống. Trong hạt giống virus có
thể tồn tại được hai năm. Ngoài ra, virus có thể lan truyền qua nhiều loài rệp
muội như: Aphis gossypii, A. cracivora, A. citricola, Rhopalosiphum maydis theo
kiểu không bền vững.

Hình 2.5: Rệp muội Aphis gossypii
(Nguồn: />
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


SMV có phạm vi ký chủ rộng và gây hại trên 30 loài cây trồng đặc biệt là
những cây họ đậu. Bệnh phát triển mạnh trên những cây đậu tương trồng vào vụ
đông vào giai đoạn cây ra hoa và hình thành quả. Bệnh gây hại nặng ở những
ruộng đậu tương chăm sóc kém, bón nhiều đạm hoặc bón phân không cân đối.
Phòng trừ bệnh khảm vàng: Chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống. Trồng
cách ly ruộng làm giống với ruộng đậu thương phẩm. Vệ sinh đồng ruộng, luân
canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng. Nhổ bỏ những cây bị
bệnh trên ruộng, tránh lây lan từ cây bênh sang cây khỏe. Diệt trừ côn trùng
truyền bệnh (rệp, bọ trĩ) bằng các loại thuốc hoá học. Bệnh do virus gây ra nên
chưa có thuốc trị.
Tuy nhiên, các biện pháp nêu trên không mang lại hiệu quả cao trong việc
phòng trừ đối với bệnh mà lại tốn nhiều thời gian, công sức. Vì thế, hướng giải

quyết tốt nhất để phòng và trừ bệnh là tạo ra những giống cây đậu tương kháng
lại loại virus này.
2.5. NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG BỆNH VIRUS KHẢM
LÁ ĐẬU TƯƠNG
2.5.1. Các gen kháng bệnh khảm lá đậu tương
Hiện nay trên thế giới sử dụng giống đậu tương kháng SMV được xem là
cách hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ
sinh học, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm hơn đến vấn đề “chọn giống nhờ
chỉ thị phân tử”, sử dụng các chỉ thị phân tử phát hiện ra nguồn gen kháng khảm
lá đậu tương. Các nhà khoa học đã tìm được vị trí các gen được định vị trên từng
nhiễm sắc thể, cũng như các chỉ thị phân tử DNA liên kết với các gen đó, tạo ra
các bản đồ di truyền liên kết gen. Dựa vào các chỉ thị này, chúng ta có thể phát
hiện được sự có mặt của một gen bất kỳ, nếu biết được một hoặc nhiều chỉ thị
liên kết chặt với gen đó. Cho đến nay, 3 gen Rsv đã được xác định và lập bản đồ
(Shi A et al., 2008). Trong nghiên cứu các giống đậu tương kháng bệnh khảm lá
trên thế giới đang được quan tâm nhiều nhất là ở các nước như: Mỹ, Trung Quốc,
Nhật Bản, Iran. Ở Trung Quốc có hai giống cây trồng: “J05” và “V94-5152” đó
là giống có mang gen kháng Rsv1, Rsv3, Rsv4, đã được chọn là giống kháng bệnh
khảm lá trong nhân giống đậu tương ở nước này (Shi A et al., 2009).
Sàng lọc rộng rãi cho đậu tương kháng SMV đã xác định với ba gen kháng
độc lập, 3 gen kháng bệnh khảm lá đó là: gen Rsv1 (Kiihl và Hartwig., 1979; Yu
et al., 1994) kháng các chủng G1-G4, gen Rsv3 (Buss et al.,1999) kháng các

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


chủng G5-G7, gen Rsv4 (Ma et al.,1995) kháng các chủng G1-G7. Các gen
kháng bệnh khảm lá đậu tương kháng lại virus SMV theo cơ chế câm gen

(RNAi). Đến nay, nhiều chỉ thị liên kết với gen Rsv1 và gen Rsv3 đã được phát
triển, trong đó Sat_154 và Satt560 là chỉ thị tốt nhất cho phép phát hiện dễ dàng
các cây mang gen kháng Rsv1 và gen Rsv3 (Shi A et al., 2009) tạo thuận lợi lớn
cho công tác chọn tạo giống kháng.
Gen Rsv1 nằm trên nhiễm sắc thể số 13 kháng được cá chủng từ G1-G4, và
được chia thành chín alen nhỏ là: Rsv1 (Kiihl và Hartwig, 1979), Rsv1-h (Lim, 1985;
Chen et al., 2002), Rsv1-k (Buss et al., 1989; Chen et al., 1991), Rsv1-m (Buss et al.,
1989; Chen et al., 1991), Rsv1-n (Ma et al., 2003), Rsv1-r (Chen et al., 2001), Rsv1-s
(Chen et al., 1993), Rsv1-t (Kiihl and Hartwig 1979; Chen et al., 1991), Rsv1-y
(Roane et al., 1983 ; Chen et al., 1991). Gene Rsv3 (Buss et al., 1999) nằm trên
nhiễm sắc thể số 14 kháng các chủng G5-G7. Gene Rsv4 (Ma et al., 1995; Buss et
al., 1997) nằm trên nhiễm sắc thể số 2 kháng các chủng G1-G7.
Gen Rsv1 và Rsv3 là hai gen kháng khảm lá quan trọng, có tính kháng cao,
kháng được các chủng đặc hiệu. Gen Rsv1 và Rsv3 đã được sử dụng rộng rãi nhất
trong tạo các giống đậu tương chống chịu Soybean mosaic virus khoảng hai thập
kỷ và nó vẫn đang được sử dụng và phát triển trong nhiều lĩnh vực của đậu tương
(Shi A et al., 2008). Gen Rsv1 được xác định nằm ở nhiễm sắc thể số 13, nằm
giữa marker Sat_154 và Satt510 trong nhóm liên kết phân tử F của bản đồ gen
đậu tương; độ liên kết với Sat_154 là 0,5cM (Shi A et al., 2008). Gen Rsv3 được
xác định nằm ở nhiễm sắc thể số 14, Sat_424 và Satt560 trong nhóm liên kết
phân tử B2 của bản đồ gen đậu tương; độ liên kết với Satt560 là 0,7cM.
Marker Sat_154 đã được sử dụng để phát hiện gen Rsv1 với kích thước
sản phẩm là 310bp, marker Satt560 đã được sử dụng để phát hiện gen Rsv3 với
kích thước sản phẩm là 300bp.
2.5.2. Các loại chỉ thị phân tử DNA
Đánh giá sự đa dạng di truyền có vai trò quan trọng trong cung cấp thông
tin cho quản lý và sử dụng hiệu quả nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống.
Chỉ thị phân tử DNA là chỉ thị phân tích đa dạng di truyền hiệu quả và không bị
ảnh hưởng nhiều từ các yếu tố môi trường. Trong các loại chỉ thị phân tử RFLP,
AFLP, RAPD, SSR, chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội biểu thị tính đa hình cao,

được coi là chỉ thị hữu ích để phát hiện sự đa dạng di truyền đậu tương (Akkaya
et al., 1992; Abe et al., 2003; Hwang et al., 2008; Wang and Takahata, 2007).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


Việc sử dụng chỉ thị phân tử DNA đã cung cấp một cơ hội mới không chỉ
đối với việc nghiên cứu hệ gen mà cả trong việc nghiên cứu đa dạng cùng nguồn
gốc phát sinh của các loài sinh vật. Bởi lẽ sự đa dạng của acid nucleic là hết sức
phong phú. Một số phương pháp sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di
truyền:
2.5.2.1. Kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – đa hình các
đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên) do William đề xuất năm 1990, Wlellsh
và cộng sự hoàn thiện năm 1991. Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình
của các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc sử dụng mồi đơn chứa
trật tự các Nucleoticle ngẫu nhiên. Đến nay kỹ thuật này đã và đang được ứng
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử. Người ta đã sử dụng kỹ
thuật này để thiết lập bản đồ di truyền, đánh giá hệ gen của giống và sự đa dạng
di truyền của tập đoàn giống. Với kỹ thuật RAPD và RFLP, Lambrides C.J và
cộng sự đã thành lập được bản đồ gen của đậu xanh (Lambrides et al., 2004).
Nguyên lý: Kỹ thuật RAPD có cơ sở là kỹ thuật PCR, nhưng sử dụng
mồi ngắn ngẫu nhiên để nhân bản những đoạn DNA hoàn toàn ngẫu nhiên
trong hệ gen.
Thành phần phản ứng: cũng tương tự phản ứng PCR, các yếu tố cần thiết
để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm:
- DNA khuôn (DNA template) là vật liệu khởi đầu cho phản ứng RAPD,
được tách từ các mẫu virus, vi khuẩn, tế bào thực vật, động vật…DNA có độ tinh

sạch, có thể là sợi đôi, mạch vòng hoặc mạch thẳng. DNA khuôn được khuyếch
đại dưới dạng thẳng có hiệu quả hơn dạng vòng (Phạm Thành Hổ, 2006).
- Đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đó là một oligonucleoticle có trật
tự nucleoticle ngẫu nhiên và có chiều dài từ 8-10 nucleoticle (thường sử dụng
mồi dài 10 nucleoticle). Nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng (phù hợp với lượng
DNA cần tổng hợp) tạo nên lượng sản phẩm cần thiết. Nồng độ mồi thích hợp để
tiến hành phản ứng thường là 0,1–0,5µM.
- Taq-polymerase: là một enzym tổng hợp DNA, có vai trò quyết định đến
phản ứng PCR. Đây là loại enzym chịu được nhiệt độ cao. Taq-polymerase
được tách chiết từ những vi khuẩn sống ở suối nước nóng Thermus aquaticus
không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính (92- 95oC). Taq-polymerase có
hoạt tính ở dải nhiệt độ cao, tồn tại ở nhiệt độ ủ 95oC kéo dài. Enzym này có
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14


hoạt tính cao ở 72- 80oC làm cho phản ứng xảy ra nhanh, hiệu quả và chính xác
(Khuất Hữu Thanh, 2006).
- dNTP: là các nucleoticle tự do được sử dụng làm nguyên liệu cho phản
ứng RAPD, gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng độ dNTP mỗi loại
thường dùng trong các phản ứng RAPD khoảng 50-200µM.
Dung dịch đệm: là một trong những yếu tố quan trọng làm ảnh hưởng đến
chất lượng và hiệu quả của phản ứng. Thành phần của dung dịch đệm của phản
ứng bao gồm: Tris HCl 100mM (PH= 8,3 ở nhiệt độ phòng), KCl 50mM, MgCl2
1,5mM khi ủ ở nhiệt độ phòng. Nồng độ MgCl2 có thể từ 0,5-5mM.
Chu kỳ phản ứng: được tiến hành qua các giai đoạn sau:
-

Giai đoạn biến tính DNA: ở nhiệt độ 95oC trong 30-60 giây làm cho các

liên kết hydro giữa các mạch bị đứt khi đó DNA sợi đôi tách thành hai sợi đơn
tạo điều kiện cho sự bắt cặp mồi
-

Giai đoạn tiếp hợp mồi: Nhiệt độ hạ xuống 32–40oC mồi bám vào đầu

3’OH của mạch khuôn DNA và bắt đầu quá trình tổng hợp sợi mới.
-

Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên 72oC thì các đoạn mồi đã bắt

cặp với các mạch đơn sẽ được kéo dài với sự tham gia của Taqpolymerase.
Một chu kỳ trên xảy ra, một đoạn DNA được nhân lên thành hai, các đoạn
DNA được nhân tiếp tục được coi là các mạch khuôn để tổng hợp cho chu kỳ
sau. Như vậy sau n chu kỳ sẽ tạo ra 2n-2 các đoạn DNA giống hệt đoạn DNA
khuôn ban đầu. Phản ứng RAPD có thể thực hiện 40-45 chu kỳ.
2.5.2.2. Kỹ thuật AFLP
AFLP (Amplified Fragment Length Plymorphism – đa hình chiều dài các
đoạn DNA được nhân bản chọn lọc) là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR, kỹ
thuật này cho phép phát hiện một cách có chọn lọc các đoạn DNA hệ gen đã
ñược cắt bởi enzym giới hạn và gắn với đoạn tiếp hợp.
Về nguyên tắc kỹ thuật AFLP: DNA genome được cắt đồng thời với hai
loại enzyme khác nhau thành các đoạn có kích thước không giống nhau, trong số
đó sẽ có một số đoạn mang một số phân đoạn có các đầu mút giống nhau. Nếu ta
sử dụng một số đoạn nối (adaptor) như nhau có gắn thêm một hoặc một số
oligonucleotide được chọn lọc trước để định hướng cho việc gắn các cặp mồi
PCR thì tất cả các đầu mút giống nhau sẽ được nhân bản. Khi thay đổi số lượng
và trình tự các oligonuceotide được chọn lọc ở các đầu nối ta có thể nhận lại

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 15