thiết kế và ứng dụng các chỉ thị adn xác định các gen ứng viên liên quan đến tính chịu mặn ở một số giống lúa bản địa của việt nam đã giải mã hệ gen

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ THÙY LIÊN

THIẾT KẾ VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHỈ THỊ ADN
XÁC ĐỊNH CÁC GEN ỨNG VIÊN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU MẶN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA CỦA
VIỆT NAM ĐÃ GIẢI MÃ HỆ GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ THÙY LIÊN

THIẾT KẾ VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHỈ THỊ ADN
XÁC ĐỊNH CÁC GEN ỨNG VIÊN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU MẶN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẢN
ĐỊA CỦA VIỆT NAM ĐÃ GIẢI MÃ HỆ GEN

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Mã số

: 60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học:
TS. Khuất Hữu Trung
PGS. TS Nguyễn Thị Phương Thảo

HÀ NỘI, NĂM 2015


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn
của TS. Khuất Hữu Trung và PGS. TS Nguyễn Thị Phương Thảo. Các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Thùy Liên

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới TS. Khuất Hữu Trung, PGS. TS Nguyễn Thị Phương Thảo đã tận tình
hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt
Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức bộ môn Kỹ thuật di
truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Thùy Liên

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


MỤC LỤC

Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục chữ viết tắt

v

Danh mục bảng

vi

Danh mục hình

vii

Trích yếu luận văn

viii

Thesis abstract

ix

Phần 1 Mở đầu

1

1.1

Tính cấp thiết của đề tài

1

1.2

Mục tiêu nghiên cứu

2

1.3

Yêu cầu của đề tài

2

1.4

Phạm vi nghiên cứu

3

1.5

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

3

Phần 2 Tổng quan tài liệu

4

2.1

Tính chống chịu mặn của cây lúa

4

2.2

Nghiên cứu di truyền về giống lúa chống chịu mặn

4

2.2.1

Nghiên cứu di truyền số lượng về tính chống chịu mặn của cây lúa

4

2.2.2

Nghiên cứu di truyền phân tử về tính chống chịu mặn của cây lúa

5

2.3

Gen ứng viên

6

2.3.1

Các bước xác định gen ứng viên

6

2.3.2

Phương pháp tin sinh học xác định gen ứng viên chịu mặn

9

2.4

Chỉ thị adn trong xác định gen ứng viên liên quan đến tính chịu mặn

12

2.4.1

Chỉ thị ADN

12

2.4.2

Phương pháp thiết kế chỉ thị phân tử

13

2.5

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn

14

2.5.1

Các giả thuyết mô hình MAS

15

2.5.2

Điều kiện để ứng dụng MAS

16

2.5.3

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn trên thế giới

17

2.5.4

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn tại Việt Nam

19

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

22

3.1

Địa điểm nghiên cứu

22

3.2

Thời gian nghiên cứu

22

3.3

Vật liệu nghiên cứu

22

3.3.1

Nguồn vật liệu

22

3.3.2

Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

23

3.4

Nội dung nghiên cứu

24

3.5

Phương pháp nghiên cứu

24

3.5.1

Phương pháp thiết kế chỉ thị ADN xác định các gen ứng viên dựa trên
trình tự genome

24

3.5.2

Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng

28

3.5.3

Phương pháp lai hữu tính – lai trở lại giữa các giống cho và nhận gen

28

3.5.4

Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

30

3.5.5

Phương pháp xử lí số liệu

32

Phần 4 Kết quả và thảo luận

33

4.1

Kết quả xác định gen ứng viên chịu mặn

4.1.1

Kết quả phân tích thành phần nucleotide vùng CDS (Coding DNA

33

Sequence) và thành phần amino acid của các gen ứng viên SRWD5
(SALT RESPONSIVE WD40 PROTEIN 5 )

33

4.1.2

Kết quả tầm soát và thiết kế mồi nhận dạng gen ứng viên SRWD5 chịu mặn

34

4.1.3

Kết quả phân tích thành phần nucleotide vùng CDS (Coding DNA
Sequence) và thành phần amino acid của các gen ứng viên RSS1

38

4.1.4

Kết quả tầm soát và thiết kế mồi nhận dạng gen ứng viên RSS1 chịu mặn

42

4.2

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác đinh, chọn lọc cá thể và con lai mang
gen ứng viên chịu mặn

4.2.1

46

Kết quả xác định cá thể mang gen ứng viên chịu mặn trong tập đoàn 36
giống lúa bản địa

4.2.2

46

Kết quả lai tạo và chọn lọc cá thể mang gen ứng viên chịu mặn ở các thế
hệ con lai

48

Phần 5 Kết luận và kiến nghị

54

5.1

54

Kết luận

5.2 Kiến nghị

54

Tài liệu tham khảo

55

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

:

Axit Deoxyribonucleic

AFLP

:

Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các
đoạn được nhân bản chọn lọc

RAPD

:

Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình ADN được
nhân bản ngẫu nhiên

RFLP

:

Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài
mảnh phân cắt giới hạn

STS

:

Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu

NCBI

:

National Center for Biotechnology Information – Trung tâm quốc
gia công nghệ thông tin về sinh học

SNP

:

Single Nucleotide Polymorphisms – Đa hình nucleotide đơn

SSR

:

Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản

Bp

:

Base pair – Cặp bazơ nitơ

cDNA

:

Complementary DNA – Thư viện ADN bổ trợ

cs

:

Cộng sự

ctv

:

Cộng tác viên

IRGSP

:

International Rice Genome Sequencing Project

dNTP

:

Deoxynucleotide triphosphate

MABC

:

Marker Assisted Backcrossing – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử kết
hợp lai trở lại

MAS

:

Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử

NST

:

Nhiễm sắc thể

PCR

:

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

QTL/ QTLs

:

Quantitative Trait Loci - Locus kiểm soát tính trạng số lượng

TBE

:

Tris-Boric Acid-EDTA

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1

Danh sách 36 giống lúa bản địa đã giải mã

22

Bảng 3.2

Thành phần của một phản ứng PCR

31

Bảng 3.3

Các bước phản ứng PCR

31

Bảng 3.4

Thành phần gel polyacrylamide

31

Bảng 4.1

Thống kê nucleotide vùng CDS (Coding DNA Sequence) gen/gen
ứng viên SRWD5

33

Bảng 4.2

Thống kê tỉ lệ (%) amino acid của gen/gen ứng viên SRWD5

34

Bảng 4.3

Thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotit của các gen ứng viên SRWD5 ở
các giống lúa đã giải mã

Bảng 4.4

35

Thống kê nucleotide vùng CDS (Coding DNA Sequence) gen/gen
ứng viên RSS1

38

Bảng 4.5

Thống kê tỉ lệ (%) amino acid của gen/gen ứng viên RSS1

40

Bảng 4.6

Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các gen ứng viên RSS1

Bảng 4.7

ở các giống lúa đã giải mã

43

Kết quả lai tạo con lai ở các thế hệ F1, BC1F1 và BC2F1

48

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1

Tóm tắt các bước xác định gen ứng viên

Hình 4.1

Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen SRWD5 của

7

một số giống lúa bản địa (đoạn mất khoảng 200Nucleotide so với
một số giống bản địa)
Hình 4.2

35

Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen chịu mặn
RSS1 của một số giống lúa bản địa (đoạn thêm 15 Nu)

Hình 4.3

44

Kết quả điện di sản phẩm PCR 36 giống lúa bản địa với chỉ thị
SRWD5del200

Hình 4.4

46

Kết quả điện di sản phẩm PCR 36 giống lúa bản địa với cặp mồi
RSS1del15

Hình 4.5

47

Kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 với cặp mồi
49

SRWD5del200
Hình 4.6

Kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC2F1 với cặp mồi
50

SRWD5del200
Hình 4.7

Kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 với cặp mồi
RSS1del15

Hình 4.8

50

Kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC2F1 với cặp mồi
RSS1del15

Hình 4.8

51

Kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC2F1 với cặp mồi
RSS1del15

Hình 4.9

51

Ruộng gieo mạ và ruộng cấy các nguồn vật liệu bố mẹ phục vụ lai
tạo F1

52

Hình 4.10

Ghép cặp cho các tổ hợp lai

52

Hình 4.11

Bao cách ly sau khi khử nhị

52

Hình 4.12

Hạt lai BC2F1 (Bắc thơm 7 x Coi ba đất ) sau khi thu hoạch

53

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Nhiễm mặn là một nhân tố phi sinh học làm giảm năng suất tại nhiều vùng trồng
lúa trên thế giới. Cải tiến tính chịu mặn của lúa tại các vùng nhiễm mặn là mục tiêu
quan trọng trong chương trình chọn tạo giống lúa. Dựa vào trình tự của 36 giống lúa bản
địa của Việt Nam đã được giải mã hệ gen đã xác định được 2 gen ứng viên liên quan
đến tính chịu mặn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải mã: SRWD5
(SRWD5 TOLERANCE) và RSS1(RICE SALT SENSITIVE 1). Dựa vào kết quả phân tích
thành phần nucleotide vùng CDS (Coding DNA Sequence) và thành phần amino acid
của các gen ứng viên; kết quả tầm soát trình tự tương đồng của 36 giống lúa đã giải mã
và so sánh với locus gen có khả năng chịu mặn đã thiết kế được 2 chỉ thị ADN là
SRWD5del200 và RSS1del15 đặc trưng cho từng gen ứng viên chịu mặn. Thực hiện
phép lai trở lại (MABC) của 2 tổ hợp lai: Bắc thơm 7 x Coi ba đất và TSL1x OM6377
đã lai tạo được tổng số 16 hạt lai BC1F1 và 54 hạt lai BC2F1. Sử dụng 2 chỉ thị ADN đã
thiết kế để sàng lọc các cá thể từ thế hệ BC1F1 đến thế hệ BC2F1 xác định được 7 cá thể
BC1F1 và 27 cá thể BC2F1 mang gen ứng viên chịu mặn. Kết quả nghiên cứu là cơ sở
cho việc áp dụng các chỉ thị phân tử trong chương trình chọn tạo giống lúa chịu mặn.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii

THESIS ABSTRACT
Salt tolerance is an important agronomic trait in Oryza sativa (rice). Salt is a
major abiotic stress that could be harmful to crops in agriculture. In this study, based on
the genome sequence data of 36 native rice varieties, we have identified two potentially
interesting candidate genes SRWD5 (SRWD5 TOLERANCE) and RSS1(RICE SALT
SENSITIVE 1). The nucleotide sequences of these candidate genes were similar to the
published sequences in Genbank. SRWD5del200 and RSS1del15 markers were designed
to test for the presence of SRWD5 and RSS1 candidate genes, respectively. This result
is very important serves as a basic for the application of molecular markers in salt
tolerance rice breeding program. Based on screening for SRWD5 and RSS1 resistant to
candidate genes, two native resistant rice varieties Coi ba dat; OM6377 were used as the
donor plants to transfer the resistant genes to commercial rice varieties Bac thom 7 and
TSL1, respectively (Bac thom 7 x Coi ba dat and TSL1 x OM6377). The crossed
progenies were heterozygote for tested to determine the presence of SRWD5 and RSS1
candidate genes. Result showed that 7 individual plants of BC1F1 and 27 plants of
BC2F1 carrying resistant gene were shown in heterozygote. These lines are being used
for further investigations.
Keywords: Salt tolerance, marker design, SRWD5 TOLERANCE candidate gene, RSS1
candidate gene, native rice variety

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ix


PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính đảm bảo an
ninh lương thực, ổn định xã hội ở nhiều quốc gia trên thế giới. Ở nước ta, lúa gạo

không chỉ là nguồn lương thực tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất
khẩu quan trọng. Năng suất và sản lượng lúa luôn bị đe doạ bởi thiên tai, sâu
bệnh và các yếu tố môi trường. Trong đó, yếu tố đáng chú ý là hiện tượng đất
nhiễm mặn. Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam,
hàng năm những vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm
thực của biển. Theo báo cáo mới nhất của Cục trồng trọt đến đầu tháng 3/2015,
tại Đồng bằng sông Cửu Long, xâm ngập mặn đã ảnh hưởng đến 620.000
ha/1.545.000 ha lúa đông xuân năm 2009 - 2010, chiếm 40% diện tích toàn vùng.
Hiện nước mặn đang xâm nhập sâu vào khu vực nội đồng ở các tỉnh ven biển
ĐBSCL, có nơi vào sâu đến 60km. Mức nhiễm mặn cao nhất tập trung ở các tỉnh
Kiên Giang, An Giang, Sóc Trăng bởi ảnh hưởng thủy triều từ biển Tây theo
kênh Long Xuyên - Rạch Giá và kênh Vĩnh Tế đổ vào vùng Thoại Sơn (tỉnh An
Giang) và khu vực Đông Hồ (tỉnh Kiên Giang) dù trước đó các cửa đập ngăn
mặn của vùng tứ giác Long Xuyên đã đóng lại. Diện tích có nguy cơ bị xâm ngập
mặn cao khoảng 100.000 ha/650.000 ha, chiếm 16% diện tích canh tác lúa của
các tỉnh trên. Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện tượng
băng tan ở hai cực, nước biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp ven
biển. Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn cho
chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo, và ảnh hưởng xa hơn là mục tiêu đảm
bảo an ninh lương thực thế giới sẽ khó hoàn thành. Do đó, việc hạn chế mức độ
gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần được quan
tâm nghiên cứu.
Để nhanh chóng tạo ra các giống lúa chịu mặn, hướng nghiên cứu ứng dụng
kỹ thuật chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa đang được sử dụng rộng rãi do
có thể rút ngắn thời gian chọn tạo, việc chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử hiệu quả hơn
và đáng tin cậy hơn chọn lọc kiểu hình (Liu et al., 2003; Pei et al., 2011; Miah et
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1

al., 2013).
Một trong các phương pháp hiện đại hiện nay đó là giải mã toàn bộ hệ gen,
so sánh, đánh giá sự giống nhau (tương đồng) của chuỗi ADN và protein, từ đó
có thể đưa ra dự đoán về chức năng cũng như cấu trúc của những gen mới phát
hiện (Sequence alignment) ứng dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống
(Thompson et al., 2007, Mueen et al., 2015). Tiếp cận theo định hướng nghiên
cứu mới này, việc “Thiết kế và ứng dụng các chỉ thị ADN xác định các gen ứng
viên liên quan đến tính chịu mặn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải
mã hệ gen” là rất cần thiết, nhằm đưa ra nguồn thông tin hữu ích để phục vụ cho
việc chọn ra các giống lúa có khả năng chịu mặn.
Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu và vật liệu cho các nghiên
cứu khoa học tiếp theo về cây trồng chống chịu mặn, đồng thời góp phần vào
công tác chọn tạo giống lúa có khả năng chịu mặn, phẩm chất gạo tốt, năng suất
cao, phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng nhiễm mặn và cơ cấu sản xuất lúa
vùng nhiễm mặn ở Việt Nam, giúp người nông dân trồng lúa vùng nhiễm mặn
tăng thêm thu nhập, giảm đói nghèo.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Mục tiêu tổng quát là xác định các gen ứng viên liên quan đến tính chịu
mặn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải mã, thiết kế các chỉ thị
ADN chức năng để ứng dụng trong chọn tạo giống lúa chịu mặn.
Các mục tiêu cụ thể bao gồm:
- Xác định được các gen ứng viên liên quan đến tính chịu mặn ở một số
giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải mã;
- Thiết kế được các chỉ thị ADN đặc trưng cho từng gen ứng viên chịu
mặn phục vụ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu mặn.
- Tạo được quần thể F1, BC1F1, BC2F1 của các tổ hợp lai và xác định được
cá thể trong quần thể F1, BC1F1, BC2F1 mang gen ứng viên chịu mặn.
1.3 YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
- Xác định được các gen ứng viên liên quan đến tính chịu mặn ở một số

giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải mã;
- Thiết kế được các chỉ thi ADN đặc trưng cho từng gen ứng viên chịu
mặn phục vụ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu mặn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


1.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Vì thời gian hạn chế nên đề tài chỉ tập trung các nội dung thiết kế chỉ thị
ADN nhận dạng gen ứng viên chịu mặn và ứng dụng trong lai tạo để chọn các cá
thể mang gen ứng viên chịu mặn đến thế hệ BC2F1. Đề tài được thực hiện tại Bộ
môn Kỹ thuật di truyền và khu ruộng thí nghiệm của Viện Di truyền Nông
nghiệp từ tháng 6/2014 đến tháng 11/2015.
1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
-

Kết quả đề tài sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu và vật liệu cho các nghiên cứu

khoa học về tính chịu mặn, đồng thời góp phần vào công tác nghiên cứu chọn tạo
giống lúa có khả năng chịu mặn phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng nhiễm
mặn ở Việt Nam.
- Những thành công bước đầu trong thiết kế các chỉ thị ADN xác định các
gen ứng viên liên quan đến tính chịu mặn sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi
trong công tác chọn tạo giống nói chung, không chỉ đối với khả năng chịu mặn mà
còn đối với nhiều khả năng kháng khác, đáp ứng nhu cầu lương thực con người.
- Những cá thể trong quần thể BC1F1, BC2F1 triển vọng được chọn lọc
trong đề tài này sẽ trồng thử nghiệm, đánh giá, chọn ra các dòng lúa mang gen
ứng viên chịu mặn để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 TÍNH CHỐNG CHỊU MẶN CỦA CÂY LÚA
Đối với cây lúa, tính chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi
theo các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây. Tính trạng bất thụ của bông
lúa khi bị stress do mặn được điều khiển bởi một số gen trội, nhưng các gen này
không tiếp tục thể hiện ở các thế hệ sau. Phân tích diallele về tính trạng chịu
mặn, người ta ghi nhận cả hai hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng
tính với hệ số di truyền thấp (19,18%) và ảnh hưởng của môi trường rất lớn
(IRGSP, 2005).
Rất nhiều nghiên cứu cho rằng, yếu tố di truyền tính chịu mặn biến động rất
khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa chịu mặn có hiệu
quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chịu mặn, từ đó loại bỏ ngay từ
những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọn giống.
Theo Aslam et al. (1993), nghiên cứu di truyền số lượng tính chịu mặn cho thấy,
cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý
nghĩa trong di truyền tính chịu mặn.
Hiện chúng ta có rất ít thông tin về kiểu hình chịu mặn ở giai đoạn
trưởng thành của cây lúa. Greenway and Munns (1980) chỉ rõ: “Hầu hết các
thí nghiệm đều được tiến hành trên giai đoạn mạ với quy mô quần thể hạn chế
và chỉ số Na/K thường được dùng như một giá trị chỉ thị. Cây lúa nhiễm mặn
có xu hướng hấp thu Na nhiều hơn cây chịu mặn. Ngược lại, cây chịu mặn hấp
thu K nhiều hơn cây nhiễm. Ngưỡng chịu NaCl của cây lúa là EC = 4 dS/m”.
Trong quá trình bị nhiễm mặn, nồng độ ion K+ trong tế bào được điều tiết
tương thích với cơ chế điều tiết áp suất thẩm thấu và khả năng tăng trưởng tế
bào. Nhiều loài thực vật thuộc nhóm halophyte và một phần của nhóm

glycophyte thực hiện hoạt động điều tiết áp suất thẩm thấu làm cản trở ảnh
hưởng gây hại của mặn. Hoạt động này sẽ giúp cây duy trì một lượng lớn K+
và hạn chế hấp thu Na+.
2.2 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VỀ GIỐNG LÚA CHỐNG CHỊU MẶN
2.2.1 Nghiên cứu di truyền số lượng về tính chống chịu mặn của cây lúa
Rất nhiều nghiên cứu cho rằng yếu tố di truyền tính chịu mặn biến động rất
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa chịu mặn có hiệu
quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chịu mặn, từ đó loại bỏ ngay từ
những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọn giống.
Nghiên cứu di truyền số lượng tính chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt
động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền
tính chịu mặn.
Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chịu mặn giai đoạn mạ của cây lúa
trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao (EC = 12
dS/m) trong môi trường kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh, người ta thấy
rằng, tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi, khối lượng
khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giống chịu
và giống nhiễm, tính trạng này chủ yếu được điều khiển do hoạt động của
một nhóm gen cộng tính. Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua các tính
trạng này rất thấp.
Theo Mishra et al. (1990), trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa, tính
trạng chiều cao cây, năng suất, trong điều kiện mặn được điều khiển bởi nhóm
gen cộng tính”.
Do ảnh hưởng rất lớn của môi trường bên ngoài, sự thể hiện di truyền là rất
thấp trong các tính trạng. Bằng phương pháp lai diallel đầy đủ, Gregorio and

Senadhira (2002) cho rằng: “có thể tìm ra một số cặp lai tốt phục vụ cho chương
trình ưu thế lai. Nghiên cứu về di truyền số lượng tính chịu mặn thông qua lai
diallel 6 x 6, năng suất thể hiện hoạt động của một nhóm gen cộng tính không có
ý nghĩa trong điều kiện bình thường, nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử
lý mặn. Năng suất lúa bị giảm là do ảnh hưởng của mặn. Trong một số giống lúa,
ưu thế hoạt động của gen cộng tính đối với năng suất là điều kiện thuận lợi cho
chọn lọc giống cho môi trường mặn”.
Nghiên cứu về các thông số di truyền Mishra et al. (1990) cho rằng,
chiều dài bông và khối lượng hạt chịu tác động rất ít bởi các yếu tố môi
trường, nếu như chọn giống chịu mặn dựa vào hai tính trạng này sẽ không
hiệu quả. Khối lượng bông, số hạt chắc trên bông, chiều cao cây có hệ số path
rất cao trong môi trường mặn. Chính ba tính trạng này đóng góp phần lớn
trong việc tăng năng suất lúa trong môi trường mặn.
2.2.2 Nghiên cứu di truyền phân tử về tính chống chịu mặn của cây lúa
Bản đồ QTL (Quantitative Trait Loci) được áp dụng trong trường hợp
những tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (tính chịu mặn, hạn, lạnh, ...). Di
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những loci riêng biệt
gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và
liên kết của nó với những gen khác. Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số
lượng marker phủ trên toàn bộ nhiễm sắc thể trong hệ gen cây trồng có thể cung
cấp cho chúng ta công cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng di truyền số lượng
phức tạp, định vị gen trên những nhiễm sắc thể và xác định các gen mục tiêu liên
kết với gen khác.
Teng (1994) đã sử dụng quần thể cận giao tái tổ hợp (RI) thế hệ F8 bao
gồm 324 cá thể thuộc tổ hợp lai giữa IR29/Nona Broka để nghiên cứu di truyền

tính chịu mặn của cây lúa. Các dòng RI được thanh lọc mặn trong nhà lưới ở điều
kiện EC = 15 dS/m và điều kiện đồng ruộng. Phân tích RFLP với 5 enzyme phân
cắt hạn chế (DraI, EcoRV, HindIII, ScaI, XbaI) cho thấy trong 266 RFLP
marker, có 117 RFLP marker thể hiện đa hình (43,98%), phủ trên hệ gen cây lúa
với mật độ 15 cM/quãng. RG100 và RZ323 được ghi nhận cho đa hình rõ nhất.
Có 13 marker định vị gần RG100 và RZ323 trên nhiễm sắc thể số 3 cũng được sử
dụng để xem xét liên kết gen. Phân tích ANOVA một chiều chứng minh Nona
Broka mang allele kháng liên kết với RG100 và RZ323 tại các loci số lượng. Khi
phân tích ANOVA hai chiều, tác giả phát hiện thêm RZ323 (trên nhiễm sắc thể
số 3) và RG333 (trên nhiễm sắc thể số 8) liên kết với QTL chịu mặn. Các cá thể
tái tổ hợp mang allele từ Nona Broka ở locus RZ323 và từ IR29 ở locus RG333
có kiểu hình sống sót lâu hơn trong môi trường mặn so với những tổ hợp khác.
Bản đồ QTL (trên cơ sở AFLP và STS marker) cho thấy gen chủ lực
điều khiển tính trạng chịu mặn định vị trên nhiễm sắc thể số 1 (saltol). Bên
cạnh gen chủ lực, 3 QTL được ghi nhận có quan hệ với tính trạng hấp thu K
cao, 4 QTL có quan hệ với tính trạng hấp thu Na thấp và 3 QTL có quan hệ
với tính trạng tỷ số Na/K thấp. Những QTL này định vị trên nhiễm sắc thể số
1, 3, 4, 10 và 12.
2.3 GEN ỨNG VIÊN
Gen ứng viên là các gen với các đa hình phân tử về mặt di truyền liên kết
với locus hoặc QTLs chính, hoặc là các gen với các đa hình phân tử về mặt
thống kê liên kết với các biến thể của tính trạng đang được nghiên cứu (Pflieger
et al., 2001).
2.3.1 Các bước xác định gen ứng viên
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


Gen ứng viên có thể được xác định bởi một số phương pháp, bao gồm kiến

thức đã biết về con đường sinh học, các nghiên cứu liên kết gen, nghiên cứu biểu
hiện gen, và nghiên cứu liên kết trên toàn bộ hệ gen. Các bước xác định gen ứng
viên bao gồm: Chọn, sàng lọc và xác nhận gen ứng viên.

Hình 1.1 Tóm tắt các bước xác định gen ứng viên
2.3.1.1 Chọn gen vứng viên
a. Chọn gen ứng viên chức năng
Gen ứng viên trước tiên được đề xuất dựa trên các nghiên cứu phân tử và
sinh lý (gen ứng viên chức năng) hoặc dựa trên dữ liệu liên kết của locus đang
được xác định (tất cả các gen liên kết chặt chẽ, có thể là gen ứng viên vị trí). Các
thí nghiệm sơ bộ tạo thuận lợi cho sự lựa chọn gen ứng viên. Việc xây dựng các
thư viện cDNA riêng biệt tương ứng với các cơ quan khác nhau, các giai đoạn phát
triển hoặc các phản ứng với stress kèm theo việc sàng lọc các thư viện này hỗ trợ
việc tách biệt gen ứng viên. Công nghệ cDNA và oligonucleotide microarray cũng
cho một hứa hẹn lớn trong việc xác định gen ứng viên và điều chỉnh sự biểu hiện
của mRNA hoặc sự biểu hiện của các đa hình trong DNA hệ gen. Các đột biến
biểu hiện các kiểu hình đặc biệt cũng là nguồn khác của gen ứng viên.
b. Chọn gen ứng viên vị trí
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


Phương pháp này kết hợp phân tích toàn hệ gen và gen ứng viên, trong đó
việc xác định gen ứng viên chủ yếu dựa trên thông tin liên kết vật lý trong đoạn
nhiễm sắc thể xác định QTL. Cách tiếp cận này tập trung vào vùng lân cận của
QTLs đã biết, và gen ứng viên được tìm ra từ hàng chục đến hàng trăm thành
viên gen có trong các vùng nhiễm sắc thể mục tiêu.
Bản đồ các marker cho các gen đã biết chức năng có thể hỗ trợ việc chọn
gen ứng viên vị trí. Sự lựa chọn này được hoàn thành bởi đánh giá mức độ gần

của liên kết với các locus của tính trạng. Phương pháp này được ứng dụng rộng
rãi trong việc tách các dòng gen kháng bệnh ở thực vật. Phân tích bản đồ so sánh
cũng hỗ trợ việc chọn lựa các gen ứng viên vị trí. Bởi các loài có quan hệ họ
hàng thường bảo tồn các cấu trúc hệ gen. Việc bảo tồn các trình tự, thứ tự và
phân bố gen giữa các loài cũng hỗ trợ lựa chọn gen ứng viên vị trí giả định. Giải
trình tự hệ thống của các dòng cDNA cung cấp một số lượng expressed sequence
tags (ESTs) mà rất hiệu quả cho phân tích bản đồ so sánh. Bản đồ liên kết của
marker EST đã được xây dựng ở ngô và lúa.
2.3.1.2 Sàng lọc gen ứng viên
Một khi đã chọn một gen ứng viên, bước tiếp theo các nhà nghiên cứu phải
lựa chọn đa hình nào sẽ là hữu ích nhất để xác định vị trí của gen ứng viên trên
bản đồ di truyền liên kết giữa marker của gen ứng viên và locus đang được xác
định và để tính toán mối tương quan thống kê giữa đa hình của gen ứng viên và
biến thể kiểu hình trong một tập các cá thể không cùng phả hệ. Trong thực vật,
hai phương pháp đang được sử dụng là: vị trí bản đồ di truyền của các gen ứng
viên chức năng giả định và các locus mục tiêu liên quan trong tính trạng nghiên
cứu cần được so sánh.
2.3.1.3 Xác nhận gen ứng viên
Khi gen ứng viên và đa hình thích hợp được chọn, các nhà nghiên cứu
thường tiếp tục kiểm tra vai trò của gen này trong các mẫu bệnh và mẫu không
bệnh được chọn ngẫu nhiên. Việc chọn lọc thành các nhóm riêng biệt giúp cho
cách tiếp cận gen ứng viên có thể trả lời câu hỏi: Liệu có 1 alen của một gen ứng
viên biểu hiện thường xuyên hơn trong nhóm bệnh hay nhóm không bệnh?
Để xác nhận gen ứng viên, phân tích sinh lý bao gồm đo mức độ biểu hiện
của gen ứng viên ở mức độ mRNA (bằng RT-PCR số lượng hoặc northern
blotting) hoặc mức độ protein hoặc bằng xác định hoạt động enzyme của gen ứng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8

viên (Pflieger et al., 2001).
Chuyển gen là cách cuối cùng để xác định một gen ứng viên cho một tính
trạng đơn gen. Tuy nhiên, trong một số trường hợp và đặc biệt là các tính trạng
phức tạp, nó không cung cấp bằng chứng không thể chối cãi rằng gen ứng viên
xác định sự thay đổi tính trạng. Trong những trường hợp này, bằng chứng có thể
chỉ thu được thông qua tái tổ hợp tương đồng.
2.3.2 Phương pháp tin sinh học xác định gen ứng viên chịu mặn
Với sự bùng nổ về thông tin di truyền và thông tin về gen chức năng, các
phương pháp xác định gen gây bệnh đã nhanh chóng phát triển. Cơ sở dữ liệu
bây giờ là rất cần thiết cho quá trình lựa chọn các gen ứng viên kháng bệnh. Khi
trình tự hệ gen được giải mã, việc xác định gen ứng viên trở nên dễ dàng hơn, tuy
nhiên cũng chỉ với các gen đơn. Việc phân tích di truyền các tính trạng phức tạp
vẫn còn là nhiệm vụ khó khăn, và hầu hết các gen quy định các bệnh do nhiều
yếu tố vẫn chưa được phát hiện.
Ngày nay, cơ sở dữ liệu đã trở thành một nguồn cốt lõi cho cho các nhà săn
gen. Các hệ thống thu hồi như Trung tâm Quốc gia về Thông tin công nghệ sinh
học của Entrez, hệ thống thu hồi trình tự và hệ thống thu hồi của Maarten cung
cấp một sự truy cập dễ dàng và nhanh chóng vào một tập hợp các cơ sở dữ liệu
thường xuyên được sử dụng. Trọng tâm chính của các hệ thống thu hồi là để lấy
một tập hợp các cơ sở dữ liệu nhằm đáp ứng các thắc mắc của người sử dụng.
Tích hợp các dữ liệu dựa trên bối cảnh di truyền, chẳng hạn như trong trường Đại
học California, trình duyệt gen SantaCruz và Ensembl, từng bước hình thành nên
giao diện (ví dụ như EnsMart) mà trích xuất dữ liệu dựa trên vị trí nhiễm sắc thể,
biểu hiện gen và bản chất gen. Việc làm giàu các gen ứng viên sử dụng các giao
diện cơ sở dữ liệu, tuy nhiên phụ thuộc nhiều vào kỹ năng hoạt động của các nhà
nghiên cứu. Phương pháp khác đã được phát triển một cách hệ thống để phát hiện
bộ dữ liệu cho hầu hết các gen ứng viên kháng bệnh.
Để xác định gen ứng viên kháng bệnh bằng các nguồn dữ liệu khác nhau,
một số phương pháp đã được phát triển, chẳng hạn như Gene2Diseases (G2D).

Phương pháp này tạo ra khả năng kết hợp các dạng kiểu hình với các dạng chức
năng thông qua các dạng hóa học. Phương pháp G2D gần đây đã được mở rộng
với dữ liệu gắn trình tự được biểu hiện (expressed sequence tag - EST). Hệ thống
mới này làm cho đầu vào kiểu hình cũng đã được cải thiện, nghĩa là làm giảm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


những kiến thức lâm sàng có trước cần thiết để được nhập vào. Phiên bản mới
của G2D thực hiện tốt hơn, chủ yếu là vì nhiều cơ sở dữ liệu hơn được sử dụng
với bộ dữ liệu lớn hơn.
2.3.2.1 Phân tích microarray
Gần đây, phân tích microarray về phản ứng với stress mặn của nhiều loài
cây trồng đã được thực hiện, đánh giá trên nuôi cấy tế bào, cả cây hoặc từng cơ
quan riêng biệt. Một số nền tảng dựa trên microarray là có sẵn cho nghiên cứu
phiên mã ARN vô sinh căng thẳng liên quan đến stress phi sinh học của cây
trồng. Kim et al. (2013) đã kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ muối cao trên phản
ứng biểu hiện gen ở để hiểu rõ hơn các quy định di truyền của sự tăng trưởng và
sự trao đổi chất trong môi trường độ mặn cao. Thí nghiệm sử dụng các giống lúa
đột biến chịu mặn cao Salt10 và Salt23 và giống gốc không có khả năng chịu
mặn Dongjin. Sự biểu hiện gen được đánh giá bằng RNA, tách chiết từ mẫu lá ở
các giai đoạn xử lý muối khác nhau. Kết quả, quan sát được 8.275 gen ứng viên
liên quan đến chịu mặn. Trong đó, quan sát được 342 ortholog gen và 74
pathway gen gắn với sinh tổng hợp phản ứng với muối. Cuối cùng, xác định
được 6 gen biểu hiện một cách khác biệt giữa các giống chịu mặn tốt và chịu mặn
kém bằng cách so sánh gen pathway và gen ortholog. Trong số 6 gen, 3 gen là
up-regulated và 3 gen là down-regulated
Juexin Wang et al. (2011) đề xuất một quy trình hoàn chỉnh để lựa chọn và
cung cấp một nhóm gen đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát mặn từ phân tích

dữ liệu microarray thông qua sử dụng t-test và lựa chọn tính năng lặp đi lặp lại
bởi SVM-RFE (Support Vector Machine Recursive Feature Elimination). Sử
dụng dữ liệu từ GSE14403 từ GEO (Gene Expres-sion Omnibus) của NCBI để
phân tích khả năng chịu mặn ở từng kiểu gen chịu mặn. Dữ liệu microarray được
xử lý bằng thuật toán RMA. Tiến hành thí nghiệm trên kiểu giống lúa FL478,
Pokkali và IR63731, IR29. Các giống gieo trong cát, tưới dung dịch (NaCl và
CaCl2 5:nồng độ 1mol) trong 3 ngày (EC = 7.4 dS/m). Sau 30 ngày, nghiên cứu
sử dụng Affymetrix Rice Genome Array (GP2025 từ GEO) để phân tích dữ liệu
microarray thể hiện bởi các gen từ mô rễ, giải thích các gen chọn lọc bằng cách
sử dụng kiến thức từ ngân hàng gen và cơ sở dữ liệu từ Gene Ontology. Kết quả
chọn lọc và phân tích được top 10 gen ứng viên đóng vai trò quan trọng trong
phản ứng ở các điều kiện mặn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10


Bằng cách phân tích các dữ liệu microarray, Ji Huang et al. (2008) đã thấy
có một gen mã hóa protein tên là WD40 lặp đi lặp lại, được quy định bởi stress
mặn ở lúa và đặt tên là SRWD1 (Salt responsive WD40 protein 1). Các dữ liệu
tìm kiếm được bốn gen bổ sung (SRWD2– SRWD5) để phân tích phát sinh loài,
tất cả 5 gen SRWD ở lúa đã được quy định bởi stress muối.
Kawasaki et al. (2001) đã sử dụng kĩ thuật microarray để theo dõi sự thể
hiện của phân tử transcript và từng quá trình thể hiện gen điều khiển tính chống
chịu mặn trong cây lúa. Trên cơ sở thư viện cDNA ly trích từ rễ lúa và bộ marker
EST của hệ gen cây lúa chịu mặn pokkali, người ta đã áp dụng kỹ thuật
microarray để kiểm soát những transcript trong việc so sánh với nghiệm thức
không xử lý mặn, thời gian thay đổi từ 15 phút đến 1 tuần lễ trong điều kiện gây
mặn nhân tạo. Vật liệu được sử dụng là giống lúa pokkali (chuẩn kháng) và
giống IR29 (chuẩn nhiễm). Nhóm tác giả này tập trung xem xét phản ứng đối với

stress do mặn trong quần thể lai có 1782 transcript dẫn suất từ rễ của cây bị xử lý
mặn (NaCl ở nồng độ 150mM). Kết quả này cho thấy một tiến trình điều tiết gen
chức năng với nhiều mức đồ khác nhau của transcript. Trong giai đoạn đầu tiên,
đáp ứng của IR29 chậm hơn so với pokkali. Sau 3-6 giờ xử lý mặn, mức độ
phong phú của transcript thay đổi nhanh trong Pokkali, còn IR29 có sự suy giảm
trong vòng 3 giờ đầu gây nên cái chết của giống này ngay sau đó.
2.3.2.2 Phân tích cDNA
cDNA được nghiên cứu để xác định các gen mà các gen này biểu hiện một
cách khác biệt trong phản ứng với stress mặn. Nghiên cứu của Zahra et al. (2013)
đã xây dựng hai thư viện cDNA từ mRNA của mẫu chồi trong điều kiện mặn ở
giai đoạn I (24h) và II (10 ngày) đối với giống lúa At354 (một giống đã cải tiến
tính chịu mặn, nhưng chưa xác định gen). Tổng số 3192 và 960 dòng cDNA
được sàng lọc từ giai đoạn I và II tương ứng. Sau đó, các dòng cDNA được lai
khác biệt với mẫu dò được chuẩn bị từ mẫu chồi của At354 trong điều kiện ức
chế mặn và đối chứng (không bị ức chế mặn). Các dòng cDNA được xác định là
biểu hiện một cách khác biệt được tái khẳng định bằng RNA dot blot method.
RT-PCR (relative reverse transcription polymerase chain reaction) được thực
hiện để so sánh mức độ biểu hiện của các gen được xác định. Giải trình tự và tìm
kiếm tương đồng liên tiếp đã xác định 14 gen up-regulated và 17 gen downregulated trong giai đoạn I. Tương tự, 11 gen up-regulated và 2 gen downregulated được xác định trong giai đoạn II. Những gen này có thể cho phép khám
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


phá con đường mới cho việc thao tác chịu mặn ở lúa.
Nghiên cứu xác định số lượng các biểu hiện của gen SalT –gen được cho
rằng có khả năng chịu mặn, mô tả các vùng promoter của gen này và xác định
được các yếu tố cis- có thể sẽ tham gia vào việc biểu hiện gen có khả năng chịu
mặn. Kết quả đã tìm được promoter Os01g0348900-SalT không duy trì mối quan
hệ trực tiếp với khả năng chịu mặn nhưng với cơ chế cho phép thích nghi với

điều kiện này (Letícia. C. Benitez, Luciano C. da Maia et al., 2013)
Gen SalT mã hóa muối cho một nhóm các protein carbonhydrate (lectin).
Một số tác giả cho thấy sự gắn kết của lectin để loại đường có vai trò quan trọng
trong việc kích thích phản ứng với stress phi sinh học, điều chế tín hiệu trong
màng tế bào và tế bào chất (Van Damme et al., 2004). Ở lúa gen này đã được
phân lập và đặc trưng ở cây trồng chịu mặn, xác nhận sự tham gia của mình trong
việc thích ứng với điều kiện của cơ chế thẩm thấu (Zhang et al., 2000)
2.4 CHỈ THỊ ADN TRONG XÁC ĐỊNH GEN ỨNG VIÊN LIÊN QUAN
ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN
2.4.1 Chỉ thị ADN
Chỉ thị phân tử (chỉ thị ADN) là các chỉ thị chọn lọc trực tiếp dựa trên cấu
trúc phân tử ADN. Số lượng các chỉ thị ADN là rất lớn, cây trồng có khoảng
108 - 1010 nucleotide trong ADN tổng số và vì thế, nếu giữa 2 cá thể chỉ cần có
sự sai khác nhỏ thì giữa chúng sẽ có một số lượng khổng lồ các chỉ thị ADN để
phân biệt sự sai khác đó. Theo lý thuyết, một chỉ thị ADN lý tưởng phải đáp
ứng đầy đủ các yêu cầu sau:
-

Cho đa hình cao
Di truyền đồng trội
Xuất hiện nhiều trong genome
Tập tính chọn lọc trung tính

- Dễ tiếp cận
- Phân tích nhanh, dễ dàng
Tuy nhiên, gần như không thể tìm được một chỉ thị phân tử nào có thể
thoả mãn được tất cả các yêu cầu trên. Tuỳ thuộc vào từng nghiên cứu mà
người ta sử dụng hệ thống các chỉ thị phù hợp cho mục đích của mình. Các chỉ
thị phân tử được phân loại dựa trên phương pháp thực hiện với chúng bao gồm:
chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN (chỉ thị RFLP) và chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


ADN (chỉ thị RFLP, RADP, SSR…).
2.4.2 Phương pháp thiết kế chỉ thị phân tử
Mồi là một chuỗi oligonucleotide sợi đơn ngắn (kích thước thường từ 18 –
24 nucleotide). Có hai loại mồi được sử dụng cho chẩn đoán bệnh cây:
- Mồi chung (universal/degenerate primers): được thiết kế trên các vùng
bảo thủ cao, có khả năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau (thường các đối
tượng của một chi, một họ).
- Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể phân
biệt được loài, thậm chí dưới loài như chủng/nòi/type sinh học…
Có được các mồi tốt là bước quan trọng nhất trong chẩn đoán bệnh cây. Có
2 cách để có thể nhận được các mồi tốt.
- Tham khảo và lựa chọn từ các nghiên cứu đã được công bố.
- Tự thiết kế mồi.
Để tự thiết kế mồi dựa trên các chuỗi gen sẵn có trên Genbank, người ta cần
sử dụng một phần mềm có khả năng căn trình tự đa chuỗi (multiple sequence
alignment), chẳng hạn ClustalX, Bioedit, MEGA 6. Ngay sau khi các chuỗi ADN
đã được căn trình tự, chúng ta có thể thiết kế các mồi chung hay mồi đặc hiệu tùy
theo yêu cầu.
Các chú ý khi thiết kế mồi
- Độ dài mồi: Nên nằm trong khoảng 18-22 nucleotide. Độ dài này đủ dài
để đảm bảo tính đặc hiệu và đủ ngắn để mồi gắn đễ dàng vào khuôn.
- Nhiệt độ tách chuỗi (Tm = Melting Temperature): Tm là nhiệt độ mà tại
đó 1/2 số sợi ADN kép tách thành sợi đơn. Tm của mồi nên nằm trong khoảng
52-580C.
- Nhiệt độ gắn mồi (Ta = annealing temperature): Ta được tính dựa trên Tm. Ta

quá cao làm mồi khó gắn vào khuôn dẫn tới năng xuất PCR thấp. Ta quá thấp làm
mồi dễ gắn không đặc hiệu vào khuôn dẫn tới tạo các sản phẩm không đặc hiệu. Ta
của 2 mồi xuôi và ngược dòng nên tương đương. Có nhiều cách tính Ta:
Ta = 0.3 x Tm(mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9
- Hàm lượng GC: Số các gốc G và C nên nằm trong khoảng 40-60%.
- Chuỗi GC đầu 3’: Đầu tận cùng 3’ nên là G hoặc C hoặc GC hoặc CG.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


Đầu 3’ không nên có nhiều hơn 3 gốc liên tục G/C.
Việc lựa chọn chiều dài mồi và nhiệt độ nóng chảy của chúng dựa vào
một số lý do. Nhiệt độ nóng chảy của mồi được định nghĩa là nhiệt độ thấp hơn
nhiệt độ của mồi mà sẽ anneal khuôn ADN và cao hơn nhiệt độ làm mồi rời khỏi
khuôn ADN. Nhiệt độ nóng chảy cần tăng lên theo độ dài của mồi. Mồi quá ngắn
sẽ làm anneal một số vị trí trên khuôn ADN dài, dẫn đến các bản sao không đặc
hiệu. Nói cách khác, chiều dài của mồi bị giới hạn bởi nhiệt độ làm nóng chảy
nó. Nhiệt độ nóng chảy quá cao, nghĩa là trên 80°C, có thể gây ra một số vấn đề
do ADN polymerase ít hoạt động ở nhiệt độ này. Chiều dài tối ưu của mồi vào
khoảng 30 đến 40 nucleotide với nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 60°C đến 75°C.
Có một số cách để tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi. (A, G, C và T tương
ứng là số nucleotide của mồi. [Na+] là nồng độ Na+ trong PCR)
Các chuỗi lặp
Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép (ví dụ TATATATA) hoặc chuỗi
lặp đơn (ví dụ TTTT) vì có thể gây ra hiện tượng bắt cặp nhầm (misprime).
Trong một mồi, chỉ nên có tối đa 4 chuỗi lặp. Các chuỗi lặp cũng không nên xuất
hiện nhiều lần trong 1 mồi.
Độ ổn định đầu 3’
Tận cùng đầu 3’ (khoảng 5 nucleotide) không nên chứa toàn gốc G hoặc C

vì có giá trị ∆G cao dễ dẫn tới bắt cặp không đặc hiệu vào khuôn. Trái lại nếu
đầu 3’ chứa quá nhiều gốc T hoặc A sẽ khó bắt cặp.
Vùng thiết kế mồi của khuôn
Vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa quá nhiều cấu trúc thứ cấp.
Nếu các cấu trúc thứ cấp này ổn định ở nhiệt độ gắn mồi thì mồi sẽ không thể bắt
cặp được.
2.5 ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA
CHỊU MẶN
Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết
với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương
tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Ở đây, thay vì phải đánh giá
kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong
muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14