“nghiên cứu phát triển chủng actinoplanes sp và tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp acarbose”

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG THỊ HẢI YẾN

“NGHIÊN

CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG ACTINOPLANES SP.

VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP
ACARBOSE”

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. VŨ VĂN HẠNH
TS. ĐỒNG HUY GIỚI

HÀ NỘI – 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng
được bảo vệ ở bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã
được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn
gốc.

Hà Nội, tháng 7 năm 2015
Tác giả luận văn

Dương Thị Hải Yến

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bài luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực của bản thân,
tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các cá nhân, tập
thể trong và ngoài trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Văn Hạnh và TS. Đồng Huy Giới đã
tạo điều kiện cho tôi được nghiên cứu và thực hiện bài luận văn tại Phòng Các
chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, chỉnh
sửa luận văn và tạo điều kiện về vật tư, hóa chất và thiết bị cho nghiên cứu để
chúng tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả các anh chị làm việc tại Phòng Các chất
chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tận tình và cho tôi được sống, học tập, làm việc trong
môi trường hòa đồng, thân thiện trong thời gian vừa qua.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo khoa Công nghệ
sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt
những kiến thức chuyên ngành cũng như trong cuộc sống trong suốt thời gian
học tập tại trường.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, tập thể lớp CH22CNSHB và tất
cả bạn bè đã luôn động viên, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho chúng tôi

trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Tác giả luận văn

Dương Thị Hải Yến

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


MỤC LỤC

Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục bảng

vi

Danh mục hình, đồ thị

vii

Danh mục chữ viết tắt

ix

MỞ ĐẦU

1

1. Đặt vấn đề

1

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

2

3. Nội dung nghiên cứu của đề tài

2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2

1.1. Acarbose – thuốc điều trị bệnh tiểu dường type 2

2

1.1.1. Nhóm ức chế hoạt động của α-glucosidase

2

1.1.2. Tính chất hóa học của acarbose

4

1.1.3. Cơ chế tác dụng và dược lý

4

1.1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất acarbose từ các chủng vi sinh vật trên
thế giới và ở Việt Nam
1.2. Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose

5
7

1.2.1. Tổng quan về xạ khuẩn

7

1.2.2. Đặc điểm, hình thái của xạ khuẩn

8

1.2.3. Xạ khuẩn Actinoplanes

8

1.3. Đột biến và cải biến chủng
1.3.1. Giới thiệu về đột biến

9
9

1.3.2. Sự cải biến chủng trên thế giới

10

1.3.3. Sự cải biến chủng ở Việt Nam

11

1.4. Ảnh hưởng của các thành phần môi trường đến khả năng sinh tổng hợp
acarbose của các chủng xạ khuẩn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

12
Page iii


1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến khả năng sinh tổng hợp acarbose
của các chủng xạ khuẩn

12

1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn Nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp acarbose

của các chủng xạ khuẩn

12

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

14

2.1. Vật liệu

14

2.1.1. Chủng vi sinh vật

14

2.1.2. Hóa chất

14

2.1.3. Dung dịch đệm

14

2.1.4. Môi trường

15

2.1.5. Thiết bị thí nghiệm

15

2.2. Phương pháp nghiên cứu

16

2.2.1. Phương pháp vi sinh

16

2.2.2. Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase (AG) (Yamaki K and Mori
Y 2006)

17

2.2.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng

18

2.2.4. Phương pháp gây đột biến bằng NTG kết hợp với tia UV

18

2.2.5. Tối ưu môi trường lên men sản xuất acarbose

19

2.2.6. Tinh sạch acarbose

24

2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu

25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

26

3.1. Kết quả đột biến và sàng lọc

26

3.1.1. Tạo dòng đột biến bằng NTG kết hợp tia UV

26

3.1.2. Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dòng đột biến bởi
NTG kết hợp tia UV

29

3.1.3. Sắc ký đồ TLC của các dòng đột biến bởi NTG + UV

31

3.1.4. Tính ổn định của một số dòng đột biến qua các thế hệ

33

3.1.5. So sánh hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) trước và sau đột biến

36

3.2. Tối ưu môi trường sản xuất cho hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) đạt cao nhất 37
3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn Nitrogen đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 37
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv


3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)

38

3.2.3. Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 39
3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)41
3.2.5. Tối ưu đa hướng các yếu tố

42

3.2.6. Hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) của chủng Actinoplanes trong môi
trường trước và sau khi tối ưu.

47

3.3. Tinh sạch chất hoạt tính ức chế α-glucosidase từ dịch lên men dòng NV45.18.

48

3.3.1. Tinh sạch qua cột trao đổi cation (amberlyst resin exchange 15R)

48

3.3.2. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng acarbose trong dịch tinh sạch

50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

54

Kết luận

54

Kiến nghị

54

TÀI LIỆU THAM KHẢO

55

PHỤ LỤC

61

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


DANH MỤC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

2.1

Danh mục các hóa chất chính dùng trong thí nghiệm

14

2.2

Các dung dịch đệm và dung dịch hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu

15

2.3

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

16

3.1

Số lượng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau khi xử lý NTG + UV

26

3.2

Hoạt tính ức chế α-glucosidase của một số dòng đột biến chọn lọc

30

3.3

Sắc ký đồ TLC của các dòng đột biến bởi NTG + UV

33

3.4

So sánh hoạt tính α-glucosidase (%) trước và sau đột biến

36

3.5

Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)

37

3.6

Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)

38

3.7

Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)

40

3.8

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)

41

3.9

Các nhân tố tối ưu

42

3.10 Các giải pháp nhận được sau sử dụng phương pháp RSM- CCD

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

46

Page vi

DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ
STT
1.1

Tên hình

Trang

Cấu trúc enzyme α- glucosidase trong phức hợp maltose and NAD+
( />
1.2

2

Ảnh hưởng của chất ức chế α-glucosidase đến quá trình trao đổi
đường trong cơ thể.

3

1.3

Công thức cấu tạo của acarbose

4

1.4

Hình thái xạ khuẩn

8

2.1

Sơ đồ thí nghiệm tối ưu nguồn cacbon

19

2.2

Sơ đồ thí nghiệm tối ưu nguồn nitrogen:

21

2.3

Sơ đồ thí nghiệm tối ưu nhiệt độ

22

2.4

Sơ đồ thí nghiệm tối ưu pH

23

3.1

Đường cong sống sót của chủng Actinoplane sp KCTC 9162 VD sau
khi đột biến bằng NTG kết hợp tia UV

3.2

27

Các dòng khuẩn lạc của xạ khuẩn chủng Actinoplanes sp sau các
khoảng thời gian đột biến

28

3.3

Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ một số dòng đột biến

31

3.4

Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ các dòng đột biến

32

3.5

Tính ổn định của sáu dòng đột biến qua các thế hệ.

34

3.6

Sắc ký đồ TLC dịch lên men lỏng từ sáu dòng đột biến qua các thế
hệ: Acarbose chuẩn 10mg/ml (C), NV45.15(1), NV45.18 (2),
NV15.8 (3), NV15.5 (4), NV30.4 (5): A, B, C, D, E, F lần lượt là sắc
ký đồ TLC dịch lên men lỏng từ các dòng đột biến ở thế hệ 2, thế hệ
3, thế hệ 4, thế hệ 5, thế hệ 6 và thế hệ 7)

35

3.7

So sánh hoạt tính α-glucosidase (%) trước và sau đột biến

36

3.8

Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)

37

3.9

Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)

39

3.10 Ảnh hưởng cả pH môi trường đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)

40

3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)

41

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


3.12 Tương tác giữa hàm lượng maltose và pH tới khả năng ức chế αglucosidase (%)

43

3.13 Tương tác giữa pepton với nhiệt độ tới khả năng ức chế αglucosidase (%)

44

3.14 Tương tác giữa pepton với Maltose tới % ức chế α-glucosidase

45

3.15 Tương tác giữa nhiệt độ với pH tới khả năng ức chế α-glucosidase (%)

45

3.16 Giải pháp tối ưu thực nghiệm theo mô hình RSM-CCD

46

3.17 Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men dòng NV45.18

trong môi trường trước và sau tối ưu; C: acarbose chuẩn; 1: MT trước
tối ưu; 2: MT sau tối ưu.

47

3.18 So sánh hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) của dịch lên men chủng
NV45.18 trong môi trường trước và sau khi tối ưu.

48

3.19 Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men dòng NV45.18
trong môi trường trước khi đưa qua cột.

49

3.20 Sắc ký đồ TLC các phân đoạn acarbose từ dịch lên men dòng
NV45.18 khi qua cột trao đổi ion dạng acid amberlyst 15R.
C: acarbose chuẩn; 1-18: các phân đoạn.

50

3.21a Phổ MS của mẫu chuẩn Acabose (C25H43NO18, KLPT 645.60) từ
Sigma (CAS Number 56180-94-0, EC Number 260-030-7, (Sigma)
được xác định trong dung môi methanol hệ thống LC/MS-MS-xevo
TQ, ESI.

51

3.21b Phổ MS của Acabose tinh sạch được xác định trên hệ thống
HPLC/MS-MS-xevo TQ, ESI.

3.21c Mẫu sau sắc kí trao đổi cation amberlyst resin exchange 15R

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

52
53

Page viii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

ĐTĐ

Đái tháo đường

NTG

N-methyl-N’-nitron-nitrosoguanidine

AGI

α-glucosidase inhibition

TLC

Thin-layer chromatography

RSM

Response Surface Methods

CCD

Central Composite Design

BĐT

Bột đậu tương

UC

Ức chế

CNM

Cao nấm men

pNP-G

ρ- nitrophenyl α- D- glucopyranoside

ĐB

Đột biến

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ix


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Acarbose là hợp chất hữu cơ giả đường (pseudo-oligosaccharide), hoạt động
như một chất ức chế cạnh tranh α-glucosidase, khó bị tiêu hóa và không có độc
tính (Wehmeier UF and Piepersberg W 2004). Hiện nay, acarbose đã được sử dụng
rộng rãi trong điều trị bệnh đái tháo đường type 2 (không phụ thuộc insullin)
(Kihara Y, Ogami Y et al. 1997; Hanefeld M 2007; Hanefeld M, Schaper F et al.
2008). Khi dùng acarbose duy nhất để điều trị đái tháo đường type 2 cùng chế độ
ăn, acarbose làm giảm nồng độ trung bình của hemoglobin glycosylat (0.6 đến
1%). Trái ngược với tác dụng của sulfonylurea, acarbose không làm tăng tiết
insulin. Các hoạt động ức chế sự tăng đường huyết xuất phát từ một sự ức chế cạnh
tranh thuận nghịch α-amylase tuyến tụy và enzyme thủy phân tạo đường ở màng
ruột kết. Acarbose thuộc nhóm C7 N-aminocyclitol, một sản phẩm tự nhiên
(Mahumud T 2003) do các chủng Actinoplanes sp. như Actinoplanes sp. SE50
(Goeke K, Drepper A et al. 1996) Actinoplanes sp. A56 (Wei S, Cheng X et al.
2010), Actinoplanes sp.CKD485-16 (Choi BT and Shin CS 2003) sinh tổng hợp ra.
Actinoplanes là một chủng xạ khuẩn được nghiên cứu rộng rãi, nhiều
nghiên cứu đã chứng minh chủng Actinoplanes sp. sinh tổng hợp ra acarbose như
là một sản phẩm tự nhiên. Maltose cần được duy trì ở nồng độ cao trong môi
trường trong suốt quá trình lên men để sinh tổng hợp acarbose có hiệu quả (Choi
BT and Shin CS 2003). Dịch chiết ngô là phụ phẩm chính trong công nghiệp chế
biến bột ngô, được sử dụng rộng rãi và thành công làm môi trường giá thấp trong
nhiều quá trình lên men (De Azeredo LAI, de lima MB et al. 2006). Ngoài ra,
maltose có tác động rõ rệt đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp.
A56 do maltose cấu thành nên acarbose (Lee S, Saueribrei B et al. 1997; Choi

BT and Shin CS 2003; Cheng X, Xu B et al. 2008; Wei SJ, cheng X et al. 2010).
Tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường đang tăng nhanh trên toàn thế giới, nhu cầu
đối với các thuốc tiểu đường cũng như acarbose ngày càng tăng. Vì vậy, việc
nghiên cứu phát triển chủng Actinoplanes sp. tổng hợp acarbose cao sản có vai
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


trò hết sức quan trọng và cấp thiết. Tuy nhiên, ở nước ta có rất ít đề tài nghiên
cứu và sản xuất thành công chế phẩm kìm hoãm hoạt động của men αglucosidase từ các chủng xạ khuẩn dùng cho bệnh tiểu đường type 2. Cũng có
nhiều phương pháp đã được sử dụng để nâng cao việc sản xuất acarbose
(Beunink J, Schedel M et al. 1997; Choi BT and Shin CS 2003). Nhưng cho đến
nay, có ít thông tin về việc tối ưu hóa môi trường lên men sinh tổng hợp
acarbose. Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn, chúng tôi tiến hành đề tài
“Nghiên cứu phát triển chủng Actinoplanes sp. và tối ưu điều kiện lên men
sinh tổng hợp acarbose”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Chọn được một chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp acarbose năng suất cao.
- Tối ưu môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose của chủng xạ khuẩn

theo phương pháp RSM- CCD.
- Tối ưu qui trình tinh sạch acarbose

3. Nội dung nghiên cứu của đề tài
- Gây đột biến chủng xạ khuẩn bằng cách sử dụng hóa chất gây đột biến

NTG (N-methyl-N’-nitron-nitrosoguanidine) và tia UV (tia cực tím).
- Sàng lọc các chủng đột biến từ chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng

hợp acarbose cao nhất.
- Tối ưu môi trường lên men sản xuất acarbose từ chủng xạ khuẩn chọn

lọc sau đột biến.
- Tinh sạch acarbose từ môi trường lên men chủng xạ khuẩn chọn lọc sau

đột biến

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Acarbose – thuốc điều trị bệnh tiểu dường type 2
1.1.1. Nhóm ức chế hoạt động của α-glucosidase
α-glucosidase gồm nhóm các enzyme (amylase, succrase, maltase, αamylase) thủy phân hydratcacbon để giải phóng ra đường; α-glucosidase có
nhiều nguồn gốc khác nhau: vi khuẩn, nấm mốc, đường tiêu hóa động vật…, αglucosidase từ nguồn gốc khác nhau sẽ dẫn đến sự khác biệt về pH hoạt động,
nhiệt độ hoạt động, hoạt tính…(Chiba S 1997).

Hình 1.1: Cấu trúc enzyme α- glucosidase trong phức hợp maltose and
NAD+ ( />Tinh bột hoặc đường saccarose là những chất dinh dưỡng quan trọng còn
được gọi là cacbonhydrat. Để cơ thể người có thể hấp thụ được, cacbonhydrat sẽ
bị phân cắt hoàn toàn thành monosaccharit nhờ hệ thống enzyme tiêu hóa. Dưới
tác dụng của amylase, tinh bột bị phân cắt thành oligosaccharide (Viera
Horváthová, Štefan Janeček et al. 2000).
Sau đó, α-glucosidase thủy phân các oligosaccharid thành các monosaccharit
tại ruột non và làm tăng quá trình hấp thu monosaccharit, làm tăng đường huyết. Chất
ức chế α-glucosidase có tác dụng ngăn cản sự tạo thành monosaccharit từ
oligosaccharid được dùng trong điều trị tiểu đường type 2 (Bischoff H 1995).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


Saccharose

Tinh bột

(Glucose + Fructose)
Amylase
Maltose
(Glucose + Glucose)

α-glucosidase

Chất ức chế

Glucose

Chất ức chế

Glucose

Glucose

Fructose

Mạch máu

Glucose huyết tăng
Hình 1.2: Ảnh hưởng của chất ức chế α-glucosidase đến quá trình trao đổi
đường trong cơ thể.
Acarbose (tên thương mại Precose): là chất ức chế α-glucosidase và làm
chậm tốc độ thủy phân tinh bột để tạo glucose; làm tăng nồng độ lactate và làm
giảm tổng acid béo dễ bay hơi liên quan đến toan cấp tính đã bị giảm; ngăn chặn
và giảm tỷ lệ nhiễm acid hiệu quả hơn việc dùng natri bicarbonate trong mô hình
thử nghiệm cấp tính (McLaughlin CL, Thompson A et al. 2009). Acarbose là hợp
chất hữu cơ giả đường (pseudo-oligosaccharide), hoạt động như một chất ức chế
cạnh tranh α-glucosidase, khó bị tiêu hóa và không có độc tính (Wehmeier UF
and Piepersberg W 2004). Hiện nay, acarbose đã được sử dụng rộng rãi trong
điều trị bệnh đái tháo đường type 2 (không phụ thuộc-insullin) (Kihara Y, Ogami
Y et al. 1997; Hanefeld M 2007; Hanefeld M, Schaper F et al. 2008).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


1.1.2. Tính chất hóa học của acarbose
Acarbose thuộc nhóm C7 N-aminocyclitol, một sản phẩm tự nhiên
(Mahumud T 2003) do các chủng Actinoplanes sp. như Actinoplanes sp. SE50
(Goeke K, Drepper A et al. 1996) Actinoplanes sp. A56 (Wei SJ, cheng X et al.
2010), Actinoplanes sp.CKD485-16 (Choi BT and Shin CS 2003) sinh tổng hợp
ra. Cấu trúc của acarbose gồm một nửa là phân tử acarviose và nửa còn lại là
maltose. Acarviose là đơn vị lõi của acarbose, với chức năng quan trọng và chủ
yếu kìm hãm α-glucosidase. Các đơn vị maltosyl cấu thành nên phân tử acarbose
hầu hết bắt nguồn từ phân tử maltose (Lee S, Saueribrei B et al. 1997).

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của acarbose

Acarbose (C25H43NO18), với danh pháp O-4,6- dideoxy4-[[(1S, 4R,5S, 6S)4,5,6- trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-2- cyclohexen-1-yl] amino] α-D- glucopyranos
YL-(1→4)-O-α-D- glucopyranosyl-(1→4)-D-glucose. PLT 645,6 hòa tan trong
nước và có pKa là 5,1.
1.1.3. Cơ chế tác dụng và dược lý
• Cơ chế tác dụng
Khi dùng acarbose duy nhất để điều trị đái tháo đường type 2 cùng chế
độ ăn, acarbose làm giảm nồng độ trung bình của hemoglobin glycosylat (vào
khoảng 0,6-1%). Trái ngược với sulfonylurea, acarbose không tăng cường tiết
insullin. Các hoạt động ức chế sự ra tăng đường huyết xuất phát từ một sự ức chế
cạnh tranh thuận nghịch α-amylase tuyến tụy và enzyme thủy phân tạo đường ở
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


màng ruột kết. α-Amylase tụy thủy phân tinh bột thành oligosacchride trong lumen
của ruột non, trong khi màng có các α-glucosidase thủy phân oligosacchride,
trisaccharide, và disaccharide thành glucose và các monosaccharide khác trong
ruột non (Viera Horváthová, Štefan Janeček et al. 2000).
• Dược động học
Chuyển hóa acarbose:
Acarbose được chuyển hóa hoàn toàn trong đường tiêu hóa, chủ yếu do
hệ vi khuẩn đường ruột, bên cạnh đó nó còn được chuyển hóa bởi các enzyme
tiêu hóa khác. Một phần nhỏ các chất chuyển hóa (khoảng 34% liều dùng) được
hấp thu và sau đó bài tiết qua nước tiểu. Một chất chuyển hóa cũng có bản chất
ức chế hoạt động α-glucosidase (phân tử acarbose đã cắt bớt đi một phân tử
glucose) (Hanefeld M, Schaper F et al. 2008).
Một số ưu điểm và nhược điểm khi sử dụng acarbose
• Ưu điểm
Giảm sự gia tăng đường huyết, giảm lượng hemoglobin liên kết với

đường, không có nguy cơ hạ đường huyết khi dùng đơn trị liệu, giảm lượng
insullin phải dùng hàng ngày, giảm tình trạng tăng insullin huyết ở bệnh nhân đái
tháo đường type 2, cải thiện việc sử dụng insullin, cải thiện tình trạng chuyển hóa
của bệnh nhân về lâu dài ( />• Nhược điểm
Khi dùng thuốc có một vài tác dụng không mông muốn có thể xảy ra như
đầy hơi, đau bụng, tiêu chảy. Khi đang dùng phối hợp acarbose với các thuốc hạ
đường huyết khác, nếu đường huyết giảm quá mức phải giảm liều các thuốc dùng
kèm theo cho thích hợp, acarbose sẽ không gây hạ đường huyết
( />1.1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất acarbose từ các chủng vi sinh vật trên
thế giới và ở Việt Nam
• Trên thế giới
Chủng Actinoplanes sp. CKD485-16 được lên men sinh tổng hợp
acarbose với năng suất 2,3 g/l acarbose và 0,6 g/l thành phần C của acarbose sau
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


khi kết thúc lên men. Maltose, bán phân tử của acarbose, cần được duy trì ở nồng
độ cao trong môi trường trong suốt quá trình lên men để sinh tổng hợp acarbose
có hiệu quả (Choi BT and Shin CS 2003). Các liên kết giữa phân tử acarviose và
maltose trong phân tử acarbose được hình thành bởi acarviosyl transferase
(Hemker M, S.A. et al. 2001). Đã có nhiều lỗ lực trong nghiên cứu để cải thiện
sản xuất acarbose (Beunink J, Schedel M et al. 1997). Tuy nhiên, đến nay, rất ít
thông tin, công trình được công bố liên quan đến tối ưu hóa quá trình lên men
sinh tổng hợp acarbose, họ mới chỉ báo cáo ở mức độ phân lập và nhận biết các
chủng sinh tổng hợp acarbose (Cheng X, Xu B et al. 2008).
Để nâng cao năng suất sinh tổng hợp acarbose, Wei et al. (2010) đã tối
ưu môi trường lên men cho chủng Actinoplanes sp. A56, ảnh hưởng của glucose,
maltose, dịch chiết ngô, bột đậu tương và monosodium glutamate đến sinh tổng

hợp acarbose. Maltose và dịch chiết ngô là hai yếu tố có tác dụng quan trọng, làm
tăng sinh tổng hợp acarbose từ 837 đến 1043mg/l (Wei SJ, cheng X et al. 2010).
Maltose có tác động rõ rệt đến sinh tổng hợp acarbose bởi chủng
Actinoplanes sp. A56 (Lee S, Saueribrei B et al. 1997), nồng độ maltose trong
dịch nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất acarbose. Choi và Shin
(2003), đánh giá ảnh hưởng maltose đến việc sản xuất acarbose bởi chủng
Actinoplanes sp. CKD485-16 và maltose cần được duy trì ở nồng độ cao trong
suốt quá trình lên men. Nồng độ maltose trong môi trường tối ưu được tăng từ 30
lên 61,25g/l (Choi BT and Shin CS 2003; Wei SJ, cheng X et al. 2010).
Dịch chiết ngô (corn steep liquor) là nguồn nitrogen rất quan trọng đối
với nhiều vi sinh vật (Shah MM and Cheryan M 1995; Silveira MM, Wisbeck E
et al. 2001; Vu VH and Kim K 2009). Hơn nữa dịch chiết ngô là phụ phẩm chính
trong công nghiệp chế biến bột ngô, được sử dụng rộng rãi trong nhiều quá trình
lên men như sản xuất dung môi, kháng sinh và enzyme do giá thành thấp (De
Azeredo LAI, de lima MB et al. 2006). Dịch chiết ngô là một yếu tố quan trọng
để sản xuất acarbose và sử dụng làm nguồn nitrogen rẻ tiền để sản xuất acarbose
ở qui mô công nghiệp bởi Actinoplanes sp. A56 (Wei SJ, cheng X et al. 2010).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


• Ở Việt Nam
Cho tới nay chưa có đề tài nào nghiên cứu và sản xuất thành công chế
phẩm kìm hãm đặc hiệu α-glucosidase từ các chủng vi sinh vật dùng điều trị bệnh
đái tháo đường, và hiện có hai đề tài cấp Bộ NN và PTNN giai đoạn 2010-2012 “
Nghiên cứu sản xuất một số thực phẩm chức năng cho người bệnh đái tháo
đường từ là dâu tằm” do TS. Hoàng Thị Lệ Hằng, viện khoa học nông nghiệp
Việt Nam làm chủ nhiệm và đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm

chức năng từ đậu tương lên men bởi nấm mốc dùng cho người bệnh đái tháo
đường” do TS. Nguyễn Thị Hương Trà, Viện Cơ Điện NN, và CN sau thu hoạch
làm chủ nhiệm, hai đề tài này mới ở giai đoạn bắt đầu thực hiện. Những công
trình nghiên cứu về chất ức chế hoạt động của α-glucosidase mới bắt đầu trong
những năm gần đây tại Viện CNSH: “phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh
vật sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase (AGI) dùng trong điều trị bệnh đái
tháo đường” 2011-2012.
1.2. Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose
1.2.1. Tổng quan về xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt, khuẩn lạc khô và đa số có dạng
hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh như nấm
(myces). Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Số lượng đơn vị sinh khuẩn
lạc xạ khuẩn trong 1g đất thường đạt tới hàng triệu. Trên môi trường đặc đa số xạ
khuẩn có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) và khuẩn ty cơ
chất ( substrate mycelium). Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ chất nhưng cũng có
loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí sinh. Giữa khuẩn lạc thường
thấy có nhiều bào tử màng mỏng gọi là bào tử trần (conidia hay conidiospores).
Nếu bào tử nằm trong bào nang (sporangium) thì được gọi là nang bào tử hay bào
tử kín (sporangiospores). Bào tử ở xạ khuẩn được sinh ra ở đầu một số khuẩn ty
theo kiểu hình thành các vách ngăn (septa). Các chuỗi bào tử có thể thẳng, có thể
xoắn, có thể ở hình dạng lượn sóng, có thể mọc đơn hay mọc vòng… Các cuống
sinh bào tử (sporophore) và cuống sinh nang bào tử (sporangiophorres) có thể
riêng rẽ, có thể phân nhánh (.).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


1.2.2. Đặc điểm, hình thái của xạ khuẩn
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh

và không có vách ngăn. Hệ sợ xạ khuẩn mảnh hơn nấm mốc với đường kính thay
đổi trong khoảng 0.2-1µm đến 2-3µm, chiều dài có thể đặt tới một vài cm (Dũng
NL, Quyến NĐ et al. 2007). Kích thước và khối lượng hệ sợi của xạ khuẩn
thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý, nuôi cấy. Khuẩn lạc
của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng
mảnh dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, nâu,
xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh. Các sản phẩm trong quá
trinh trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ…
có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra môi
trường. Hình thái luôn là đặc điểm chung để nhận dạng và định danh xạ khuẩn.
Tuy nhiên, trình tự 16S rRNA cho thấy các đặc điểm hình thái của xạ khuẩn có ít
mối tương quan về di truyền và tiến hóa giữa các chủng xạ khuẩn (Hà BT 2008).

Hình 1.4: Hình thái xạ khuẩn
( />
1.2.3. Xạ khuẩn Actinoplanes
Actinoplanes là một xạ khuẩn thuộc lớp: Actinobacteria; Phân lớp:
Actinobacteridae; Chi: Actinoplanes. Các chi Actinoplanes có đặc điểm (Wiliams
and Wilkins 1974) là có 3-20 bọc bào tử, mỗi bọc bào tử có kích thước bởi 6-30
micromet. Các bọc bào tử có thể là hình cầu, hình trụ với đầu tròn, hoặc không
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


có hình dạng xác định. Các bào tử hình cầu có đường kính 1-1,5 mm, xuất hiện
trong vòng xoắn theo trật tự, hoặc đột ngột được sắp xếp trong bọc bào tử
(Simone M, Monciardini P et al. 2013).
Actinoplanes sp. tổng hợp acarbose cao sản được sử dụng trong lên men
với qui mô lớn kể từ năm 1990 (UF W and WP 2004). Chủng Actinoplanes sp.

cho năng suất sinh tổng hợp acarbose 2,3g/l môi trường lên men chứa matlose.
Actinoplanes sp. còn được ứng dụng trong việc sản xuất các loại dược
liệu như: kháng khuẩn (Fremmer W, Puls W et al. 1975; Vértesy L, Ehlers E et
al. 2000), kháng nấm (Cooper R, Truumees I et al. 1992) và các tác nhân chống
ung thư (Jung H-M, Jeya M et al. 2009).
1.3. Đột biến và cải biến chủng
1.3.1. Giới thiệu về đột biến
Đột biến là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền ở cấp độ
phân tử (ADN, gen) hoặc cấp độ tế bào (nhiễm sắc thể), dẫn đến sự biến đổi đột
ngột của một hoặc một số tính trạng, những biến đổi này có tính chất bền vững
và có thể di truyền cho các đời sau (Lê Đình Trung 2002)
Đột biến là quá trình xảy ra đột ngột, riêng rẽ, ngẫu nhiên, không định
hướng ở cơ thể sống trong điều kiện tự nhiên. Đa số là đột biến gen lặn và có hại,
một số ít có lợi và có ý nghĩa rất lớn đối với quá trình tiến hóa và chọn giống (Lê
Đình Trung 2002).
Chúng có thể chỉ xảy ra đối với một tế bào đơn lẻ hoặc có thể được
chuyền từ một tế bào khác trong một sinh vật đa bào (tế bào soma đột biến), hoặc
có thể được truyền từ một thế hệ khác đột biến thông qua giao tử (mầm dòng đột
biến). Đột biến có thể được gây ra bởi các yếu tố tự nhiên từ môi trường, từ sự
hoạt động hay không hoạt động của enzyme sửa chữa, và từ những hóa chất (chất
gây đột biến) hoặc các bức xạ năng lượng cao. Tỷ lệ đột biến khác nhau giữa các
loài sinh vật, giữa các gen, thời gian và địa điểm. Nó có thể gây ra tác động đáng
kể không chỉ đối với cá nhân mà còn cả sự tiến hóa chung của các loài. Những
biến đổi này có tính chất bền vững và có thể di truyền cho các thế hệ sau, góp
phần thúc đẩy đa dạng sinh học (Mai Xuân Lương 2001).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9

Đối với các enzyme sử dụng trong công nghiệp phải được sản xuất với
chi phí thấp và có thể tái sử dụng và tái sản xuất. Để đạt được điều này, việc
cải thiện thường được thực hiện bằng kỹ thuật đột biến. Người ta có thể tạo
đột biến bằng các chất gây đột biến hóa học như N-methyl-N’-nitro-Nnitrosoguanidine (NTG), EMS… hoặc bằng cách chiếu xạ vật lý như tia X, tia
UV (Zhang M and et al 2009).
Sự đột biến các dòng nấm để tạo ra các enzyme công nghiệp khác nhau
như: protease, chitinase, cellulose, glucoamylase….đã được sử dụng rộng rãi
(Kudad R, Kumar M et al. 1994; Chand P and et al 2005).
1.3.2. Sự cải biến chủng trên thế giới
Trước thập kỷ 70, công nghệ sinh học được hiểu là sự lên men công
nghiệp vi sinh vật để tạo thương phẩm. Trong những thập kỷ 60 và 70 công nghệ
lên men đã phát triển thành một ngành công nghiệp lớn. Giống vi sinh vật được
xem là yếu tố quyết định trong thành công của ngành công nghiệp lên men này.
Phương pháp chọn giống cổ điển được tiến hành trên các chủng phân lập từ tự
nhiên và sau đó đột biến bằng tia tử ngoại và bằng hoá chất.
Năm 1994, Kuhad và cộng sự đã xử lý chủng nấm Fusarium oxysporum
bằng tia cực tím, chủng đột biến được xử lý với NTG đã làm tăng khả năng tổng
hợp Cellulose lên nhiều lần so với chủng tự nhiên (Kudad R, Kumar M et al.
1994).
Năm 1992, các nhà khoa học Nhật Bản đã đột biến chủng
Actinoplanes sp. N902-109 (FERM BP-3832) và biến nạp để sản xuất rapamycin
(Nakao Kojima and Yasuhiro Kojima et al 1992).
Năm 1996, Anneliese Crueger và cộng sự đã đột biến chủng
Actinoplanes sp. SE 50/110 để chọn lọc ra gene sinh tổng hợp acarbose từ chủng
xạ khuẩn đột biến này (Anneliese Crueger and Jurgen Distler et al 1996).
Năm 1998, Kim và cộng sự đã sử dụng xung điện và hóa chất NTG để
cải biến hai chủng nấm men S. diastaticus (ATCC 28339) và Saccharomyces
spp. trong sản xuất cồn sinh học. Dòng đột biến chọn lọc NF30-9 lên men được
ethanol nồng độ cao hơn (Keun K and Jae- Yeon L 1998).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10


Năm 2003, các nhà khoa học Hàn Quốc là Lee Jae-Chan và cộng sự đã
đột biến chủng Actinoplanes teicomyceticus bằng hóa chất NTG và tia UV đã
làm tăng khả năng sinh tổng hợp teicoplanin (Jae-Chan Lee and Hae-Ryong Park
et al 2003).
Năm 2005, Chand và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm gây đột biến trên
nấm sợi bằng NTG kết hợp với ethidium bromide và UV hoặc NTG kết hợp với
ethidium bromide. Kết quả sang lọc đột biến được chủng có khả năng tổng hợp
cellulose tăng lên nhiều lần so với chủng tự nhiên (Chand P and et al 2005).
Năm 2011, Klaus Selber và cộng sự đã đột biến chủng Actinoplanes
utahensis dại SE50-100 nhằm cải biến gene nâng cao năng suất sinh tổng hợp
acarbose (Klaus Selber and Bernhard Weingaertner et al 2011).
1.3.3. Sự cải biến chủng ở Việt Nam
Năm 2009 , Hồ Tuyên và cộng sự đã sử dụng ba phương pháp gây đột biến
gồm chiếu tia cực tín (UV) vào bào tử, xử lý hóa chất gây đột biến NTG đối với tế
bào trần và các phân đoạn khuẩn ty nâng cao hoạt tính kháng sinh của Acremonium
chrysogenum. Biến chủng tối ưu thu được có hoạt tính kháng sinh tăng khoảng 75%
so với chủng ban đầu (Hồ Tuyên, Nguyễn Thị Hồng Liên et al. 2009).
Năm 2010, tác giả Nguyễn Quỳnh Uyển và cộng sự đã sử dụng hóa chất
gây dột biến NTG để nâng cao hoạt độ phân giải protein của protease ngoại bào
của vi khuẩn Bacillus sp. Sau khi gây đột biến bằng NTG và sàng lọc, hai chủng
vi khuẩn đột biến có hoạt độ phân giải protein cao hơn 1,5 lần và 2 lần so với
hoạt độ so của chủng gốc đã thu được (Nguyễn Quỳnh Uyển and et al 2010).
Năm 2011, Vũ Văn Hạnh và các cộng sự đã xử lý chủng nấm sợi
Aspergillus sp. bằng cách kết hợp tia Rontghen và hóa chất NTG để gây đột biến.
Chủng nấm đột biến chọn lọc có khả năng tổng hợp men phân hủy tinh bột sống
cellulase tăng lên rất rõ rệt so với chủng tự nhiên (Hanh V. V, Anh P.T et al.

2009; Hanh V. V, Anh P.T et al. 2010).
Năm 2012, Vũ Văn Hạnh và các cộng sự tiến hành thí nghiệm nâng cao
độc lực diệt rệp đào của chủng nấm ký sinh côn trùng Lecanicillium bằng đột
biến tia UV và NTG nhằm sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. Sàng lọc 42 dòng nấm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


đột biến, trong đó hai thể đột biến UV (UV10.4 và UV60.3) và ba thể đột biến
NTG (NTG30.2, NTG50.2 và NTG60.2) diệt 100% rệp muội sau 4 đến 5 ngày
phun. Độc lực của các thể đột biến tăng từ 10 đến 20% so với kiểu dại (Vũ Văn
Hạnh, Lê Thị Thùy Dương et al. 2012).
1.4. Ảnh hưởng của các thành phần môi trường đến khả năng sinh tổng hợp
acarbose của các chủng xạ khuẩn.
1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến khả năng sinh tổng hợp acarbose
của các chủng xạ khuẩn
Cacbon là nguyên tố có mặt ở hầu hết các chất trong cơ thể xạ khuẩn
cũng như trong các sản phẩm trao đổi chất. Các hợp chất hữu cơ chứa cả Cacbon
và Nito (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại
mạch, nước chiết giá đậu ...) có thể sử dụng vừa làm nguồn Cacbon vừa làm
nguồn Nito đối với vi sinh vật. Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong
sinh trưởng và hình thành acarbose (Ronald and M. A 1946).
Ngoài ra, maltose có tác động rõ rệt đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng
xạ khuẩn do maltose cấu thành nên acarbose (Lee S, Saueribrei B et al. 1997),
nồng độ maltose trong dịch nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất
acarbose. Choi và Shin (2003), đánh giá ảnh hưởng maltose đến việc sản xuất
acarbose bởi chủng Actinoplanes sp. CKD485-16 và maltose cần được duy trì ở
nồng độ cao trong suốt quá trình lên men. Nồng độ maltose trong môi trường tối
ưu được tăng từ 30 lên 61,25g/l (Choi BT and Shin CS 2003; Wei SJ, Cheng X et

al. 2010).
1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn Nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp acarbose
của các chủng xạ khuẩn
Nitrogen là thành phần dinh dưỡng không thể thiếu được trong quá trình
sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn. Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp
đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn. Sau khi vi sinh vật sử dụng hết gốc
NO3- các ion kim loại còn lại (K+, Na+, Mg2+ ...) sẽ làm kiểm hoá môi trường. Xạ
khuẩn có thể sử dụng nito vô cơ nhưng nito hữu cơ có khả năng nâng cao tốc độ
tăng trưởng. Peptone là nguồn nitro được sử dụng trong môi trường lên men
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


chủng xạ khuẩn Actinoplanes(Ronald and M. A 1946).
Ngoài ra, pH môi trường và nhiệt độ lên men cũng là hai yếu tố quan
trọng trong quá trình sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn.
Trong những năm gần đây nhóm nghiên cứu chúng tôi đã và đang tìm
kiếm những hợp chất ức chế α-glucosidase như acarbose, 1-Deoxynojirimycin
(DNJ) định hướng sử dụng trong điều trị đái tháo đường type 2 (Quyền Đình Thi
and Vũ Văn Hạnh 2011; Vũ Thi Hằng, Vũ Văn Hạnh et al. 2012; Bạch Hoàng
Mi, Nguyễn Thị Nguyệt et al. 2013; Đỗ Thị Tuyên, Vũ Văn Hạnh et al. 2013;
Thi Tuyen Do, Thanh Hoang Le et al. 2014; Thi Tuyen Do and Vu Van Hanh et
al 2014). Đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ điều chế acarbose làm
nguyên liệu thuốc chữa bệnh đái tháo đường” thuộc chương trình NCKH
trọng điểm quốc gia phát triển Công nghiệp dược liệu đến năm 2020, Bộ công
thương 2012-2015 do TS Đỗ Thị Tuyên chủ nhiệm cũng đang được tiến hành.
Trong khuôn khổ của luận văn thạc sỹ, chúng tôi đặt ra nhiệm vụ “Nghiên cứu
phát triển chủng Actinoplanes sp. và tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp
acarbose”. Mục đích của nghiên cứu này là chọn được chủng đột biến tổng hợp

acarbose cao hơn chủng tự nhiên, chọn được môi trường tối ưu rẻ tiền để sản
xuất acarbose cao sản, đồng thời đưa ra được qui trình tinh sạch acarbose.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Chủng Actinoplane sp. KCTC 9162 VD tại phòng Các chất chức năng
sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm đều ở mức độ tinh khiết.
Bảng 2.1. Danh mục các hóa chất chính dùng trong thí nghiệm
Tên hóa chất

Hãng, nước sản
xuất

Tên hóa chất

Hãng, nước
sản xuất

Agar

Việt Nam

KH2PO4

Trung Quốc

Pepton

Bio Basic Inc
(Mỹ)

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

Sucrose

Việt Nam

K2HPO4.3H2O

Trung Quốc

Glucose

Việt Nam

FeSO4.7H2O

Trung Quốc

Casein hydrolysate

Trung Quốc

KCl

Trung Quốc

Bột đậu tương

Thị trường

Muối Natri
citrate

C.ty HC Đức
Giang, VN

CaCO3

Việt Nam

Na2CO3

C.ty HC Đức
Giang, VN

Axit foocmic

Trung Quốc

Methanol

Trung Quốc

Ethylaxetate

Trung Quốc

Ethanol

Trung Quốc

ρ- nitrophenyl α- Dglucopyranoside

Sigma

α- glucosidase

Sigma

Và một số hóa chất khác tinh khiết mức phân tích được sử dụng trong
nghiên cứu.
2.1.3. Dung dịch đệm
Các dung dịch và đệm sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14