kỹ thuật phân tách .công nghệ sinh học

Viện Công Nghệ Sinh Học - Công Nghệ Thực Phẩm
Viện Đào Tạo Sau Đại Học - Đại Học Bách Khoa Hà Nội

TIỂU LUẬN MÔN HỌC
KỸ THUẬT PHÂN TÁCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC

Đề Tài: Phương Pháp Thử Hoạt Tính Chống Ung Thư

Giáo viên : PGS.TS

:

Học viên : Nguyễn Thu Hà
Trần Thị Duyền
Đinh Thị Mỹ Linh
Lớp : CH2014B. CNSH. KH
Hà Nội 2014


1. TỔNG QUAN

NỘI DUNG

2. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT
TÍNH CHỐNG UNG THƯ
3. ỨNG DỤNG

4. TÀI LIỆU THAM KHẢO


1. TỔNG QUAN

1.1. Ung thư
•

Ung thư là tên chung dùng để gọi
một nhóm bệnh trên 200 loại khác
nhau gây ra bởi sự phân chia
không kiểm soát được của tế bào

•

Ung thư rất khó phát hiện cho tới
khi nó phát bệnh ra ngoài

•

Ung thư lành tính là chỉ việc các
khối u không lan rộng trong cơ
thể. Ung thư ác tính lây lan (di
căn) ra khắp cơ thể và dẫn tới
việc chữa trị trở nên cực kỳ khó
khăn


1.2 Cơ sở phân tử của bệnh ung thư
•

Một gen mã hóa protein kích
thích sinh sản bị đột biến và trở
nên hoạt động bất thường, dẫn
đến tế bào có thể sinh sản vô hạn

(bất tử) . Một gen mã hóa sản
phẩm ức chế sinh sản bị đột biến
bất hoạt, dẫn đến không còn sự
kiểm soát sinh sản của tế bào
khối u.

Các gốc tự do trong ung thư:
Các tác nhân gây ung thư rất đa
dạng: các hợp chất amino,
hydrocacbon đa vòng; thực phẩm
biến
chất,
bức
xạ…
Tuy bản chất rất khác nhau,
nhưng các tác nhân kể trên có
bản chất chung là sinh gốc tự do
R* theo các cơ chế khác nhau.
Đám gốc tự do R* tấn công chuỗi
DNA tạo các chất hư hỏng của
DNA, tạo NST sai lệch, ghép
nhầm các base khi sao chép gây
nên đột biến gen.


- Nhiều hợp chất thiên nhiên đã được sử dụng một cách hiệu quả trong việc điều trị, phòng ngừa
trong ung thư bằng cách làm tế bào ung thư phát triển kém, hay yểm trợ tối đa để mạng lưới tế bào
phòng vệ ( các loại thực bào) có thể truy lùng và huỷ diệt tế bào ung thư ngay từ đầu.
- Các hợp chất có hoạt tính trong việc chống ung thư: Curcumin, Catechin, Allicin, Sulforaphane ,
Selen, β- Glucan…

Lycopene
chống ung thư tuyến tiền liệt

Catechin
chữa ung thư da, bao tử, lá lách, phổi

Sulforaphane
chống ung thư gan, dạ dày

Allicin
chữa bệnh ung thư dạ dày, ung thư tử cung


2. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH
CHỐNG UNG THƯ
2.1. khái niệm
Khảo nghiệm sinh học ( Bioassay): là thử nghiệm được thiết kế để phân tích tác động
Sinh học bất kỳ của một hợp chất nào bằng cách sử dụng các hệ thống sinh học phù
hợp
2.2 Phương pháp:
>> Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư (phương pháp sinh học và phương pháp

dược học) Tế bào ung thư in vitro được nuôi cấy theo phưon̛ g pháp của Skehan et al. (1991) [1].
Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư được xác định theo phưon̛ g pháp SRB
Likhiwitayawuid et al. [2]. Thử nghiệm SRB là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để
xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện với
các phận tích điện dương của protein tế bào. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng
protein của tổng số tế bào.
Nguyên tắc: Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ

quang học OD trên máy quang phổ. Kết quả so sánh với chất đối chứng có hoạt tính gây độc đối
với dòng tế bào ung thư thử nghiệm và nếu Giá trị IC50 < 20μg/ml được coi là đạt chuẩn với
chất chưa tinh khiết, Giá trị IC50 < 4μg/ml được coi là đạt chuẩn với chất tinh khiết,
- ODcontrol(-) là giá trị thu được ở giếng thử chỉ có môi
trường nuôi cấy mà không có tế bào.
- ODcontrol(+) là giá trị thu được ở giếng thử có môi
trường nuôi cấy chứa tế bào nhưng không xử lý với mẫu
cặn dịch chiết.
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần
trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm
máy tính table curve.


Vật liệu:
- Phân đoạn dịch chiết chứa hoạt chất (mẫu thử)
- Các dòng tế bào ung thư
- Môi trường nuôi cấy tế bào
Phương pháp:
- Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy
phù hợp và các thành phần cần thiết khác
- Điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tuỳ thuộc vào
đặc tính của từng dòng tế bào, thời gian nuôi cấy chuyển khác nhau. Tế bào phát triển
ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính
Tiến hành:
- Các dòng tế bào này được cho vào đĩa 96 giếng (mỗi giếng chứa 2x103 tế bào) rồi cho
chất cần thử (ở đây là chất chiết từ thực vật với các nồng độ pha theo thang 10) hòa tan
trong DMSO. Sau đó các đĩa được nuôi trong tủ CO2 ở 37 ºC trong 3 ngày. Tỷ lệ phần
trăm sống sót của tế bào được hiện thị màu bằng SRB (sulforhodamine B) và được đọc
bằng máy đọc ELISA (ELISA reader) ở bước song 450 nm.
- Hoạt tính gây độc tế bào được tính bằng phần trăm ức chế khi so sánh mật độ quang

học của giếng được xử lý với mẫu nghiên cứu với giếng không được xử lý với mẫu thử.
Nồng độ ức chế 50% (IC50) được suy ra từ đường cong phát triển tế bào và nồng độ
chất thử (phần trăm sống sót so với nồng độ chất thử)


3.Ứng dụng
VÍ DỤ 1 : THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ CÂY
MẴNG CẦU XIÊM (ANNONA MURICA L.) HỌ ANNONACEAE
Cây mãng cầu xiêm thuộc chi Na (Annona), Họ Na
(Annonaceae). Ở nước ta cây Mãng cầu xiêm thường
được trồng để lấy quả, cây Mãng cầu xiêm đã đƣợc
dùng để chữa bệnh ngoài da, giun, thấp khớp, Lá còn
đƣợc sử dụng với một số công dụng nhƣ làm thuốc
lợi tiểu mạnh khi bị phù chân (Amazonia)
Thành phần hóa học:
- Các hợp chất acetogenin:Acetogenin là nhóm chất
chỉ đƯợc tìm thấy ở họ Annonaceae, do vậy đây là
nhóm chất đặc trưng của họ thực vật này
- Các hợp chất alkaloid
Đến nay đã có 14 alcaloit được phân lập từ cây Mãng
cầu xiêm
- Tinh dầu
- Sterol
- Carotenoit
- Các nhóm chất khác


Dịch chiết
n-hexan

Thử tác dụng gây độc tế bào
Các dòng tế bào :Các dòng tế bào cung cấp bởi ATCC gồm: tế bào ung thư biểu mô
KB, tế bào ung thư phổi LU, tế bào ung thư vú MCF7.
Tiến hành:
• 200μl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3x10^4 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa
96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào MCF7, KB; môi
trường DMEM cho LU-1
• Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt
đến nồng độ cuối cùng là 128 /ml, 32 /ml, 8 /ml, 2 /ml, 0,5 /ml, 0,125 /ml,
0,03125 /ml, 0,0078 /ml. Ủ ở 370C, 5% CO2 rong 3 ngày.
• Giếng “điều khiển (-)” gồm môi trường không có tế bào, giếng “điều khiển (+)
“200μl dung dịch tế bào 3x10^4 tế bào/ml không xử lý với diachj chiết nhecxan, ử 37oC trong 4h, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy


Nhận xét:
Chất đối chứng dương Ellipticin thể hiện hoạt tính gây độc đối với cả 3 dòng tế
bào ung thư KB, LU, MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 0,31; 0,45 và 0,53 μg/ml.
Cặn dịch n-hexan của mãng cầu xiêm có tác dụng gây độc tế bào trên cả 3 dòng
tế bào thử nghiệm KB, LU và MCF7 với các giá trị IC50 lần lượt tương ứng là 0,08
μg/ml, 0,7 μg/ml và 6,9 μg/ml đều < 20 μg/ml ( theo tiêu chuẩn Mỹ với chất
chưa tinh khiết). Tác dụng của cặn dịch chiết n-hexan trên dòng tế bào KB là
mạnh nhất thể hiện ở giá trị IC50 nhỏ nhất là 0,08 μg/ml đều < 20 μg/ml , tốt
hơn chất đối chứng Ellipticine với giá trị IC50 lớn hơn; trong khi đó cặn chiết này
có hiệu lực trung bình trên dòng tế bào MCF7.


Ví dụ 2: thử hoạt tính tác dụng trên tế bào ung thư của
nụ vối Việt Nam
1. Cây vối có tên khoa học là

Cleistocalyx operculatus (Roxb.).
Phân bố
Cây vối mọc hoang và được trồng hầu
hết ở khắp các tỉnh miền bắc nước ta.
Ngoài ra còn gặp ở một số nước châu Á
nhiệt đới như Lào, Campuchia, Trung
Quốc.


Thành phần hóa học
•

Lá vối chứa rất ít tanin, alcaloit và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều thành
phần trong đó có thành phần chính là (Z) β-ocimen,myrcen, (E) β-ocimen.

•

Vỏ cây chứa triterpen nhóm olean là acid arjunolic

•

Nụ vối:

- Flavonoid: Nụ vối chứa nhiều flavonoid, với nhiều thành phần đã được định
dạng.
- Tinh dầu: Từ mẫu nụ vối Việt Nam, với phương pháp sắc ký khối phổ GC/MS,
Nguyễn Thị Dung và cộng sự đã xác định được 55 thành phần khác nhau có
trong tinh dầu nụ vối, gồm các monoterpen,serquiterprn và hydrocarbon
serquiterpen.
- Thành phần khác: ethyl galat, acid galic,acid ursolic,β-sitosterol và acid

einamic


Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3. Nội dung nghiên cứu
•

Nghiên cứu tác dụng trên tế bào ung thư: cao phân đoạn EtOAc, chất phân lập.

4. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
•

Nghiên cứu tác dụng trên tế bào ung thư
– Dòng tế bào ung thư phổi: A549
– Dòng tế bào ung thư vú đã kháng adriamicin : MCF7IADR
– Dòng tế bào ung thư vú đã kháng tamoxifen: MCF7/TamR
– Dòng tế bào ung thư dạ dày: NCI-N87
– Dòng tế bào ung thư buồng trứng: OVCAR-8

•

Đối tượng nghiên cứu: hợp chất phân lập , cao phân đoạn EtOAc

•

Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp Skehan SRB

Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng. Sau khi ủ, tế bào được cố định bằng acid tricloacetic, sau đó được nhuộm bằng
SRB 0,4%, rửa thuốc nhuộm dư bằng acid acetic 1 %. Thôi thuốc nhuộm bằng Triz base, SRB liên kết với protein tế bào
được hòa tan hết, đem mẫu đi đo mật độ quang tại bước sóng 540nm. Mật độ quan của dung dịch tương quan với lượng

protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu.


Nụ vối (8kg)
Ethanol 960, chiết ở nhiệt độ thường x3 lần
Dịch chiết ethanol

Cao đặc nụ vối
+ 2l ethanol 960

Cao ethnol lỏng
+ n-hexan(2l) x5 lần

DC ethanol

DC n-hexan

+ nước (1,5l)
Cao chiết n-hexan (241,5g

DC nước
EtOAc (2l) x 5 lần

DC EtOAc

DC nước

Cao EtOAc (640g)

Hình 2. Sơ đồ thu dịch chiêt từ nụ vối

THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1. Chuẩn bị mẫu
•

Mẫu nghiên cứu
Mẫu 1: Cao phân đoạn EtOAc
Mẫu 2: Hợp chất 1 phân lập được

•

Chuẩn bị mẫu: Các mẫu thử được hòa tan trong
dung môi DMSO (dimethyl sufloxide) ở nồng độ
10mg/ml (với nồng độ ban đầu).

•

Môi trường nuôi cấy thích hợp là RpMI 1640 hoặc
DMEM, pha thành 5 nồng độ để thử sao cho nồng
độ cuối cùng của mẫu thử trong giếng lần lượt là
100,50,25,12.5,6.25 µg/ml với mẫu 1 và
20,10,5,2.5,1.25 với mẫu 2 một cách tương ứng.

•

Adriamicin – có tác dụng ức chế sự phát triển của
tế bào ung thư được sử dụng làm thuốc đối chứng
dương trong thí nghiệm, với 5 liều tác dụng trực
tiếp lên tế bào là 20,4,0.8,0.16 và 0.032 µg/ml

2. Tiến hành:
Các thao được tiến hành với điều kiện sạch
khuẩn nghiêm ngặt.
o Tế bào được cung cấp vào các giếng của đĩa 96
giếng, sao cho trong 180µl môi trường nuôi cấy
có khoảng 5000 – 8000 tế bào/ giếng. Để 3 giếng
trống làm chứng trắng
o Các đĩa được ủ trong tủ ấm 370 , 5% CO2 trong
24h cho tế bào ổn định, bám lên bề mặt đáy
giếng.
o Sau 24h nuôi cấy, thêm 20µl thuốc thử và thuốc
chuẩn ở các nồng độ khác nhau vào mỗi giếng.
Mỗi nồng độ được lặp lại ở 3 giếng, lắc nhẹ đĩa
nuôi cấy để thuốc tan hoàn toàn trong môi trường


o Ủ đĩa nuôi cấy trong 48h cho thuốc phát huy tác dụng. Sau đó, đĩa tế bào được cố định bằng
cách nhỏ thêm 50µl dung dịch acid tricloacetic 50% vào mỗi giếng ở 40c trong thời gian 1h rồi
rửa nhẹ bằng nước cất và hong khô (nhiệt độ phòng)
o Nhuộm SRB: Thêm 50µl SRB 0,4% vào mỗi giếng, ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng
o Rửa thuốc nhuộm SRB dư thừa bằng acid acetic 1% 3 lần sau đó để khô ở nhiệt độ phòng.
o Thôi thuốc nhuộm SRB trong mẫu bằng 100µl dung dịch triz –base 10mM/giếng, để thuốc
nhuộm tan hết thì đem mẫu đo mật độ quang ở bước sóng 540nm.
o % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng (tế bào không được xử ký bằng thuốc)
được tính theo công thức sau:


3.Kết quả
- Thử kết quả độc tính của mẫu 1 và mẫu 2

Tác dụng ức chế ( % )
Mẫu thử

Nồng độ µg/ml
MCF7- TamR
A549

100

OVCAR-8

NCI-N87

MCF7-ADR

66,0±1,19

63,47±4,47

72,19±2,71

65,64±1,57

79,73±5,81

32,3±6,08

41,07±4,54

42,75±1,66

47,65±6,65

51,53±2,97

I

13,87±4,73

27,02±1,42

18,23±4,34

28,06±1,47

12.5

I

1,03±0,17

11,83±0,85

9,09±2,80

16,64±6,65

6.125

I

0,24±0,04

2,39±2,55

6,48±3,56

59,6±5,45

63,49±0,35

67,63±2,38

72,15±3,45

74,36±6,75

29,6±0,50

40,43±5,06

31,41±1,98

54,23±4,49

23,21±5,41

I

9,4 ±1,82

11,44±3,51

1,33±3,94

Mẫu 1: cao phân đoạn EtOAc
50
25

20

10

I

Mẫu 2: hợp chất 1
5

3,28±0,25

2.5

I

I

1.25

I

I

I

I

I

I

I

I

Ghi chú /: tế bào trong đĩa nuôi không bị ức chế
Nhận xét: cả 2 mẫu nghiên cứu đều có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư rõ rệt với 2
nồng độ cao nhất là 100 và 50 µg/ml với mẫu 1. 20 và 10 µg/ml với mẫu 2.


Kết quả thử độc tính
Tác dụng ức chế (IC50, ug/ml)"

A549

OVCAR-8

NCI- N87

MCF7- ADR

MCF7- TamR

Mẫu 1

84,85

74,38

53,60

62,08

42,41

Mẫu 2 (hợp
chất
flavonoid
được phân
lập)

20,11

16,90

16,09

10,95

17,03

0,74

0,71

1,16

21,54

0,54

Adriamicinb

Bảng : Tác dụng ức chế tế bào ung thư của mẫu thử


Nhận xét:
- Mẫu cao phân đoạn EtOAc từ dịch chiết nụ vối có tác dụng độc trên cả 5 dòng tế
bào ung thư nghiên cứu với IC50 thấp nhất là 42.41 µg/ml trên dòng MCF7-tamR
và IC50 cao nhất là 84,4 µg/ml trên dòng A549
- Mẫu hợp chất 1: có tác dụng độc trên cả 5 dòng tế bào ung thư nghiên cứu với
IC50 thấp nhất là 10,95 µg/ml trên dòng tế bào MCF7-ADR và IC50 cao nhất là
20,11 µg/ml trên dòng A549
- Hợp chất 1(mẫu 2) phân lập được và mẫu cao phân đoạn EtOAc đều có tác dụng
trên các dòng tế bào ung thư trong nghiên cứu, đặc biệt là tác dụng trên các dòng tế
bào ung thư đã kháng thuốc điều trị Adriamicinb
- So sáng với mẫu chứng dương Adriamicin ở dòng tế bào MCF7-ADR, IC50 của
hợp chất 1 chỉ bằng một nửa, từ đó cho thấy tác dụng rõ rệt của hợp chất 1 trên
dòng tế bào ung thư đã kháng thuốc.

Ảnh minh hoạ

Ảnh hưởng của mẫu thử lên sự phát triển tế bào ung thư


TÀI LIỆU THAM KHẢO
•

[1] Nguyễn Tiến Bân (2000), Thực vật chí Việt Nam - Họ Na (Annonaceae), Nxb. Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội, tr. 8, tr. 316-321.

•

[2] Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb. Y học, Hà Nội,

•

[3] Bộ y tế (2009), ung thư đại cương, Nhà xuất bản giáo dục Hà Nội

•

[4] Adeyemi, David Olawale, Komolafe, Omobola Aderibigbe, Adewole, Olarinde Stephen, Obuotor Efere Martins, Adenowo Thomas Kehinde
(2009), ―Anti hyperpglycemic activities of Annona muricata (Linn)‖, Afr. J. Trad., CAM 6 (1): 62 – 69

•

[5] Anon., Purdue News September 1997; Purdue University, West Lafayette, IN. />
•

[6] Berlowski A., Katarzyna Zawada, Iwona Wawer, Katarzyna Paradowska (2013), ―Antioxidant Properties of Medicinal Plants from Peru―, Food
and Nutrition Sciences, 4, 71-77

•

[7]Almudena Bermejo, Bruno Figadère, Maria-Carmen Zafra-Polo, Isabel Barrachina, Ernesto Estornell and Diego Cortes (2005), “Acetogenins from
Annonaceae: recent progress in isolation, synthesis and mechanisms of action‖, Nat. Prod. Rep., 22, 269-303

•

[8] Nguyen Thi Dung,Jung Min Kim, Sun Chul Kang (2008), “Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and
the ethanol extract of Cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr and Perry buds”, Food and Chemical Toxicology


Xin chân thành cảm ơn !