Nghiên Cứu Tách Dòng Và Biểu Hiện Gen Mã Hóa Kháng Nguyên Bề Mặt Của Tiên Mao Trùng (Trypanosomma Evansi) Lưu Hành Trên Trâu Ở Tỉnh Tuyên Quang

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HIỀN

TÊN ĐỀ TÀI:

“NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA TIÊN MAO TRÙNG
(TRYPANOSOMMA EVANSI) LƯU HÀNH TRÊN TRÂU Ở
TỈNH TUYÊN QUANG”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Thú y

Khoa

: Chăn nuôi thú y

Khóa học

: 2009 - 2014

Giảng viên hướng dẫn : GS.TS. Nguyễn Thị Kim Lan

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2013


65

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực tập tại cơ sở với sự nỗ lực, cố gắng của bản thân
và sự giúp đỡ, dạy bảo ân cần của các thầy, cô giáo trong khoa Chăn nuôi Thú
y; các anh chị và các thầy, cô giáo trong khoa Công nghệ sinh học, Viện đại
học mở Hà Nội, đến nay em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình với
đề tài: “Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên bề
mặt của tiên mao trùng (Trypanosoma evansi) lưu hành trên trâu ở tỉnh
Tuyên Quang”.
Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc tới cô giáo GS.TS. Nguyễn Thị Kim Lan đã trực tiếp hướng dẫn, tận
tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành khóa luận
tốt nghiệp.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong khoa Chăn nuôi Thú y
đã giúp em hoàn thành khóa học.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân, gia đình,
bạn bè đã động viên, giúp đỡ em hoàn thành khoa luận tốt nghiệp này.
Xin trân trọng cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2013
Sinh viên

Nguyễn Thị Hiền


66

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang
đoạn chèn RoTAT 1.2 ................................................................... 49
Bảng 4.2. Thành phần và điều kiện phản ứng giải trình tự gene .................... 50
Bảng 4.3. So sánh trình tự gene RoTAT 1.2 của chủng T. evansi Tuyên Quang
với trình tự GenBank..................................................................... 51
Bảng 4.4. Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen
RoTAT 1.2/ pET32a (+) bằng enzyme Bam HI............................ 53
Bảng 4.5. Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen
RoTAT 1.2/ pET32a (+) bằng enzyme Xho I ............................... 53
Bảng 4.6. Thành phần và điều kiện phản ứng nối gen .................................... 54


67

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 4.1. Kết quả điện di ADN tổng số .......................................................... 43
Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu ADN tổng số .................. 44
Hình 4.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .................................................... 44
Hình 4.4. Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp pJET1.2 - RoTAT 1.2 ................... 46
Hình 4.5. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn biến nạp trên môi trường LB có
ampicilin, chất chỉ thị màu X-gal, chất cảm ứng IPTG ................ 47
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid .......................................... 48
từ các khuẩn lạc màu trắng.............................................................................. 48
Hình 4.7. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR với cặp
mồi F1.2 /R1.2............................................................................... 50
Hình 4.8. Trình tự gene RoTAT 1.2 của T. evansi ......................................... 51

Hình 4.9. Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện gen RoTAT1.2... 52
Hình 4.10. Hình ảnh điện di gen RoTAT 1.2 cắt bằng các enzyme giới hạn
Bam HI và Xho I............................................................................ 53
Hình 4.11. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng ............... 55
Hình 4.12. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn
E. coli BL21 .................................................................................. 56
Hình 4.13. Sơ đồ cấu trúc của vector pET 32a(+) .......................................... 57
Hình 4.14. Kết quả điện di protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 trên gel SDS - PAGE ... 57
Hình 4.15. Kết quả phản ứng Western blot giữa protein tái tổ hợp RoTAT 1.2
với kháng thể kháng 6xHis .......................................................... 58
Hình 4.16. Kết quả phản ứng Western blot giữa protein tái tổ hợp RoTAT 1.2
với kháng thể kháng T. evansi ..................................................... 59


68

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
ADN
: Acid deoxyribonucleic
ARN
: Acid Ribonucleic
BSA
: Bovine Serum Albumin
CATT
: Card Agglutination Test for Trypanosomiasis
cADN
: ADN bổ sung (complementary ADN)
dNTP
: Deoxynucleotid triphotphat
ddNTP

: Dideoxynucletit
EDTA
: Ethylen Diamin Tetra Acetic
ELISA
: Enzym Linked Immunosorbent Assay
EtBr
: Ethydium bromide
IFAT
: Indirect Fluorescent Antibody Test
IPTG
: Isopropyl β - D - thiogalactoside
ISG
: Invanant Surface Glycoprotein
KST
: Ký sinh trùng
LATEX
: Latex Agglutination Test
PBS
: Phosphat Buffered Saline
PBST
: Phosphat Buffered Saline Tween
PCR
: Polymerase Chain Reaction
PVDF
: Polyvinylidene difluoride
RE
: Restriction enzyme
SDS
: Sodium Dodecyl Sulfat
SDS - PAGE : Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide

TAE
: Tris - axit acetic – EDTA
TMT
: Tiên mao trùng
VAT
: Variable Antigen Type
VGS
: Vanant Glycoprotein Surface


69

MỤC LỤC
Trang
Phần 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................. 1
1.2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
1.3. Điểm mới của đề tài ................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................... 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
2.1. Tiên mao trùng và bệnh tiên mao trùng ở gia súc...................................... 3
2.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng ...................... 3
2.1.1.1. Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma trong hệ thống phân loại
động vật nguyên sinh ..................................................................................... 3
2.1.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng ............................... 4
2.1.1.3. Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi .... 5
2.1.2. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng ............................................................. 7
2.1.2.1. Phân bố của bệnh .............................................................................. 7

2.1.2.2. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng ........................ 8
2.1.2.3. Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh ............................................................. 9
2.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh ............................................... 10
2.1.3.1. Đặc điểm bệnh lý ............................................................................ 10
2.1.3.2. Triệu chứng lâm sàng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò ............. 11
2.1.3.3. Bệnh tích của bệnh tiên mao trùng ................................................. 12
2.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ............................................................ 13
2.1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng ........................................................................ 13
2.1.4.2. Chẩn đoán thí nghiệm ..................................................................... 13
2.1.5. Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR
(Polymerase Chain Reaction).......................................................................... 18
2.1.6. Phòng trị bệnh tiên mao trùng ............................................................... 18
2.1.6.1. Phòng bệnh ...................................................................................... 18
2.1.6.2. Điều trị bệnh.................................................................................... 20


70

2.2. Tách dòng gene ........................................................................................ 21
2.2.1. Khái niệm và các phương pháp ............................................................. 21
2.2.2. Vector tách dòng ................................................................................... 24
2.2.2.1. Khái niệm ........................................................................................ 24
2.2.2.2. Các loại vector tách dòng ................................................................ 25
2.2.3. Plasmid pCR 2.1.................................................................................... 26
2.3. Biểu hiện gene .......................................................................................... 27
2.3.1. Khái niệm .............................................................................................. 27
2.3.2. Vector biểu hiện .................................................................................... 29
Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 30
3.1. Đối tượng ................................................................................................. 30

3.2. Vật liệu ..................................................................................................... 30
3.2.1. Sinh phẩm trong nghiên cứu ................................................................. 30
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ............................................................. 30
3.2.3. Môi trường và hóa chất ......................................................................... 31
3.2.4. Cặp mồi dùng trong nghiên cứu. ........................................................... 33
3.3. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ................................................................ 33
3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 33
3.4.1. Nghiên cứu các điều kiện tách dòng gene mã hóa kháng nguyên bề mặt
của Trypanosoma evansi ................................................................................. 33
3.4.2. Nghiên cứu biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của
Trypanosoma evansi........................................................................................ 33
3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 34
3.5.1. Tách chiết ADN từ ký sinh trùng Trypanosoma evansi ....................... 34
3.5.2. Phương pháp điện di trên gel agarose ................................................... 34
3.5.3. Khuếch đại đoạn gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 bằng phương
pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ........................................................ 35
3.5.4. Phương pháp tinh sạch ADN không sử dụng gel agarose .................... 36
3.5.5. Phương pháp nối gene ........................................................................... 36
3.5.6. Phương pháp tạo tế bào khả biến .......................................................... 37


71

3.5.7. Phương pháp chuyển ADN tái tổ hợp mang đoạn gene RoTAT 1.2 vào
tế bào khả biến (biến nạp) ............................................................................... 38
3.5.8. Phương pháp tách plasmid .................................................................... 38
3.5.9. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn ............................................... 39
3.5.10. Phương pháp tinh sạch ADN bằng gel agarose .................................. 39
3.5.11. Phương pháp điện di gel SDS-PAGE ................................................. 40
3.5.12. Phương pháp biểu hiện protein T4 trong E. coli BL21....................... 41

3.5.13. Phương pháp Western blot .................................................................. 42
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 43
4.1. Tách dòng và xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề mặt
RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi ............................................................. 43
4.2. Kết quả biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên của T. evansi .................. 52
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 60
5.1. Kết luận .................................................................................................... 60
5.1.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề
mặt RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi ...................................................... 60
5.1.2. Kết quả biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi ... 60
5.2. Đề nghị ..................................................................................................... 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 62
I. Tài liệu tiếng Việt ........................................................................................ 62
II. Tài liệu tiếng Anh ....................................................................................... 64


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Nhiều tác giả nghiên cứu về miễn dịch học cho rằng, tiên mao trùng
biến đổi kháng nguyên bề mặt để né tránh miễn dịch đặc hiệu của vật chủ.
Tuy nhiên, Van Meirvenne cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt của ký
sinh trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện
đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ). Theo Hajduc và Vickernlan (1981)
[27], hiện tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở
gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch. Những quan điểm này là
hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao
trùng. Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên mao

trùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất.
Hiện nay, có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng như:
phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, phương pháp tập trung tiên
mao trùng, phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm, phương pháp chẩn
đoán huyết thanh học. Trong đó, phương pháp chẩn đoán huyết thanh học
được đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh và có khả
năng chẩn đoán với số lượng mẫu lớn, trong thời gian ngắn. Phương pháp
tiêm truyền động vật thí nghiệm là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác
và thường được ứng dụng nhiều để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt
Nam. Song, nhược điểm của phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là
khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng nhiều và thời gian ngắn thì phương
pháp này không thể đáp ứng được.
Kháng nguyên RoTAT 1.2 có mặt ở hầu hết các VAT (Variable
Antigen Type) của Trypanosoma evansi. Kháng nguyên này được chế tạo
bằng công nghệ gene cho khả năng phát hiện đặc hiệu tiên mao trùng đạt
98%. Để sản xuất kháng nguyên RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi phục
vụ chế tạo các bộ Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng lưu hành trên trâu ở tỉnh
Tuyên Quang, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tách dòng và biểu


2

hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng (Trypanosoma
evansi) lưu hành trên trâu ở tỉnh Tuyên Quang”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
- Xác định được gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng
- Tạo được tế bào chủ yếu biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt
của tiên mao trùng
1.3. Điểm mới của đề tài
- Đề tài xác định được gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 của tiên

mao trùng phân lập ở Tuyên Quang để tạo cơ sở cho việc xác định cấu trúc
kháng nguyên
- Kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp được chế tạo trong nước phục vụ
sản xuất Kit chẩn đoán có khả năng phát hiện đặc hiệu với bệnh tiên mao
trùng ở Việt Nam do tính tương đồng kháng nguyên.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài sẽ tách dòng, xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề
mặt RoTAT 1.2 và biểu hiện được gene mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT
1.2 của tiên mao trùng Trypanosoma evansi phân lập ở Tuyên Quang.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học phục vụ sản xuất Kit chẩn đoán
huyết thanh học có khả năng phát hiện đặc hiệu bệnh tiên mao trùng gia súc ở
Việt Nam do tính tương đồng kháng nguyên.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tiên mao trùng và bệnh tiên mao trùng ở gia súc
2.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng
2.1.1.1. Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma trong hệ thống phân loại động
vật nguyên sinh
Theo Levine et al (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997) [5],
vị trí của tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa)
như sau:
Ngành Sarcomastigophora
Phân ngành Mastigophora
Lớp Zoomastigophorasida

Bộ Kinetoplastorida
Phân bộ Trypanosomatorida
Họ Trypanosomatidae Donein, 1901
Giống Trypanosoma Gruby, 1843
Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (M) theileria
Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901
Loài Trypanosoma (H) leisi
Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909
Loài Trypanosoma (S) cruzi
Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918
Loài Trypanosoma (D) vivax
Loài Trvpanosoma (D) uniform
Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (N) congolense
Loài Trypanosoma (N) siminae
Loài Trypanosoma (N) vanhogi
Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906
Loài Trypanosoma (T) brucei


4

Loài Trypanosoma (T) gambience
Loài Trypanosoma (T) rhodesiense
Loài Trypanosoma (T) equiperdum
Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (P) suis
Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843
Loài Trypanosoma evansi

(Steel, 1885)
Trong các loài tiên mao trùng trên, có 7 loài được tổ chức dịch tễ quốc tế
(OIE) thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là: T.
brucei, T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. gambiense, T. siminae, T. vivax.
2.1.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng
Tiên mao trùng T. evansi được xếp vào loại đơn hình thái, cơ thể chỉ là
một tế bào, có kích thước nhỏ, chiều dài 18 - 34 µm (trung bình là 25 µm),
chiều rộng 1,5 - 2 µm. Cơ thể có hình suốt chỉ mảnh hoặc hình thoi, cuối thân
nhọn. Nhìn chung, cấu trúc cơ bản của T. evansi cũng giống như cấu trúc của
các loài tiên mao trùng khác thuộc họ Trypanosomatidae. Cấu trúc từ ngoài
vào trong được chia thành 3 phần chính:
- Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớp
ngoài và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa). Lớp
vỏ ngoài cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Vanant
Glycoprotein Surface -VGS). Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp
song song dọc theo chiều dài thân tiên mao trùng. Chính nhờ sự sắp xếp của
các cặp vi ống nên tiên mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare, 1972
[28]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [7]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [3]).
- Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài. Trong nguyên sinh
chất có chứa các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào
màu sáng, kinetoplast (thể cơ động), mitochrondno, reticulum (lưới nội bào)
và mạng lưới golgi.
- Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa ADN, hình bầu dục hoặc hình trứng.
Nhân thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể. Ngoài nhân,
về phía cuối thân còn có thể kinetoplast chứa ADN (KADN). Từ kinetoplast có


5

một roi chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể thành một roi tự

do. Roi của tiên mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏ của thân. Trong
roi có 9 cặp vi ống ở xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc
chiều dài roi (Hoare, 1972 [28]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [3]).
2.1.1.3. Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi
Kháng nguyên của T. evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định
(kháng nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi
* Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi)
Phần lớn các thành phần kháng nguyên tiên mao trùng không biến đổi
trong quá trình sống ký sinh. Bằng phương pháp điện di miễn dịch huyết
thanh thỏ tối miễn dịch với T. evansi, đã phát hiện tới 30 thành phần kháng
nguyên khác nhau. Có ba loại kháng nguyên không biến đổi ở màng nguyên
sinh chất tế bào (ISG: Invanant Surface Glycoprotein): ISG 65, ISG 75 và
ISG 100. Do cấu trúc không gian ba chiều và đặc tính ưa nước, các loại ISG
65 và ISG 75 nằm chen vào phần VSG (Jackson và cs,1993 [26]). Còn ISG
100 do có đặc tính ưa nước và không thể kết hợp với kháng thể của vật chủ,
loại này nằm ở túi tiên mao.
* Kháng nguyên biến đổi
Về kháng nguyên biến đổi, cần đề cập đến sự biến đổi lớp vỏ bề mặt
VSG, những quan điểm mới về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên
mao trùng và cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi.
Nhờ kháng thể đặc hiệu được đánh dấu mà Vickerman và Luckins đã
phát hiện ra sự biến đổi của lớp kháng nguyên bề mặt. Lớp áo bề mặt của tiên
mao trùng có thành phần là glycoprotein bao phủ toàn bộ bề mặt tế bào bằng
một lớp phân tử giống nhau (mỗi tiên mao trùng có 107 phân tử). Lớp áo bề
mặt này kích thích cơ thể vật chủ tạo ra kháng thể đặc hiệu với từng type
kháng nguyên biến đổi. Kháng nguyên biến đổi có tính miễn dịch cao, chiếm
khoảng 10% protein của tiên mao trùng. Loại kháng nguyên này kích thích
tạo kháng thể đặc hiệu đối với từng loại sinh ra nó. Chỉ có kháng nguyên biến
đổi mới có khả năng kích thích vật chủ tạo miễn dịch chủ động. Người ta ước
lượng rằng, một con tiên mao trùng có ít nhất vài trăm hoặc vài nghìn VSG,

nghĩa là từ 5 - 10% số gene của KST cung cấp cho sự biến đổi kháng nguyên


6

bề mặt này.
Quá trình biến đổi kháng nguyên từ trước đến nay đều cho rằng do đáp
ứng của KST đối với kháng thể của vật chủ để trốn tránh sự phá hủy của hệ
thống miễn dịch. Ngày nay, nhiều quan sát đã cho phép loại bỏ giả thiết này.
Van Meirvenne cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt của ký sinh
trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện đáp
ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ). Theo Hajduc và Vickernlan (1981) [27],
hiện tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở gia
súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch. Những quan điểm này là hoàn
toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao
trùng. Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên mao
trùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất.
* Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi
Khi kháng thể đặc hiệu kết hợp với phân tử của kháng nguyên bề mặt
(VSG) và với bổ thể, gắn lên trên bề mặt và làm tiêu tan tiên mao trùng thì đó
cũng là nguyên nhân chính thúc đẩy sự hoạt hoá của gene. Kết quả là các
phân tử kháng nguyên VSG được thay đổi hoàn toàn bằng các phân tử VSG
mới. Lúc này, kháng thể đặc hiệu lúc trước đã không còn tác dụng đối với
kháng nguyên mới này.
Theo Barry và Tumer (1991) [24], các VSG được mã hoá nhờ các gene
chuyên biệt. Từ kho chứa hàng nghìn gene khác nhau, một loại gene VSG
được hoạt hoá một cách chọn lọc, dẫn đến tổng hợp ra một loại kháng nguyên
VSG. Mỗi bên VSG mới tạo ra một loại kháng nguyên VSG mới. Trong bộ
gene của tiên mao trùng tồn tại một số lớn gene VSG, các gene này sử dụng
nhiều cơ chế sắp xếp khác nhau, do vậy tiên mao trùng đã tạo ra nhiều VSG

khác nhau ở gia súc bị bệnh mãn tính. Cơ chế biến đổi kháng nguyên theo 2
cách: cách thứ nhất là, sử dụng lần lượt các điểm biểu hiện khác nhau, không
có sự sắp xếp của ADN. Các điểm biểu hiện khác nhau sẽ mang các gene
VSG khác nhau, sự luân phiên này dẫn đến sự thay đổi type kháng nguyên.
Cơ chế này quan sát được chủ yếu ở giai đoạn đầu của quá trình cảm nhiễm.
Có lẽ ở giai đoạn đầu này chưa có đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với
VSG, chính điều này không gây ra một cản trở hoạt hoá tự nhiên của các điểm


7

biểu hiện gene này. Cách thứ hai là, tập hợp lại các đoạn ADN khác nhau để
tái tổ hợp gene, mà việc tái tổ hợp này cho phép thay thế hoàn toàn hoặc từng
phần gene; hoặc việc thay thế diễn ra dựa vào sự chuyển đổi gene chứ không
phải dựa vào tái tổ hợp gene. Trường hợp này được diễn giải như sau: một
gene hoạt hoá được thay thế bằng bản sao chép của một gene khác. Do có sự
thay thế một phần của gene nên đã tạo ra loại gene phức hợp và đặc trưng.
2.1.2. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng
2.1.2.1. Phân bố của bệnh
Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán
cầu. Phía Tây bán cầu thuộc châu Mỹ, phía Đông bán cầu trải dài từ châu Phi
cho đến Philippine.
Bệnh phổ biến ở trâu, bò, ngựa các nước nhiệt đới ở châu Phi, châu Á
và Nam Mỹ.
Ở châu Phi, bệnh trải dài từ Tây sang Đông, phía Bắc qua vùng sa mạc
Sahara, dọc theo bờ biển Atlantique Địa trung hải.
Bệnh tiên mao trùng xảy ra với tên gọi "bệnh Surra” ở Ả rập Saudi, Yêmen,
Sultanate, Ả Rập thống nhất, Thổ Nhĩ Kỳ, Israel, Syrie, Afganistan, Pakistan.
Ở châu Á, bệnh xuất hiện ở Trung Á (thuộc Liên Xô cũ), Ấn Độ,
Malaysia, bán đảo Đông Dương, Trung Quốc, Indonexia, Philippine.

Ở châu Âu, bệnh xuất hiện ở Bungaria (nay đã được thanh toán), hiện
chỉ còn ở vùng Volga và Nam Capcase (Liên Xô cũ).
Ở châu Mỹ, bệnh xuất hiện ở Trung Mỹ, Nam Mỹ, đặc biệt phổ biến ở
Brazil, Mexico, Venezuela, Colombia.
Châu Úc cũng đã được xác định là có bệnh tiên mao trùng. Losos G. T.,
1972 [29], cho rằng, bệnh tiên mao trùng phổ biến nhất ở châu Á và châu Phi,
từ Ấn Độ đến Srilanca, Trung Quốc, Indonexia, Thái Lan, Lào, Camphuchia,
Iran, Philippine.
Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy ở hầu hết các vùng sinh thái
khác nhau: miền núi, trung du, đồng bằng, ven biển. Theo Phạm Sỹ Lăng
(1982) [7], bệnh tiên mao trùng có ở tất cả các tỉnh miền Bắc (Bắc Kạn, Lạng
Sơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Ninh Bình, Hà Tây). Trâu, bò nhiễm bệnh
với tỷ lệ cao và thay đổi giữa các vùng khác nhau.


8

Lê Ngọc Mỹ (1994) [15], đã điều tra tình hình nhiễm tiên mao trùng ở
trâu bò Việt Nam. Kết quả cho thấy, trâu bò nhiễm tiên mao trùng với tỷ lệ
cao (21,27%), trong đó trâu bò nuôi ở các tỉnh miền núi phía Bắc nhiễm T.
evansi cao hơn ở đồng bằng.
Theo Lê Đức Quyết (1995) [19], Phạm Chiến và cs (1999) [1], trâu ở
một số tỉnh miền Nam và Tây Nguyên nhiễm tiên mao trùng là 22,12%; bò là
6,6 - 10,3%.
Phan Lục và Nguyễn Văn Thọ (1995) [12], cho biết, tỷ lệ nhiễm tiên
mao trùng của bò ở một số địa phương miền Bắc là 5,9%.
Theo Hà Viết Lượng (1998) [13], tỷ lệ bò nhiễm tiên mao trùng ở các
tỉnh miền Trung là 8,99%.
2.1.2.2. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng
Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và

thú hoang, thấy nhiều hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo,
sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch..., nhưng
không ký sinh ở người.
Sự lây truyền tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khỏe là nhờ
các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu
(thuộc họ Tabanidae). Ruồi và mòng hút máu của gia súc bị bệnh, hút luôn cả
tiên mao trùng vào vòi hút, sau đó lại hút máu gia súc khoẻ, trong khi hút máu
sẽ truyền tiên mao trùng từ vòi hút vào máu con vật khoẻ. Sự lây truyền này
mang tính chất cơ học. Như vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giới
truyền bệnh tiên mao trùng quan trọng.
Theo Phan Địch Lân (1974) [10], Phan Địch Lân (2004) [11], phần lớn
các loài mòng tập trung ở khu vực miền núi và trung du. Trong 53 loài mòng
thì có tới 44 loài phân bố ở vùng rừng núi có độ cao dưới 1.000 mét so với
mặt nước biển, càng lên cao số loài càng ít dần (độ cao trên 1.000 mét chỉ có
26 loài). Ở vùng trung du (rừng thưa, độ cao không quá 500 mét so với mặt
nước biển có 27 loài; vùng đồi trọc chỉ có 9 - 11 loài; vùng rừng núi ven biển
phát hiện chỉ có 8 loài. Những loài mòng phổ biến ở tất cả các vùng là:
Tabanus rubidus, T. striatus, Chrysops dispar, Chrysozoma assamensis.
Những loài mòng chỉ gặp ở vùng núi là: Tabanus flavistriatus, T.


9

fumifer, Chrysops vADNer. Miền Bắc nước ta có 4 loài ruồi hút máu, 2 loài
phổ biến ở tất cả các vùng là Stomoxys calcitrans và Liperosis exigua; 2 loài
chỉ thấy ở những vùng sinh cảnh đặc biệt: loài Bdellolarynx sanguinolentus
(chỉ xuất hiện ở vùng có độ cao dưới 1.000mét), loài Stomoxys indica (chỉ
thấy ở vùng núi Cẩm Thuỷ - Thanh Hoá).
Phan Địch Lân (2004) [11], cho biết, kiểm tra ở nhiều địa điểm thấy hai
loài mòng T. rubidus và T. striatus mang tiên mao trùng với tỷ lệ 15,2% và

14,0%; ruồi hút máu Stomoxys calcitrans mang tiên mao trùng với tỷ lệ
12,5%. Ở những vùng đang có bệnh tiên mao trùng, kiểm tra ruồi và mòng
hút máu dễ dàng tìm thấy tiên mao trùng. Sau khi theo máu vào vòi hút của
ruồi và mòng, tiên mao trùng vẫn sống đến giờ thứ 53, thời gian hoạt động
mạnh nhất là từ giờ thứ nhất đến giờ thứ 34 trung bình là 24 giờ. Sự hoạt
động của tiên mao trùng yếu dần từ giờ thứ 35 đến 42. Từ 46 - 53 giờ thì tiên
mao trùng ngừng hoạt động.
Hình thái tiên mao trùng khi ở trong vòi ruồi, mòng biến đổi theo thời
gian: từ 1 - 34 giờ có hình thái, kích thước bình thường; 35 - 45 giờ: tiên mao
trùng có hình dạng thay đổi, tăng kích thước chiều rộng và thô dần; 46 - 53
giờ: tiên mao trùng trương to, duỗi thẳng, mất khả năng di động và ngừng hẳn
hoạt động.
Thực nghiệm đã chứng minh khả năng gây bệnh của tiên mao trùng sau
khi xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus như sau: thời gian từ giờ thứ 1 đến
thứ 5, tiên mao trùng có khả năng gây bệnh và làm chết chuột bạch tương tự
như khi truyền thẳng máu có tiên mao trùng cho chuột; từ giờ thứ 6 đến thứ 7
chỉ còn 30% số chuột thí nghiệm phát bệnh, thời gian gây bệnh kéo dài và
thời gian chết của chuột cũng dài. Điều này có thể giải thích là do độc lực của
tiên mao trùng giảm dần và số lượng tiên mao trùng còn hoạt lực gây bệnh
cũng giảm dần sau khi chúng xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus.
2.1.2.3. Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh
Trâu, bò và các loài gia súc khác ở mọi lứa tuổi đều nhiễm tiên mao
trùng và đều phát bệnh, có thể dẫn đến tử vong hoặc suy nhược, thiếu máu,
giảm sức đề kháng, giảm khả năng sinh đẻ và sức sản xuất.
Phan Địch Lân (2004) [11], đã tổng hợp kết quả điều tra 3.172 trâu ở các


10

tỉnh đồng bằng: trâu dưới 3 năm tuổi nhiễm thấp nhất (3,2 - 6,l%), trâu 3 - 5 tuổi

nhiễm cao hơn ( 6 - 12,7%), trâu 6 - 8 tuổi nhiễm cao nhất (12,9 - 14,8%), trâu
trên 9 năm tuổi tỷ lệ nhiễm giảm thấp hơn trâu 3 - 8 năm tuổi.
Theo Phan Văn Chinh (2006) [2], tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cao nhất ở
4 - 8 năm tuổi (trâu: 12,71%; bò: 5,77%), thấp nhất là trâu, bò dưới 3 năm
tuổi (6,92% và 2,31%). Mùa lây lan bệnh thường xảy ra trong các tháng nóng
ẩm, mưa nhiều (từ tháng 4 đến tháng 9).
Theo Luckins (1988) [30], sự xuất hiện lượng lớn ruồi, mòng trong
mùa mưa nóng ẩm luôn có liên quan đến tình hình dịch tễ bệnh tiên mao trùng
ở trâu, bò, dê, lạc đà. Từ cuối mùa thu, mùa đông và đầu mùa xuân, trâu bò
nhiễm tiên mao trùng phải sống trong điều kiện thời tiết lạnh, thiếu thức ăn
nên sức đề kháng giảm, bệnh thường phát ra vào thời gian này và trâu bò bị
đổ ngã hàng loạt. Tiên mao trùng có sức đề kháng yếu, dễ chết khi tiếp xúc
với nước cất, cồn và thuốc sát trùng.
Bò ở Guaico nhiễm T. evansi từ 11 - 74%, bò dưới 12 tháng nhiễm
21,04%; bò trên 25 tháng nhiễm 72,92%; bò Zebu cao sản nhiễm 74,4%.
Bò ở Venezuela dưới 3 tháng nhiễm T. evansi 13% và bò trên 36 tháng
nhiễm 50%.
2.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh
2.1.3.1. Đặc điểm bệnh lý
Khi ruồi trâu, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào trâu, bò,
ngựa, tiên mao trùng xâm nhập vào da, gây ra vết viêm trên mặt da, kích
thước chỗ viêm phụ thuộc vào số lượng tiên mao trùng được tiêm truyền.
Vào máu, tiên mao trùng nhân lên theo cấp số nhân ở trong máu, trong
bạch huyết và ở trong các mô khác của cơ thể vật chủ theo cách phân chia
theo chiều dọc. Số lượng tiên mao trùng trong máu không phải lúc nào cũng
như nhau. Mật độ tiên mao trùng thay đổi theo ngày. Biểu đồ sóng tiên mao
trùng cho thấy, xen kẽ giữa những sóng tiên mao trùng mạnh là những đợt
sóng yếu. Mỗi đợt sóng tiên mao trùng bắt đầu bằng sự tăng số lượng tiên
mao trùng trong máu, sau đó giảm và khó phát hiện thấy tiên mao trùng. Mỗi
đợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu hiện sự xuất hiện một quần thể

tiên mao trùng có tính kháng nguyên bề mặt mới, quần thể này có thể tiếp tục


11

sinh sản và tồn tại một thời gian cho đến khi cơ thể xuất hiện kháng thể đặc
hiệu với chúng.
Tiên mao trùng phát triển nhanh trong máu, tiêu thụ Glucose, các chất
đạm, chất béo và khoáng chất trong máu ký chủ bằng phương thức thẩm thấu
qua bề mặt cơ thể để duy trì hoạt động và sinh sản. Tiên mao trùng chiếm
đoạt dinh dưỡng nhiều, làm cho súc vật bệnh gây còm, thiếu máu và mất dần
khả năng sản xuất sữa, thịt, mất dần khả năng sinh sản và giảm sức đề kháng
với các bệnh khác.
Sống trong máu vật chủ, tiên mao trùng còn tạo ra độc tố Trypanotoxin,
độc tố này gồm: độc tố do tiên mao trùng tiết ra qua màng thân trong quá
trình sống và độc tố do xác chết của tiên mao trùng phân huỷ trong máu sau
15 - 30 ngày. Độc tố của tiên mao trùng tác động lên hệ thần kinh trung ương
làm rối loạn trung khu điều hoà thân nhiệt, gây sốt cao và gián đoạn (lúc sốt,
lúc hết sốt xen kẽ nhau). Khi sốt thường có rối loạn về thần kinh (kêu rống,
run rẩy, ngã vật xuống). Độc tố cũng phá huỷ hồng cầu, ức chế cơ quan tạo
máu làm cho vật chủ thiếu máu và suy nhược dần. Độc tố còn tác động tới bộ
máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy. Hội chứng tiêu chảy
thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh.
Khi tăng lên với số lượng lớn trong máu, tiên mao trùng còn làm tắc
các mao mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ
thũng chất keo vàng dưới da.
2.1.3.2. Triệu chứng lâm sàng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò
Trâu, bò bị bệnh thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như sau:
- Sốt cao và gián đoạn: sau 14 - 30 ngày bị ruồi, mòng hút máu truyền
0

tiên mao trùng, trâu bò thường đột ngột lên cơn sốt (40 - 41,7 C) kéo dài 2 - 4
ngày rồi giảm, thời gian sau nhiệt độ lại tăng lên. Thời gian gián đoạn giữa
hai cơn sốt dài hay ngắn tuỳ theo thể trọng con vật. Khi sốt, kiểm tra máu
thường thấy tiên mao trùng.
- Hội chứng thần kinh: ở một số trâu, bò khi lên cơn sốt còn thể hiện
hội chứng thần kinh như điên loạn, mắt đỏ ngầu, húc đầu vào tường, chạy
vòng quanh kêu rống lên. Trường hợp nhẹ thấy run rẩy từng cơn, mắt trợn
ngược rồi đổ ngã vật xuống, sùi bọt mép giống như trâu bị cảm nắng. Sau 20 -


12

30 phút con vật lại đứng dậy đi lại được. Những trâu bò mắc bệnh có triệu
chứng lâm sàng như trên thường là mắc bệnh ở thể cấp tính.
Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân
sau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được. Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và
nhai lại cho đến khi sắp chết.
- Phù thũng dưới da: phù thũng thường thấy ở vùng thấp của cơ thể như
ở bốn chân (từ khớp khuỷu trở xuống), phần yếm, ngực, bộ phận sinh dục.
- Viêm giác mạc và kết mạc mắt: triệu chứng này thấy ở hầu hết trâu,
bò bệnh. Mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng đỏ
ngầu. Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng (củi nhãn) kéo che kín giác mạc.
- Hội chứng tiêu hoá: một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng,
màu vàng, sau chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy. Các đợt ỉa chảy tiếp
theo những cơn sốt cách quãng. Ỉa chảy trong bệnh tiên mao trùng thường dai
dẳng và con vật vẫn ăn được.
- Gầy yếu, suy nhược: ở thể bệnh cấp tính trâu, bò gầy sút nhanh, chỉ
sau 7 - 14 ngày từ khi phát bệnh con vật đã gầy rộc, mắt trũng sâu. Nếu bệnh
kéo dài thì con vật gầy xơ xác, lông dựng ngược, da khô nhăn nheo, niêm mạc
mắt nhợt nhạt, lông dễ rụng, dần dần suy nhược cơ thể nặng, mất khả năng

cày kéo và sinh sản. Nếu gặp điều kiện bất lợi như thiếu ăn, rét mướt thì trâu,
bò dễ chết. Trong thực tế, có khoảng 3% trâu bệnh ở thể ẩn vẫn béo khoẻ, làm
việc bình thường khi được chăm sóc nuôi dưỡng tốt.
Tình trạng thiếu máu thể hiện rõ trong bệnh do T. evansi gây ra. Số
lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố giảm, số lượng bạch cầu tăng,
thành phần bạch cầu thay đổi: bạch cầu lymphô, bạch cầu ái toan tăng nhưng
bạch cầu trung tính giảm, protein tổng số và Albumin giảm rõ rệt.
Phạm Sỹ Lăng và cs (1984) [8], cho biết, khi protein tổng số và
Albumin giảm thì các thành phần α, β và γ globulin đều tăng, chỉ số A/G < 0,5.
2.1.3.3. Bệnh tích của bệnh tiên mao trùng
Trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có
những biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão,
xoang bao tim tích nước vàng; phổi xung huyết và tụ máu từng đám nhỏ; gan
sưng to, nhạt màu; lách sưng, mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và có


13

tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực và
xoang bụng tích dịch màu vàng nhạt; có những đám keo nhầy vàng dưới vùng
da thuỷ thũng.
2.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
2.1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng
Các biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò,
ngựa không phải lúc nào cũng phát hiện được. Rất nhiều gia súc mang bệnh
nhưng khó phát hiện các triệu chứng đặc trưng, nhất là đối với những gia súc
mắc bệnh tiên mao trùng mãn tính. Đối với gia súc mắc bệnh ở thể cấp tính,
các biểu hiện bệnh đặc trưng là sốt cao, bỏ ăn, có triệu chứng thần kinh (điên
loạn) và chết nhanh. Trâu bị bệnh mãn tính có thể thấy triệu chứng: sốt gián
đoạn, gầy còm, thiếu máu kéo dài, viêm giác mạc, phù thũng ở bụng và chân

sau, chết do kiệt sức (Phạm Sỹ Lăng, 1982 [7]). Triệu chứng sẩy thai có thể
thấy ở trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng (Nguyễn Đăng Khải, 1995 [6]).
2.1.4.2. Chẩn đoán thí nghiệm
* Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp:
Muốn phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, có thể áp dụng những phương
pháp sau:
- Phương pháp xem tươi (Direct smear)
Khi bệnh súc sốt, T. evansi thường xuất hiện trong mao quản ngoại vi;
vì vậy, nên lấy máu vùng ngoại vi để xem tươi. Cho 1 giọt máu nhỏ lên phiến
kính đã có sẵn 1 giọt EDTA 1%; dùng góc của la men khuấy đều, đậy la men
lên để máu dàn theo la men thành một lớp mỏng. Soi dưới kính hiển vi (độ
phóng đại 10 x 10 và 10 x 20) để phát hiện tiên mao trùng sống.
- Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky)
+ Phương pháp giọt dầy: Đặt 1 giọt máu to vào giữa phiến kính, dùng
một góc của đầu một phiến kính khác ria tròn giọt máu với đường kính
khoảng 1 - 1,25 cm. Để khô tự nhiên trong khoảng 1 giờ, rồi cố định bằng cồn
Methanol, nhuộm Giemsa [1 giọt Giemsa + 1 ml dung dịch PBS (Phosphat
Buffered Saline) pH = 7,2] trong 25 phút. Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy
mạnh, để khô rồi soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100 hoặc 10 x 90).
Phương pháp này có nhược điểm là dễ làm tổn thương tiên mao trùng,


14

do đó khó phân biệt được các loài khác nhau trong trường hợp nhiễm nhiều
loài tiên mao trùng cùng một lúc.
+ Phương pháp giọt mỏng: Đặt 1 giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm,
dùng la men ria máu thành một lớp mỏng. Để khô, cố định bằng cồn
Methanol trong 2 phút. Nhuộm Giemsa trong 25 phút (l giọt Giemsa + 1 ml
dung dịch PBS pH = 7,2). Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy mạnh, để khô, soi

dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100 hoặc 10 x 90).
Ưu điểm của phương pháp giọt mỏng là có thể phân biệt được hình thái
các loài tiên mao trùng khác nhau.
+ Phương pháp làm tan hồng cầu: dung dịch SDS (Sodium Dodecyl
Sulfat) là chất làm tan hồng cầu. Nhờ dung dịch SDS, tiên mao trùng dễ dàng
được phát hiện trong máu. Dung dịch SDS rất độc nên tránh tiếp xúc với da
và tránh hút bằng pipet. Dung dịch SDS dễ bảo quản ở nhiệt độ thường trong
nhiều tháng.
* Phương pháp tập trung tiên mao trùng:
Phương pháp ly tâm tập trung bằng ống Haematocrit: cho máu động vật
nghi mắc bệnh vào ống Haematocrit, một đầu ống được bịt kín bằng chất dẻo
matit, một đầu ống để hở. Ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút.
Sau đó kiểm tra sự tập trung của tiên mao trùng tại vị trí tiếp giáp giữa huyết
tương và hồng cầu (độ phóng đại 10 x 10).
Phương pháp này đơn giản, phát hiện tiên mao trùng tốt hơn phương
pháp xem tươi và nhuộm Giemsa. Song, tỷ lệ phát hiện chưa cao.
Với ống Haematocrit trên, có thể thực hiện phương pháp Darkground:
dùng cưa y tế cắt ống ở vị trí tiên mao trùng tập trung (ranh giới giữa huyết
tương và hồng cầu), nhỏ 1 giọt huyết tương lên phiến kính, đậy la men và
kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 40).
* Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm:
Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng
dụng nhiều để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam. Phương pháp này
có ưu điểm là chính xác, do trực tiếp phát hiện thấy tiên mao trùng sau khi
nhân chúng lên trong động vật thí nghiệm mẫn cảm. Song, nhược điểm của
phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là khi cần chẩn đoán nhanh, với


15

số lượng nhiều và thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng
được (Lê Ngọc Mỹ, 1994 [14]; Đoàn Văn Phúc, 1994 [17]).
* Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học:
Bằng phương pháp huyết thanh học, có thể phát hiện kháng thể hoặc kháng
nguyên tiên mao trùng. Đây là các phương pháp huyết thanh học đặc hiệu.
- Các phương pháp phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng
+ Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slice Agglutination
Test): hoà tan 1 giọt huyết thanh gia súc nghi mắc bệnh vào 1 giọt nước muối
sinh lý trên phiến kính, sau đó cho 1 giọt máu chuột bạch có nhiều tiên mao
trùng vào, trộn đều, đậy la men và soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 20
hoặc 10 x 40). Nếu thấy ngưng kết hình hoa cúc là (+) và ngược lại là (-).
Phương pháp này đơn giản, dễ làm và có thể áp dụng trên diện rộng.
+ Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)
LATEX là phương pháp được dùng để phát hiện kháng thể lưu động có
trong máu của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng.
Nguyên lý của phương pháp LATEX: khi kháng nguyên bề mặt T.
evansi gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao
trùng ở trên bản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên
với kháng thể. Hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường,
và được giải thích là do kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng được gắn lên các
hạt latex là loại kháng nguyên hữu hình, có nhiều điểm quyết định tính kháng
nguyên bề mặt (epitop surface). Còn kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng
lại có nhiều điểm thụ thể (receptor) tương ứng, đặc hiệu với các điểm quyết
định của kháng nguyên. Do đó, khi kháng nguyên tiên mao trùng gặp kháng
thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng, sẽ có hiện tượng một phân tử kháng thể
đặc hiệu liên kết với nhiều phân tử kháng nguyên và ngược lại. Kết quả là các
hạt latex cùng với kháng nguyên chụm lại, tạo thành đám ngưng kết có thể
quan sát bằng mắt thường. Kháng nguyên dùng cho phản ứng là kháng
nguyên bề mặt được tinh chế từ chủng T. evansi không nhuộm màu.
Phương pháp này có thể ứng dụng trong kiểm tra dịch tễ và có thể ứng

dụng ở cơ sở. Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện bệnh không cao do phương pháp này
cho kết quả dương tính cả khi con vật khỏi bệnh nhưng vẫn còn kháng thể tồn


16

tại trong huyết thanh; mặt khác, đối với những súc vật mới nhiễm bệnh TMT
trong huyết thanh chưa có kháng thể nên khi kiểm tra bằng phương pháp
LATEX sẽ cho kết quả âm tính.
+ Phương pháp CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis)
Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng
thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể lưu động trong máu
động vật nhiễm bệnh.
Nguyên lý: kháng nguyên tiên mao trùng đã được nhuộm màu kết hợp
với kháng thể tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh.
Cách tiến hành: dùng ống hút 2,5 ml dung dịch buffer cho vào lọ kháng
nguyên chuẩn đã được nhuộm màu (CATT reagent), lắc đều. Cho vào lọ
kháng nguyên đối chứng (đối chứng dương, đối chứng âm) mỗi lọ 0,5 ml
dung dịch buffer, lắc đều. Dùng micropipette pha loãng huyết thanh theo tỷ lệ
cần chẩn đoán (1/8). Cho các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán đã được pha
loãng lần lượt vào các vòng tròn của bản CATT, cho kháng nguyên đối chứng
vào hai vòng tròn khác của bản, mỗi loại 1 giọt (tương đương 45 µl). Sau đó
cho vào tất cả các vòng tròn trên bản CATT 1 giọt kháng nguyên chuẩn. Dùng
que nhựa trộn đều. Cuối cùng cho lên máy lắc 5 phút (60 - 70 lần/ phút) và
đánh giá kết quả.
+ Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect
Fluorescent Antibody Test). Phản ứng này là phản ứng huyết thanh học đặc
hiệu có độ nhạy cao, được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm và thực
địa. Ngoài việc được dùng làm phản ứng chuẩn để so sánh với các phương
pháp huyết thanh khác, phương pháp IFAT còn được dùng trong nghiên cứu

các dòng kháng nguyên, phát hiện kháng thể (Luckins, 1988 [23]; Davison,
1999 [20]).
Trong phương pháp IFAT, huyết thanh dương chuẩn được lấy từ trâu
bò mắc bệnh tiên mao trùng, huyết thanh âm chuẩn được lấy từ trâu bò khoẻ
mạnh, huyết thanh cần chẩn đoán là huyết thanh lấy từ gia súc nghi mắc bệnh.
Ứng dụng phương pháp này ở Việt Nam, Lương Tố Thu (1994) [21],
đã chế tạo conjugate huỳnh quang trên thỏ kháng IgG của bò để chẩn đoán
bệnh tiên mao trùng. Độ pha loãng của conjugate tự chế sử dụng cho phản


17

ứng là 1/8 và huyết thanh chuẩn pha loãng tới 1/40. Theo Lương Tố Thu, Lê
Ngọc Mỹ và cs (1996) [22], độ nhạy của phương pháp IFAT là 71,25.
Để tinh chế kháng nguyên T. evansi dùng trong phản ứng miễn dịch
huỳnh quang gián tiếp để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu bò, Vương
Thị Lan Phương (2004) [18], đã nghiên cứu kháng nguyên bề mặt T. evansi
phân lập từ trâu, bò ở 6 tỉnh phía Bắc Việt Nam và cho biết: đã thu được 6
mẫu tiên mao trùng từ 6 tỉnh, tiến hành phân dòng, phân VAT và thu được
26 VAT thuộc 6 kho kháng nguyên khác nhau. Bằng phản ứng dung giải
miễn dịch và phương pháp thấm miễn dịch, tác giả đã xác định được sự
thay đổi kháng nguyên bề mặt của T. evansi: đa số các VAT của các kho
kháng nguyên khác nhau là khác nhau, chỉ có 8 VAT/26 VAT có hiệu giá
kháng thể đơn giá đặc hiệu, có phản ứng chéo với các VAT của các kho
kháng nguyên khác. Các VAT trội xuất hiện sớm trong 4 tuần lễ đầu nhiễm
bệnh, có tính kháng nguyên mạnh có thể nghiên cứu ứng dụng chế kháng
nguyên chẩn đoán. Từ đó, tác giả đã tinh chế kháng nguyên theo phương
pháp tách tiên mao trùng để dùng trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang
gián tiếp, chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
+ Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)

Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại nhất
được ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
Nguyên lý: dùng kháng thể hoặc kháng thể kháng Globulin (kháng kháng
thể) có mang một enzym (phosphatase hoặc Peroxydase) được gắn trên mảnh Fc,
cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên. Sau đó, cho cơ chất sinh
màu vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzym và bị enzym phân huỷ tạo nên màu. So
sánh với màu của quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ của phản ứng.
Phương pháp ELISA hiện đang được sử dụng rộng rãi ở các nước trên thế
giới. Ở Việt Nam, Lê Ngọc Mỹ (1994) [15], đã bước đầu chế kháng nguyên tiên
mao trùng và ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở nước ta.
* Các phương pháp phát hiện kháng nguyên tiên mao trùng
- Phương pháp ELISA kháng nguyên (Ag - ELISA)
Đây là phương pháp sử dụng phản ứng ELISA kháng nguyên để phát