NGHIÊN CỨU CHẤT ỨC CHẾ HOẠT TÍNH PROTEASE HIV TỪ DỊCH CHIẾT CỦA LÁ CÂY THẠCH DÂU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Hồng Anh

NGHIÊN CỨU CHẤT ỨC CHẾ HOẠT TÍNH PROTEASE HIV-1
TỪ DỊCH CHIẾT CỦA LÁ CÂY THẠCH CHÂU
(PYRENARIA JONQUERIANA), ỔI (PSIDIUM GUAJAVA)
VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA)

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


MỞ ĐẦU
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) gây ra bởi virus gây suy
giảm miễn dịch ở người (HIV). Đây là virus thuộc họ Retroviridae và có hai type
chính là HIV-1 và HIV-2, trong đó type 1 xuất hiện phổ biến và là nguyên nhân
chính gây ra AIDS ở người. Cho đến nay, dù đã có những chương trình hành động
toàn cầu cùng với sự phát triển của các phương pháp điều trị, AIDS vẫn là đại dịch
của toàn nhân loại và cần thiết phải tăng cường các biện pháp phòng ngừa, điều trị
bệnh hiệu quả.
Trong phòng chống nhiễm HIV-1, phát triển vaccine gặp rất nhiều khó
khăn và thường thất bại do thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, thường xuyên xảy
ra đột biến ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên. Vì vậy, cho đến hiện nay,
người nhiễm HIV-1 muốn kéo dài cuộc sống chỉ có con đường duy nhất là sử
dụng liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART).
Trong chu trình tái bản của HIV-1, protease là enzyme có tác dụng phân
cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và
chức năng trong quá trình trưởng thành của virus. Khi ức chế hoạt tính của

protease hoặc gây đột biến trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus vẫn
hình thành nhưng không được đóng gói phù hợp để tạo thành virus hoàn chỉnh
nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ. Vì vậy, một số
chất ức chế protease HIV-1 (PI) đã được phát triển thành thuốc điều trị bệnh
nhân HIV/AIDS. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trong thời gian dài với nồng
độ cao cùng với tốc độ đột biến lớn của HIV-1 dẫn đến sự xuất hiện các chủng
virus kháng thuốc là một trong những nguyên nhân chính gây thất bại điều trị
với ART nói chung và PI nói riêng. Hơn nữa, việc thiết kế các chất PI mới
không phải dễ dàng, không định hướng, phải sàng lọc trên số lượng khá lớn
các hợp chất thiết kế tương tự nhau trên cơ sở hiểu biết về cấu trúc và chức
năng của protease HIV-1. Chính vì vậy, bên cạnh các thuốc tổng hợp hóa học,
1


các nhà khoa học trên thế giới cũng không ngừng tìm kiếm và chọn lọc các
chất tự nhiên từ dịch chiết thực vật có tác dụng ức chế protease của HIV-1
(protease HIV-1).
Việt Nam với nguồn thực vật phong phú và nhiều cây thuốc có giá trị
lớn với sức khỏe con người. Theo thống kê, Việt Nam có hơn 12.000 loài
thực vật, trong đó có gần 4.000 loài được dùng làm thuốc trong y học dân
gian và y học cổ truyền. Như vậy, thực vật Việt Nam cũng s là nguồn
nguyên liệu phong phú để sàng lọc và xác định các hoạt chất ức chế protease
HIV-1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân
HIV/AIDS. Tuy nhiên, cho đến nay chúng ta chưa khai thác nguồn tài
nguyên phong phú của đất nước theo hướng này.
Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên
cứu chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết của lá cây Thạch
châu (Pyrenaria jonqueriana), Ổi (Psidium guajava) và Ma hoàng
(Ephedra distachya)” nhằm thu nhận được chất ức chế protease HIV-1 có
nguồn gốc từ dược liệu Việt Nam.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦA HIV-1
1.1.1. Giới thiệu chung về HIV
Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trình
phát triển xã hội. Sau 3 thập kỷ phát hiện mà đầu tiên là ở các nước phát triển,
HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt ở khu vực châu Phi và các
nước châu Á. Đến nay vẫn chưa có vaccine phòng ngừa HIV hay thuốc chữa trị
AIDS đặc hiệu.
Theo chương trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2015), tính
đến cuối năm 2014, thế giới có khoảng 36,9 triệu người (dao động trong khoảng
từ 34,3 triệu đến 41,4 triệu) đang mang căn bệnh AIDS, trong đó số đối tượng
nhiễm mới là 2 triệu người và có khoảng 1,2 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS
trong năm 2014.
Trong phòng chống nhiễm HIV/AIDS, phương thức điều trị phổ biến nhất
hiện nay vẫn là liệu pháp dùng thuốc chống virus (ART-antiretroviral drug
therapy) bao gồm thuốc ức chế reverse transcriptase, thuốc ức chế integrase và
thuốc ức chế protease (PI). Trong đó, protease được mã hóa bởi gen pol của virus
có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định
để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh.
Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 không được đóng gói phù hợp để tạo virus
hoàn chỉnh. Vì vậy, protease của HIV-1 (protease HIV-1) là một trong những
đích quan trọng để phát triển thuốc điều trị AIDS.
1.1.2. Cấu trúc và chức năng của protease HIV-1
Về cấu trúc, protease HIV-1 là một protease aspartyl, họ retropepsin A2.
Enzyme này có cấu trúc dạng homodimer, mỗi monomer gồm 99 acid amin và
được sắp xếp gần như theo kiểu đối xứng.

3


Cấu tạo của protease HIV-1 có thể chia thành ba vùng chính: vùng dimer
hóa, vùng lõi và vùng mũ. Trong đó, vùng dimer hóa được hình thành nhờ
tương tác giữa 8 gốc acid amin 1 – 4 (vùng N đầu cùng) và 96 – 99 (vùng C tận
cùng) từ mỗi monomer và các acid amin trong trung tâm hoạt động 24 – 29. Khi
enzyme gắn thêm chất ức chế hoặc cơ chất, sự ổn định của cấu trúc dimer được
tăng cường. Vùng lõi gồm 4 đầu N sợi β có vai trò quan trọng đối với sự ổn
định cấu trúc dimer và hoạt tính xúc tác của enzyme. Trung tâm hoạt động của
enzyme nằm trong vùng lõi và bao gồm ba gốc acid amin từ mỗi monomer.
Vùng mũ nằm ở phần rộng nhất của enzyme bao gồm các acid amin từ 33 – 43
và 44 – 63 bao quanh trung tâm hoạt động.
Trung tâm hoạt động của protease chứa bộ ba Asp – Thr – Gly nằm tại mặt
phân giới của dimer. Tại một monomer nhóm bộ ba xúc tác được đặt ở vị trí 25 –
26 – 27 và do tính đối xứng ở monomer còn lại là 25’ – 26’ – 27’. Phân tử Asp25
và 25’ là cần thiết cho cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease.
Về chức năng, sau khi được giải phóng khỏi màng tế bào vật chủ, HIV-1
tồn tại như một hạt virus không có khả năng lây nhiễm được gọi là virion. Để
trở thành một hạt virus hoàn chỉnh, virion phải trải qua quá trình sắp xếp lại cấu
trúc nhờ khả năng phân cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) của protease để
tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho sự trưởng thành của
virus. Ngoài vai trò phân cắt các tiền chất của virus, protease HIV-1 cũng cắt các
protein của tế bào chủ. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự phân giải và
suy giảm các protein của tế bào dẫn tới cả quá trình chết hoại tử và chết tự hủy ở
các tế bào CD4+ T. Sự suy giảm các tế bào CD4+ T là một dấu hiệu của
HIV/AIDS. Như vậy, có thể dễ dàng nhận thấy vai trò quan trọng của protease
HIV-1 trong việc phân cắt các protein tiền thân của virus, lắp ráp của các virion
trưởng thành và góp phần gây độc cho tế bào vật chủ trong quá trình xâm nhiễm.

4


1.1.3. Phân tích hoạt độ của protease HIV-1
Protease HIV-1 có chức năng phân cắt các polyprotein tiền thân gag và
gag-pol của virus. Trung tâm hoạt động của protease bao gồm bộ ba Asp25,
Thr26 và Gly27; nếu đột biến xảy ra tại Asp25 s dẫn đến mất hoạt tính của
protease HIV-1. Protease HIV-1 cũng có hoạt tính tự cắt xảy ra sau khi protein
gag-pol hình thành dimer hóa, qua đó cho phép giải phóng chính nó ra khỏi
polyprotein tiền thân. Hoạt tính của enzyme này là tuyệt đối cần thiết cho quá
trình hình thành virus hoàn chỉnh dẫn đến vai trò quan trọng của protease trong
liệu pháp dùng thuốc chống HIV-1.
Phát triển thuốc ức chế protease HIV-1 cần thiết phải có các phương pháp
xác định hoạt độ của protease phù hợp. Do protease HIV-1 chỉ thủy phân
peptide hay protein chứa những trình tự đặc hiệu, không thủy phân các protein
thông thường nên việc xác định hoạt độ của protease chỉ có thể được thực hiện
khi sử dụng các cơ chất được thiết kế dựa trên các trình tự phân cắt của protease
HIV-1. Vì vậy, phần lớn cơ chất là các chuỗi peptide có trình tự giống với một
trong các vị trí cắt đặc hiệu của protease HIV-1 trên các chuỗi polyprotein gag và
gag-pol của HIV-1. Dưới đây là một số phương pháp xác định hoạt độ của
protease HIV-1 được sử dụng phổ biến.
Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp pha đảo (Reversed Phase HPLC)
định lƣợng sản phẩm phân cắt từ cơ chất tổng hợp: Phương pháp có độ nhạy
cao nhưng nhược điểm là: tiêu tốn nhiều thời gian, không thích hợp làm nhiều
mẫu và thiếu tính liên tục. Những hạn chế này của HPLC đã dần được khắc phụ
bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC (Ultra
performance liquid chromatography) để tăng độ phân giải, độ nhạy và số lượng.
So với HPLC, UPLC có quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản, thời gian phân tích
ngắn và có tính chọn lọc cao cho phép đánh giá đồng thời nhiều chất ức chế.

5


Phƣơng pháp quang phổ kế với cơ chất peptide có liên kết đặc hiệu
của protease HIV-1: cơ chất peptide được thiết kế có chứa vị trí phân cắt của
protease HIV-1 có khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng nhất định trong vùng
tử ngoại. Dưới tác dụng của protease, liên kết bị phân cắt, độ hấp thụ ánh sáng
giảm dần theo thời gian tác dụng của enzyme. Phương pháp được thực hiện
nhanh, không tốn nhiều thời gian, liên tục và cho số liệu chính xác.
Phƣơng pháp quang phổ huỳnh quang: Dựa trên trình tự cắt của
protease HIV-1, Taylor và tập thể (1992) đã tổng hợp một cơ chất huỳnh quang
DABCYL-SerGlnAsnTyrProIleValGln-EDANS để đo hoạt độ của enzyme. Cơ
chất được đặc trưng bởi chất phát quang là EDANS và chất thu tín DABCYL.
Khi protease HIV-1 thủy phân liên kết Tyr-Pro, DABCYL tách ra khỏi phần gắn
EDANS, nhờ đó EDANS phát ra huỳnh quang có thể đo được dưới tác dụng của
ánh sáng kích thích. Phương pháp này ít tốn thời gian, có độ nhạy, độ đặc hiệu
cao hơn quang phổ thông thường và được xem là phương pháp hiện đại nhất hiện
nay để xác định hoạt độ protease HIV-1.
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG
ĐIỀU TRỊ AIDS
1.2.1. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc hoá học
Protease HIV-1 là một trong các đích quan trọng để phát triển thuốc điều
trị HIV/AIDS. Nhìn chung, các chất ức chế protease có thể chia thành hai
nhóm lớn: i) các chất ức chế có bản chất peptide và ii) các chất ức chế không
phải peptide. Ở nhóm thứ nhất, chất ức chế giống với cơ chất tự nhiên mang
liên kết đặc hiệu của protease HIV-1. Chúng được thiết kế giống với dạng
trung gian chuyển tiếp tứ diện hình thành trong quá trình protease xúc tác.
Trong khi đó, nhóm chất ức chế không phải peptide lại gắn với phân tử H2O
trong trung tâm hoạt động của protease làm cho protease không gắn được với
các polyprotein tiền thân của HIV-1 để thực hiện chức năng của mình.

6


Đến nay, đã có 8 thuốc PI được FDA cấp phép để điều trị cho bệnh nhân
nhiễm HIV, bao gồm: Atazanavir, Darunavir, Fosamprenavir, Indinavir,
Nelfinavir, Saquinavir, Tipranavir và Ritonavir. Để đánh giá mức độ mạnh yếu
của các chất ức chế các nghiên cứu trước thường sử dụng giá trị IC50 và IC90
(nồng độ của chất ức chế mà tại đó 50% và 90% hoạt tính của enzyme bị ức chế).
Saquinavir là chất ức chế đầu tiên được FDA phê duyệt. Cơ sở của thiết
kế dựa trên khả năng phân cắt các liên kết bất thường giữa Tyr-Pro hoặc PhePro trên chuỗi polypeptide pol tiền thân của protease. Các nghiên cứu trong
phòng thí nghiệm cho thấy, Saquinavir có hoạt tính ức chế cao với giá trị IC90 là
6 nM. Tuy nhiên, Saquinavir lại có hoạt tính sinh học thấp theo đường uống và
nhanh chóng bị phân hủy trong cơ thể.
Indinavir, Nelfinavir và Ritonavir đều được thiết kế dựa trên chức năng
nhận biết trình tự acid amin tương tự như Saquinavir. Trong điều kiện in vitro,
Ritonavir đã được chứng minh có khả năng ức chế các chủng HIV-1 phân lập
với IC90 vào khoảng 70 – 200 nM. Tác dụng phụ của thuốc là tương tác thuốc
cao nên nhiều thuốc bị chống chỉ định khi dùng Ritonavir, xảy ra nhiều rối loạn
chuyển hóa, giảm chức năng gan.
Indinavir là một chất ức chế mạnh và chọn lọc của protease ở nồng độ 0,6
nM. Indinavir được tăng cường độ hòa tan, hoạt tính sinh học theo đường uống
rất tốt và ức chế virus với nồng độ từ 50 – 100 nM. Mặc dù vậy, có một số vấn
đề liên quan đến Indinavir đó là thuốc gây sỏi thận ở khoảng 5 – 25% số bệnh
nhân, có tác dụng phụ trên da, niêm mạc và gây tăng bilirubin không triệu
chứng. Do đó, hiện nay Indinavir vẫn có vai trò thứ yếu trong điều trị HIV.
Nelfinavir cũng là một trong các chất ức chế protease được sử dụng nhiều
nhất. Ở điều kiện in vitro, Nelfinavir ức chế protease HIV-1 mạnh với Ki là 2,0
nM. Thuốc này đã được chứng minh có khả năng kháng một số chủng HIV-1 và
7

HIV-2 với IC50 là 9 – 60 nM. Tác dụng của Nelfinavir được tăng cường khi sử
dụng cùng các thuốc kháng retrovirus khác.
Bên cạnh các tác dụng phụ, khi sử dụng các thuốc tổng hợp hóa học để
điều trị cho các bệnh nhân nhiễm HIV phải xem xét tới vấn đề đột biến kháng
thuốc của HIV-1. Trong các đột biến kháng thuốc thì phổ các đột biến PI rất
rộng, có thể do sự đa hình xảy ra ở 49 gốc acid amin trong tổng số 99 gốc acid
amin của protease. Khi điều trị bằng các thuốc ức chế protease không tăng
cường, các đột biến chính làm giảm rõ rệt hoạt tính của các thuốc. Đối với các
chất ức chế protease tăng cường phải cần sự xuất hiện của nhiều đột biến đồng
thời mới xảy ra tình trạng kháng thuốc.
1.2.2. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc tự nhiên
Mặc dù PI tổng hợp hoá học có tính đặc hiệu cao nhưng nhược điểm là gây
ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn khi sử dụng trong thời gian dài và khả
năng kháng thuốc cao. Do đó, sự ra đời của các loại thuốc PI mới chống
HIV/AIDS là hết sức cần thiết. Tuy nhiên, việc thiết kế các chất mới thường khá
phức tạp, phải trải qua nhiều bước thử nghiệm và không thân thiện với con người.
Chính vì vậy, ngoài các thuốc tổng hợp hóa học, các nhà khoa học cũng không
ngừng tìm kiếm và chọn lọc các chất tự nhiên có tác dụng ức chế protease HIV-1.
Nhiều dịch chiết từ thực vật và vi sinh vật đã được sử dụng để chống
nhiễm trùng, chống lại sự phát triển của các khối u cũng như có hoạt tính kháng
HIV-1 và protease HIV-1. Otake và tập thể đã nghiên cứu tác dụng của 30 dịch
chiết thực vật lên hoạt động của HIV-1 và nhận thấy khả năng ức chế nhiều
nhất là dịch chiết methanol của cây xà cừ Tây Ấn. Các loài thực vật khác cũng
có khả năng ức chế 40 – 50% hoạt tính của protease HIV-1 tại nồng độ 100
µg/ml như dịch chiết methanol thân rễ của cây Riềng nếp (Alpinia galangal) ức
chế 48,70% và cây Nhọ nồi (Eclipta prostrate) ức chế 42,53%.
8

Protease HIV-1 thuộc họ protease aspartyl, có dạng dimer và mang
những đặc điểm tương đồng với pepsin về cấu trúc cũng như cơ chế xúc tác.
Do protease HIV-1 có tính đặc hiệu cơ chất cao nên gần như không thể sử
dụng nó trong các khâu sàng lọc, vì các chất có mặt s ảnh hưởng đến phép
phân tích. Chính vì vậy, trong nhiều nghiên cứu, pepsin thường được dùng
thay thế cho protease HIV-1 trong quá trình sàng lọc. Chẳng hạn như, Rege và
tập thể đã sử dụng pepsin thay thế cho protease HIV-1 để đánh giá hoạt tính ức
chế của các dịch chiết từ thực vật. Kết quả cho thấy, dịch chiết ethanol của
Hương nhu tía (Ocimum sanctum) và Thần thông (Tinospora cordifolia) có hoạt
tính ức chế với IC50 tương ứng là 123,73 và 11,20 µg/ml.
Từ các dịch chiết thực vật và vi sinh vật ban đầu, một loạt các hợp chất thứ
cấp có khả năng ức chế protease HIV-1 đã được phân tách và tinh sạch bao gồm:
Các flavonoid: Đây là nhóm chất lớn nhất (các hợp chất polyphenol) được
tổng hợp trong các tế bào thực vật. Chúng được biết đến với nhiều tác dụng sinh
học quan trọng và đặc biệt là hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt tính kháng HIV-1
của các flavonoid khác nhau đã được chứng minh. Một số chalcone trong nhóm
flavonoid như: hydroxypanduratin A và panduratin A từ dịch chiết metanol của
thân, rễ cây Gừng (Boesenbergia pandurata Holtt) thể hiện khả năng ức chế
hoạt độ protease HIV-1 với IC50 tương ứng là 5,6 µM và 18,7 µM.
Các lignin: Lignin là các hợp chất cao phân tử, có mặt chủ yếu ở thực vật
có mạch. Longipedunin A được phân lập từ cây Na rừng (Kadsura
longipedunculata Finet et Gagnet) ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 là 50
µM. Nhóm nghiên cứu của Gao đã phân lập và xác định được 26 lignin (và hai
triterpenoid) từ cây Oải hương (K.angustifolia (Bertol.) O. Kuntze). Trong số
này, binankadsurin A đã thể hiện hoạt tính kháng HIV với IC50 là 3,86 µM.
Các triterpen và dẫn xuất của chúng: Triterpen là những terpene chứa
6 đơn vị isoprene, có công thức C30H48, một số kết hợp với đường gọi là
9

saponin triterpen. Trong đó, nhiều hợp chất có hoạt tính ức chế protease HIV1 đã được biết đến như: acid maslinic, acid ursolic, acid oleanolic... Cụ thể,
acid ursolic và các dẫn xuất malonate mono-este có hoạt tính ức chế protease
HIV-1 với IC50 tương ứng 8 và 6 µM. Acid ursolic, acid maslinic và một số
triterpen khác cũng đã được phân lập từ một thực vật của Trung Quốc Geum
japonicum, trong đó acid maslinic thể hiện hoạt tính ức chế protease HIV-1
mạnh nhất. Bên cạnh tác dụng ức chế protease HIV-1, các triterpen cũng được
công bố làm ngăn chặn quá trình xâm nhập của HIV, ức chế enzyme phiên mã
ngược và ức chế quá trình trưởng thành của HIV.
Không chỉ có ở thực vật, nhiều triterpen phân lập từ nấm cũng cho thấy
hoạt tính ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 dao động từ 20 đến hơn 200 µM
chẳng hạn như các triterpen từ C. songaricum thể hiện hoạt tính ức chế mạnh
protease HIV-1 với giá trị IC50 từ 4 – 14 µM. Họ nấm Ganodermataceae gồm
hơn 200 loài chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Phân lập dịch
chiết chloroform của Ganoderma colossum (FR.) thu được 8 lactone lanostane
triterpen gọi tên là colossolactone I-VIII và các hợp chất đã biết như
ergosterol, schisanlactone, và colossolactone B, C, D, E và G. Trong đó,
colossolactone I và II ức chế mạnh nhất với IC 50 tương ứng là 4,1 µM và 4,4
µM, các hợp chất còn lại ức chế yếu hơn với IC 50 từ 10,8– 29,1 µM. Qua đây,
có thể thấy rằng nhiều hợp chất triterpen có hoạt tính ức chế protease HIV-1.
Các hợp chất phenol: Tannin – một nhóm hợp chất phenol và các hợp
chất phenol liên quan khác có khả năng kháng virus hiệu quả. Một số tannin
có thể thủy phân như acid gallic và các galloyl glucose phân lập từ cây Chiêu
Liêu (Terminalia chebula) và camellia-tannin H phân lập từ cây Trà My
(Camellia japonica) lần lượt thể hiện hoạt tính ức chế intergrase và protease
HIV-1 mạnh. Các curcumin phân lập từ dịch chiết ethyl acetate của thân rễ cây
Nghệ (Curcuma longa) cũng cho thấy hoạt tính kháng protease HIV-1 và
10


HIV-2. Từ dịch chiết chloroform quả thể của nấm G. colossum ở Việt Nam đã

phân lập được hai hợp chất hydroquinone farnesyl là ganomycin B đã biết và
hợp chất mới ganomycin I. Cả hai ganomycin I và ganomycin B ức chế
protease HIV-1 với giá trị IC50 lần lượt tương ứng 21,9 µM và 2,9 µM.
Ở trong nước, nghiên cứu của Đỗ Thế Lộc và Phạm Viết Dự đã cho thấy
tác dụng hỗ trợ điều trị HIV/AIDS trên lâm sàng của bài thuốc y học cổ truyền
MD 07. Ngoài ra, một số các nghiên cứu cũng được tiến hành để đánh giá tác
dụng của viên nang Brishamin hay thuốc BSP1 trong hỗ trợ điều trị bệnh nhân
nhiễm HIV/AIDS. Nghiên cứu của Lã Đình M i và Đái Duy Ban điều tra được
40 loài thảo mộc có tác dụng kháng virus, kháng HIV và tăng cường miễn dịch
có triển vọng ở Việt Nam. Khả năng ức chế protease HIV-1 của 8hydroxyquinoline, menadione và acid asiatic cũng được phát hiện bởi Nguyễn
Thị Hồng Loan và Phan Tuấn Nghĩa. Mặc dù, cho tới nay chưa có loại thuốc
nào có nguồn gốc tự nhiên được đưa vào điều trị lâm sàng cho bệnh AIDS
nhưng hoạt động đầy hứa hẹn của các sản phẩm tự nhiên này đã được chứng
minh. Bên cạnh tác dụng ức chế trực tiếp protease HIV-1, việc tìm ra các hoạt
chất này cũng s là cơ sở để thiết kế các chất hóa học có cấu trúc tương tự
nhưng được cải biến phù hợp nhằm tăng hiệu quả ức chế protease HIV-1.
Theo thống kê của Viện Dược liệu, Việt Nam có hơn 12.000 loài thực vật,
trong đó có gần 4.000 loài được dùng làm thuốc trong y học dân gian và y học
cổ truyền. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các cây thuốc Việt Nam có
chứa nhiều hoạt chất có tác dụng sinh học đáng chú ý. Nguồn thực vật phong
phú và nhiều cây thuốc, vị thuốc của Việt Nam s là nguồn nguyên liệu phong
phú cho việc sàng lọc và phát hiện ra các hoạt chất ức chế protease HIV-1,
làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS.

11


Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Mẫu dƣợc liệu

Các mẫu thực vật, bao gồm: lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana
Pierre.), lá Ổi (Psidium guajava L.), cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.) được
thu hái và kiểm tra tính chính xác về loài thông qua đặc điểm hình thái bởi TS. Đỗ
Thị Xuyến, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Mẫu nghiên cứu
hiện được lưu giữ tại Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.
2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác
Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu gồm: protease HIV-1 là sản
phẩm của đề tài mã số: ĐT-PTNTĐ.2012-G/02; pepsin, hemoglobin, pepstatin A,
dimethyl sulphoxide (DMSO), Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB), cơ chất
peptide L6525(Lys-Ala-Arg-Val-Nle-p-nitro-Phe-Glu-Ala-amide) cho protease
HIV-1 của Sigma-Aldrich (Mỹ), kit xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ
chất huỳnh quang Kit SensoLyte® 520 HIV-1 Protease Assay (Anaspec, Mỹ).
Các hóa chất khác như trichloroacetic acid (TCA), agar, urea, βmercaptoethanol… đều đạt độ tinh sạch dành cho phân tích.
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ
Các máy móc, trang thiết bị chính sử dụng cho nghiên cứu bao gồm: tủ
ấm 37ºC (Memmert, Anh); tủ an toàn sinh học cấp 2 (Nuaire, Mỹ); máy li tâm
lạnh 5417R (Eppendorf, Đức); máy li tâm Sigma 3K (Sartorius, Đức); máy gia
nhiệt khô Multi Blok® Heater (Lab-Line Instruments, Hoa Kỳ); máy quang phổ
(Thermo Scientific, Hoa Kỳ); máy quang phổ kiến DU 800 (Beckman coulter,
Hoa Kỳ); máy NanoDrop huỳnh quang 3300 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ).
Các dụng cụ, trang thiết bị cơ bản khác của phòng Protein tái tổ hợp
thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein.
12


2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phân tách các hợp chất từ dịch chiết thực vật
- Lá dược liệu (1,5 kg) độ ẩm 8,5% được cắt nhỏ, chiết hồi lưu với ethanol
96% ở nhiệt độ sôi (chiết 3 lần, mỗi lần 4 giờ).
- Dịch chiết được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được

cao chiết ethanol đã cô khô.
- Cao chiết được hòa tan vào nước cất (0,5 lít) thành nhũ dịch và tiếp tục
chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần theo
thứ tự n-hexan (Hx) (0,5 lít × 3 lần), ethyl acetate (EtOAc) (0,5 lít × 3
lần), n-butanol (BuOH) (0,5 lít × 3 lần).
- Các dịch chiết Hx, EtOAc và BuOH được tách riêng, cất loại dung môi
dưới áp suất giảm thu được các phần cao tương ứng.
- Cao phân đoạn có hoạt tính ức chế tốt tiếp tục được chạy qua cột sắc ký
silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi dicloromethan/methanol với tỷ lệ
methanol tăng dần từ 0 đến 100%.
- Thành phần dịch rửa giải được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Sự có mặt
của các hợp chất quan tâm được quan sát bản sắc ký dưới đèn tử ngoại ở
bước sóng UV – 254 nm, 365 nm và ánh sáng trắng sau khi phun thuốc
thử H2SO4 10%/ethanol và sấy ở 110oC trong 5 phút.
- Phân đoạn lựa chọn được chạy qua cột silica gel rửa giải với hệ dung môi
gradient n-hexan/ethyl acetat (4/1; 2/1; 1/1) thu được hợp chất quan tâm.
2.3.2. Xác định cấu trúc của chất đƣợc phân tách
Công thức cấu tạo của chất phân tách được xác định thông qua các tính
chất lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và các phổ tử ngoại (UV), hồng
ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR,
DEPT, sử dụng chất nội chuẩn là TMS - tetramethyl silan) và so sánh với các dữ
liệu đã công bố.
13


2.3.3. Xác định hoạt tính ức chế pepsin bằng phƣơng pháp khuếch tán trên
đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin
Trong giai đoạn sàng lọc, hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các dịch
chiết thực vật được đánh giá gián tiếp thông qua khả năng ức chế pepsin phân
giải cơ chất hemoglobin. Quá trình chuẩn bị đĩa thạch gồm các bước như sau:

1. Các đĩa agar (2,5%) được chuẩn bị trong đệm acetate 50 mM pH 3,5, chứa
hemoglobin (0,3%) và được đục các lỗ (đường kính 4 mm) để cho mẫu.
2. 10 µl dịch chiết thực vật hoặc các phân đoạn tinh sạch pha trong DMSO
được cho vào giếng, ủ 37ºC trong 15 phút cho đến khi dịch chiết khuếch
tán một phần vào đĩa thạch.
3. 10 µl pepsin (1 mg/ml) pha trong HCl 0,01 N được bổ sung và tiếp tục ủ
ở 37ºC trong 2 giờ. Mẫu kiểm tra âm là mẫu thay đồng thời dịch chiết
bằng DMSO, thay pepsin bằng dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), mẫu
kiểm tra dương là mẫu thay dịch chiết (chứa chất ức chế) bằng DMSO.
4. Sau khi ủ 120 phút, đĩa thạch được nhuộm bằng dung dịch CBB 0,25% và
được tẩy nhiều lần cho tới khi nhìn rõ vòng phân giải của pepsin.
Hoạt tính ức chế pepsin được đánh giá trên cơ sở đo vòng phân giải cơ
chất, so sánh giữa mẫu thí nghiệm và các mẫu kiểm tra. Cụ thể, khả năng ức chế
của các hợp chất thực vật được thống kê trên cơ sở đo vòng phân giải (Bảng 1).
Bảng 1. Mức độ ức chế pepsin của các hợp chất thực vật theo
đƣờng kính vòng phân giải
Đƣờng kính vòng phân giải
(ĐKVPG) (cm)

Mức độ ức chế

0 < ĐKVPG ≤ 0,6 cm

+++

0,6 < ĐKVPG ≤ 0,9

++

0,9 < ĐKVPG < 1,1

+

1,1 ≤ ĐKVPG

(Không ức chế)
14


2.3.4. Xác định hoạt tính ức chế pepsin theo phƣơng pháp Anson cải tiến
Bên cạnh phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, hoạt tính ức chế pepsin
của các dịch chiết thực vật cũng được đánh giá bằng phương pháp Anson cải
tiến với cơ chất hemoglobin theo quy trình mô tả của hãng Sigma Aldrich.
Nguyên tắc: Hemoglobin bị phân cắt bởi pepsin thành các peptide và
acid amin hòa tan. Sự có mặt của các acid amin thơm trong sản phẩm thủy
phân được xác định thông qua độ hấp thụ của chúng ở bước sóng 280 nm
(A280) và là cơ sở để đánh giá hoạt độ của pepsin.
Cách tiến hành: Pepsin được ủ với dịch chiết ở 37ºC, 5 phút. Sau đó bổ
sung hemoglobin 2% trong HCl 60 mM và tiếp tục ủ ở 37ºC trong 15 phút. Phản
ứng được làm ngừng bằng TCA 5%, sản phẩm phân giải trong dịch nổi thu được
sau khi ly tâm được xác định bằng cách đo A280. Mẫu kiểm tra là pepsin bị bất
hoạt bằng TCA 5% trước khi bổ sung cơ chất. Hoạt độ pepsin được đánh giá
trên cơ sở hiệu số số đọc A280 của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng.
Công thức tính % ức chế:
AĐC - ATN
% ức chế =

× 100%

AĐC

Trong đó: AĐC và ATN lần lượt là độ hấp thụ tại bước sóng 280 nm của
mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm.
2.3.5. Xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu
Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các hợp chất được xác định bằng
cách sử dụng cơ chất tổng hợp có liên kết đặc hiệu dựa theo phương pháp được
mô tả bởi Richards và tập thể.
Nguyên tắc: Cơ chất peptide với trình tự Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Nph-GluAla-Met (Sigma-Aldrich) chứa vị trí phân cắt của protease HIV-1 dưới dạng cải
biến Nle (nonleucine) và 4-NO2- phenylalanine (Nph) có khả năng hấp thụ ánh
sáng cực đại ở bước sóng 300 nm (A300). Dưới tác dụng thủy phân của protease
15


HIV-1 liên kết bị phân giải, đo độ giảm A300 theo thời gian trên máy quang phổ
kế UV-VIS.
Cách tiến hành:
 Enzyme và chất ức chế được ủ trước với nhau trong môi trường đệm thử
hoạt tính (Bảng 2.) trong 5 phút.
 20 µL cơ chất được bổ sung.
 Hỗn hợp được trộn đều và tiến hành đo mức độ giảm A300 trên hệ thống
máy quang phổ trong 10 phút ở 37oC.
 Mẫu kiểm tra hay đối chứng là mẫu thay dung dịch chứa chất ức chế bằng
đệm chiết hay dung môi hòa tan chất ức chế.
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng đo hoạt độ protease HIV-1
sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu L6525
Thể tích

Thành phần

(μL)

H2O khử ion, khử trùng

127

Đệm 2x (Na-acetate 200 mM, pH 4.5, EDTA 8 mM,
-mecaptoethanol 10 mM, NaCl 1.8 M, CaCl2 10 mM)

150

Cơ chất 1mg/ml

20

Chất ức chế (ở các nồng độ khác nhau)

1

Protease HIV-1 150 ng/l

2

Tổng thể tích

300

16


Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ N NG ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 CỦA
THẠCH CHÂU (PYRENARIA JONQUERIANA PIERRE.), ỔI (PSIDIUM
GUAJAVA L.) VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA L.)
Nguyễn Văn Dũng và tập thể đã tiến hành sàng lọc hoạt tính ức chế
pepsin/protease HIV-1 của các cao chiết cồn từ 136 loài thực vật; kết quả cho
thấy có 5 cao chiết gồm: hạt Bơ (Persea americana Mill.), lá Gối hạc (Leea
rubra L.), cây Ma hoàng (Ephedra sinica L.), lá Ổi (Psidium guajava L.) và lá
Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.) ức chế mạnh enzyme. Từ dịch
chiết ethanol lá cây Gối hạc (Leea rubra L.), hợp chất acid maslinic (2α,3βdihydroxy-olean-12-en-28-oic acid; công thức phân tử C30H48O4) được phân
lập. Hợp chất này có tác dụng ức chế mạnh pepsin và protease HIV-1 với giá
trị IC50 tương ứng là 3,2 mM và 4,5 µM. Trên cơ sở đó, trong nghiên cứu này,
chúng tôi đã lựa chọn Thạch châu Pyrenaria jonqueriana Pierre. (Theaceae),
lá cây Ổi Psidium guajava L. (Myrtaceae) và cây Ma hoàng Ephedra
distachya L. (Ephedraceae) để tiếp tục phân lập, tinh sạch chất ức chế tiềm
năng protease HIV-1 và nghiên cứu tính chất của các hoạt chất thu được.
3.1.1. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây
Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.)
Cây Thạch châu Pyrenaria jonqueriana Pierre. thuộc họ Chè (Theaceae)
là một loài cây mới được phát hiện ở một số tỉnh nước ta (Lâm Đồng, Quảng
Trị, Lào Cai). Người dân những vùng này từ lâu đã thu hái và sử dụng Thạch
châu để pha nước uống giải nhiệt thay cho chè. Ngoài ra, Thạch Châu còn được
sử dụng trong các bài thuốc để thanh nhiệt, lợi tiểu, tăng sức đề kháng... Theo
các nghiên cứu, nhiều thực vật trong họ Chè (Theaceae) thường chứa nhiều hợp
chất thứ cấp quan trọng như tanin, flavonoid, polyphenol, triterpen và
17


glycoside… Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam và trên thế giới có rất ít tài liệu
nghiên cứu về cây Thạch châu, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đặc điểm
hình thái và phân loại. Do đó, nghiên cứu của chúng tôi s góp phần cung cấp

thêm các thông tin về thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của các
hợp chất phân lập từ cây Thạch châu.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành chiết cao ethanol tổng số
của lá cây Thạch châu trong các dung môi hexane (Hx), ethyl acetate (EtOAc)
và butanol (BuOH) có độ phân cực tăng dần để thu riêng các phân đoạn và cao
nước. Các dịch chiết này sau đó được kiểm tra khả năng ức chế pepsin bằng
phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với cơ chất hemoglobin.
Kết quả cho thấy, tại các giếng đối chứng chỉ có dung dịch pha pepsin HCl
là 0,01 N và dung môi pha chất nghiên cứu là DMSO 100% đều không có vòng
phân giải; với giếng chỉ có pepsin hoặc pepsin và DMSO, đường kính vòng
phân giải cơ chất là lớn nhất 1,2 cm. Qua đó chứng tỏ, vòng phần giải do hoạt
tính của pepsin tạo ra. Trong khi đó, một số giếng chứa dịch chiết cũng như
pepstatin A có đường kính vòng phân giải bị giảm đi. Dựa vào đường kính vòng
phân giải có thể kết luận, phân đoạn BuOH ức chế hoạt tính pepsin tốt nhất.
3.1.2. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây
Ổi (Psidium guajava L.)
Cây Ổi có tên khoa học là Psidium guajava L., thuộc họ Sim
(Myrtaceae). Các phần khác nhau của cây Ổi được dùng làm thuốc điều trị
một loạt các bệnh ở người: điều trị đi ngoài, bệnh tả, bỏng, liền da, hạ sốt,
ho, viêm họng… Trong cây Ổi có nhiều hợp chất hữu cơ thứ cấp, gồm
saponin, alkaloid, tannin, flavonoid, steroid, tinh dầu và rất giàu nhóm
triterpen. Triterpen đã được biết đến với nhiều tác dụng sinh học và có nhiều
tiềm năng trong điều trị bệnh như chống lại quá trình tăng sinh của tế bào
ung thư, điều trị tiểu đường, chống oxi hoá, kháng viêm và kháng HIV-1...
18


Tương tự lá cây Thạch châu, dịch chiết ethanol lá cây Ổi cũng được chiết
bởi các dung môi Hx, EtOAc và BuOH có độ phân cực tăng dần để thu được
các cao tương ứng. Khi tiến hành kiểm tra khả năng ức chế pepsin bằng phương

pháp khuếch tán trên đĩa thạch và dựa trên đường kính của vòng phân giải cho
thấy các phân đoạn Hx và EtOAc có hoạt tính ức chế pepsin tốt nhất.
3.1.3. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ thân
cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.)
Ma hoàng Ephedra distachya L. là loài cây bụi thuộc họ Ma hoàng
(Ephedraceae). Trong y học cổ truyền, Ma hoàng thường được dùng để chữa
các chứng bệnh cảm mạo phong hàn, tức ngực, hen suyễn, phù thũng, làm ra
mồ hôi, trừ lạnh, trừ ho hen, long đờm, lợi tiểu… Các nghiên cứu về thành
phần hóa học cho thấy, chi Ma hoàng có chứa alkaloid với tỷ lệ 1 – 2,5%,
trong đó chủ yếu là ephedrine có tác dụng gây hưng phấn tinh thần và giảm
đau. Ngoài ra, ma hoàng còn chứa nhiều hợp chất thứ cấp như flavonoid,
tannin, tinh dầu, acid hữu cơ, các hợp chất phenol…
Các cao được phân tách từ dịch chiết ethanol của cây Ma hoàng trong các
dung môi khác nhau cũng đã được nghiên cứu ảnh hưởng lên hoạt tính của
pepsin theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch chứa hemoglobin. Kết quả
thu được cho thấy cao BuOH có khả năng ức chế pepsin tốt nhất.
Theo kết quả thử khuếch tán trên đĩa thạch, đường kính vòng phân giải của
giếng có bổ sung cao ethanol tổng số lá cây Ổi với nồng độ 100 mg/mL là 0,95
cm, trong khi đó, hai giếng bổ sung cao ethanol từ lá Thạch châu và cây Ma
hoàng ở cùng nồng độ đều có đường kính là 1,15 cm. Bên cạnh đó, hoạt tính của
các cao Hx, cao EtOAc, cao BuOH và cao nước từ dịch chiết ethnol lá Ổi cũng
đều ức chế pepsin tốt hơn các cao tương ứng thu được từ dịch ethanol lá Thạch
châu và thân Ma hoàng, đặc biệt là hai cao EtOAc và Hx từ lá Ổi. Như vậy, bước
đầu chúng tôi có thể kết luận hoạt tính ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá Ổi
19


tốt hơn dịch chiết từ lá Thạch châu và cây Ma hoàng. Từ kết quả này, lá cây Ổi
được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phân lập, tinh sạch hợp chất có
hoạt tính ức chế protease HIV-1.

3.2. TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ N NG ỨC CHẾ PROTEASE
HIV-1 CỦA HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ỔI (PSIDIUM
GUAJAVA L.)
Khi tiến hành khảo sát cao phân đoạn Hx và EtOAc của lá cây Ổi trên sắc
ký bản mỏng chúng tôi nhận thấy vết chính trong hai phân đoạn này là cùng
một hợp chất (màu vàng, Rf = 0,7). Dựa vào đặc điểm của hợp chất này trên
bản mỏng và tham khảo các tài liệu về thành phần hoá học của cây Ổi, nhóm
hợp chất chính này được dự đoán là triterpen. Khảo sát nhiều hệ dung môi khác
nhau cũng cho thấy các vết của cao phân đoạn Hx từ lá Ổi phân tách rõ ràng
hơn các vết của cao chiết EtOAc và đặc biệt là vết chính không bị chồng lặp với
các vết khác. Do đó, cao phân đoạn Hx được lựa chọn cho các nghiên cứu phân
lập chất ức chế protease HIV-1 tiếp theo.
3.2.1. Kết quả tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease
HIV-1 từ cao Hx của lá Ổi
Cao phân đoạn Hx từ dịch chiết ethanol tổng số của lá cây Ổi được chạy
qua cột sắc ký silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi dicloromethan/methanol
với tỷ lệ methanol tăng dần từ 0 đến 100%. Dịch rửa giải được chia thành 5
phân đoạn chính ký hiệu lần lượt là: PĐ1; PĐ2; PĐ3; PĐ4 và PĐ5. Kết quả
kiểm tra khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn cho thấy, PĐ2 có khả năng
ức chế pepsin mạnh nhất.
Để khẳng định chắc chắn các dịch chiết và phân đoạn lá cây Ổi ức chế
pepsin cũng ức chế protease HIV-1, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng
của PĐ2 lên hoạt tính phân giải cơ chất peptide của protease HIV-1. Kết quả cho
thấy, tại nồng độ 4,5 µg/mL, PĐ2 ức chế trên 70% hoạt tính của protease HIV-1.
20


Để khảo sát thành phần các hợp chất có mặt trong PĐ2 chúng tôi tiến
hành phân tích phân đoạn này bằng sắc ký lớp mỏng (silica gel pha thường, hệ
dung môi n-hexan/ethyl acetate; 1/2). Kết quả cho thấy, PĐ2 có một vết chính

(màu vàng, Rf = 0,7). Đây là hợp chất triterpen chính có trong cả cao phân đoạn
Hx và EtOAc. Chính vì vậy, chúng tôi định hướng phân lập hợp chất này.
3.2.2. Kết quả tinh sạch và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1
của hợp chất LO-I
PĐ2 tiếp tục được đưa lên cột silica gel rửa giải gradient với hệ dung môi
n-hexan/ethyl acetate (4/1; 2/1; 1/1) thu được hợp chất, ký hiệu là LO-I. Kết
quả thử khả năng ức chế cho thấy: LO-I có hoạt tính ức chế pepsin rõ rệt. Khi
tăng dần nồng độ LO-I từ 5 đến 50 mg/ml, đường kính vòng phân giải giảm dần
hay hoạt tính ức chế pepsin của LO-I tăng dần. LO-I tại nồng độ 50 mg/ml ức
chế pepsin gần tương đương với pepstatin A 5 µM.
Kiểm tra hoạt tính ức chế protease HIV-1 với cơ chất đặc hiệu chúng tôi
thấy LO-I ức chế hơn 70% hoạt tính protease HIV-1 tại nồng độ 2,5 µg/ml. Khi
so sánh khả năng ức chế protease HIV-1 giữa LO-I và PĐ2 chúng tôi thấy, hợp
chất LO-I ức chế protease HIV-1 mạnh hơn PĐ2 1,8 lần. Như vậy, có thể khẳng
định LO-I chính là hoạt chất có khả năng ức chế protease HIV-1 đang quan tâm.
3.2.3. Xác định cấu trúc hợp chất LO-I
Kết quả phân tích hợp chất LO-I cho thấy: Hợp chất LO-I thu được ở
dạng bột vô định hình màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 260-262 oC. Phổ UV
(MeOH) λmax: 202 nm. Phổ IR (cm-1): 3424; 2926; 1690. Phổ ESI-MS (m/z)
=455 [M-H]. Phổ 1H-NMR (CD3OD+CDCl3; 500 MHz): 5,14(1H, t, 4,0, H-12),
3,07 (1H, dd, 4,5; 11,0, H-3), 2,11 (1H, d, 11,5, H-18), 1,01; 0,87; 0,86; 0,75;
0,68 (tín hiệu 3H, s, H-27; 23; 25; 26; 24), 0,89 (3H, d, 6,5, H-29), 0,79 (3H, d,
6,5, H-30). Phổ 13C-NMR (CD3OD+CDCl3; 125 MHz): 39,5 (C-1), 27,6 (C-2),
21


79,4 (C-3), 39,7 (C-4), 56,3 (C-5), 19,2 (C-6), 28,6 (C-7), 40,4 (C-8), 48,5 (C9), 37,7 (C-10), 24,1 (C-11), 126,5 (C-12), 139,2 (C-13), 42,9 (C-14), 34,0 (C15), 25,1 (C-16), 48,5 (C-17), 53,9 (C-18), 39,9 (C-19), 40,1 (C-20), 31,5 (C21), 37,8 (C-22), 28,9 (C-23), 17,5 (C-24), 16,2 (C-25), 15,9 (C-26), 24,1 (C27), 181,4 (C-28), 17,6 (C-29), 21,5 (C-30).
Phổ IR cho biết trong phân tử LO-I có các nhóm chức OH (dải hấp thụ có
đỉnh 3424 cm-1) và nhóm C=O (đỉnh 1690 cm-1). Phổ 1H-NMR cho biết có một
proton olefin có δH 5,14 ppm; có 5 tín hiệu proton của của nhóm methyl xuất

hiện ở dạng một đỉnh đơn ở độ chuyển dịch từ 0,68 ppm đến 1,01ppm, hai tín
hiệu nhóm CH3 xuất hiện dưới dạng đỉnh kép với hằng số ghép cặp J=6,5 Hz.
Các phổ 13C-NMR và DEPT cho biết có tổng cộng 30 tín hiệu cacbon trong cấu
trúc của hợp chất LO-I, bao gồm 7 nhóm methyl (CH3), 9 nhóm methylen (CH2),
7 nhóm methin (CH), 7 cacbon bậc 4 (C). Trong đó có các tín hiệu cacbon
carbonyl (C=O; δc 181,4 ppm) và hai cacbon olefin (δc 126,5 và 139,2 ppm).
Dựa trên tất cả các dữ kiện phổ, chất số LO-I được dự đoán là một triterpen
khung ursan. Phổ ESI-MS có đỉnh ion tại m/z 455 [M-H]- (negative) cho biết
công thức phân tử của LO-I là C30H48O3 (M=456,7). Từ việc phân tích các dữ
liệu phổ, kết hợp với tài liệu tham khảo hợp chất LO-I được xác định là acid
ursolic (3β-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid).
3.3. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ACID URSOLIC
3.3.1. Hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1của acid ursolic
Nghiên cứu ảnh hưởng của acid ursolic lên hoạt độ của protease HIV1 cho thấy acid ursolic ức chế mạnh protease HIV-1 với nồng độ cơ chất tại
đó 50% protease còn hoạt động (IC 50) là 3,5 µM. Tại nồng độ 20 µM của
acid ursolic, hoạt tính của protease HIV-1 gần như bị ức chế hoàn toàn. Bên
cạnh đó, khi sử dụng phương pháp Anson cải tiến trong ống nghiệm, chúng
tôi thấy acid ursolic ức chế hoạt động của pepsin với IC 50 là 2,5 mM. Như
22


vậy, acid ursolic đã ức chế protease HIV-1 mạnh hơn 700 lần so với ức chế
pepsin, chứng tỏ chất ức chế này đặc hiệu cao hơn với protease HIV-1. Tuy
nhiên, do cơ chất dùng cho protease HIV-1 không thể dùng cho pepsin và
ngược lại nên sự khác nhau về cơ chất có thể làm gia tăng sự khác biệt về
mức độ ức chế hai enzyme này bởi acid ursolic.
3.3.2. Cơ chế ức chế protease HIV-1 của acid ursolic
Nghiên cứu kiểu ức chế của acid ursolic đối với protease HIV-1 được xác
định trên cơ sở sự thay đổi các giá trị K m và Vmax của protease HIV-1 trong điều
kiện không có chất ức chế là acid ursolic (chỉ có dung môi DMSO hoà tan acid

ursolic) so với khi có mặt của acid ursolic tại nồng độ 1,5 và 20 µM. Trong đó,
Km và Vmax được xác định khi thuỷ phân cơ chất đặc hiệu của protease HIV-1
với nồng độ tăng dần và dựa theo phương trình Lineweaver – Burk. Kết quả
cho thấy, khi có mặt của acid ursolic, các giá trị Km và Vmax của protease HIV-1
đều giảm. Do đó, acid ursolic đã ức chế protease HIV-1 theo kiểu không cạnh
tranh (uncompetitive).
Acid ursolic là một triterpenoid vòng năm cạnh có công thức phân tử
C30H48O3 được phân lập đầu tiên từ cây Táo (Malus domestica Borkh.) vào
năm 1920. Khả năng ức chế protease HIV-1 của acid ursolic cùng với một số
acid triterpen khác tinh sạch từ dịch chiết loài thực vật Geum japonicum, họ
Hoa hồng (Rosaceae) đã được phát hiện từ khá sớm.
Acid ursolic cũng đã được phân lập từ cây Ổi và có hoạt tính thúc đẩy
tăng sinh, biệt hoá và hấp thụ glucose của tế bào hay chống viêm, chống oxy
hoá. Trong nghiên cứu này, acid ursolic phân lập từ lá cây Ổi có hoạt tính ức
chế protease HIV-1 với nồng độ IC50 là 3,5 µM tốt hơn acid ursolic được phân
lập từ nấm Toả dương (Cynomorium songaricum Rupr.) và các thực vật khác.
Các kết quả trong nghiên cứu này gợi ý về khả năng phát triển và sử dụng lá
cây Ổi và hoạt chất acid ursolic trong điều trị HIV.
23


3.3.3. Dạng chế phẩm phù hợp của acid ursolic
Sau khi có hoạt chất, phần lớn các nghiên cứu thường tìm ra dạng chế phẩm
có hiệu quả sử dụng cao nhất: tăng khả năng hòa tan trong nước, tăng cường sinh
khả dụng... Để xác định dạng chế phẩm bảo quản phù hợp cho acid ursolic, trước
tiên, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng hoà tan của acid ursolic trong 5 dung
môi khác nhau. Nồng độ thử nghiệm là 2 mg chất/300 µl dung môi hòa tan. Kết
quả cho thấy acid ursolic tan tốt (dung dịch trong suốt) trong DMSO và ethanol;
không tan tốt (xuất hiện vẩn đục dù sau khi đã siêu âm) trong ethyl acetate và
trong nước. Đối với trường hợp sử dụng dung môi hòa tan là acetone, acid uroslic

không tan hoàn toàn. Tuy nhiên, sau khi siêu âm trong 5 phút thì thu được dung
dịch trong suốt. Từ những kết quả trên, chúng tôi lựa chọn các mẫu chế phẩm hòa
tan trong DMSO, ethanol, acetone và mẫu chế phẩm dạng bột (khi thử nghiệm hòa
tan trong DMSO) để đánh giá tác dụng ức chế enzyme protease HIV-1.
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng ức chế protease HIV-1
của acid ursolic ở các dạng chế phẩm khác nhau. Dạng 1: dạng bột, hòa tan
trong dung môi DMSO trước khi thử phản ứng; Dạng 2,3 và 4 là dạng dung
dịch, hòa tan trong các dung môi lần lượt là DMSO, acetone và ethanol. Kết
quả cho thấy, acid ursolic ở dạng 1, 2, 3 và 4 đã ức chế protease HIV-1 với giá
trị IC50 tương ứng là: 2,0 µg/mL, 2,3 µg/mL, 4,2 µg/mL và 3,9 µg/mL.
Như vậy, ở dạng dung dịch, acid ursolic hoà tan trong DMSO có hoạt
tính ức chế protease HIV-1 cao nhất gấp tương ứng 1,7 lần và gần 2 lần so với
khi hoà tan trong acetone và ethanol. So sánh giữa dạng bột, hoà trong DMSO
trước khi tiến hành thí nghiệm và dạng dung dịch acid ursolic được bảo quản
trong dung dịch DMSO thì giá trị IC 50 của dạng 1 thấp hơn dạng 2. Sự chênh
lệch chưa đáng kể, tuy nhiên chế phẩm bảo quản dạng bột thường ổn định và
không cần yêu cầu nhiệt độ khắt khe khi bảo quản lâu dài như dạng dung dịch
nên việc tạo chế phẩm acid ursolic để bảo quản ở dạng bột s được lựa chọn.

24