Nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin (GmARF) ở đậu tương và strigolactone ở Arabisopsis trong chịu hạn và mặn.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP & PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HÀ VĂN CHIẾN

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ
PHIÊN MÃ ĐÁP ỨNG AUXIN (GmARF) Ở ĐẬU
TƯƠNG VÀ STRIGOLACTONE Ở ARABIDOPSIS
TRONG CHỊU HẠN VÀ MẶN

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP & PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HÀ VĂN CHIẾN

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ
PHIÊN MÃ ĐÁP ỨNG AUXIN (GmARF) Ở ĐẬU
TƯƠNG VÀ STRIGOLACTONE Ở ARABIDOPSIS
TRONG CHỊU HẠN VÀ MẶN
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 62 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng
2. TS. Trần Phan Lam Sơn

HÀ NỘI – 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. Toàn bộ số
liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử
dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích
dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận án

HÀ VĂN CHIẾN

i


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn chương trình đào tạo IPA (International

Program Associate) liên kết giữa Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam (VAAS,
Việt Nam) và Viện RIKEN (Nhật Bản) đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận
án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng (Giám
đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền nông
nghiệp), TS. Trần Phan Lam Sơn (Trưởng nhóm nghiên cứu về Phương thức dẫn
truyền tín hiệu, Trung tâm Khoa học về nguồn tài nguyên bền vững, Viện RIKEN,
Nhật Bản), đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn
thành công trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ của nhóm nghiên cứu về Phương
thức dẫn truyền tín hiệu, Trung tâm Khoa học về nguồn tài nguyên bền vững, Viện
RIKEN, Nhật Bản - nơi tôi thực hiện các nội dung chính trong đề tài luận án, đã tạo
điều kiện và thời gian cho tôi hoàn thành luận án này.
Để hoàn thành luận án, tôi còn nhận được sự động viên, khuyến khích giúp đỡ
của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tất cả những sự giúp đỡ và tình cảm quý
báu đó là nguồn động lực lớn giúp tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận án

HÀ VĂN CHIẾN

ii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. ix
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài ..........................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ...............................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu của đề tài ...............................................................................2
3.1. Nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin trong điều kiện hạn
ở đậu tương..................................................................................................................2
3.2. Nghiên cứu vai trò của strigolactone trong điều kiện hạn, mặn ở Arabidopsis ...2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.................................................................................3
4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................3
5. Những đóng góp mới của luận án ...........................................................................3
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................5
1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................5
1.2. Cơ chế đáp ứng của thực vật với các điều kiện bất lợi của môi trường .............10
1.3. Tổng quan về các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin ở thực vật ............................14
1.3.1. Khái niệm, phân loại yếu tố phiên mã .................................................... 14
1.3.2. Cấu trúc và chức năng của yếu tố phiên mã ............................................ 15
1.3.3. Tình hình nghiên cứu của các yếu tố phiên mã trong chống chịu các điều
kiện bất lợi của môi trường ............................................................................... 17
1.3.4. Yếu tố phiên mã đáp ứng auxin .............................................................. 18
iii


1.3.5. Các yếu tố phiên mã ở đậu tương ........................................................... 20

1.4. Tổng quan về strigolactone ................................................................................21
1.4.1. Định nghĩa, phân loại strigolactone ........................................................ 21
1.4.2. Đặc điểm cấu trúc của strigolactone ....................................................... 23
1.4.3. Quá trình sinh tổng hợp strigolactone ..................................................... 24
1.4.4. Quá trình vận chuyển và truyền dẫn tín hiệu strigolactone ..................... 27
1.4.5. Vai trò của strigolactone ........................................................................ 28
1.4.6. Tiềm năng ứng dụng của strigolactone ................................................... 30
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................32
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu ...............................................................32
2.1.1. Vật liệu thực vật ..................................................................................... 32
2.1.2. Hóa chất ................................................................................................. 32
2.1.3. Thiết bị và phần mềm ............................................................................. 33
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................33
2.2.1. Thời gian nghiên cứu .............................................................................. 33
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 33
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................33
2.3.1. Phương pháp trồng, xử lý và thu mẫu đậu tương và Arabidopsis ............ 33
2.3.2. Phương pháp xác định các thành viên của GmARF và các gen liên quan
đến sinh tổng hợp và truyền dẫn tín hiệu strigolactone ở đậu tương .................. 34
2.3.3. Phương pháp xây dựng và phân tích cây phát sinh chủng loại ................. 35
2.3.4. Phương pháp phân tích mức độ biểu hiện của các gen GmARF sử dụng các
dữ liệu microarray và Illumina transcriptome sẵn có của đậu tương. ................ 35
2.3.5. Phương pháp tách chiết RNA và tổng hợp cDNA, thiết kế mồi cho phân
tích sự biểu hiện gen ở đậu tương và Arabidopsis ............................................. 35
2.3.6. Phương pháp xử lý hạn và phân tích microarray ở Arabidopsis ............... 39
2.3.7. Các phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn, chịu mặn và chịu áp suất
thẩm thấu cao ................................................................................................... 40
2.3.8. Phương pháp RT-qPCR và phân tích thống kê các số liệu ....................... 43
iv

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................45
3.1. Vai trò của các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin trong điều kiện hạn ở đậu
tương………………………………………………………………………………45
3.1.1. Thành viên thuộc họ các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin ở đậu tương .... 45
3.1.3. Biểu hiện của các gen GmARF trong các mô và các cơ quan khác nhau ở
điều kiện bình thường ....................................................................................... 53
3.1.4. Biểu hiện của các gen GmARF ở rễ và thân của cây trong điều kiện hạn 60
3.1.5. Biểu hiện của các gen GmARF ở điều kiện hạn trong giai đoạn cây con và
cây trưởng thành của cây đậu tương ................................................................. 64
3.2. Vai trò của strigolactone trong điều kiện hạn, mặn ở Arabidopsis ....................67
3.2.1. Khả năng chịu hạn và mặn của các cây đột biến gen max ....................... 67
3.2.2. Vai trò của strigolactone ngoại sinh trong việc phục hồi khả năng kháng
hạn ở cây đột biến gen max3 và max4 và tăng cường khả năng chịu hạn ở cây
nguyên thủy ...................................................................................................... 71
3.2.3. Tác động của ABA ngoại sinh tới các cây đột biến max ......................... 73
3.2.4. Sinh trưởng rễ của các cây đột biến max trong điều kiện nồng độ muối và
áp suất thẩm thấu cao ....................................................................................... 75
3.2.5. Ảnh hưởng của hạn và sự hoạt động của khí khổng dưới tác dụng của
ABA ở cây đột biến gen max ............................................................................ 77
3.2.6. Kết quả phân tích microarray ở lá của các cây đột biến gen max2-3 ở điều
kiện bình thường và điều kiện hạn .................................................................... 79
3.2.7. Khả năng chịu mặn của đậu tương dưới tác động của strigolactone ...... 104
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................107
Kết luận ...................................................................................................................107
Kiến nghị .................................................................................................................107
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .........................108
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................109

v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ABA

Abscisic acid

ABI1/ABI2

ABA-Insensitive 1/ABA-insensitive 2

AD

Vùng trình tự hoạt hóa (Activation domain)

AMF

Nấm cộng sinh với rễ (arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)

ARF

Nhân tố đáp ứng với auxin (Auxin response factor)

Aux/IAA

Auxin/indole acetic acid

BR

Brasino steroid

CCD

Carotenoid Cleavage Dioxygenases (CCDs)

CK

Cytokinin

CTD

Vùng trình tự lặp kép đầu C (Carboxy-terminal dimerization
domain)

d

dwarf

dad

decreased apical dominance

DBD

Vùng trình tự liên kết với DNA (DNA-binding domain)

DNA

Deoxinucleic acid

FAO

Tổ chức lương thực và nông nghiệp của Liên hiệp quốc (Food
and Agriculture Organization of the Uniteds Nations)

GA

Gibberelic acid

GM

Môi trường nảy mầm (Germination medium)

HAB1

Nhạy cảm cao với ABA1 (Hypersensitive to ABA1)

htd

high tillering dwarf

max

more axillary growth

M-C

Cây đột biến ở điều kiện bình thường (Mutant control)

M-D2

Cây đột biến ở điều kiện hạn 2h (Mutant dry 2h)

M-D4

Cây đột biến ở điều kiện hạn 4h (Mutant dry 4h)

MR

Vùng ở giữa (Middle region)

MS

Muối Murashige – Skoog

NST

Nhiễm sắc thể
vi


ORF

Khung đọc mở (Open reading frame)

PP2C

Protein Phosphatases 2C

PYR1/PYL

Protein Pyrabactin resistance 1/PYR1-LIKE

R2

Cây đậu tương giai đoạn ra hoa toàn bộ (Full flowering)

RD

Vùng trình tự ức chế (Repression domain)

rms

ramosus

RNA

Ribonucleic acid

RT-qPCR

Phản ứng trùng hợp chuỗi định lượng (Real-time quantitative
polymerase chain reaction)

TAD

Vùng kích hoạt trans (trans-activating domain)

TF

Yếu tố phiên mã (Transcription factor)

TRR

Vùng điều khiển phiên mã (Transcriptional regulatory region)

V6

Cây đậu tương giai đoạn có 6 lá (6 unfold trifolilate leaves)

SL

Strigolactone

SnRK2

Protein Snf1-related kinase

SSD

Vùng cảm biến tín hiệu (signal sensing domain)

W-C

Cây nguyên thủy ở điều kiện bình thường (Wild-type control)

W-D2

Cây nguyên thủy ở điều kiện hạn 2 h (Wild-type dry 2 h)

W-D4

Cây nguyên thủy ở điều kiện hạn 4 h (Wild-type dry 4 h)

WT

Loài (cây) gốc, loài nguyên thủy (Wild-type)

vii


DANH MỤC BẢNG

TT Bảng

Nội dung

Trang

Bảng 2.1

Các cặp mồi của các gen GmARF sử dụng cho RT-qPCR

36

Các cặp mồi của các gen được sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.2

vai trò của strigolactone trong chống chịu điều kiện hạn,

39

mặn.
Bảng 3.1
Bảng 3.2

Bảng 3.3

Các yếu tố phiên mã GmARF ở đậu tương
Các gen tăng cường mức độ biểu hiện ở điều kiện hạn
và ABA nhưng giảm mức độ biểu hiện ở M-C/W-C.
Các gen tăng cường sự biểu hiện bởi hạn và ABA nhưng
giảm sự biểu hiện ở M-D2/W-D2 và M-D4/W-D4

46
81

82

Giá trị Z-score của các phép so sánh giữa M-C/W-C
(giảm), W-D2/W-C (tăng) và W-D4/W-C (tăng); Giữa
Bảng 3.4

M-D2/W-D2 (giảm), W-D2/W-C (tăng) và W-D4/W-C

86

(tăng); và giữa các so sánh M-D4/W-D4 (giảm), WD2/W-C (tăng) và W-D4/W-C (tăng).
Các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp flavonoid

Bảng 3.5

và cytokinin ở cây max2-3 so sánh với cây nguyên thủy

90

trong điều kiện bình thường và điều kiện hạn
Bảng 3.6

Các gen tăng cường sự biểu hiện ở cây đột biến max2-3
tham gia vào quá trình quang hợp trong điều kiện hạn

viii

94


DANH MỤC HÌNH
TT Hình

Nội dung

Trang

Hình 1.1

Tình hình khan hiếm nước trên thế giới

6

Hình 1.2

Dự báo sản lượng của 11 cây trồng chính

7

Hình 1.3

Hình 1.4
Hình 1.5

Sự truyền dẫn tín hiệu của quá trình mất nước ở thực
vật
Vai trò của các yếu tố phiên mã trong đáp ứng với điều
kiện thiếu nước ở Arabidopsis và lúa
Cấu trúc của một số strigolactone trong tự nhiên

12

14
23

Quá trình sinh tổng hợp và truyền dẫn tín hiệu
Hình 1.6

Hình 3.1

Hình 3.2

Hình 3.3

26

strigolactone
Thành phần, phân bố các gen GmARF trên NST và cấu
trúc của các protein GmARF
Cây phân tích phát sinh chủng loại của các yếu tố phiên
mã đáp ứng auxin ở đậu tương và Arabidopsis.
Sự biểu hiện của 51 gen GmARF ở rễ và thân của cây
đậu tương 12 ngày tuổi trong điều kiện bình thường.

49

52

54

Sự biểu hiện của các gen GmARF trong các mô khác
Hình 3.4

nhau. Mức độ biểu hiện của các gen GmARF trong 8
loại mô khác nhau được phân tích sử dụng dữ liệu từ

57

Illumina transcriptome.
Mức độ biểu hiện của 42 gen GmARF trong 68 mô, cơ
Hình 3.5

quan khác nhau. Mức độ biểu hiện của các gen GmARF

59

sử dụng các dữ liệu sẵn có tại Genvestigator.
Kết quả phân tích RT-qPCR của các gen GmARF ở rễ
(cột màu đen) và thân (cột màu trắng) của cây đậu
Hình 3.6

tương trong điều kiện khô hạn. (A) Các gen GmARF
tăng cường sự biểu hiện ở thân ít nhất 2 lần. (B) Các
gen GmARF giảm sự biểu hiện ở thân ít nhất 2 lần
ix

62


Kết quả phân tích RT-qPCR của các gen GmARF ở rễ
(cột màu đen) và thân (cột màu trắng) của cây đậu
Hình 3.7

tương trong điều kiện khô hạn. (A) Các gen GmARF

63

tăng cường sự biểu hiện ở rễ ít nhất 2 lần. (B) Các gen
GmARF giảm sự biểu hiện ở rễ ít nhất 2 lần
Mức độ biểu hiện của các gen GmARF ở các giai đoạn
V6, R2 và cây con 12 ngày tuổi trong điều kiện khô
hạn. Dữ liệu về mức độ biểu hiện của các gen GmARF
Hình 3.8

trong điều kiện hạn ở lá của cây đậu tương giai đoạn

66

V6, R2 được sử dụng từ phân tích microarray. Mức độ
biểu hiện của các gen GmARF ở cây đậu tương 12 ngày
tuổi được lấy từ kết quả RT-qPCR
Hình 3.9

Khả năng chống chịu hạn của các cây đột biến max

68

Hình 3.10

Khả năng chống chịu mặn của các cây đột biến max

70

Hình 3.11

Hình 3.12

Hình 3.13

Hình 3.14

Hình 3.15

Ảnh hưởng của strigolactone ngoại sinh đến kiểu hình
và khả năng chịu hạn
Đáp ứng của các cây đột biến max khi xử lý với ABA
ngoại sinh ở thời điểm 5 ngày và 14 ngày.
Đáp ứng của các cây đột biến max khi xử lý với ABA
ngoại sinh
Rễ của cây nguyên thủy và đột biến max trong môi
trường MS ½ có bổ sung muối (A) và manitol (B).
Hàm lượng nước tương đối, sự đóng mở khí khổng và mật
độ khí khổng của các cây nguyên thủy và cây đột biến max

71

73

74

76

78

Sự biểu hiện khác nhau ở lá của các cây nguyên thủy và
Hình 3.16

cây đột biến max2-3 trong điều kiện bình thường và

80

điều kiện hạn
Hình 3.17

Kết quả kiểm tra độ tin cậy của dữ liệu microarray của
một số gen chọn lọc bằng kỹ thuật RT-qPCR.

x

87


Kết quả phân tích các gen tham gia vào quá trình quang
Hình 3.18

hợp ở điều kiện bình thường (A) và điều kiện xử lý hạn
(B) ở cây đột biến gen MAX2 (max2-3) so với cây

93

nguyên thủy (WT)
Kết quả phân tích các gen giảm sự biểu hiện trong MHình 3.19

D4/W-D4 (A) và tăng sự biểu hiện trong W-D4/W-C
(B) tham gia vào sự thay đổi của các quá trình trao đổi

97

chất
Kết quả phân tích các gen giảm sự biểu hiện trong MHình 3.20

D4/W-D4 (A) và tăng sự biểu hiện trong W-D4/W-C

98

(B) tham gia vào quá trình trao đổi thứ cấp
Sự biểu hiện của các gen MAX1, MAX3 và MAX4 trong
Hình 3.21

cây nguyên thủy ở điều kiện xử lý với điều kiện hạn,

103

mặn và ABA
Hình 3.22

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của strigolactone lên khả
năng chịu mặn của đậu tương

xi

106


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Sự gia tăng dân số nhanh chóng làm cho vấn đề an ninh lương thực trở thành
vấn đề chính của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng ().
Thêm vào đó, sản lượng lương thực cũng đang bị tổn hại nghiêm trọng bởi ảnh
hưởng của hiện tượng biến đối khí hậu, dẫn tới hậu quả là nền sản xuất nông nghiệp
bền vững bị đe dọa bởi các nhân tố như hạn, ngập úng, dịch bệnh, sói mòn đất và ô
nhiễm môi trường (Nikos and Bruinsma, 2012). Trước thực trạng đó, việc tăng
cường sự hiểu biết về đáp ứng với các điều kiện bất lợi ở thực vật sẽ tạo cơ sở cho

việc chọn tạo các giống cây trồng mới có khả năng chống chịu với các nhân tố bất
lợi nêu trên.
Trong quá trình thích ứng để chống chịu với điều kiện bất lợi ở thực vật,
sự biểu hiện và các cơ chế điều hòa mức độ biểu hiện của gen có vai trò quan
trọng. Do đó, chúng tôi tiến hành đặt nền móng cho nghiên cứu về một số nhóm
gen mới chưa từng được công bố bởi các nhà khoa học trong và ngoài nước, đặc
biệt là trên đối tượng đậu tương (Glycine max) cũng như cây mô hình
Arabidopsis thaliana. Sinh học phân tử và DNA tái tổ hợp đã chỉ ra rằng, sự biểu
hiện của gen ở sinh vật nhân chuẩn được điều khiển bởi rất nhiều nhân tố, trong
đó không thể không nhắc tới sự điều hòa chặt chẽ của các nhân tố phiên mã. Sử
dụng các công cụ và phần mềm tin sinh học để tìm kiếm, phân tích, đánh giá; kết
hợp với các kỹ thuật công nghệ tiên tiến hiện đại, chúng tôi đã xác định hướng
nghiên cứu về các yếu tố phiên mã liên quan đến đặc tính chống chịu điều kiện
bất lợi phi sinh học như hạn, mặn. Điển hình như trong luận án này, chúng tôi
tập trung phân tích tác động của các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin (auxin
response factor, ARF). Bên cạnh đó, các loại hormone thực vật đã được biết đến
với vai trò quan trọng đối với sự điều hòa các quá trình sinh lý của thực vật. Vì
vậy, chúng tôi tập trung nghiên cứu nhằm phát hiện các gen tham gia vào quá
trình sinh tổng hợp, trao đổi và truyền tin của strigolactone (SL), một nhóm
1


hormone mới của thực vật, trong điều kiện hạn và mặn. Để giải quyết vấn đề đặt
ra, chúng tôi đồng thời tiến hành nghiên cứu đề tài trên cây mô hình Arabidopsis
thaliana và cây trồng quan trọng là đậu tương với đề tài “Nghiên cứu vai trò của
các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin (GmARF) ở đậu tương và strigolactone ở Arabisopsis
trong chịu hạn và mặn”.

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Xác định được các gen tiềm năng mã hóa các yếu tố phiên mã đáp ứng

auxin ở đậu tương (GmARF) phục vụ công tác chọn tạo giống cây trồng mới có khả
năng chống chịu điều kiện hạn bằng công nghệ gen.
- Đánh giá vai trò của SL trong sự đáp ứng với điều kiện hạn và mặn ở mức
độ kiểu hình và mức độ phân tử.
3. Nội dung nghiên cứu của đề tài
3.1. Nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin trong điều kiện
hạn ở đậu tương
- Xác định gen, cấu trúc phân bố, đặc điểm cấu trúc protein suy diễn và phân
tích phát sinh chủng loại của các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin ở đậu tương
(GmARF).
- Xác định mức độ biểu hiện của các gen GmARF trong các mô, cơ quan
khác nhau ở điều kiện bình thường và điều kiện hạn sử dụng phương pháp RTqPCR, các dữ liệu microarray và trình tự phiên mã sẵn có.
3.2. Nghiên cứu vai trò của strigolactone trong điều kiện hạn, mặn ở
Arabidopsis
- Xác định vai trò của strigolactone trong việc đáp ứng với điều kiện hạn và
mặn trong cây mô hình Arabidopsis thaliana.
- Phân tích sự biểu hiện của các gene liên quan đến strigolactone trên cây A.
thaliana trong các điều kiện bất lợi.
- Đánh giá sự nhạy cảm với ABA trên cây A. thaliana đột biến sinh tổng hợp
và truyền dẫn tín hiệu strigolactone nhằm xác định mối tương quan giữa ABA và
strigolactone.
2


- Đánh giá quá trình mất nước, số lượng, mật độ cũng như sự hoạt động của
khí khổng ở các cây đột biến sinh tổng hợp và truyền dẫn tín hiệu strigolactone.
- Phân tích microarray để xác định vai trò của strigolactone trong việc chống
chịu với các điều kiện bất lợi phi sinh học.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên, cung cấp các dữ liệu khoa
học về vai trò của các gen mã hóa yếu tố phiên mã đáp ứng auxin ở đậu tương và
strigolactone ở Arabidopsis thalianana trong quá trình đáp ứng lại điều kiện bất lợi,
đặc biệt là tập trung vào điều kiện khô hạn. Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi
tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong vấn đề này. Đồng thời, các kết quả
này cũng cung cấp tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy và nghiên cứu thuộc
lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật và công nghệ sinh học nông nghiệp.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Nghiên cứu này cho phép chúng tôi xác định được một số gen tiềm năng
nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống đậu tương có khả năng chống chịu với
điều kiện bất lợi (hạn, mặn) của môi trường bằng công nghệ gen.
- Kết quả nghiên cứu này cũng mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng của
strigolactone trong việc giảm thiểu những ảnh hưởng tiêu cực của các yếu tố bất lợi
của môi trường đến năng suất cây trồng.
5. Những đóng góp mới của luận án
- Cung cấp có hệ thống về đặc điểm và chức năng của các gen GmARF tham
gia vào sự đáp ứng với điều kiện hạn ở cây đậu tương.
- Xác định được một số gen GmARF đặc hiệu mô, cơ quan có tiềm năng ứng
dụng trong công nghệ gen để chọn tạo các giống đậu tương có khả năng chống chịu
điều kiện hạn.

3


- Chứng minh được vai trò của strigolactone trong quá trình chống chịu hạn
và mặn ở cây mô hình A. thaliana.
- Mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng strigolactone nhằm tăng cường khả
năng chống chịu hạn, mặn của cây trồng trong sản xuất nông nghiệp.

4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Trước áp lực gia tăng của dân số trên thế giới, khí hậu trái đất bị biến đổi dẫn
đến diện tích khô hạn, nhiễm mặn ngày một tăng và nguồn nước ngọt ngày một suy
giảm (, (Nikos and Bruinsma, 2012). Hệ quả là môi trường
sống của tất cả các loài sinh vật đang dần trở nên khắc nghiệt hơn. Những thiệt hại
do điều kiện bất lợi của môi trường gây ra như khô hạn, ngập úng, mặn, phèn,
nóng, lạnh,… được gọi chung là các điều kiện bất lợi phi sinh học (abiotic stress).
Các điều kiện bất lợi phi sinh học này là nguyên nhân chính gây ra những thiệt hại
nhất định cho thực vật nói chung và cây trồng nói riêng. Bên cạnh những thiệt hại
do sâu bệnh gây ra, người ta ước đoán có khoảng 40-70% tiềm năng về năng suất
bị mất đi do điều kiện bất lợi của môi trường, ngay cả đối với những quốc gia có
nền nông nghiệp phát triển. Trong đó, hạn hán đã và đang trở thành một nhân tố
gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới nền sản xuất nông nghiệp của toàn cầu
(). Hạn hán có thể gây ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất
trung bình của cây trồng tới trên 50% (Bray et al., 2000; Boyer, 1982). Ví dụ, ở
cây đậu tương, ảnh hưởng bởi sự thiếu hụt nước gây ra các hệ quả to lớn. Trong
vòng từ năm 2008 đến 2012, lượng mưa của các vùng sản xuất nông nghiệp bị suy
giảm, nhất là vùng châu Mỹ la tinh như Brazil, Argentina, Paraguay, Uruguay.
Đặc biệt là vụ mùa năm 2011 - 2012 (Agrodigital, 2012), sản lượng đậu tương của
Brazil bị mất tới 64% so với dự kiến. Ở Argentina, sự thiếu hụt mưa vào cuối năm
2011 và đầu năm 2012 dẫn đến năng suất trung bình giảm 30%. Tuy năng suất
không giảm 50% như dự kiến của năm 2008-2009, nhưng thiệt hại do hạn hán gây
ra là đặc biệt nghiêm trọng (Agrodigital, 2012).

5

Hình 1.1: Tình hình khan hiếm nước trên thế giới (FAO, 2007)
Sự khan hiếm về nước tưới phục vụ cho nông nghiệp đã được báo động trong
rất nhiều hội nghị khoa học của thế giới. Hiệu ứng nhà kính dẫn tới nhiệt độ của khí
quyển ấm dần lên, băng tan ở hai cực sẽ tạo ra sự ngập mặn ở các vùng đất thấp
(Bains et al., 2000; National Research Council, 2010). Theo cả 3 ước tính giả thuyết
về biến đổi khí hậu toàn cầu, hầu hết các cây trồng chính sẽ bị giảm năng suất (hình
1.2), có thể gây ra mối nguy hại nghiêm trọng đối với tình hình an ninh lương thực
trong thế kỷ này (). Hạn hán và mặn được xem như một
trong những hậu quả nghiêm trọng gây ra bởi sự suy giảm của nguồn nước, là yếu
tố hàng đầu gây suy giảm năng suất cây trồng, ảnh hưởng tới an ninh lương thực
toàn cầu (Bray et al., 2000; Nikos and Bruinsma, 2012). Do đó, việc đầu tư nghiên
cứu đặc tính chống chịu khô hạn và mặn đã được đưa lên thứ tự ưu tiên hàng đầu
trên toàn thế giới, trong lĩnh vực cải tiến giống cây trồng, tiếp sau đó là tính chống
chịu lạnh, ngập úng và các đặc tính chống chịu khác. Tại Trung Quốc, nghiên cứu
tạo các giống lúa có khả năng sử dụng nước hiệu quả và kháng hạn là mục đích
chính của một đề án lớn Green Super Rice Project (Zhang, 2007), nhằm tăng năng
suất của cây lúa trong những điều kiện canh tác bất thuận. Tài nguyên nước phục vụ
cho nông nghiệp là hữu hạn, bên cạnh đó là áp lực của sự gia tăng dân số, đi kèm
với quá trình đô thị hóa dẫn tới nhu cầu sử dụng nước tăng nhanh. Do vậy, sự khan
hiếm nước phục vụ sản xuất nông nghiệp và hệ quả của nó là hạn hán và ngập mặn
6


đang được dự báo rất cấp thiết trên toàn thế giới. Báo cáo của FAO cho thấy, có trên
800 triệu ha đất bị ảnh hưởng bởi muối, chiếm khoảng 6% tổng số đất trên thế giới
( Trong số 230 triệu ha diện tích đất được tưới, có 45 triệu ha
(chiếm 19.5%) bị ảnh hưởng bởi vấn đề xâm nhập mặn theo mức độ khác nhau
( Nhiễm mặn có thể gây ra hậu quả ảnh hưởng trực tiếp đến
năng suất cây trồng, tăng chi phí đầu vào cũng như tăng nhu cầu về nước tưới, thu

hẹp cơ cấu cây trồng, giảm hiệu quả sử dụng nước, thậm chí có thể gây ra hậu quả
là không thể sử dụng cho sản xuất nông nghiệp trên vùng đất nhiễm mặn
( Bên cạnh đó, sự nhiễm mặn còn ảnh hưởng đến sự đa dạng
sinh thái, giảm hiệu quả của chu trình dinh dưỡng, ảnh hưởng sức khỏe con người…

Hình 1.2: Dự báo sản lượng của 11 cây trồng chính (lúa mì, lúa gạo, ngô, kê,
đậu trường, củ cải đường, khoai lang, đậu tương, lạc, hướng dương và cải dầu) từ
2046 đến 2055, so sánh với giai đoạn 1996–2005 (Tính trên giá trị trung bình của 3
giả thuyết của sự biến đổi khí hậu toàn cầu ).(Nguồn: )
Chống chịu hạn là một tính trạng phức tạp và điều kiện hạn thường là sự kết
hợp giữa nóng và các yếu tố bất lợi khác. Thực vật nói chung và cây trồng nói riêng
sử dụng rất nhiều phương thức khác nhau để đáp ứng lại với điều kiện thiếu nước
thông qua các đặc điểm hình thái, sự thay đổi sinh lý và các cơ chế phân tử (Fujita
et al., 2005; Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 2006; Manavalan et al., 2009;
7


Nakashima et al., 2009; Ha et al., 2012; Osakabe et al., 2014b). Thực vật có thể sử
dụng các cơ chế chống chịu điều kiện khô hạn bằng cách thay đổi làm ngắn chu
trình sống thông qua sự ra hoa sớm, làm giảm sự mất nước hoặc làm tăng khả năng
hấp thụ nước thông qua sự phát triển của hệ thống rễ. Các nhà khoa học cũng tập
trung chủ yếu vào hai con đường này để chọn tạo ra các giống cây trồng có khả
năng thích nghi với điều kiện khô hạn. Tuy nhiên, các cơ sở hóa sinh và phân tử của
quá trình tiếp nhận, truyền tin và thích nghi với điều kiện khô hạn hiện nay vẫn còn
nhiều điều chưa được làm sáng tỏ. Trong khi đó, thực vật đáp ứng với mặn thông
qua 2 giai đoạn giai đoạn phản ứng nhanh hay còn gọi là giai đoạn áp suất thẩm
thấu, giai đoạn này gây ra sự ức chế sinh trưởng của lá non; giai đoạn thứ 2 là giai
đoạn phản ứng chậm hay còn gọi là giai đoạn ion, xảy ra sự thay đổi trong quá trình
già hóa tự nhiên của các lá trưởng thành. Thực vật thích nghi với điều kiện mặn bởi
3 nhóm phân biệt: kháng áp suất thẩm thấu, bài xuất (tiết) Na+ hoặc Cl- và sự kháng

của các mô với sự tích lũy của Na+ hoặc Cl-. Trong điều kiện mặn, thực vật bị ức
chế sinh trưởng, đặc biệt là hệ thống lá, giảm khả vận chuyển ion, gây độc tế bào
(đặc biệt là lục lạp) từ đó làm giảm sự quang hợp thực vật, qua đó dẫn tới sự suy
giảm năng suất (Munns and Tester, 2008).
Việc nghiên cứu các đáp ứng của cây lương thực nói chung, trong đó có cây
đậu tương, trồng trong điều kiện môi trường thiếu nước, mặn ngày càng trở nên
quan trọng (Manavalan et al., 2009; Tran and Mochida, 2010; Tran et al., 2010).
Tuy nhiên, tiến độ cải tiến giống cây trồng có khả năng chống chịu tốt hiện gặp trở
ngại do tính trạng năng suất cao và tính trạng chống chịu có khả năng tương hợp rất
thấp. Năng suất cao trong điều kiện bị tác động bởi yếu tố bất lợi cũng không tương
hợp với năng suất cao trong điều kiện bình thường. Điều này cho thấy rằng chúng ta
cần có một chương trình cải tiến giống độc lập nhằm tạo ra những giống có yêu cầu
đặc biệt, đối với từng loại yếu tố bất lợi riêng biệt. Thách thức với các nhà chọn tạo
giống hiện nay đó là tạo ra được các giống cây trồng mới có khả năng thích nghi với
điều kiện bất lợi mà vẫn duy trì được năng suất cao. Do vậy, việc nghiên cứu về gen
cũng như phát triển các giống chống chịu vẫn đang được tập trung nghiên cứu.
8


Việt Nam là nước chịu sự tác động lớn bởi sự biến đổi khí hậu trái đất. Tình
trạng khô hạn, ngập mặn đã và đang trở thành thách thức cho nền sản xuất nông
nghiệp. Vấn đề cải tiến giống cây trồng có khả năng sử dụng hợp lý nguồn nước
đang là vấn đề cấp thiết. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn,
tính đến cuối tháng 3/2014, diện tích cây trồng vụ Đông Xuân 2013-2014 bị thiếu
nước và hạn hán hơn 26 nghìn ha, tập trung chủ yếu ở các tỉnh Bình Phước (14000
ha), Ninh Thuận (5481 ha), Đắk Lắk (5450 ha) (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn, 2014). Theo Nguyễn Lập Dân (2010), các vùng sản xuất nông nghiệp chính
của Việt Nam hàng năm đều từng trải qua nhiều đợt hạn lớn. Mặc dù diện tích mất
trắng trung bình không cao nhờ khả năng tưới tiêu, nhưng có thời điểm hạn hán đã
ảnh hưởng tới 60% diện tích canh tác của một số vùng sản xuất (Nguyễn Lập Dân,

2010). Sự xâm nhiễm mặn của các vùng đất thấp như khu vực đồng bằng Sông Cửu
Long cũng là vấn đề cấp thiết cần giải quyết đối với nền sản xuất nông nghiệp nước
ta. Nhà nước cũng đã giao cho các cơ sở nghiên cứu các đề tài về phát triển các loại
giống cây trồng chủ lực chịu hạn như lúa, ngô, đậu tương. Bên cạnh các chương
trình phát triển các giống mới theo các phương pháp truyền thống, chương trình
phát triển giống cây trồng chống chịu điều kiện bất lợi bằng công nghệ gen cũng
đang được phát triển mạnh mẽ và triển khai với các đề tài cấp bộ, cấp nhà nước.
Các đề tài đã và đang triển khai có thể có tiềm năng để hình thành các giống chống
chịu mới. Nhóm nghiên cứu của TS. Phạm Xuân Hội đã ứng dụng gen yếu tố phiên
mã DREB1A và DREB2A (Nguyễn Hoàng Quang và Phạm Xuân Hội, 2011; Cao Lệ
Quyên et al., 2012) trong chọn tạo giống lúa có khả năng chống chịu với điều kiện
bất lợi. Nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập gen và thiết kế vector
chuyển gen để ứng dụng trong các nghiên cứu tiếp sau. Tương tự như vậy, nhóm
nghiên cứu của TS. Nguyễn Văn Đồng cũng áp dụng thành công các gen yếu tố
phiên mã NF-YB2, MYB trong việc chọn tạo giống ngô và đậu tương có khả năng
chống chịu với điều kiện khô hạn (Nguyễn Văn Đồng và Nguyễn Hữu Kiên, 2013;
Nguyễn Văn Đồng et al., 2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2015). Các dòng đậu
tương đồng hợp tử mang gen GmMYB thể hiện khả năng kháng hạn tốt hơn so với
9


đối chứng (Dữ liệu chưa được công bố). Gen DREB1A cũng được áp dụng ở đậu
tương (Trần Thị Cúc Hòa, 2009; Trần Thị Cúc Hòa et al., 2015) để chọn tạo giống
đậu tương có khả năng chống chịu hạn. Như vậy, tiềm năng ứng dụng các yếu tố
phiên mã trong sự phát triển giống cây trồng có khả năng chống chịu với điều kiện
bất lợi là rất lớn. Tuy nhiên, mới chỉ có một phần nhỏ các gen yếu tố phiên mã được
phát hiện và nghiên cứu vai trò trong sự đáp ứng với các điều kiện bất lợi phi sinh
học (Hu et al., 2006; Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 2006; Tran et al., 2010;
Puranik et al., 2012; Luo et al., 2013; Ni et al., 2013). Do vậy, việc mở rộng nghiên
cứu về nguồn gen, cũng như các cơ chế điều hòa quá trình chống chịu của thực vật

đối với môi trường vẫn cần phải tập trung nghiên cứu sâu rộng hơn.
1.2. Cơ chế đáp ứng của thực vật với các điều kiện bất lợi của môi trường
Khi gặp điều kiện môi trường bất lợi như khô hạn, mặn và lạnh, thực vật
thường có những phản ứng sinh lý đa dạng, phức tạp để thích nghi và tồn tại
(Manavalan et al., 2009). Về cơ chế sinh lý, để thích nghi với điều kiện khô hạn,
mặn và lạnh, thực vật sẽ đóng các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể
tích nước trong các mô thực vật, quá trình sinh trưởng chậm lại, hệ rễ phát triển
xuyên sâu và lan rộng để hút nước (Tran and Mochida, 2010). Về cơ chế phân tử,
khả năng chống chịu của thực vật với các điều kiện bất lợi của môi trường, trong đó
có tính trạng chịu hạn, thường là các tính trạng được kiểm soát bởi nhiều gen
(Dorothea and Ramanjulu, 2005). Những nghiên cứu liên quan đến khả năng chống
chịu điều kiện bất lợi phi sinh học ở thực vật trong các năm gần đây đã cho thấy, có
hàng trăm gen tham gia vào quá trình này và được chia thành hai nhóm gen chính là
nhóm gen điều khiển (gen tổng hợp protein điều khiển quá trình phiên mã transcription factor, kinase...) và nhóm gen chức năng (gen tham gia vào quá trình
tổng hợp photphatase, protease, late embryogenesis abundant (LEA) protein, các
protein sinh tổng hợp amino acid, đường,…) (Hadiarto and Tran, 2011; Osakabe et
al., 2013; Osakabe et al., 2014b). Trong điều kiện bất lợi, khi một gen điều khiển
hoạt động sẽ kích hoạt hàng loạt các gen chức năng hoạt động để bảo vệ thực vật.

10


Đây chính là hướng tiếp cận mới của các nhà khoa học trên thế giới trong việc cải
tạo cây trồng chống chịu với các điều kiện bất lợi phi sinh học. Dưới tác động của
các yếu tố bất lợi của môi trường, thực vật kích hoạt một số cơ chế chống chịu và
bảo vệ, trong đó bao gồm có sự tiếp nhận các tín hiệu gây ra bởi yếu tố bất lợi và
chuyển hóa truyền tin các tín hiệu này, dẫn tới sự hoạt hóa một số phản ứng sinh lý
và trao đổi chất (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 2006; Tran et al., 2007a;
Hadiarto and Tran, 2011). Trong quá trình đáp ứng với các điều kiện bất lợi, có sự
tham gia của rất nhiều các yếu tố phiên mã và các nhân tố cis-acting của các

promoter thuộc hệ thống điều hòa biểu hiện gen đóng vai trò như các phân tử khởi
động biểu hiện gen cũng như các tín hiệu dẫn truyền kết thúc của các quá trình điều
hòa.
Bên cạnh đó, phytohormone cũng có vai trò vô cùng quan trọng trong sự
chống chịu và hình thành các cơ chế thích nghi. Trong quá trình đáp ứng với sự thay
đổi của môi trường, các con đường của hormone thực vật có thể tăng hoặc giảm
khác nhau, trong đó vai trò của nhóm hormone ABA là quan trọng nhất
(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 2006; Nakashima et al., 2009; Fujita et al.,
2011; Osakabe et al., 2014a). Sự thay đổi trong cân bằng hormone nội môi cũng
như các tín hiệu nội bào sẽ dẫn đến mức độ kháng hoặc thích nghi khác nhau với
các yếu tố bất lợi. Sự thay đổi cân bằng hormone này cũng ảnh hưởng đến sự phát
triển của thực vật, với một tác động trực tiếp trong sự phát triển của hạt, nảy mầm,
chế độ ngủ cũng như toàn bộ sự sinh trưởng của thực vật (Ha et al., 2012).

11


Hình 1.3: Sự truyền dẫn tín hiệu của quá trình mất nước ở thực vật
ABA là loại phytohormone đã được nghiên cứu nhiều nhất bởi nó đóng vai trò
đặc biệt quan trọng trong sự thích nghi của thực vật đối với các yếu tố bất lợi phi
sinh học (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 2006; Nakashima et al., 2009;
Fujita et al., 2011). Trong quá trình đáp ứng với các yếu tố bất lợi phi sinh học như
hạn và mặn, nồng độ ABA nội sinh tăng lên rất nhanh, hoạt hóa các con đường tín
hiệu đặc hiệu cũng như thay đổi mức độ biểu hiện của các gen liên quan (Hình 1.3
và Hình 1.4) (Seki et al., 2002; Osakabe et al., 2014a). Thực tế, trên 10% protein
mã hóa bởi các gen liên quan đến quá trình phiên mã được điều khiển bởi ABA
(Fujita et al., 2011). Các thành phần chủ chốt của con đường tín hiệu ABA đã được
xác định (Cutler et al., 2010; Fujita et al., 2011). Ở cây mô hình Arabidopsis, các
protein

PYR1/PYL/RCAR

(pyrabactin

resistance

1/PYR1-LIKE/regulatory

components of ABA receptor) được đề xuất như là các thụ thể ABA nội bào chính
(Ma et al., 2009; Park et al., 2009; Santiago et al., 2009; Nishimura et al., 2010).
Các đột biến làm mất chức năng của nhiều thụ thể ABA như pyr1/pyl1/pyl4,
pyr1/pyl2/pyl4 và pyr1/pyl1/pyl2/pyl4/pyl5/pyl8 đều ít nhạy cảm với ABA, thậm chí

12