ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA BA PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO ỐI VÀ QUY CÁCH SỬ DỤNG DEMECOLCINE KHI TẠO TIÊU BẢN NHIỄM SẮC THỂ THAI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÂM THỤY ANH THƯ

ĐỀ TÀI

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA BA PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ
BÀO ỐI VÀ QUY CÁCH SỬ DỤNG DEMECOLCINE KHI TẠO
TIÊU BẢN NHIỄM SẮC THỂ THAI
Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM - hướng Sinh lý động vật
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS TRẦN THỊ DÂN

Thành phố Hồ Chí Minh – Tháng 6/2011


Lời cảm ơn

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã tận
tình dạy dỗ chúng em trong thời gian vừa qua. Xin cám ơn Ban
giám hiệu trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM và ban
lãnh đạo bệnh viện Từ Dũ Tp HCM đã hỗ trợ và giúp đỡ em
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin gởi những lời tri ân sâu sắc nhất đến cô Trần Thị Dân và
thầy Phùng Như Toàn, là người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo
mọi điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Và cho tôi
gởi những lời cám ơn chân thành đến anh Hoan, các bạn

Quyên, Phú, Ngân, chị Liên, chị Oanh, chị Trang, bạn Hoàng,
Trâm, anh Cường và các anh chị ở Khoa Di Truyền bệnh viện
Từ Dũ, những người đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực
hiện đề tài.
Cám ơn các thầy cô đã dành thời gian quý báu của mình để
đọc và đóng góp ý kiến giúp cho luận văn này hoàn thiện hơn.
Lâm thụy Anh Thư


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾTi TẮT
AF (amniotic fluid specific): đặc trưng của dịch ối
AFP: alpha-fetoprotein
bFGF(basic fibroblast growth factor): nhân tố cơ bản phát triển nguyên bào sợi
DMSO: dimethyl sulphoxide
DVME medium: môi trường Dulbecco-Vogt modified Eagle's
E (epithelioid): dạng biểu mô
F (fibroblastic): dạng nguyên bào sợi
F12: môi trường Ham's F12
FBS (Fetal bovine serum): huyết thanh phôi bò
FISH (Flourescence in situ hybridization): kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang
FSH (human follicle-stimulating hormone ): hóc-môn kích thích nang trứng
GH (growth hormon): hóc-môn sinh trưởng
hCG (human chorionic gonadotropin): kích dục tố màng đệm người
LH (human luteinizing hormone): hóc-môn hoàng thể hoá
mFISH (multi-color flourescence in situ hybridization): kỹ thuật lai tại chỗ phát
huỳnh quang nhiều màu
NST: nhiễm sắc thể
PBS: phosphate buffered saline solution
SD (Standard Deviation): độ lệch chuẩn
SF medium (serum-free medium): môi trường không huyết

thanh α MEM: α -modified minimum essential medium


DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VÀi BIỂU ĐỒ
1. Các bảng

Bảng 3.1: Phân bố theo tình trạng lẫn máu mẹ của các mẫu ối
Bảng 3.2: Tuổi thai của các mẫu vào thời điểm chọc ối
Bảng 4.1: Tỷ lệ thành công của 3 phương pháp nuôi cấy tế bào ối
Bảng 4.2: Số lượng các mẫu nuôi cấy đạt được các mức phát triển
Bảng 4.3: Phân bố (%) mẫu theo thời gian xuất hiện tế bào bám và tạo
cụm ở các phương pháp

Trang
23
23
33
38

41

Bảng 4.4: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (+) ở các
phương pháp
Bảng 4.5: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (++) của

42
44

các mẫu ối ở các phương pháp
Bảng 4.6: Thời gian nuôi cấy tế bào ối ở 3 phương pháp

Bảng 4.7: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức (+) của các mẫu ối có

46
51

tuổi thai khác nhau
Bảng 4.8: Phân bố (%) số mẫu theo thời gian bám và tạo cụm của các

56

mẫu ối ở các nhóm có tình trạng lẫn máu mẹ khác nhau
Bảng 4.9: Số cụm NST trung bình trong một quang trường của các lô thí
nghiệm
Bảng 4.10: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung ở các lô thí nghiệm
Bảng 4.11: Trung bình số cụm NST trong một quang trường theo liều

59
64


lượng demecolcine xử lý mẫu trong 60 phút

5

68

Bảng 4.12: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung ở các liều lượng
demecolcine khác nhau xử lý mẫu trong 60 phút
Bảng 4.13: Trung bình số cụm NST trong một quang trường ở các lô

68
69

theo thời gian xử lý với liều demecolcine 0,25 µg/ml

Bảng 4.14: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung của các lô thí nghiệm ở

70

các mức thời gian xử lý với liều demecolcine 0,25 µg/ml

2. Hình
Hình 2.1: Hình minh họa thủ thuật chọc ối dưới sự hỗ trợ của siêu âm
Hình 2.2: Hình minh họa việc nuôi cấy tế bào thu nhận từ dịch ối
Hình 2.3: NST hiện băng tạo bởi các kỹ thuật nhuộm khác nhau

3
5
13

Hình 4.1: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có nhiều tế bào
đang phân chia (100x)

39

Hình 4.2: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ dày mức độ
trung bình (100x)

39

Hình 4.3: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ che phủ
mức độ dày (100x)

40

Hình 4.4 (a), (b): Các cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ
che phủ mức độ rất dày (100x)
Hình 4.5: Một số mẫu thu hoạch của phương pháp 2 và phương pháp 3

40
48

Hình 4.6: Các tế bào ở giai đoạn khác nhau trong quá trình phân bào
(200x)
Hình 4.7: Các tế bào có bộ NST ở trạng thái khác nhau (200x)

62
63

Hình 4.8: Bộ NST vẫn còn tế bào chất tạo lớp mờ bao bọc bộ NST và độ
bung mức + (200x)
Hình 4.9: Hai cụm NST có độ bung mức ++ và +++ (200x)

65
66


Hình 4.10: Bộ NST có độ bung mức +++ (A) và NST đồ6tương ứng (B)
(200x)

66

3. Biểu đồ

Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ thành công – thất bại ở 3 phương pháp
Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ mẫu nuôi cấy đạt được các mức phát triển

35
36

Biểu đồ 4.3: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (++) ở các
phương pháp
Biểu đồ 4.4: Thời gian nuôi cấy ở 3 phương pháp
Biểu đồ 4.5: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức (+) ở 2 nhóm tuổi thai

45
47
53

Biểu đồ 4.6: Phân bố (%) mẫu theo thời gian bám và tạo cụm ở các nhóm
có tình trạng lẫn máu mẹ khác nhau

57

Biểu đồ 4.7: Số cụm NST trung bình của các lô theo liều lượng
demecolcine và thời gian xử lý với chất này

60

Biểu đồ 4.8: Số cụm NST trung bình ở các lô theo theo thời gian xử lý với

liều demecolcine 0,25µg/ml

70


MỤC LỤC
Trang
Phụ lục bìa
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng, hình và biểu đồ

i
ii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu

1
2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.

Tế bào ối người

2.2.

Nuôi cấy tế bào

2.3.

Nuôi cấy tế bào ối người

2.4.

Các kỹ thuật kiểm tra số lượng và cấu trúc NST

2.5.

Demecolcine

2.6.

Một số các nghiên cứu về nuôi cấy tế bào ối người trên thế giới và
ở Việt Nam

CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3
7
9

11
14

16


3.1.

Đối tượng nghiên cứu và địa điểm thực hiện

3.2.

Nội dung nghiên cứu

3.3.

Thiết bị và hóa chất

3.4.

Phương pháp nghiên cứu

3.5. Phương pháp toán học sử dụng trong nghiên cứu

20
20

21
22

31

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.

Xác định phương pháp nuôi cấy hiệu quả

4.2.

Bước đầu xác dịnh liều lượng demecolcine và thời gian ủ với chất
này khi tạo tiêu bản NST thai

32

58

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1.

Kết luận

5.2.

Đề nghị

Công trình của tác giả đã công bố

Tài liệu tham khảo
Phụ lục

72
73

74
75


9

CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh lý nhiễm sắc thể (NST) là một trong những nguyên nhân gây dị tật bẩm
sinh cho thai nhi. Những dị tật nặng sẽ gây sẩy thai, thai lưu hoặc trẻ sẽ chết sau
sinh. Ví dụ như các dạng đột biến thể tam nhiễm liên quan 52% với các trường hợp
sẩy thai, trong đó hội chứng Tơcnơ (Turner) (45,XO) liên quan 18% trường hợp
sẩy thai, chiếm tỷ lệ cao nhất; tiếp đến là tam nhiễm cặp NST số 16 liên quan 16,4%
trường hợp, các đột biến dạng chuyển đoạn không tương hỗ liên quan 3%... [49].
Những dị tật nhẹ như chậm phát triển trí tuệ hay vô sinh không đe dọa tính mạng
của thai nhi, nhưng thường không điều trị được, chúng tồn tại suốt cuộc đời của trẻ.
Do đó tạo ra gánh nặng cho xã hội cũng như những rối loạn về tâm sinh lý khi trẻ
trưởng thành. Vì vậy cần hạn chế việc sinh ra những trẻ dị tật do bệnh lý NST ngay
từ trước khi sinh và đó là vai trò quan trọng của chẩn đoán tiền sản.
Một trong những phương pháp chẩn đoán tiền sản khá phổ biến hiện nay là phân
tích NST. Phân tích NST cùng với khám, siêu âm theo dõi, làm các xét nghiệm cần
thiết đã giúp xác định được đến 99,3% trong tổng số ca dị tật được phát hiện (số
liệu tại bệnh viện Từ Dũ từ tháng 6/2000 đến tháng 6/2001). Đối với các trường hợp
nghi ngờ thai nhi mang các bất thường về cấu trúc hoặc số lượng NST, việc phân
tích NST có thể được thực hiện qua chọc rút nước ối (chọc ối) sau đó nuôi cấy tế
bào nước ối thai nhi, hoặc nuôi cấy tế bào lympho của máu đứa trẻ, sau đó dùng kỹ

thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (kỹ thuật FISH) hay nhuộm (nhuộm thường quy
hoặc nhuộm băng) khảo sát NST đồ. Đây là các xét nghiệm có ích lợi rất lớn, không
những giúp chẩn đoán mà còn có thể giúp bác sĩ điều trị dự đoán khả năng bất
thường đó xuất hiện lại ở những đứa con sau [2].


Xét nghiệm bằng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang cho kết quả nhanh hơn,
chỉ mất khoảng 5 ngày – 1 tuần, tuy nhiên xét nghiệm này rất đắt tiền và chỉ khảo
sát được bất thường về số luợng của cặp NST số 13, 18, 21 và cặp NST giới tính.
Khuynh hướng xét nghiệm sàng lọc trước sinh hiện nay ở nước ta đang nghiêng về
kỹ thuật nhuộm băng khảo sát NST đồ. Kỹ thuật này cho phép khảo sát cả đột biến
số lượng và cấu trúc bộ NST của thai nhi với chi phí rẻ hơn khoảng 10-20%. Tuy
nhiên, nhược điểm của kỹ thuật này là mất thời gian khá lâu để có được kết quả,
khoảng 2 – 2,5 tuần. Bên cạnh đó việc tiến hành kỹ thuật này đến nay vẫn chưa cho
kết quả ổn định, tỷ lệ nuôi cấy thành công và thời gian nuôi cấy tế bào chịu ảnh
hưởng bởi nhiều yếu tố như tuổi thai, tình trạng lẫn máu mẹ, phương pháp nuôi cấy
tế bào ối…Phương pháp nuôi cấy tế bào ối bằng bình cấy flask được dùng phổ biến
hiện nay có thời gian nuôi cấy dài và tiêu hao hóa chất hơn và khi tạo tiêu bản NST
chưa cho nhiều cụm NST so với các phương pháp nuôi cấy in situ.
Nhằm chọn ra phương pháp nuôi cấy tế bào ối vừa hiệu quả vừa tiết kiệm, đồng
thời xem xét kỹ thuật tối ưu thu hoạch tiêu bản NST chất lượng tốt khi dùng
demecolcine xử lý mẫu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá hiệu quả của ba
phương pháp nuôi cấy tế bào ối và quy cách sử dụng demecolcine khi tạo tiêu
bản NST thai”.
1.2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
(1) Lựa chọn phương pháp nuôi cấy tế bào ối hiệu quả
(2) Xác định liều lượng demecolcine và thời gian xử lý mẫu với chất này để
tạo tiêu bản NST tốt.

CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

TẾ BÀO ỐI NGƯỜI

2.1.1

Đặc điểm dịch ối

Dịch ối được chứa trong màng ối bao bọc thai, bảo vệ thai khỏi các tổn thương
bên ngoài do cử động và tác động như phương tiện vận chuyển các chất trao đổi với
cơ thể mẹ [10].

Bộ chuyển đổi siêu âm
Kim

Tử cung

Dịch ối
Túi ối
Thai
Hình cắt ngang
vùng bụng
Hình 2.1: Hình minh họa thủ thuật chọc ối dưới sự hỗ trợ của siêu âm (nguồn
/>Trung bình lượng dịch ối đo được tương đối cố định khoảng 207 ± 92 ml ở thai
16 tuần, 258 ± 97 ml ở thai 18 tuần, và 365 ± 88 ml ở thai 20 tuần. Trong dịch ối
người phát hiện được lượng lớn hóc-môn, bao gồm hóc-môn sinh trưởng GH, hócmôn kích thích nang trứng FSH, hóc-môn hoàng thể hoá LH, kích dục tố màng đệm

người hCG, hóc-môn tuyến giáp, insulin, glucagons, testosterone, progesterone,
estradiol, và cortisone [13]. Lượng dịch ối hiện diện đủ để tiến hành chọc ối bắt
đầu vào tuần 14 của thai kỳ, hầu hết việc chọc ối được thực hiện giữa tuần 14 – 20
của thai kỳ. Lơ lửng trong dịch ối là các tế bào của thai, chúng có thể phát triển
trong nuôi cấy để phân tích NST, phân tích sinh hóa và sinh học phân tử [7].
2.1.2

Tế bào ối người

Năm 1966, Steele và Breg chứng minh được trong dịch ối người có chứa các tế
bào sống, có khả năng sinh sản phát triển khi nuôi cấy đủ để làm tiêu bản NST [42]
mặc dù các tế bào ối đã được đề nghị dùng để chẩn đoán phái tính và ngăn ngừa các
bệnh lý di truyền liên kết với giới tính từ 1960. Trong các năm sau đó, tế bào ối
được nuôi cấy để khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể thai nhi cũng như chẩn
đoán một số các bệnh biến dưỡng di truyền ở thai nhi [21], [29], [31], [44], [48].
Dịch ối người chứa lượng tế bào thay đổi tùy theo thai kỳ, trung bình chỉ 20% tế
bào tồn tại trong dịch ối ở thai 14-18 tuần [37]. Tổng số lượng và tỷ lệ các tế bào
quan sát được cũng khác nhau giữa các thai phụ khác nhau có cùng thời gian thai
kỳ. Số tế bào ở dịch ối ở 3 tháng giữa thai kỳ khoảng 10 – 1000 tế bào/µl. Mức dao
động còn lớn hơn khi xét các thai có các biểu hiện bệnh lý [23]. Mặt khác, số lượng
tế bào của thai hiện diện trong dịch ối tăng theo tuổi thai, nhưng thai kỳ tăng cũng
làm tăng lượng tế bào không có khả năng phát triển. Những mẫu lấy ở thai 12 tuần
có thể có ít tế bào nhận được sau khi ly tâm, nhưng lượng lớn trong số chúng có khả
năng phát triển. Dù những mẫu dịch ối 20 tuần sau ly tâm có thể cho nhiều cặn tế
bào, nhưng đa số chúng là tế bào chết [39]. Các tế bào ối người khác nhau về nguồn
gốc, hình dạng, kích thước, tỷ lệ nhân/tế bào chất, đặc điểm tế bào chất, thuộc tính
bề mặt tế bào và đặc điểm sinh hoá [15]. Một loạt các nghiên cứu được thực hiện từ
những năm 1980 phát hiện trong dịch ối người có các tế bào của cả 3 lớp mầm ngoại bì, trung bì và nội bì - tùy theo tuổi thai và tình trạng bệnh lý của thai. Tuy

nhiên nguồn gốc phôi thai của từng loại tế bào trong dịch ối vẫn chưa được biết rõ
[10].

Rút dịch ối (1)
Ly tâm (2)

Thành phần dịch

Nhau thai
Khoang ối

Tế bào

Vách tử cung
Nuôi cấy tế bào (3)

Nghiên cứu
sinh hóa và
NST (4)

Hình 2.2: Hình minh họa việc nuôi cấy tế bào thu nhận từ dịch ối (nguồn
/>Năm 1980, khi thực hiện các nghiên cứu nuôi cấy tế bào ối, người ta dựa vào
hình thái chia các tế bào nuôi cấy từ dịch ối làm 2 loại, tế bào dạng biểu mô và tế
bào dạng sợi. Nhóm nghiên cứu của Namba và Hyodo (1980) tiến hành nuôi cấy dài
ngày (nuôi cấy 7 tháng) cho thấy tế bào sợi dễ dàng cấy chuyền, và tối đa được
khoảng 30 lần (nuôi cấy 150 ngày), trong khi tế bào biểu mô khó cấy chuyền và tối
đa chỉ 2 đến 5 lần. Sau 6 tháng nuôi cấy, hầu hết tế bào phát triển trong nuôi cấy là
tế bào biểu mô. Về hình thái, quan sát được 2 loại tế bào, loại Golgi và loại hình
sợi. Các tế bào loại Golgi có nhiều vi nhung mao, nhiều túi không bào trong bào
chất và một phức hợp Golgi phát triển tốt biểu lộ chức năng tiết [30]. Bổ sung cho

quan sát của nhóm tác giả Namba, tác giả Bossolasco và cộng sự (2006) đã mô tả 3
dạng tế bào: tế bào giống biểu mô kích thước nhỏ, dạng tế bào lớn có bờ và phồng


không đều, thỉnh thoảng có 2 nhân hay có tỷ lệ nhân/tế bào chất cao, và dạng
nguyên bào sợi [10].
Chỉ lượng nhỏ tế bào trong dịch ối có khả năng phát triển và sinh sản trong điều
kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm cho mục đích chẩn đoán, mặt khác có thể
nhiều tế bào ối đặc biệt vẫn sống nhưng không sinh sản hay hình thành cụm do chu
kỳ tế bào đã ngừng, hoặc ở trạng thái biệt hóa hay do tế bào quá già. Vì lý do đó,
thời gian sau này, Kaviani và đồng sự (2001) khi phân loại các tế bào nuôi cấy từ
dịch ối đã xét đến các khía cạnh bao gồm kiểu hình, tiêu chuẩn sinh hóa và đặc
điểm phát triển, họ đã phân loại các tế bào ối phát triển được và hình thành cụm
trong điều kiện nuôi cấy thông thường thành 3 nhóm chính [23]: tế bào dạng biểu
mô (epitheloid - loại E), tế bào đặc trưng của dịch ối (amniotic fluid specific - loại
AF) và tế bào dạng nguyên bào sợi (fibroblastic - loại F). Tế bào loại AF và E xuất
hiện ngay từ khi bắt đầu nuôi cấy. Tế bào loại AF vẫn tiếp tục tồn tại trong suốt quá
trình nuôi trong khi loại E giảm đáng kể. Tế bào loại F không hình thành cụm trong
mỗi mẫu ối, chúng thường xuất hiện trễ hơn trong quá trình nuôi cấy. Mặc dù người
ta tin rằng vẫn còn nhiều điều chưa biết về nguồn gốc của 3 loại tế bào, tế bào loại E
được cho rằng có nguồn gốc từ da và nước tiểu của thai, tế bào AF từ màng thai và
lá nuôi phôi, còn tế bào loại F từ mô sợi liên kết và nguyên bào sợi của da. Tế bào
AF sản xuất estrogen, hCG và progesterone. Điều này gợi ra giả thiết là các tế bào
này có nguồn gốc từ mô lá nuôi phôi. Dựa vào việc không sản xuất hóc-môn, các tế
bào F được coi là có nguồn gốc từ trung mô [47]. Tế bào biểu mô ối cấu thành lớp
trong của màng ối, và được hình thành từ nguyên bào ối vào ngày thứ 8 sau thụ
tinh, chúng từ lâu được cho rằng không để lộ rõ tiềm năng biệt hóa thành các loại cơ
quan khác nhau, bao gồm tim, gan và não. Đáng chú ý, tế bào biểu mô ối được
chứng minh biểu hiện chỉ thị của tế bào nguồn gốc thần kinh và tế bào thần kinh
đệm [35].

Tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ dịch ối đã được phân lập từ dịch ối thu
vào 3 tháng giữa thai kỳ nhờ quy trình nuôi cấy 2 giai đoạn do nhóm tác giả Tsai


(Đài Loan) phát triển vào năm 2004 - 2005 [46], [47]. Bên cạnh đó, dịch ối còn
chứa các tế bào gốc biểu hiện tiềm năng nhiều dòng, khi nuôi cấy trong môi trường
thích hợp chúng có thể cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ, tạo xương, tạo máu,
biểu hiện kiểu hình của tế bào nguồn gốc thần kinh và có khả năng tạo van tim [10],
[40], [46].
2.2 . NUÔI CẤY TẾ BÀO
Trong phòng thí nghiệm, có 3 cấp độ nuôi cấy mô và tế bào động vật, đó là nuôi
cấy cơ quan, nuôi cấy mô phát triển sơ cấp và nuôi cấy tế bào. Nuôi cấy tế bào được
chia thành nuôi cấy in vitro (trong phòng thí nghiệm) và nuôi cấy in vivo (trong cơ
thể sống). Một số khác biệt của tế bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro so với in
vivo:
-

Tập tính tế bào: tế bào nuôi cấy in vitro chuyển từ sự kết hợp theo dạng

không gian ba chiều sang mặt phẳng hai chiều, không còn đặc tính tương tác tế bào
chuyên biệt của mô. Vì khi dòng tế bào hình thành nó chỉ thể hiện một hay hai dạng
tế bào, nên nhiều tương tác đa chiều bị mất đi.
-

Tính ổn định và được kiểm soát của quá trình chuyển hóa: trong tế bào nuôi

cấy in vitro, chuyển hóa của tế bào ổn định hơn do thiếu sự kiểm soát của sự điều
hòa in vivo của các chất dẫn truyền thần kinh và hệ nội tiết [7].
Khoảng 50 năm sau khi thuyết Tế bào ra đời, các kỹ thuật nuôi cấy tế bào bắt
đầu phát triển. Một số sự kiện đáng chú ý trong lịch sử phát triển nuôi cấy tế bào

[6]:
- Năm 1907, Harrison sử dụng kỹ thuật “giọt treo” (hanging drop) nuôi 1 mẫu
phôi ếch trong 1 giọt dịch bạch huyết, quan sát sự phát triển các tế bào thần kinh.
- Năm 1912, bác sĩ Carrel đưa các kỹ thuật vô trùng vào nuôi cấy tế bào và sáng
chế ra bình Carrel, tiền thân các bình nuôi cấy ngày nay.


- Năm 1902, lần đầu tiên việc nuôi cấy tế bào thực vật được thực hiện do nhà thực
vật học Harberlandt tiến hành.
- Đặc biệt, vào năm 1948, Sanford và cộng sự cho rằng các tế bào đơn có thể phát
triển trong môi trường dịch nuôi; và Eagle (1955) khẳng định hỗn hợp các axit
amin, vitamin, các co-factor, carbonhydrat, muối và bổ sung thêm huyết thanh có
thể dùng nuôi cấy tế bào, thay thế các dịch chiết mô phức tạp, điều này đã mở ra
thời kỳ mới trong nuôi cấy tế bào in vitro [7].
Các điều kiện khi nuôi cấy tế bào in vitro:
- Môi trường nuôi với các thành phần hóa học xác định: nhiều công thức môi
trường nuôi khác nhau được phát triển cho phù hợp với nhu cầu các loại tế bào khác
nhau. Các môi trường nuôi thường bao gồm các chất như carbohydrat, axit amin,
vitamin, hóc-môn, các nhân tố tăng trưởng, các nguyên tố vi lượng, muối với nồng
độ đẳng trương và hệ đệm để ổn định pH. Đa số môi trường nuôi cấy tế bào động
vật đều cần bổ sung huyết thanh. Huyết thanh cũng chứa các nhân tố bám dính ở
dạng hòa tan như fibronectin, vì thế ngoài tác dụng bổ sung thêm chất dinh dưỡng,
cung cấp các nguyên tố vi lượng, cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng,
huyết thanh còn có tác dụng giúp các tế bào nhanh chóng bám vào bề mặt nuôi.
- Điều kiện nuôi cấy: thông thường các tế bào động vật phát triển tốt nhất ở
nhiệt độ ấm (36-390C). Mặt khác, môi trường cần được thông khí liên tục đủ đáp
ứng nhu cầu chuyển hóa thông thường của tế bào hiếu khí, đặc biệt là tỷ lệ của O2,
CO2, N2 cần được phối trộn để tạo ra các phân áp khí thích hợp cho từng loại tế bào.
Nồng độ CO2 trong tủ cấy thường là 5%.
- Sự vô trùng: tế bào động vật có tốc độ phân chia chậm nên chúng dễ dàng bị

lấn áp bởi các sinh vật ngoại nhiễm, do đó sự vô trùng là yếu tố cực kỳ quan trọng
trong nuôi cấy tế bào động vật. Khi pha môi trường, tùy tính chất hóa học các thành
phần của môi trường để chọn cách khử trùng thích hợp. Bên cạnh đó, môi trường
cần được bảo vệ chống lại các tạp nhiễm không mong muốn bằng việc sử dụng các
kháng sinh [7].


2.3.

NUÔI CẤY TẾ BÀO ỐI NGƯỜI

2.3.1. Đặc điểm
Việc nghiên cứu nuôi cấy tế bào ối cho chẩn đoán trước sinh phát triển mạnh
đến cuối thế kỷ XX. Đến đầu thế kỷ XXI, với việc phát hiện nguồn tế bào gốc trong
dịch ối, các nghiên cứu về nuôi cấy tế bào ối thời gian gần đây chủ yếu theo hướng
khảo sát xác định thành phần và phân lập các loại tế bào gốc nhiều tiềm năng trong
dịch ối, phục vụ cho y sinh học. Chiều hướng này đặc biệt phát triển kể từ khi xuất
hiện quy trình nuôi cấy 2 giai đoạn (Tsai, 2005) [46], [47]. Các yếu tố có thể tác
động tới việc nuôi cấy tế bào ối [13], [53], [55] bao gồm:
- Tình trạng dịch ối: tế bào ối có thể được lưu trữ khi cần ít nhất 2 ngày ở nhiệt
độ phòng hay tủ lạnh mà không gây giảm khả năng phát triển.
-

Tình trạng lẫn máu mẹ: tác động của dịch ối nhiễm máu ảnh hưởng đến thời

gian cấy nhiều hơn so với tỷ lệ thành công/thất bại khi nuôi cấy.
- Lượng dịch ối ít nhất cần cho nuôi cấy: để nhận được kết quả đáng tin thì
lượng dịch ối tối thiểu cần là 3,2ml.
-

Áp lực oxy trong suốt quá trình nuôi cấy: giảm áp lực oxy trong suốt quá

trình nuôi cấy làm tăng 2,5 lần số tế bào trong 1 cụm nhưng chỉ làm tăng nhẹ số
cụm.
-

Nồng độ FBS: 20% là nồng độ FBS tốt nhất cho sự phát triển của tế bào nuôi

cấy. Nồng độ cao của FBS có thể gia tăng khả năng bị nhiễm, từ đó tăng nguy cơ
xuất hiện bất thường NST cho tế bào ối nuôi cấy.
- Đặc điểm môi trường nuôi cấy: mỗi loại môi trường có hàm lượng các chất
dinh dưỡng khác nhau do đó làm ảnh hưởng đến thời gian và hiệu quả nuôi cấy.
-

Sự có mặt các nhân tố sinh trưởng, ví dụ như transferrin, selenium, insulin,

triiodothyronine, glucagon, nhân tố phát triển nguyên bào sợi, hydrocortisone,
testosterone, estradiol, progesterone. Mỗi nhân tố sinh trưởng kích thích sự phát
triển 20-76%, với sự kết hợp từ 2-10 yếu tố, sự phát triển có thể tăng lên 48-213%.


1

2.3.2.

Giới thiệu một số phương pháp nuôi cấy tế bào ối

Có 2 phương pháp nuôi cấy tế bào ối chính, đó là nuôi cấy bằng bình cấy flask
và nuôi cấy in situ. Trong đó nuôi cấy in situ gồm phương pháp nuôi cấy trên lá
kính đặt trong đĩa cấy (đĩa petri) hoặc nuôi cấy trên slide flask (flaskette).

Nuôi cấy tế bào ối trên bình cấy flask là phương pháp được thực hiện sớm nhất,
tuy nhiên phương pháp này cần thời gian nuôi cấy dài (trước đây thời gian nuôi cấy
là 2-3 tuần) và lượng môi trường sử dụng lớn (4-5ml). Nhu cầu thực hiện nuôi cấy
tế bào ối nhanh chóng cho mục đích chẩn đoán dẫn đến kết quả ra đời các bình cấy
và môi trường nuôi cấy mới [49].
Phương pháp nuôi cấy tế bào ối in situ trên slide flask (flaskette) được ứng dụng
rộng rãi trong đầu những năm 1980 [13], [57]. Với dụng cụ nuôi cấy mới, quy trình
nuôi cấy và thu hoạch cũng có thay đổi, thể hiện ưu điểm của phương pháp này,
trong đó rõ nhất ở việc giảm thể tích môi trường sử dụng (khoảng 2ml) và rút ngắn
thời gian xử lý thu hoạch mẫu tạo tiêu bản NST. Khi thu hoạch tại chỗ, lượng cụm
NST kỳ giữa bị mất đi sẽ giảm đáng kể so với thu hoạch tế bào huyền phù, do đó số
cụm NST có được để khảo sát số lượng và cấu trúc NST tăng lên. Cùng với sự phát
triển các môi trường nuôi cấy mới, slide flask góp phần rút ngắn thời gian nuôi cấy
từ 2-3 tuần xuống còn từ 1 tuần đến 10 ngày [49]. Tuy nhiên giá thành slide flask
cao hơn nhiều so với bình cấy thông thường nên thời gian sau đó, các nhà nghiên
cứu tiếp tục tìm kiếm các dụng cụ nuôi cấy mới rẻ tiền và có nhiều ưu điểm hơn,
phục vụ cho các mục đích nuôi cấy khác nhau.
Phương pháp nuôi cấy tế bào ối in situ trên giá thể lá kính trong đĩa petri được
sử dụng từ những năm 90 của thế kỷ XX và vẫn được sử dụng rộng rãi trên thế giới
cho đến nay. Tế bào huyền phù được đặt lên lá kính, cho bám qua đêm hoặc lâu hơn
(tùy quy trình nuôi cấy), sau đó lá kính được làm ngập bằng môi trường nuôi cấy.
Các tế bào bám và phát triển thành cụm trên bề mặt lá kính. Thời gian nuôi cấy tế
bào ối bằng phương pháp này khoảng 10-12 ngày. Bên cạnh các ưu điểm của nuôi


cấy in situ, phương pháp này còn có nhiều ưu điểm (Liang và cộng sự, 2008) [26]
như cho tỷ lệ thành công cao, thời gian nuôi cấy ngắn, dùng cho dịch ối từ thai tuổi
lớn, dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm và giảm thể tích môi trường sử dụng. Tuy nhiên khi
ứng dụng thực tế, chưa có quy trình thống nhất cho phương pháp này, các quy trình
nuôi cấy được thực hiện khác nhau tùy cơ sở nghiên cứu, do đó thời gian cũng như

hiệu quả nuôi cấy cũng rất biến động [24], [26].
2.4.

CÁC KỸ THUẬT KIỂM TRA SỐ LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC NST

2.4.1. Kỹ thuật NST đồ (Karyotyping technique)
2.4.1.1.

Đặc điểm

NST đồ (kiểu nhân – karyotype) là một tập hợp hoàn chỉnh tất cả các NST của
một tế bào ở bất kỳ sinh vật nào. Các NST này được sắp xếp và thể hiện với định
dạng chuẩn theo từng cặp, có thứ tự theo kích thước và sự định vị của tâm động.
Kỹ thuật NST đồ là quá trình sắp xếp và phân cặp tất cả các NST của một cơ
thể. NST đồ được chuẩn bị bằng cách sử dụng các quy trình nhuộm chuẩn làm bộc
lộ cấu trúc đặc trưng của mỗi NST. Các nhà di truyền học lâm sàng phân tích NST
đồ người để khám phá những thay đổi di truyền lớn như bất thường bao gồm nhiều
cặp base hay nhiều DNA. NST đồ cũng có thể phát hiện các thay đổi số lượng NST
liên quan đến các đột biến lệch bội. Phân tích kỹ NST đồ cũng có thể phát hiện
nhiều thay đổi cấu trúc khó nhận diện như mất đoạn, chuyển đoạn, đảo đoạn hay lặp
đoạn trên toàn NST [32]. Kỹ thuật làm NST đồ sử dụng dịch ối hay gai nhau thường
được dùng trong chẩn đoán tiền sản (đặc biệt cho chọc ối chẩn đoán bệnh Down),
điều tra các trường hợp sẩy thai liên tiếp hay tìm kiếm nguyên nhân gây hiện tượng
hình dạng bất thường, chậm phát triển trí tuệ hay nghiên cứu các bất thường về
hành vi hay phân loại bệnh bạch cầu, u bạch huyết và các loại u bướu để chẩn đoán
chính xác, xác định cách điều trị.


Quá trình tạo NST đồ bắt đầu bằng giai đoạn nuôi cấy các tế bào mẫu xét
nghiệm; các tế bào từ mẫu máu, tuỷ xương, dịch ối hay khối u được nuôi cấy

khoảng 4-7 ngày. Sau khi tế bào phát triển và nhân lên, phân chia tế bào bị làm
ngưng lại bằng cách thêm colchicine, chất làm phá hủy thoi phân bào. Tế bào
sau đó được xử lý tiếp tục với dung dịch nhược trương làm cho nhân phồng lên
và tế bào vỡ ra. Nhân sau đó được xử lý với chất cố định, thường là dung dịch
carnoy (3 methanol: 1 acid acetic), nhỏ lên phiến kính và xử lý với các thuốc nhuộm
giúp phát hiện các đặc điểm cấu trúc của NST.
2.4.1.2.

Các yếu tố ảnh hưởng chất lượng tiêu bản NST tạo NST đồ

Chất lượng tiêu bản NST tạo NST đồ được đánh giá dựa trên các chỉ tiêu bao
gồm số cụm NST kỳ giữa và chất lượng cụm NST kỳ giữa. Trong đó, chất lượng
cụm NST được đánh giá dựa trên độ sạch (mức độ còn sót lại của tế bào chất và
màng trong cụm NST), và độ bung của cụm NST.
Hliscs và cộng sự (1997) khẳng định quá trình bung của NST là quá trình diễn ra
chậm làm duỗi căng NST [19]. Quá trình bung bao gồm sự phồng lên đáng kể do
nước gây ra ở tế bào nguyên phân trong khi chất cố định bay hơi khỏi bề mặt phiến
kính [16]. Mức độ bung của NST tế bào ối nuôi cấy thứ cấp hay nuôi cấy sơ cấp in
situ đều phụ thuộc nhiều yếu tố, trong số đó thời gian bay hơi của chất cố định được
coi là quan trọng nhất. Thời gian bay hơi phụ thuộc thành phần của chất cố định, độ
ẩm tương đối, sức gió và nhiệt độ xung quanh (Spurbeck và cộng sự, 1996) [41], 2
yếu tố cuối có thể được điều khiển bởi việc sử dụng phòng đặc biệt điều chỉnh tiểu
khí hậu [27] hay phòng thu hoạch NST (chromosome harvest chamber). Trong đó,
khi thu hoạch in situ, nhiệt độ xung quanh không ảnh hưởng chất lượng cụm NST
(Raddatz, 2005). Tuy nhiên các yếu tố nói trên chỉ tác động một cách giới hạn.
Trong giới hạn cho phép, các điều kiện này không phải yếu tố quyết định [54].
2.4.2. Kỹ thuật hiện băng (Banding techniques)
Kỹ thuật hiện băng (nhuộm phân hóa) do T.H.Hu (1969) nêu ra bao gồm các
phương pháp, kỹ thuật nhuộm màu hiện đại đối với NST, làm nổi rõ các băng. Băng

được xem là từng phần của NST bắt màu đậm hơn hoặc sáng hơn các phần kề bên
do tác dụng của các loại thuốc nhuộm khác nhau, tạo ra các giới hạn để phân biệt
đặc thù sai khác giữa các NST, đặc biệt khi dùng để phân biệt các NST giống nhau
về hình dạng và kích thước.
Các phân tử gây ra tính bắt màu khác nhau suốt chiều dài NST rất phức tạp bao
gồm thành phần cơ bản của DNA và sự khác nhau trong cấu trúc chất nhiễm sắc.
Kỹ thuật hiện băng có vai trò quan trọng để nghiên cứu hình thái NST
(chromosome morphology) và hình thái kiểu nhân (karyomorphology) trên các loài
động vật, từ đó tìm hiểu mối quan hệ di truyền về giống, chủng loại phát sinh và
chẩn đoán các bất thường NST [1].
Các kỹ thuật hiện băng phổ biến hiện nay là hiện băng Q, G, R, C. Mỗi kỹ thuật
đều có ưu và nhược điểm riêng, cùng với nhau các kỹ thuật hiện băng cung cấp cho
nhà di truyền học một kho các phương tiện nhuộm màu cho chẩn đoán bất thường
NST [32].

Hình 2.3: NST hiện băng tạo bởi các kỹ thuật nhuộm khác nhau. Nhuộm giemsa (a), hiện
băng Q (b), hiện băng R (c), và hiện băng C [32].


2.5.
2.5.1.

DEMECOLCINE
Đặc tính

Demecolcine (ColcemidTM), hoặc colcemid, được sản xuất từ năm 1972-1973 và
được phân lập từ Colchicum autumnale L (nghệ tây thu).

Demecolcine (N-Deacetyl-N-methylcolchicine C21H25NO5) [56]

Demecolcine có liên quan mật thiết với alkaloid colchicine tự nhiên, với sự thay
thế nhóm acetyl trên amin bằng methyl, nhưng ít gây độc hơn. Demecolcine tan
trong rượu, chloroform và DMSO đến 10mg/ml. Demecolcine có tác dụng ngăn cản
trùng hợp vi ống bằng cách liên kết với tubulin ở cực dương [52], gây giải trùng
hợp vi ống, ức chế nguyên phân gây đồng bộ hóa các tế bào ở kỳ giữa, ngăn cản sự
tách tâm động trong phân bào, ức chế sự di cư tế bào, hỗ trợ khoét nhân noãn trong
kỹ thuật chuyển nhân tạo dòng phôi vô tính và kích thích sự phát triển của phôi sau
chuyển nhân. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu cũng cho thấy xử lý với demecolcine
làm tăng tỷ lệ bất thường NST trong phân bào [36].
2.5.2.

Cơ chế tác dụng

Demecolcine tác động lên sự phân bố “phức hợp thúc đẩy kỳ sau” (AnaphasePromoting Complex – APC) là phức hợp protein gồm nhiều tiểu phần quan trọng
cho điều hòa chu kỳ tế bào, thông qua đó tác động làm ngưng tế bào ở pha S hay G,


ngăn cản sự tách tâm động (Castro và cộng sự, 2005 [12], Chau và cộng sự, 1989
[14], Peters, 2002 [34]).
Demecolcine là gây giải trùng hợp vi ống bằng 2 cơ chế phân biệt. Vi ống có
cấu trúc phân cực với cực dương và cực âm, thường cực âm được giữ chặt với tâm
động trong tế bào động vật [45]. Demecolcine ngăn cản trùng hợp vi ống bằng cách
liên kết với tubulin ở cực dương [52].Với nồng độ rất thấp nó liên kết với tubulin ở
cực dương và không cho phép cộng thêm các nguyên sợi, ngăn chặn động học vi
ống [22], [25], do đó liên quan đến khả năng demecolcine ức chế sự trùng hợp các
nhị hợp tubulin, ức chế sự tạo thoi vô sắc mà không gây một tác động đáng kể nào
lên đặc tính sinh hóa của tế bào nguyên phân. Các nghiên cứu gần đây phát hiện
demecolcine nồng độ cao có thể kích thích tháo gỡ cực mang điện âm của vi ống
gây giải trùng hợp theo thời gian, gây độc cho tế bào (Yang và cộng sự, 2010) [50].
Khác với colchicine,demecolcine liên kết với tubulin nhanh và thuận nghịch, ở

370C tỷ lệ liên kết không đổi cho demecolcine là 1,88x10 6mol/giờ, khoảng 10 lần
cao hơn colchicine. Điều này được phản ánh trong năng lượng hoạt hóa cho liên
kết demecolcine và tubulin là 51,4kJ/mol, và 84,8kJ/mol cho colchicine. Sự phá vỡ
liên kết của demecolcine cũng nhanh hơn colchicine. Đặc tính này của demecolcine
làm nó trở thành nhân tố ức chế phân bào của tế bào nuôi cấy cấp cao hơn
colchicine [36].
Trên tubulin có 2 vùng có ái lực với demecolcine và colchicine, vùng ái lực cao
liên kết được với cả demecolcine và colchicine, vùng ái lực thấp chỉ tạo liên kết với
demecolcine. Tương tự colchicine, liên kết demecolcine với tubulin được kích thích
bởi ion âm có sẳn (ion sulfate và tartrate) nhưng với cơ chế khác nhau. Ái lực liên
kết demecolcine ở vùng ái lực thấp của tubulin tăng khi có sự hiện diện của ion âm
sulfate hay tartrate và bị cải biến thành ái lực cao. Tuy vậy, colchicine không nhận
biết được vùng ái lực cao được cải biến nhờ sulfate.


Demecolcine còn được dùng nhiều trong hóa trị và nghiên cứu di truyền tế bào.
Về mặt y học demecolcine làm tăng kết quả xạ trị ung thư bằng cách đồng bộ hóa
các tế bào khối u ở kỳ giữa, giai đoạn nhạy cảm với bức xạ trong chu kỳ tế bào [25],
[56].
Xử lý mô phôi chuột nuôi cấy sơ cấp trên lá kính bằng demecolcine cho thấy
chất này có tác dụng kích thích tổng hợp DNA, và gây ra các thay đổi được đánh
dấu trong kỳ trung gian. Các vùng cố định của bề mặt tế bào biến mất dẫn đến sự
hoạt hóa bất thường của các phần bề mặt tế bào, ức chế di cư tế bào. Demecolcine
cũng tác động mạnh đến sự tổng hợp DNA trong tế bào khi nuôi cấy mật độ dày
[17].
Một vài nghiên cứu cho thấy khả năng đáp ứng với demecolcine khác nhau giữa
tế bào thường và tế bào khối u. Chỉ số phân bào trong nuôi cấy dòng tế bào khối u
người bắt đầu tăng ngay khi thêm thuốc, nhưng với dòng tế bào bình thường, chỉ số
phân bào không tăng trong 2-3 giờ sau khi thêm colcemid [28]. .
2.6.

MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ỐI NGƯỜI
TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

2.6.1.

Các nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, việc chọc ối được thực hiện từ những năm 1930 để phục vụ chẩn
đoán các bất thường di truyền của thai nhi. Các nghiên cứu nuôi cấy tế bào ối cho
chẩn đoán trước sinh phát triển mạnh vào nửa cuối thế kỷ XX.
Năm 1966, Steele và Breg chứng minh nước ối ở người có chứa một số tế bào
còn sống, các tế bào này nếu cấy sẽ có khả năng sinh sản, phát triển với lượng đủ để
làm tiêu bản nhiễm sắc thể. Những năm sau đó, tế bào nước ối được lấy để cấy và
khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể thai nhi và chẩn đoán một số các bệnh biến
dưỡng di truyền ở thai nhi [9].


Năm 1983, Tabor, Lind và các cộng sự (Đan Mạch) đăng bài báo về một loại
phương tiện nuôi cấy tế bào ối mới, gọi là flaskette, giúp thu hoạch và chuẩn bị tiêu
bản NST nhanh hơn so với nuôi bằng bình cấy thông thường [57].
Zheng và cộng sự (2002) khi tìm kiếm phương pháp nuôi cấy làm tăng tỷ lệ
thành công khi nuôi cấy tế bào ối đã tiến hành khảo sát việc nuôi cấy trên in situ
flask. Kết quả nhận được tỷ lệ thành công là 100%, khả năng phân tích NST đồ tốt
[51].
Raddatz và các cộng sự (2005) đã báo cáo một chuỗi nghiên cứu về các yếu tố
đến quá trình nuôi cấy và thu hoạch in situ tế bào ối và gai nhau, bao gồm đánh giá
tác động của thể tích dịch ối, loại môi trường lên thời gian và số cụm tế bào trong
nuôi cấy sơ cấp, và đánh giá ảnh hưởng của chất kiềm hãm, nhiệt độ, độ ẩm và tốc
độ lưu thông khí lên chất lượng cụm NST kỳ giữa thu hoạch từ tế bào ối và gai nhau

nuôi cấy sơ cấp [53], [54], [55].
Pan và cộng sự (2006) khảo sát hiệu quả của phương pháp nuôi cấy và thu
hoạch in situ các tế bào ối để chẩn đoán tiền sản, kết quả phương pháp mới cho tỷ lệ
nuôi cấy thành công là 100% và cụm NST tốt hơn phương pháp truyền thống [33].
Sun và cộng sự (2007) nghiên cứu làm tăng tỷ lệ thành công khi nuôi cấy bằng
cách thay môi trường nếu có sai sót trong khi thu nhận tế bào ối nuôi cấy và tách tế
bào ối khỏi các dịch ối bất thường cùng với xử lý bằng chất kháng sinh đúng lúc khi
bình cấy bị nhiễm [43].
Liang và cộng sự (2008) khảo sát kết quả nuôi cấy tế bào ối bằng phương pháp
và lượng dịch ối khác nhau. Nghiên cứu tiến hành trên 155 mẫu dịch ối nuôi cấy in
situ trên lá kính và bình cấy, kết quả cho thấy nuôi cấy in situ trên lá kính cho kết
quả tốt hơn, đồng thời không có sự khác biệt kết quả khi dùng 15-20 ml hay 6-8ml
dịch ối [26].
Cao và cộng sự (2008) phân tích NST đồ và khảo sát khả năng ứng dụng của
chúng trong chẩn đoán tiền sản, nhóm tác giả đã dùng 104 mẫu dịch ối từ thai 16-29