ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM NGẮN NGÀY

GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
MỤC LỤC

Nhóm 9

Page1


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông

I.

Khái quát về enzyme.

1.1.Enzym
- Enzym có bản chất là protein được sinh vật tổng hợp nên, tham gia vào các phản
ứng hóa sinh học.
1.2.Đặc tính chung của enzym
- Enzym được tạo ra trong tế bào sinh vật, không độc hại, thân thiện với môi
trường.
- Enzym tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi được tách khỏi tế bào
sống.
- Enzym có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn
đầu đến giai đoạn cuối giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa
học. Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của phản ứng
trước là cơ chất cho phản ứng sau.
- Enzym có thể được thực hiện một phản ứng: xảy ra ngoài tế bào (như trong ống
nghiệm)
- Phản ứng enzym tiêu hao năng lượng rất ít, hiệu suất và tốc độ cao
- Enzyme tính chọn lọc cao
- Enzym chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng.

1.3.Cấu tạo của enzym
Nhóm enzym đơn cấu tử : Thành phần cấu tạo chỉ có protein.
Nhóm enzym đa cấu tử :
- Gồm 2 phần:
+ Phần I: protein thuần : apoprotein hay apoenzym
+ Phần II: thành phần không phải protein : cofactor – chúng có thể gắn chặt
(prosthetic) hoặc lỏng lẻo với phần protein (coenzym)
Ngoài ra còn có một số kim loại giữ vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, giữa
apoenzym và coenzym, tham gia vận chuyển điện tử.
Nhóm 9

Page2


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
II.

Tổng quan về enzyme protease

1.1 .Giới thiệu.
Protease là chất xúc tác thủy phân protein tạo thành những phân tử thấp và các
amino acid.Chúng không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh
vật mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học,
trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường.Protease là một trong những enzyme được
ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực. Đặc biệt là công nghiệp thực phẩm, protease đã có
những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ và nâng cao đời sống của con người. Hiện
nay trên thế giới, công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật hiện còn đang phát triển, tìm
tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzyme protease. Ở Việt Nam cũng có
nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng Protease, chủ yếu tập trung vào các
protease thực vật và động vật còn protease vi sinh vật chỉ được nghiên cứu trong hơn

chục năm trở lại đây.
1.2 . Đặc điểm chung.
Ezyme protease là enzyme thủy phân các liên kết pectid (-CO-NH-) trong phân tử
protein giải phóng các acid amin, pepton hoặc dittripepton.

Nhóm 9

Page3


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật
(vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So
với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt.
Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất
giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng
tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh
vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.

Hình1.2: Cấu trúc không gian enzyme protease

1.3. Phân loại.
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) .

Nhóm 9

Page4

GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông

Hình
1.3: Sơ đồ phân loại protease
Với enzym protease thì có nhiều cách phân loại nhưng ta chỉ dựa vào hai đặc điểm
sau để phân loại chúng:
Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các peptide trong phân tử protein,
người ta chia protease làm 2 nhóm chính:
•
Exopeptidase: (Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptid,) được phân
thành 2 loại:
•

Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu N tự do của chuỗi
poly peptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid.
•

Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi
poly peptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một đipepti.
•

Nhóm 9

Page5


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
•

Endo peptidase: (Dựa vào động lực học của cơ chế xúc tác) được chia thành

4 nhóm:
Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của
enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin. Nhóm chymotripsin
bao gồm các enzyme động vật như chymotripsin, tripsin, elastase. Nhóm subtilisin bao
gồm 2 loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN. Các serine
proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất tương
đối rộng.
•

Cyteim proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein protease bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài
proteinase động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cystein proteinase thường hoạt động
ở vùng PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
•

Aspatic proteinase: hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin….
Các asportic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt
động mạnh ở PH trung tính.
•

Metallo proteinase metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở
vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường
hoạt động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA.
•

Dựa vào thành phần amimo acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta

chia làm các nhóm:
•

•

Protease acid: pepsin, renin,… hoạt độngở vùng pH acid 2-4.

•

Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, … hoạt độngở vùng pH kiềm 9-11.

Protease trung tính: như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa, …
hoạt độngở vùng pH trung tính 7-8
•
Ngoài ra có thể phân làm 2 loại khác:
•

Nhóm 9

Page6


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
Enzyme protease nồi bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc
ngoại biên màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kĩ thuật trích ly.
•

- Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men hoàn tất hoặc
ngay quá trình lên men đang diễn ra.
1.4. Cơ chế tác dụng

Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học
của enzym người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ quá
trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzym và cơ chất thành hợp chất trung gian.
E (enzym) + S (cơ chất)→ES(hợp chất trung gian)
1.5. Nguồn cung cấp
Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác
cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận
để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: các mô và cơ động vật, mô
và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật
•

Nguồn Động vật

Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hóa ở người và động vật, có nhiều
ứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa. Hai
enzym này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo, bê, bò…)
Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều ezyme
nhất. Trypsin là men phân giải các protein hỗn hợp men này do tuyến tụy tiết ra, tiền thân
của nó là Trypsiogen, được hoạt hóa bởi Entorokiaza của ruột. Trypsin là một enzym có
chức năng phân cắt các protein.
Ngoài ra tuyến tụy còn tiết ra enzyme Chymotrypsin, enzym này góp phần phân
giải protein trong ruột non và được chiết xuất từ tụy bò.
Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ
phomat.Renin làm biến đổi các casein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi
trường sữa có nồng độ Ca2+ (sự đông tụ sữa chua).
Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như: ở
các loài Eudothia parasitica và Mucor purillus.
Nhóm 9

Page7


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
•

Nguồn thực vật

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ
nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Caria papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa
(Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của
bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của
protease thực vật này là trong công nghệ chế biến thịt nó làm mềm thịt và trong mục tiêu
tiêu hóa.
Ngoài ra còn thu nhận ezyme Ficin tách từ dịch ép thân cây sung. Ezyme được sử
dụng để phân hủy protein tự nhiên.

Hình 1.4: Mô hình phân tử enzyme papain

Hình 1.5: Nguồn thu nhận ezyme Protease từ thực vật
•

Nguồn vi sinh vật

Hai nguồn nguyên liệu trên không để dùng làm nguyên liệu sản xuất công nghiệp
quy mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và công nghệ. Vì dùng enzyme từ vi sinh
vật sẽ khắc phục được các hạn chế sau:
Nhóm 9

Page8

GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
•

Nguồn nguyên liệu vô hạn.

•

Hệ enzyme phong phú.

•

Hoạt tính mạnh.

•

Có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọ giống.

•

Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh.

•

Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ tiền.

Ezyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn...gồm nhiều loài
thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm
men.

• Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59
lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại andopeptidase hoặc
exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi
khuẩn có tính cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide
trong phân tử protein.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
subtilis, B. Mesentericus, B. Thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.
Trong đó, B. Subtilis có khả năng tổng hợp mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp
các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 – 6) và có
khả năng chịu nhiệt thấp.Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm
ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính
có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều
bởi B. Subtilis, B. Mesentericus, B. Thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium.

Nhóm 9

Page9


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông

Hình 1.6: Clostridium
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ
20.000 – 30.000.Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7 –
12.

Hình 1.7: Bacillus

•

Nấm

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng
trong công nghiệp thực phẩm là các chủng Aspergillus oryzae, A. Terricola, A.
Fumigatus, Penicillium chysogenum,... Các loại nấm mốc có khả năng tổng hợp cả ba

Nhóm 9

Page10


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
loại protease: acid, kiềm, trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid,
có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3.
Một số nấm mốc khác như: A. Candidatus, P. Cameberti, P. Roqueforti... cũng có
khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat

Hình 1.8: Nấm mốc
• Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn nấm mốc.
Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao
như: Streptomyces grieus, S. Fradiae,...

Hình 1.9: Xạ khuẩn
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở
quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích

như sau:
• Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.
Nhóm 9

Page11


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
•

Chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16 – 100 giờ nên có thể thu hoạch nhiều
lần trong năm.

•

Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng
sử dụng và tăng hiệu suất thu hồi).

•

Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản
xuất.

Tuy nhiên, trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây
bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp.
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có
trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp
ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết.

III.

Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae.
1.1. Tổng quan về Aspergillus oryzae
a. Đặc điểm cấu tạo
Aspergillus gồm hơn 185 loài, khoảng 20 loài cho đến nay đã được báo cáo là tác
nhân gây bệnh nhiễm trùng cơ dùng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme .
Trong số này, Aspergillus fumigatus là phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus flavus,
Aspergillus niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus terreus,
versicolor, Aspergillus oryzae…
Nấm Aspergillus orzae có cấu tạo đa bào, thuộc loại vi hoàn khuẩn, các khuẩn ty
có nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu
xanh nhạt có ít vàng.
Nấm Aspergillus oryzae có hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi
sang màu xanh thẩm. dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia.
Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase,
protease và catalase có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin.

Nhóm 9

Page12


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân lên men chủ yếu trong sản xuất nước
tương theo phương pháp vi sinh vật. Trong công nghiệp, người ta nhân giống nấm mốc
này để sản xuất tương.
•

Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae.

Protease: Ứng dụng trong công nghiệp da giày, y học, công nghiệp chế
biến thức an gia súc
•

Amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học
bổ sung vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dixtrin, malt…..
•

Cellulose: ứng dụng trong công nghiệp dệt,công nghệ giấy, xử lý ô nhiễm
môi trường….
•

b. Vai trò của giống
Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đóng vai trò quyết định đến: Năng
suất của nhà máy, chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính của enzyme), vốn đầu
tư cho sản xuất, giá thành sản phẩm và có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi
sinh vật.
c. Yêu cầu của giống
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản
xuất theo qui mô công nghiệp. Do đó, giống vi sinh vật ứng dụng trong công nghệ
enzyme cần có những yêu cầu và mục đích nhất định. Giống vi sinh vật phải cho ra sản
phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm phải có số lượng và chất lượng cao.Vì trong quá trình
trao đổi chất, để chuyển hóa một lượng sinh khối khổng lồ gấp hàng ngàn lần cơ thể mình
trong khoảng thời gian ngắn thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp rất nhiều chất. Giống
dùng sản xuất phải thỏa mãn các tính chất sau :
+ Phải cho năng suất sinh học cao
+ Giống phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản
xuất công nghiệp.
+ Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm
tại địa phương.

Nhóm 9

Page13


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
+ Giống sử dụng trong quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật thuần
khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
+ Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh các sản phẩm mong muốn, dễ dàng tách
chiết, tinh sạch
+ Dễ dàng bảo quản và ổn định
Để tạo thuận lợi lớn nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên
men công nhiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết.
d. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae
•

Nuôi cấy bề mặt

Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc, do khả năng phát
triển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi, nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt
chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm sâu vào lòng môi trường đã được
tiệt trùng, làm ẩm. Người ta thường dùng môi trường: cám mì, cám gạo, ngô mảnh,trấu...
Cám, trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây
ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỷ lệ các chất phải đảm bảo sao cho hàm
lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20% có thể bổ sung thêm
nguồn nitơ vô cơ (NH4)2 SO4, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt,
nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. Với phương pháp này nồng độ enzyme cao hơn nhiều
lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật.Chế phẩm dễ dàng sấy
khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo quản, vận

chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme,
tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện quy mô gia đình.
Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm
trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó.Tuy nhiên, phương
pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ giới hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế
phẩm ở các mẻ không đồng đều.
•

Nuôi cấy chìm

Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, với chất chủ yếu trong đa số
trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất cacbon là
đường glucoza, saccharoza. Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng
Nhóm 9

Page14


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi
cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy. Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy
chìm gồm: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc
sản xuất. Phương pháp nuôi cấy hiện đại, dễ cơ giới hóa, tự động hóa, năng suất cao, dễ
tổ chức sản xuất. Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh
tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy,
enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh vô trùng. Tuy nhiên do thu
được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành
cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt,
toàn bộ, gây tổn thương lớn.
e. Nguyên liệu sản xuất

Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng
trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi
trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và
tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào
hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì
chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm hãm của
chất kìm hãm nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất
cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường thường là cơ chất tương ứng của
enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, H, O, N. Ngoài ra còn có các chất vô cơ:
Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác
•

Nguồn cacbon

Đối với Asp.oryzae: frucfoza
arabinoza
glactoza.

saccroza

maltoza

glucoza

manit

Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme
protease. Chẳng hạn như: vi khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở
môi trường tinh bột lớn hơn 8%.

Nhóm 9

Page15


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonos pora vulgaris 42, mọc tốt và sinh
tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25 – 1,5%
sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme.
•

Nguồn nitơ

Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH 4, H2PO4 là tốt hơn cả. Các nguyên liệu đã
chuẩn bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép
quả, rau, khô dầu, bã rượu, rỉ đường, sản phẩm phân hủy, nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi
lựa chọn sử dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hòa sinh tổng hợp
enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng.
f. Phương pháp phân lập
Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên, đâu đâu cũng có vi sinh vật. Ở những
nơi giàu chất hữu cơ, trong không khí, trong cơ thể động vật, thực vật….Chính vì vậy mà
vi sinh vật có khả năng tồn tại và phát triển ở những điều khắc nghiệt nhất.
Thông thường chủng vi sinh vật để thu nhận enzyme thường có 3 cách phân lập:
+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
+ Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
+ Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Tùy thuộc vào khả năng và điều kiện thực tế mà chọn cách phân lập phù hợp
nhất.Mỗi cách có những ưu điểm riêng .
•

Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt
đáng kể các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự nhiên,
được gọi là các chủng vi sinh vật hoang dại. Chúng đã quen với các điều kiện tự nhiên,
khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với điều kiện môi trường cố
định đòi hỏi các loài vi sinh vật cũng có thời gian thích nghi. Huấn luyện chúng thích
nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều kiện rất cần thiết.

Nhóm 9

Page16


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
•

Phân lập giống trong điều kiện sản xuất

Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều
kiện sản xuất.Nhờ đó sau khi phân lập các giống này không qua giai đoạn huấn luyện.
Các giống này đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những
đặc điểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại.
Mật độ tế bào vi sinh vật thường rất cao, do đó khả năng thu nhận đã sinh tổng
hợp cao
•

Phân lập giống trong điều kiện hư hỏng

Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm nhiều tế bào vi
sinh vật đã bị thoái hoá nhưng cũng có nhiều tế bào không bị thoái hoá.
•

Phương pháp phân lập nấm mốc Asp. oryzae

Quy trình lấy mẫu: khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất.Sau 8 ngày lấy những
miếng khoai tây lên cho vào bao nilon và mang về phòng thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm: Mẫu khoai tây đã xay nhuyễn cho vao 90ml nước cất vô
trùng và trộn đều mẫu.Lấy pipet hút 10ml từ dung dich ban đầu sang ống nghiêm khác
chứa 90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng tới nồng độ 10-3, 10-4.
•

Hút 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào môi trường PDA

•

Dùng que trang trang đều mãu trên bề mặt thạch

Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên sẽ xuất hiện những quầng
sáng quanh khuẩn lạc
•

•

Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy.

Cấy chuyền những mớc đặc trưng vào trong môi trường Pda trong ống
thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong vòng 72h.
•

Nhân giống vi sinh vật trong bình tam giác: cho10ml nước cất vo trùng vào
ống thạch nghiêng có chứa bào tử. Lắc đều cho bào tử trộn lẫn với môi trường
•

Nhóm 9

Page17


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
•

Hút 0,1ml dung dịch cho vào bình tam giác chứa môi trường sinh trưởng

của nấm.
KH2PO4

1,4g

MgSO4

0,1g

NH4NO3

10g

FeO4

0,01g

KCL

0,5

Hồ tinh bột 20g

pH=6,5

Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc mang đi bảo quản, dự
trữ.Để có hiệu quả cao cần lựa chon các phương pháp bảo quản thích hợp.
•

Phương pháp bảo quản

Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng đã được
kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hoá sinh, vi sinh và cần đặc biệt lưu ý đến điều kiện bảo
quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dị
ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính
ban đầu.
•

Phương pháp cấy chuyền

Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi
trường thạch (thạch nghiêng, hợp petri…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều
kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản
ở nhiệt độ lạnh 3 – 4 và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại.Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử
hoặc khuẩn lạc mà không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể

gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được).
Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ
trong đất để khử trùng.Để kéo thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến một năm,
người ta phủ một lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát
triển của nó. Cần lưu ý chỉ phủ một lớp đầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh
lý. Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảơ quản các giống nấm men, vi khuẩn và
rất hữu hiệu dễ dàng triển khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến
hư hỏng giống gốc.

Nhóm 9

Page18


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
•

Phương pháp làm khô

Bằng cách giữ giống trên cát đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều
được khử trùng cẩn thận).Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của
giống khi bảo quản. Phương pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ
khuẩn, một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữ giống có thể được một năm. Phương
pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản không cần dụng cụ đắt tiền. Tuy nhiên, giống như
phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn.
•

Phương pháp đông khô

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng

thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm
lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị động khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được
làm khô đến mức nhất định.Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân
không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các nấm men, vi
khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng, đối với tảo, động
vật nguyên sinh và tế bào động vật.
•

Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi
trường dịch thế và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ
lạnh sâu (-1960C đến -800C). Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình
làm lạnh và làm tan mẫu.Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất
điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục
nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan
nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfo xide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh
sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như: -20 0C, - 300C, -400C, -700C,
-400C và -1960C. Nói chung mức nhiệt cao hơn - 30 0C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu
nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả
với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và
virut.
1.2. Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốcAspergillus oryzae
Quy trình thu nhận enzyme protease
Trong sản xuất các chế phẩm protease, người ta thường chia làm hai giai đoạn: Thu
Nhóm 9

Page19

GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
nhận protease thô và tinh sạch protease.
Thu chế phẩm protease thô: Với nguồn động vật và thực vật thì tiến hànhnghiền ,
trích ly sau đó đem ly tâm.Còn đối với nguồn vi sinh vật thì ta nuôi cấy, phá vỡ tế bào
sau đó đem ly tâm.
Tinh sạch protease: Sửdụng các phương pháp hóa lý đểloại dần các thành phần không
phải proteasera khỏi thành phần protease. Sản phẩm cuối cùng là protease tinh khiết.

Hình 2.1: Quy trình tổng quát thu nhận protease

Nhóm 9

Page20


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông

1.2.1. Sơ đồ quy trình
Môi trường

Asp.oryzae

Nuôi cấy

Sử dụng
enzyme thô

Chế phẩm thô

Trích ly

Bã

Kết tủa
enzyme

Ly tâm

Thu nhận kết
tủa

Sấy
Nhóm 9

Page21

Thức ăn
chăn nuôi


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông

Tinh chế

Chế phẩm
enzyme tinh
khiết

Hình 2.2: Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
1.2.2. Thuyết minh quy trình

a. Môi trường
Mục đích: Chuẩn bị môi trường cho nuôi cấy cho phép vi sinh vật phát triển tốt
Cách tiến hành: Nguồn tinh bột như cám gạo, chứa khoảng 20% tinh bột, 10- 20%
chất béo, 10–14% protein, 8 – 16% cellulose, các chất hòa tan không chứa nitơ 37–
59%.Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20%, không có vị chua hay đắng,
không hôi mùi mốc, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%, có thể bổ
sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất
kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. Các phụ phẩm thêm
vào để thoáng khí cho môi trường nuôi cấy bề mặt như trấu , mùn cưa
b. Nuôi cấy
Mục đích: Tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển và sinh enzyme
Cách tiến hành: Sau khi đã trộn giống, môi trường được rải đều ra các khay với
chiều dài 2 -3cm, rồi được vào phòng nuôi cấy, đặt trên các giá đỡ. Các giá đỡ này được
thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên.Phòng nuôi cấy phải có
hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí, nhiệt độ thích hợp cho sợi nấm phát
triển là từ 280C – 32oC.Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến sự phát triển
của sợi nấm.
Trong quá trình nuôi cấy ta không cần phải điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là
môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít ảnh hưởng đến cả khối môi
trường
Thời gian nuôi sợi nấm thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ
thuộc vào chủng mốc Asp.oryza, điều kiện môi trường cùng như kĩ thuật nuôi cấy
Nhóm 9

Page22


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
Thiết bị: Khay nuôi cấy bề mặt

Hình 2.3. Khay nuôi cấy
Thông số kĩ thuật: + Dày 4-5cm
+ Cao 1-1,2m
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài từ 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy.
Ở giai đoạn này có những thay đổi sau như nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình
thành có màu trắng hoặc màu sữa, thành phần chất dinh dưỡng cũng bắt đầu thay đổi,
khối môi trường còn rời rạc, enzyme mới bắt đầu được hình thành. Trong giai đoạn này
không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài từ 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những
thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và phát triển mạnh tạo
thành những mạng chằng chịt bao quanh các hạt môi trường, có thể nhìn rõ sợi nấm màu
trắng xám bằng mắt thường, môi trường kết lại khá chặt, độ ẩm môi trường giảm dần,
nhiệt độ môi trường có thể tăng nhanh lên 40-500C, các chất dinh dưỡng giảm nhanh do
sự đồng hóa của sợi nấm, enzyme prorease được tổng hợp mạnh, lượng O 2 trong không
khí giảm và lượng CO2 tăng dần, cần phải thông khí mạnh và duy trì mức nhiệt độ từ 29300C là tốt nhất.
Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài từ 10-20 giờ. Trong giai đoạn này có những
thay đổi như sau. Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ tiêu hao chất dinh dưỡng
sẽ giảm lại, nhiệt độ của môi trường giảm, lượng enzyme tạo ra sẽ giảm xuống. Do đó
cần xác định thời gian để thu nhận enzyme hiệu quả nhất.

Nhóm 9

Page23


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
c. Chế phẩm thô
Mục đích: Thu được chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là
enzyme thô vì ngoài thành phần enzyme chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành
phần môi trường và nước.

Cách tiến hành: Để đảm bảo enzyme không bị mất hoạt tính nhanh người ta
thường sấy enzyme đến một độ ẩm thấp (Thường dùng là máy sấy chân không).Nhiệt độ
sấy vào khoảng 38-400C,enzyme protease bị mất hoạt tính ở 60-760C, độ ẩm sau khi kết
thúc sấy nhỏ hơn 10%.
Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng ngay enzyme này mà không
cần phải tinh sạch.Trong những trường hợp khác ta phải tiến hành tinh sạch enzyme để
bảo quan lâu hơn.
d. Trích ly
Mục đích: Tách enzyme ra khỏi khối môi trường.
Cách tiến hành: Sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme.
Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta sử dụng chúng như
dung môi hòa tan. Cứ 1 phần chế phẩm thô cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và lọc lấy
dịch, phần bã được loại bỏ để làm thức ăn cho gia súc.
Thiết bị: Thiết bị trích ly kiểu thùng quay

Hình 2.4. Máy trích ly

Nhóm 9

Page24


GVHD: Th.s Liêu Mỹ Đông
Thông số kĩ thuật: +
+

Nhiệt độ trích ly 250C
Thời gian 40-60 phút

e. Kết tủa enzyme

Mục đích: Thu nhận dung dịch enzyme
Cách tiến hành: Trong công nghiệp tinh chế enzyme người ta sử dụng cồn hoặc
sunfatmon. Trong quá trình này người ta làm lạnh cả dung dịch thô và các tác nhân kết
tủa để tránh làm mất hoạt tính của enzyme. Cứ 1 phần dung dịch enzyme thô cho 2-2.5
phần cồn hoặc sunfat amon, cần nhẹ nhàng để tránh hiện tượng biến tính, khuấy nhẹ và
để trong điều kiện lạnh từ 4-70Ctrong một thời gian, các enzyme tạo thành kết tủa và lắng
xuống, người ta thu nhận kết tủa (Độ ẩm > 70%). Người ta tiếp tục sấy kết tủa ở 40 0C và
độ ẩm giảm xuống 5-8%.
Thiết bị: Thiết bị kết tủa

Hình 2.5. Thiết bị kết tủa
Thông số kĩ thuật:
Nhóm 9

Page25