Phân lập đoạn gen CP từ soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây chuyển gen kháng bệnh

B GIO DC V O TO
I HC THI NGUYấN

Lề TH MAI THU

PHÂN LậP ĐOạN GEN CP Từ SOYBEAN MOSAIC VIRUS
Và PHáT TRIểN VECTOR CHUYểN GEN MANG CấU TRúC RNAi
PHụC Vụ TạO CÂY ĐậU TƯƠNG CHUYểN GEN KHáNG BệNH
Chuyờn ngnh: Di truyn hc
Mó s: 62 42 01 21

LUN N TIN S SINH HC

Ngi hng dn khoa hc:
1. GS.TS. Chu Hong Mu
2. PGS.TS. Chu Hong H

THI NGUYấN - 2014

S húa bi Trung tõm Hc liu

/>

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các kết quả
trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các Tạp
chí khoa học với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả, phần còn lại
chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Chu
Hoàng Hà đã tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá
trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Tôi xin cảm ơn Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, cảm ơn
TS. Lê Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ

, Phòng

Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ,
truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và
thực hiện đề tài luận án. Xin cảm ơn sự giúp đỡ ThS
, ThS

.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm cùng tập thể cán bộ
Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận án.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp và Bộ phận

quản lý nghiên cứu sinh, Phòng đào tạo, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Thái
Nguyên, xin cảm ơn Lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm và Lãnh đạo Đại học
Thái Nguyên.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Ban chủ nhiệm khoa Sinh.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận án này.

Nghiên cứu sinh

Mai Thu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

iii

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan...................................................................................................

i

Lời cảm ơn......................................................................................................

ii

Mục lục...........................................................................................................

iii

...............................................................

vi

...................................................................

viii

....................................................................

x

MỞ ĐẦU........................................................................................................

1

1. Đặt vấn đề …………………………………………………........………..

1

2. Mục tiêu nghiên cứu……………………………………….........………..

2

3. Nội dung nghiên cứu………………………………………........………..

3

4. Những đóng góp mới của luận án………………………….......................

3

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn……………………………........…………

4

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………….......................

5

1.1. BỆNH KHẢM DO VIRUS Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG……….........……..

5

ệnh virus ở cây đậu tƣơng………………......……

5

1.1.2. Sự xâm nhập của SMV và BYMV vào tế bào đậu tƣơng….........……

9

1.1.3. Hệ gen của SMV và BYMV…………………………….........………

10

1.2 . NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG.......................

16

1.2.1.

16

1.1.1.

......…..

1.2.2. Định hƣớng ứng dụng và một số thành tựu về chuyển gen ở cây
đậu tƣơng………………………………..........……………………………..

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
23


iv

1.2.3. Tình hình nghiên cứu tạo cây đậu tƣơng biến đổi gen ở Việt Nam….

28

1.3. KỸ THUẬT RNAi TRONG TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG
VIRUS…………………………………………………………...……………..

29

1.3.1. Các cơ chế RNAi ức chế gen ở thực vật……………........…………...

30

1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen
kháng virus…………………………………………………………………..

36

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................…..

40

2.1. VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU..........

40

2.1.1. Vật liệu thực vật……………………………………...........………….

40

2.1.2. Vector và chủng vi khuẩn ……………………….........……………....

42

2.1.3. Hóa chất và thiết bị ………………………………........……………...

42

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu……………………………….........……………

42

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………….........………...

43

2.2.1. Nhóm các phƣơng pháp phân lập gen…………………......................

43

2.2.2. Nhóm các phƣơng pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc
RNAi.............................................................................................................................

48

2.2.3. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens.............................

52

2.3.4. Nhóm các phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen...............................

58

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN…...................….

60

3.1. TÁCH DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN CP CỦA
SMV………………………………………………...........……............................

60

3.1.1. Tách dòng và xác định trình tự nucleotide đoạn gen CP từ SMV.……

60

3.1.2. Phân tích sự đa dạng của trình tự gen CP của các dòng SMV..............

67

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

v

3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi …..

74

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đơn loài
SMV…………………………………………………………...…………….

74

3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng hai loài SMV
và BYMV……………………………………………………………………

81

3.3. KẾT QUẢ TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG SMV
VÀ BYMV…………………………………………………..........…………

89

3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây thuốc lá….....

89

……….......………………

92

RNAi …...

96

…....

96

3.4. K
ut
các dòng cây đậu

-

0…………...

99

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………….......................…………….. 106
1. KẾT LUẬN……………………………………………........……………. 106
2. ĐỀ NGHỊ……………………………………………….......…………….. 107
.................

108

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………................................... 109

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

AS

Acetosyrigone

BAP

6-benzyladenine purin

BGM

Bean golden mosaic virus

bp

Base pair

BYMV

Bean yellow mosaic virus

CCM

Co-cultivation medium

CAMV

Cauliflower mosaic virus

CMV

Cucumber mosaic virus

)

CP

)

)

CPi –SMV

Đoạn bảo thủ đƣợc thiết kế từ gen CP của SMV

CPi(SMV-BYMV) Đoạn bảo thủ đƣợc thiết kế từ gen CP của cả SMV và
BYMV
DNA

Deoxyribo nucleic acid

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

đtg

Đồng tác giả

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

GA3

Gibberellic acid

GM

Germination medium (môi trƣờng nảy mầm)

gus

Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase

IAA

Indoleacetic acid

IBA

Indole-3-butyric acid

kb

Kilo base

LB

Luria and Bertani

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

vii

MS

Murashige & Skoog (1962) -Môi trƣờng cơ bản

NAA

α-Naphthaleneacetic acid

nptII

Neomycin phosphotransferase gene

OD

Optical density – Mật độ quang

PCR

Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi Polymerase

PPT

Phosphinothricin

PRSV

Papaya ringspot virus

pK7GW-CPi-SMV:

Vector chuyển gen mang cấu trúc CPi-SMV

pK7GW-CPi (SMV-BYMV)

Vector chuyển gen mang cấu trúc CPi (SMVBYMV)

RM

Rooting medium (môi trƣờng ra rễ)

RNAi

RNA interference

SDS

Sodium dodecylsulfat

SEM

Shoot elongation medium (môi trƣờng kéo dài chồi)

SIM

Shoot induction medium (môi trƣờng tạo chồi)

SL1

SMV dòng Sơn La 1 - Việt Nam

SL2

SMV dòng Sơn La 2 - Việt Nam

SMV

Soybean mosaic virus

Taq

Thermus aquaticus

T-DNA

Vùng DNA plasmid chuyển vào thực vật

Ti- plasmid

Plasmid tạo khối u

TMV

Tobacco mosaic virus

TYLCV

Tomato yellow leaf curl virus

v/p

vòng/phút

Vir

Virulence Region

X-gluc

5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

YEP

Yeast extract peptone

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

)

)

/>

viii

DANH MỤC

BẢNG
Trang

Bảng 1.1.
2014...............................................................

6

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA..............................

45

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR................................................

46

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pBT…….

47

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector
pENTRTM/D-TOPO…………………………………….

50

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng LR………………………………..

51

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế………...

52

Bảng 2.7. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh in vitro………...

53

Bảng 2.8. Thành phần dung dịch đệm tách DNA tổng số………….

58

Bảng 3.1. Trình tự cặp mồi PCR thiết kế sử dụng nhân bản đoạn
gen CP……………………………………………………

60

Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự đoạn gen CP của SMV
dòng SL2 so với dòng SL1 và trình tự có mã số X63771..

65

Bảng 3.3. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid của protein
suy diễn dòng SL2 so với dòng SL1 và trình tự có mã số
CAA45307……………………………………………….

66

Bảng 3.4.
Ngân hàng gen quốc tế
ng trong phân tích …………………………...

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
68


ix

Bảng 3.5.
…………………..

69

Bảng 3.6. Trình tự cặp mồi SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri ……………

76

Bảng 3.7. Trình tự cặp mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri …………

83

Bảng 3.8. Kết quả biến nạp cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào mảnh
lá thuốc lá C9-1………………………………………….

91

gen…………………………..

95

Bảng 3.9.

Bảng 3.10. Kết quả biến nạp cấu trúc

2008 ……………………...

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
99


x

DANH MỤC

HÌNH
Trang

Hình 1.1. Sơ đồ mô phỏng quá trình xâm nhiễm của SMV và
BYMV vào tế bào cây đậu tƣơng ………………………

10

Hình 1.2. Bản đồ hệ gen của SMV và dự đoán các điểm cắt của
protease …………………………………………………

12

Hình 1.3. Sơ đồ phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen…………..

21

Hình 1.4. Mô phỏng các con đƣờng làm câm gen thông qua RNAi.

31

Hình 1.5. Con đƣờng ức chế gen của siRNA và miRNA………….

35

Hình 2.1. Hình ảnh các mẫu lá đậu tƣơng nghi nhiễm SMV và
BYMV thu thập từ một số tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam..

40

2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát……………………………...

44

Hình 2.3. Sơ đồ mô tả các bƣớc thiết kế vector mang cấu trúc
RNAi bằng kỹ thuật Gateway …………………………..

49

giống

Hình 2.4.

2008…………………………………

57

Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn
gen CP từ SMV …………………………………………

61

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm colony - PCR từ khuẩn lạc….

62

Hình 3.3. So sánh trình tự đoạn gen CP
63771……………………………………………….
Hình 3.4.

64

So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein CP
SL1, SL2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

45307……………………….

/>
66


xi

3.5.

So sánh trình tự amino acid của vùng Poty-coat của
dòng SL1, SL2 và của protein có mã số CAA45307……

67

SMV đƣợc

CP……..

70

Sơ đồ hình cây đƣợc thiết lập dựa trên trình tự amino
acid suy diễn từ gen CP của SMV……………………..

71

Trình tự đoạn CPi-SMV thiết kế từ vùng bảo thủ của
gen CP ở các loài SMV…………………………………

75

của SMV………………………………………………...

76

3.6.

3.7.

Hình 3.8.

Hình 3.9.
Hình 3.10. Sơ đồ vị trí gắn đoạn CPi - SMV trong vector pENTRTM/D-

Hình 3.11.

TOPO và vị trí gắn cặp mồi M13-F / M13-R…………….

77

13-F / M13-R………………………………..

78

Hình 3.12. A: Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách plasmid tái tổ
hợp pEN-CPi-SMV; B: Sản phẩm PCR nhân đoạn CPi –
SMV từ pEN-CPi-SMV bằng cặp mồi SMV-CPiFi/SMV-CPi-Ri………………………………………....
3.13.

–

79

-

- plasmid pK7GW-CPi-SMV …………………………....
3.14. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm cắt bằng Xba
Hind III………………………………………………….

80

80

3.15. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc A.
tumefaciens………………………………………………

81

Hình 3.16. Trình tự đoạn gen CPi (SMV-BYMV) thiết kế từ vùng
bảo thủ của SMV và BYMV…………………………....

82

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

xii

Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen
CPi của SMV và BYMV……………………………......

83

Hình 3.18. Sơ đồ vị trí gắn đoạn CPi (SMV-BYMV) trong vector
pENTRTM/D-TOPO và vị trí gắn cặp mồi SMV-CPiF/BYMV-CPi-R và cặp mồi M13-F/M13-R………….....

84

3.19. Sơ đồ ghép nối và kết quả điện di kiểm tra sản phẩm
colony-PCR đoạn CPi (SMV-BYMV) trong vector pENCPi (SMV-BYMV)………………………………..............

84

3.20. A: Kết quả điện di kiểm tra tách plasmid; B: Sản phẩm
PCR nhân đoạn CPi (SMV-BYMV) từ plasmid bằng cặp
mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri……………..

85

Hình 3.21. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMVBYMV) …………………………………………………

86

Hình 3.22. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm cắt Vector pK7GW bằng
enzym Xba

Hind III…………………………................

87

Hình 3.23. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn
lạc A. tumefaciens…………………………….................
Hình 3.24.

89

CPi (SMV-BYMV)
vào cây thuốc lá C9-1………………………………….

90

………………………………...

92

cây thuốc lá chuyển gen ………………………………...

93

Hình 3.25.
Hình 3.26.
Hình 3.27.

cây
…………………...

94

Hình 3.28. Kết quả t
A. tumefaciens
……………………………………

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
97

xiii

Hình 3.29. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số của các dòng cây
đậu tƣơng chuyển gen giống ĐT12 (A) và giống
DT2008(B)………………………………………………

100

Hình 3.30. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại cấu trúc CPi
(SMV-BYMV) từ
12……………………………………………...

100

Hình 3.31. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại cấu trúc CPi
(SMV-BYMV) từ
DT2008…………………………………………...

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
101


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị
kinh tế, dinh dƣỡng cao, là nguyên liệu cho công nghiệp và có tác dụng cải

tạo đất trồng và bảo vệ môi trƣờng. Hiện nay, năng suất và sản lƣợng đậu
tƣơng ở nƣớc ta còn thấp, chất lƣợng hạt chƣa cao do mức độ ổn định của
giống, ảnh hƣởng của nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây

và các tác

động bất lợi khác từ ngoại cảnh. Đậu tƣơng là một trong số các cây trồng dễ
bị nhiễm nhiều loại virus, nhƣ virus gây bệnh khảm lá (Soybean mosaic virus
– SMV), virus gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ (Bean yellow mosaic virus –
BYMV) và một số virus gây bệnh khác. Trong đó, SMV và BYMV là những
loại virus gây bệnh khảm

nhất đến cây đậu tƣơng.

SMV và BYMV đƣợc lây nhiễm từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp là
môi giới

virus có thể truyền qua hạt. Khi cây đậu tƣơng bị bệnh, lá cây có

những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn bị biến dạng,
đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chậm phát triển, số lƣợng quả ít và
biến dạng, sần sùi, có vị đắng và thƣờng lép. Bệnh khảm do SMV và BYMV
gây thiệt hại đáng kể về năng suất, chất lƣợng và sản lƣợng hạt đậu tƣơng.
Năng suất đậu tƣơng có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus trƣớc khi
ra hoa và 91% hạt đậu thu đƣợc có vết lốm đốm, chất lƣợng kém [87]. Việc
nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ
[95].
Hiện nay, trong sản xuất đậu tƣơng chủ yếu mới dừng ở biện pháp
phòng mà vẫn chƣa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV. Do đó các
biện pháp phòng bệnh bao gồm chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh

đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dƣ cây bệnh trên đồng ruộng, diệt
trừ côn trùng truyền bệnh. Tuy nhiên, các biện pháp trên thƣờng có hiệu quả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

2

thấp và tốn nhiều công sức. Biện pháp có hiệu quả nhất để phòng hai loài SMV
và BYMV là sử dụng các giống đậu tƣơng kháng bệnh, nhƣng nguồn giống
đậu tƣơng kháng bệnh tự nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế. Chính
vì vậy hƣớng tiếp cận tạo cây đậu tƣơng chuyển gen kháng virus đƣợc quan
tâm nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây
bệnh theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi).
RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại và có hiệu quả đƣợc ứng dụng
để kháng lại các loài virus gây bệnh ở thực vật. Dựa trên nguyên lý bất hoạt
gen sau phiên mã, một số tác giả đã ứng dụng thành công kỹ thuật RNAi
trong chiến lƣợc tạo cây chuyển gen kháng virus [3], [31], [98].
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập
đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen
mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
Tạo đƣợc dòng cây chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm trên cây
đậu tƣơng bằng kỹ thuật RNAi.
2.2. Mục tiêu cụ thể
(i) Xác định đƣợc trình tự đoạn gen CP từ SMV gây bệnh khảm ở cây đậu
tƣơng Việt Nam.
(ii) Phát triển đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa
CPi

SMV và

gen

.

(iii) Tạo đƣợc cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng
kháng SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng

;

(iv) Tạo đƣợc cây đậu tƣơng chuyển gen mang cấu trúc RNAi .

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

3

3. Nội dung nghiên cứu
(1) Nghiên cứ

.

.
(2) Nghiên cứu phát triển vector
gen CPi của

hai loài SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway.

CPi đã thiết kế vào A.

tumefaciens.
(3) Nghiên cứu b

. Phân tích sự có

CPi

.
(4) Nghiên cứu thử nghiệm ch

u tƣơng thông

RNAi

qua A. tumefaciens

CPi

trên cây đậu tƣơng chuyển gen.
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Đoạn gen CP đƣợc phân lập từ SMV dòng SL1 và S
nucleotide,

720

240 amino acid. Hai trình tự đoạn gen CP của SMV đã

đƣợc đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103.

4.2. Phát triển

mang cấu trúc

.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

4

19

RNAi
.

DT2008, thu

5

n gen

12

19

2008.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Về khoa học
Việc phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc gen RNAi

chứa đoạn gen CPi

SMV,

tạo đƣợc cây thuốc lá chuyển gen có tính kháng đối với SMV

BYMV

và BYMV cao hơn cây đối chứng

đã khẳng định cơ sở

khoa học và tính hiệu quả của biện pháp sử dụng các gen có nguồn gốc từ
chính loài virus gây bệnh để chuyển vào cây trồng nhằm tạo cây chuyển gen
kháng virus theo nguyên lý của kỹ thuật RNAi.
Năm bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ quốc tế và
trong nƣớc cùng với 2 trình tự gen đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế là
những tƣ liệu có giá trị tham khảo

.

5.2. Về thực tiễn
Kết quả lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A.
tumefaciens) tái tổ hợp vào mô đậu tƣơng đã tổn thƣơng và tái sinh thành
công cây đậu tƣơng chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của
SMV và BYMV đã cho thấy khả năng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen và kỹ
thuật RNAi trong chọn tạo giống đậu tƣơng ở Việt Nam.
Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen CPi của SMV và
BYMV theo nguyên lý kỹ thuật RNAi để tạo đƣợc cây chuyển gen đối với
thuốc lá và đậu tƣơng đã khẳng định hƣớng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật

RNAi và mở ra triển vọng

trong thực tiễn chọn giống cây trồng

.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

5

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH KHẢM DO VIRUS Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG
1.1.1.

ệnh virus ở cây đậu tƣơng
Cây đậu tƣơng có tên khoa học là Glycine max (L.) Merill (2n = 40)

thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bƣớm (Papilinoideae). Đậu tƣơng là
loại cây trồng quan trọng bởi giá trị dinh dƣỡng và giá trị cải tạo đất. Hạt đậu
tƣơng chứa khoảng 40% protein, 20% lipid và chứa nhiều chất quan trọng cho
hoạt động sinh lý của cơ thể ngƣời và động vật, nhƣ: isoflavone, lecithin,
tocopherol và saponin. Thêm nữa hạt đậu tƣơng còn chứa nhiều protein chức
năng và là nguồn thực phẩm rẻ tiền, có vai trò trong chăm sóc và bảo vệ sức
khỏe con ngƣời [149], [158]. Các sản phẩm từ đậu tƣơng đã tăng lên đáng kể
so với các loại cây trồng khác do nhu cầu về protein và dầu [82].
Cây đậu tƣơng là cây trồng cạn ngắn ngày, lấy hạt và thuộc nhóm cây
hàng năm. Rễ của cây đậu tƣơng là loại rễ cọc, gồm rễ chính và các rễ bên. Rễ

tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm, ăn lan khoảng 20 – 40 cm. Trên rễ có
nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm
[1]. Thân cây đậu tƣơng ít phân cành, cây thảo, dạng bụi, có hình trụ, nhiều
lông, mang nhiều đốt, thân thƣờng đứng, có khi dạng bò hay nửa bò. Cành đậu
tƣơng mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá
mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang
một lá kép. Đậu tƣơng là cây tự thụ phấn, hoa lƣỡng tính, hoa đƣợc phát sinh từ
nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa thuộc hoa cánh bƣớm, mọc thành chùm,
có màu tím hay trắng, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn
tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hƣởng phối hợp của ánh sáng
và nhiệt độ [1], [2]. Quả đậu tƣơng là loại quả giáp, bên ngoài vỏ quả thƣờng
có lớp lông bao phủ, màu sắc vỏ khi chín có màu vàng hoặc xám đen. Quả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

6

thẳng hoặc hơi cong. Mỗi quả thƣờng có từ 1 - 4 hạt nhƣng phổ biến là 2 hạt.
Hạt đậu tƣơng có nhiều hình dạng nhƣ bầu dục, tròn dài, tròn dẹt. Vỏ hạt
thƣờng nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen… nhƣng đa số là
hạt màu vàng. Khối lƣợng hạt dao động từ 200 – 400 mg/hạt và khối lƣợng
1000 hạt dao động trung bình 100-200g. Hình dạng và màu sắc rốn hạt là dấu
hiệu đặc trƣng cho mỗi giống đậu tƣơng [1], [2].
Với những giá trị kinh tế và giá trị sử dụng, đậu tƣơng đƣợc xem là loại
cây trồng chiến lƣợc của nhiều quốc gia trên thế giới, với vị trí đứng thứ tƣ
chỉ sau lúa, ngô và lúa mỳ. Ở Việt Nam, cây đậu tƣơng đƣợc trồng từ rất lâu
và nhu cầu tiêu thụ đậu tƣơng cũng rất lớn, nên sản xuất đậu tƣơng trong nƣớc
đang đƣợc chú trọng. Đậu tƣơng đƣợc trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp, ở 28
tỉnh

nh trên khắp cả nƣớc, trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam.

Cây đậu tƣơng

nƣớc ta đƣợc trồng

ở vùng cao, những nơi đất

không cần màu mỡ (khoảng 65%) và 35% đƣợc trồng ở những vùng đất thấp,
ở khu vực đồng bằng sông Hồng. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, từ năm
2011 đến 2014, năng suất

diện tích trồng và sản

lƣợng đậu tƣơng

2011

1.1). Nguồn giống đậu tƣơng kháng bệnh và chống chịu cao là một
trong các nguyên nhân chính có thể giải thích cho sự phát triển chậm của
ngành sản xuất đậu tƣơng ở nƣớc ta. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng công nghệ
sinh học nhằm cải thiện tính kháng bệnh của cây đậu tƣơng là cách tiếp cận
mới, có hiệu quả đối với ngành chọn giống đậu tƣơng hiện nay.
ản lượng đậu tương

2014

2011

2012

2013

2014*

181,1

119,6

117,8

120

Năng suất (tấn/ha)

1,47

1,45

1,43

1,47

Tổng sản lƣợng (nghìn tấn)

266,9

173,7

168,4

176,4

(nghìn ha)

Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn;
.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

7

Cây đậu tƣơng có thể mắc một số bệnh do vi khuẩn, nấm hoặc virus,
nhƣ bệnh khảm do SMV hoặc BYMV, bệnh gỉ sắt hại đậu tƣơng do nấm
Phakopsora

pachyrhizi,

bệnh

Sƣơng

mai

(đốm

phấn)

do

nấm

Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc
Fusarium solani fsp. Phaseoly, bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tƣơng và một số
bệnh hại khác. Thống kê trên thế giới cho thấy có hơn 100 loại virus gây hại
trên cây đậu tƣơng. Bệnh virus đậu tƣơng phân bố rộng khắp và gây thiệt hại
lớn đến năng suất và chất lƣợng sản phẩm. Tại những nơi bị nhiễm bệnh
nặng, năng suất có thể bị giảm đến 50% ở ngoài đồng, mức giảm có thể lên
đến 93% - 95%

lây nhiễm trong thí nghiệm [17]. Một số nƣớc

có tỷ lệ thiệt hại lớn do bệnh virus ở đậu tƣơng, nhƣ vùng Georgia ở Mỹ
(37%), Australia và Thái Lan (60%), New Zealand và khu vực Bắc Mỹ (4050%) [28], [80], [158].
Bệnh khảm đậu tƣơng do virus nhóm khảm (Potyvirus) gây ra. Bệnh
đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1900 và đến nay virus khảm đậu
tƣơng đã có mặt hầu hết ở các vùng trồng đậu tƣơng trên thế giới [80]. Việt
Nam cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu tập trung
ở những vùng trồng đậu tƣơng lớn, nhƣ khu vực trung du, miền núi
khu vực Đồng Bằng Sông Hồng

,

Tây Nguyên [1], [12].

Các nhà khoa học đã xác định có một số loài virus đặc biệt nguy hiểm,
gây hại trên cây đậu tƣơng, trong đó có SMV và BYMV [17], [73]. SMV là
loài virus gây bệnh khảm ở cây đậu tƣơng, thuộc nhóm Potyvirus, họ

Potyviridae, và là một trong những virus chủ yếu nhất gây bệnh ở cây đậu
tƣơng

bệnh xảy ra trên toàn thế giới [44]. SMV gây thiệt hại đáng kể về

năng suất, thậm chí ở một số trƣờng hợp tổn thất có thể lên đến 94% tổng sản
lƣợng đậu tƣơng. Những cây đậu tƣơng bị nhiễm SMV thƣờng
bị nhiễm ở giai
đoạn muộn sẽ làm giảm sản lƣợng và chất lƣợng hạt [85] [86]. Họ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

8

Potyviridae đƣợc biết đến là có số lƣợng loài lớn nhất trong các loài virus gây
bệnh ở thực vật. Nếu nhiễm Potyvirus và các loài virus khác thì thiệt hại về
năng suất và chất lƣợng hạt đậu tƣơng tăng lên gấp bội [32], [145]. Những
cây bị nhiễm Potyvirus cũng dễ bị nhiễm nấm gây bệnh hơn [145]. SMV có
thể lây nhiễm qua hạt với tỷ lệ trung bình là 10% và thay đổi theo chủng
virus, kiểu gen thực vật

thời gian bị nhiễm [104].

Phản ứng khác biệt của giống về sức đề kháng với SMV
cây đậu tƣơng mẫn cảm với bệnh khảm hoặc khảm hệ thống (S),
chết hoại (N), và không có triệu chứng hoặc kháng (R).

ƣợc

Cho và Goodman (1982) sử dụng để phân loại SMV thành các nhóm, chủng
SMV từ G1 đến G7 [49].
BYMV là loài virus cũng thuộc nhóm Potyvirus, có thể tìm thấy ở các
cây thuộc họ đậu đỗ (đậu tƣơng, lạc, đậu xanh, đậu đen, …) và một số loài thực
vật khác [28], [80]. Khi cây đậu tƣơng nhiễm BYMV sẽ xuất hiện những vết
khảm và đƣờng biến vàng ngoằn ngoèo trên bề mặt lá, làm cây không phát
triển đƣợc và dẫn tới bị chết. Bệnh khảm vàng do BYMV cũng gây thiệt hại
đáng kể về năng suất và chất lƣợng hạt, đặc biệt đối với các cây đậu đỗ, trong
đó có đậu tƣơng [137]. Khi cây đậu tƣơng bị nhiễm BYMV, năng suất hạt bị
giảm

một số trƣờng hợp có thể giảm tới 74% - 80% [96].
Đối với cây đậu tƣơng, SMV và BYMV có thể nhiễm đồng thời trên

cùng một cây và triệu chứng rất khó phân biệt. Ảnh hƣởng của việc nhiễm
cùng lúc nhiều loại virus khác nhau dẫn tới năng suất đậu tƣơng có thể bị giảm
từ 66% - 80% [80], [91]. Bằng các quan sát thực địa nhóm tác giả ở Ukraine
đã xác định đƣợc triệu chứng nhiễm hai loại SMV và BYMV ở đậu tƣơng
vùng Cherkassy, Vinnitsa, Kiev và kết quả đã đƣợc xác nhận bằng kính hiển
vi điện tử và kỹ thuật ELISA [103]. Trên cơ sở phân tích gen và thiết lập cây
phát sinh loài một số tác giả cho rằng BYMV phân lập từ các vùng thuộc Cộng
hòa Séc đƣợc phân bố ở ba nhóm trên sơ đồ hình cây và không phụ thuộc vào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

9

cây chủ [142]. Phản ứng của cây đậu tƣơng đối với SMV và BYMV phụ
thuộc vào kiểu gen của giống, chủng virus, tuổi cây, thời gian lây nhiễm,

nhiệt độ không khí và các điều kiện môi trƣờng khác [41].
1.1.2. Sự xâm nhập của SMV và BYMV vào tế bào đậu tƣơng
SMV và BYMV có thể xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào đậu tƣơng hoặc
có thể xâm nhiễm qua môi giới trung gian là rệp. Virus và cơ thể côn trùng có
mối quan hệ sinh học với nhau, virus có thể tiềm ẩn một thời gian dài trong cơ
thể côn trùng, qua tuyến nƣớc bọt để đi vào hệ thống tiêu hoá thấm qua thành
ruột vào máu rồi trở lại tuyến nƣớc bọt. Sau giai đoạn tiềm ẩn, virus đƣợc
nhân lên trong cơ thể côn trùng và ở thời điểm này côn trùng có khả năng
truyền bệnh một cách nhanh chóng. Tuy nhiên khả năng truyền bệnh của côn
trùng cũng có những hạn chế do tuổi của côn trùng thƣờng rất ngắn [12], [13].
SMV có khả năng xâm nhập vào tế bào qua các vết thƣơng nhẹ do cọ
xát giữa các cây với nhau, hoặc còn có thể truyền bệnh trong trƣờng hợp hạt
phấn bị nhiễm virus rơi vào noãn của cây. SMV di chuyển trong tế bào chất
và có thể di chuyển sang tế bào khác thông qua các sợi liên bào. Sau 3 ngày
virus mới nhiễm hết một lá đơn, sau 4 ngày thì mới nhiễm hết đoạn gân của
lá kép và một phần đoạn thân sát gốc [80], [145]. Sau 5 ngày virus nhiễm hết
dọc thân chính và các lá ngọn, khoảng sau 25 ngày virus có thể nhiễm trên
toàn bộ cây. Virus có thể nhiễm qua nhân giống vô tính, qua hạt giống, qua
phấn hoa, hoặc qua côn trùng [108]. Cách thức truyền virus gây bệnh qua
trung gian làm cho cây đậu tƣơng có khả năng nhiễm bệnh rất cao, khi cây
trƣởng thành có thể bị nhiễm virus từ 90 - 100% ở các mức độ biểu hiện
bệnh khác nhau [80], [161].
SMV và BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần chính là
protein (60 - 95%) và nucleic acid (5 - 40%) [80], [91]. Hệ gen

SMV và

BYMV là RNA sợi đơn dƣơng (RNA (+)). Đời sống của Potyvirus sau khi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

10

xâm nhập vào các tế bào chủ qua mô tổn thƣơng bao gồm quá trình dịch mã,
xử lý polyprotein, nhân lên của mRNA, quá trình lắp ráp RNA và protein vỏ
thành hạt virus và di chuyển đến các tế bào khác, tới các bộ phận của cây và
các cây khác [145]. Quá trình xâm nhiễm của SMV và BYMV cùng với quá
trình nhân lên của RNA đƣợc mô tả ở hình 1.1.

Hình 1.1. Sơ đồ mô phỏng quá trình xâm nhiễm
BYMV vào tế bào cây đậu tương

của SMV và

1. Virus xâm nhập vào tế bào qua màng; 2. Phân tử RNA (+) của virus được giải phóng
vào nhân tế bào chủ; 3. RNA (+) virus làm khuôn để tổng hợp sợi RNA(-); 4. RNA (-) phiên
mã tổng hợp mRNA; 5. mRNA dịch mã tạo các protein của virus; 6. RNA(-)

t

các RNA (+) tức hệ gen virus; 7. Các phân tử RNA(+) kết hợp với protein vỏ tạo thành
các virus mới; 8. Virus phá vỡ màng tế bào ra ngoài và xâm nhiễm vào các tế bào khác.

1.1.3. Hệ gen của SMV và BYMV
1.1.3.1. Đặc điểm hệ gen của SMV, BYMV và Potyvirus
Các Potyvirus có dạng thanh, khúc khuỷu dài khoảng 750 nm và đƣờng
kính là 11-15 nm và bao gồm các protein vỏ đƣợc sắp xếp đối xứng, xoắn ốc
xung quanh phân tử RNA sợi đơn dƣơng có khoảng 10.000 nucleotide. Hệ gen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

11

RNA có đầu 3‟gắn đuôi poly A và một protein virion kết nối gen (VPg) ở đầu
5‟. RNA virus đƣợc dịch mã
protease

một polyprotein đƣợc phân cắt bởi

ít nhất 10 phân tử protein [93].

Các gen trong hệ gen của virus đang đƣợc sử dụng ngày càng nhiều để
phân tích các loài virus và các chủng virus khác nhau. Jayaram và đtg (1992)
đã lập bản đồ và xác định trình tự nucleotide của các chủng SMV G2 và G7
và trình tự CP của của một số chủng SMV cũng đƣợc mô tả [93]. Các vùng
trong hệ gen của các Potyvirus chứa hầu hết các gen mã hóa protein thể vùi ở
dạng hình trụ (Cl), gen RNA polymerase - phụ thuộc- RNA (POL hoặc Nib
và gen protein vỏ (CP) [93], [132]. Các protein 21K và 27K ở SMV là giống
nhƣ protein NIa ở TEV và VPg, NIa, PI, P3 và HC-Pro là các loại protein
chịu trách nhiệm về hoạt động xử lý protein sau khi đƣợc tổng hợp [61], [93].
Nghiên cứu của Jayaram & đtg (1992)

lƣu ý rằng sự khác biệt lớn

nhất về trình tự NIa giữa các dòng SMV G2 và G7 biểu hiện ở vùng đầu 5'
của hệ gen virus, chủ yếu ở ở các gen PI, P3, Cl và HC - Pro của hệ gen
virus [93]. Kim & đtg đã sử dụng enzyme giới hạn EcoRI để cắt các sản
phẩm RT-PCR của gen Cl phân lập từ SMV và phân biệt đƣợc năm chủng

(G5H, G5, G3, G6 và G7) [102]. Các chủng gây bệnh đốm vòng đu đủ
Potyviruses và virus khảm xà lách cũng đã đƣợc phân loại bằng cách sử
dụng enzyme giới hạn [35], [109].
Hệ gen của SMV gồm các gen mã hóa 3066 amino acid trong 10
chuỗi polypeptid: P1 proteinase (P1), Helper component proteinase (HC-pro),
Protein P3 (P3), 6 kDa protein 1(6K1), Cytoplasmic inclusion protein (CI), 6
kDa protein 2 (6K2), Protein liên kết hệ gen virus (VPg), Nuclear inclusion
protein A (NIa), Nuclear inclusion protein B (NIb), Capsid protein (CP) (Hình
1.2). Hệ gen của BYMV gồm các gen mã hóa 3056 amino acid, và cũng gồm
10 chuỗi polypeptid giống nhƣ ở SMV [182].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>