Định tính salmonella trong thực phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Tên đề tài:

ĐỊNH TÍNH SAMONELLA TRONG
THỰC PHẨM
GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Lớp:

02ĐHTP1

Nhóm:

4

Tp.HCM , ngày 14 tháng 5 năm 2014


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm

MỤC LỤC

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC

1.

-

Công việc

Đánh giá

Tìm kiếm tài liệu
Làm word
Thuyết trình

Tích cực

Chữ kí

2


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
-

Tìm kiếm tài liệu
Làm word
Thuyết trình

-

Tìm kiếm tài liệu
Làm powerpoint
Thuyết trình

Tích cực

4.

-

Tìm kiếm tài liệu
Thuyết trình

Tích cực

5.

-

Tìm kiếm tài liệu
Thuyết trình

Tích cực

2.

3.

Tích cực

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trở nên cấp thiết,
các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Đã có nhiều
cảnh báo, nhưng tình trạng ngộ độc thực phẩm vẫn đang leo thang và ngày càng nghiêm

trọng.
3


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
Có rất nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ như Clostridium butolinum,
Escherichia Coli, Listeria monocytogenes… trong đó, Salmonella là loài vi sinh vật gây
ngộ độc rất nguy hiểm. Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây ra bệnh thương hàn,
nhiễm trùng huyết và nhiều bệnh nghiêm trọng khác.
Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu về độc tố, khả năng gây bệnh và cách phát hiện
cũng như cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella, chúng tôi thực hiện nghiên
cứu đề tài “định tính samonella trong thực phẩm” để có cái nhìn tổng quan hơn về vi
khuẩn Salmonella và một số chủng vi sinh vật khác.

NỘI DUNG
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VỀ SALMONELLA
1.1.

Lịch sử phát hiện

Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả
và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó Schweinittz
và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loại vi rút gây nên và đã xác định
S.choleraesuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn.
4


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm

Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông
gọi vi khuẩn này là Bacillus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là
S.enteritidis. Vi khuẩn này cũng được gọi bằng nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis,
Bacillus gartner…
Năm 1889 Klein phân lập được S.gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được
S.pullorum năm 1909. Trước đây người ta cho rằng đây là hai loại vi khuẩn gây ra hai
bệnh khác nhau lên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà (Typhus avium) và căn bệnh
có tên chung là S.gallinarum–pullorum.
Năm1896 C.Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn S.paratyphi equi
và S.paratyphi bacilus. Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên là S.paratyphi Bvà đến năm
1898,S.paratyphi Ađã tìm được do N.Guyn và H Keyser.

Vi khẩn Salmonella
1.2.

Phân loại Salmonella theo loài và theo kiểu huyết thanh.

-

Về phân loại khoa học Salmonella được
xếp vào:
Giới : Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gramma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Giống:Salmonella lignieres1900

•
•

•
•
•
•

5


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
Các loài điển hình:
 Salmonella typhi: Gây bệnh thương hàn

Hình 1.2. Vi khuẩn Salmonella typhi




Salmonella cholera_suis: Gây bệnh nhiễm trùng máu

Hình 1.3. Vi khuẩn Salomonella cholera_suis
Salmonella entertidis: Gây rối loạn tiêu hóa
•
•
•
•
•
•
•
Hình 1.4. Vi khuẩn Salmonella entertidis

6


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng của chúng như
S.typhi hay S.paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thương hàn, para = phó), hoặc theo vật
chủ như S.typhimurium gây bệnh ở chuột,về sau người ta thấy rằng 1 loài Salmonella có
thể gây ra nhiều hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài khác nhau. Vì những lý
do đó mà các chủng Salmonella mới phát hiện được đặt tên theo nơi mà nó được phân lập
như S.teheran,S.congo,S.london.
Hiện nay theo phân loại của hệ thống Viện Pasteur thế giới, Trung tâm Kiểm soát
và ngăn ngừa dịch bệnh của Mỹ CDC (Control and Prevent Disease Center), giống
Salmonella được chia làm hai loài: S. enterica và S. bongori. Trong đó S. bongori gồm tất
cả các kiểu huyết thanh (serotype) của loài phụ số V, và S. enterica được chia làm 6 loài
phụ đánh số: I, II, IIIa, IIIb, IV và VI .Các loài và loài phụ này có thể phân biệt được
bằng phản ứng sinh hóa. Trong mỗi loài phụ có nhiều kiểu huyết thanh.
Cho đến nay đã xác định được trên 2463 kiểu huyết thanh thuộc giống Salmonella.
Theo hệ thống của Kauffman White, các kiểu huyết thanh này được chia dựa trên kháng
nguyên thân O, kháng nguyên tiêm mao H và kháng nguyên bề mặt Vi. Phần lớn các kiểu
huyết thanh được đặt tên theo công thức kháng nguyên, một số khác được đặt tên riêng
như Enteritidis (S. enteritidis), Typhi (S. typhi), Paratyphi (S. paratyphi), Typhimurium
(S. typhimurium)…
Bảng phân loại Salmonella theo loài và theo kiểu huyết thanh
Loài
S. enterica

S. bongori

Loài phụ
S. enterica enterica (I)
S. enterica salamae (II)
S. enterica arizonae (IIIa)
S. enterica diarizonae (IIIb)
S. enterica houtenae (IV)
S. enterica indica (VI)

Số kiểu huyết thanh
1454
489
94
324
324
12

(V)

20

Loài phụ S. enterica I hầu như chiếm đa số (99%), nó được tìm thấy ở hầu hết
các động vật máu nóng. Loài phụ này chiếm 59% (1454/2463) trong tổng số kiểu huyết
thanh của Salmonella có khả năng xâm nhập và gây nhiễm cao cho người và động vật
máu nóng, trong khi đó các loài phụ khác hầu như ở động vật máu lạnh và môi trường.
Như vậy có tới 41% (1009/2463) số kiểu huyết thanh không được phân lập từ bệnh phẩm
7


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm

của người, đây là một tỉ lệ rất có ý nghĩa để các cơ quan chức năng xem xét và sữa đổi
các tiêu chuẩn hiện hành về Salmonella trong thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho các
nhà sản xuất tiêu thụ thực phẩm.
1.3.

Đặc điểm

1.3.1. Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy
Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý kích thước trung bình
từ 0,5-3 µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S. gallimarum và S. pullorum, không tạo bào
tử, chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 6 0C – 45,60C, thích hợp nhất ở 370C, phát triển trong
pH 4.1- 9.0. Ở nhiệt độ từ 180C – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày.
Salmonella phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên môi
trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ. Có thể mọc trên những môi trường có
chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine
deoxycholate).Trong đó môi trường XLD ít chất ức chế hơn nên thường được dùng để
phân lập Salmonella.
Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có
tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu
đỏ.

1.3.2. Tính chất hóa sinh
Salmonella lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men
saccharose, lactose, salicin và inositol, không sinh indole, không phân giải ure, không có
khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H 2S,sử dụng được
citrate ở môn trường Simmons.
Tuy nhiên không phải loài Salmonella nào cũng có những tính chất trên, các ngoại
lệ được xác định là S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate
trong môi trường Simmon, hầu hết các chủng S.paratyphi và S.Cholerasuis không sinh
H2S, khoảng 5% các chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống lại E.Coli,

Shigella và ngay cả 1 số chủng Salmonella khác.
1.3.3. Cấu trúc của Salmonella

8


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể
thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của sự
kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiên mao H và kháng nguyên vỏ
K. Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên Vi (Virulence) là yếu tố chống thực
bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu.
Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O).
• Thành phân cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp. Trong cùng là một lớp
peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài (outer
membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide.
• Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết định độc tố của Nội
độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu. Kháng nguyên của
nội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide (LPS). Tính đặc hiệu của kháng
nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau : kháng nguyên O ngoài
LPS còn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch của nó mạnh hơn LPS.
Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp
trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8- 10 nm gồm 3 thành phần :
Lipid A, polysaccharide lõi, kháng nguyên O. Màng ngoài còn có thêm các protein:
Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho
phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ. Protein
màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài.
Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài .
-

Kháng nguyên tiên mao (kháng nguyên H)
- Kháng nguyên H: Chỉ có ở các Salmonella có lông. Hầu hết Salmonella đều có lông chỉ
trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm. Kháng nguyên H là một loại kháng
nguyên có bản chất là protit, kém bền hơn kháng nguyên O. Kháng nguyên H rất dễ bị
phá huỷ ở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng cồn, axit yếu.
• Kháng nguyên H chia làm 2 phase :
 Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông được biểu thị bằng
chữa số La tinh thường: a, b, c…
 Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với các loại khác đôi khi
thành phần này có thể gặp ở E.coli. Pha 2 gồm có 6 loại được biểu thị bằng chữa số Ả
Rập 1-6 hay chữa số La Tinh e, n, x…
• Kháng thể kháng kháng nguyên H ngưng kết vi khuẩn bởi các roi của chúng. Sự ngưng
kết này sẽ tạo thành những mảng kết tụ, chúng có thể bị tách bởi các yếu tố có khả năng
cắt roi của vi khuẩn.
•

9


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
Kháng nguyên H không có tác dụng gây bệnh, không gây miễn dịch, nó đặc hiệu cho các
loài vi khuẩn dựa vào kháng nguyên H để phân loại bằng phương pháp huyết thanh.
Kháng nguyên vỏ K
• Kháng nguyên K: là kháng nguyên nằm ngoài kháng nguyên O và là nơi biểu hiện độc tố,
được cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, thường kết hợp với tính gây
độc chuyên biệt cho vật chủ. Nó ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên O khi nó phát
triển nhiều, ổn định với nhiệt độ, cồn và HCl.
• Không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ là kháng nguyên Vi và cũng có ở 2 type huyết

thanh S.typhi và S.paratyphi. Kháng nguyên Vi-angtigen được Felix và các cộng sự phát
hiện năm 1935. Kháng nguyên Vi gây hiện tượng ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt
vỏ, kháng nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O, khánh
nguyên Vi không tham gia vào quá trình gây bệnh.
•

Vị trí của các kháng nguyên của Salmonella
1.3.4. Yếu tố độc lực

-

Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố.
Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét, độc tố ở
ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật.
Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt
vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy truyền như vậy từ 5 đến 10
lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại
10


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố tác động
vào thần kinh và ruột.
1.3.4.1.

Nội độc tố - Endotoxin

Màng ngoài tế bào vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn Salmonella nói riêng,
được cấu tạo bởi thành phần cơ bản là lipopolysaccharide (LPS). LPS có cấu tạo phân tử

lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với đặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưa nước, vùng lõi
và vùng lipit A.
Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi polysaccharide chứa các đơn vị cấu trúc kháng
nguyên O. Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharide, ở trung tâm nối kháng
nguyên O với vùng lipit A. Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội độc tố của vi khuẩn.
Cấu trúc nội độc tố gần giống cấu trúc của kháng nguyên O. Cấu trúc nội độc tố biến đổi
sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của Salmonella.
Nội độc tố thường là lipopolysaccharide (LPS) được phóng ra từ vách tế bào vi
khuẩn khi bị dung giải. Trước khi thể hiện độc tính của mình, LPS cần phải liên kết với
các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm ba cầu B,
lâm ba cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu thực bào, tế bào gan, lách.Rất nhiều các cơ quan
trong cơ thể chịu sự tác động của nội độc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hoá,
hệ thống miễn dịch; với các biểu hiện bệnh lý: Tắc mạch máu, giảm trương lực cơ thiếu
oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hoá, mất tính thèm ăn…
Nội độc tố tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ, kích thích
hình thành kháng thể.
-

-

LPS tác động lên các tếbào tiểu cầu, gây sốt nội độc tố, theo cơ chế :
• Giải phóng các chất hoạt động mạnh như: Histamin.
• Ngưng kết các tiểu cầu động mạch.
• Đông vón, tắc mạch quản.
LPS tác động lên quá trình trao đổi gluxit: LPS làm tăng cường hoạt lực của các men
phân giải glucoz, các men phân giải glycogen, làm giảm hoạt lực các men tham gia quá
trình tổng hợp glycogen…
1.3.4.2.

Độc tố đường ruột

Về cơ chế miễn dịch và di truyền các Enterotoxin của Salmonella có quan hệ gần
gũi với Choleratoxin, nên được gọi là Choleratoxin like enterotoxin (CT). Còn về đặc

11


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
tính sinh học Enterotoxin của Salmonella không chỉ với giống CT mà còn giống với
Enterotoxin của E.Coli.
Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: Độc tố thẩm
xuất nhanh Rapid permeability facto (RPF) và độc tố thẩm xuất chậm Delayed
permeability facto (DPF).
RPF giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, nó thực hiện khả
năng thẩm xuất sau 1-2 giờ và kéo dài 48 giờ và làm trương các tế bào CHO (Chinese
Hamster Ovary cell). Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc, thành phần giống với độc tố
chịu nhiệt của E.Coli, được gọi là độc tố chịu nhiệt của Salmonella. ST có khả năng chịu
được nhiệt độ 1000C trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo quản ở nhiệt độ
-20oC. Cấu trúc phân tử gồm một chuỗi polysaccharide và một chuỗi polypeptide.
RPF kích thích co bóp nhu động ruột, làm tăng sự thẩm thấu thành mạch, phá huỷ
tổ chức tế bào biểu mô ruột, giúp vi khuẩn Salmonella xâm nhập vào tế bào và phát triển
tăng nhanh về số lượng. Vi khuẩn tích cực tăng cường sản sinh độc tố làm rối loạn cân
bằng trao đổi muối, nước và chất điện giải. Quá trình bệnh lý đường ruột và hội chứng
tiêu chảy càng thêm phức tạp và nghiêm trọng.
DPF của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi
khuẩn E.Coli, nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt của Salmonella. Nó thực hiện chức
năng phản ứng chậm từ 18-24 giờ. LT bị phá huỷở 70 0C trong vòng 30 phút vàở 56 0C
trong vòng 4 giờ. LT có cấu trúc gồm 3 chuỗi polypeptid.
DPF làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến tăng cường bài

xuất nước và chất điện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hoá lớp
tếbào villi của thành ruột, gây tiêu chảy.
1.3.4.3.

Độc tố tế bào

Khi cơ thể người và động vật bị tiêu chảy thì kèm theo hiện tượng mất nước và
mất chất điện giải là hiện tượng hàng loạt các tế bào biểu mô ruột bị phá huỷ hoặc bị tổn
thương ở các mức độ khác nhau. Sự phá huỷhay tổn thương đó là do độc tố tế bào
củaSalmonella gây nên, theo cơ chế chung là:Ức chếtổng hợp protein của tế bào
Eukaryotic và làm trương tế bào CHO.
Ít nhất 3 dạng độc tố của tế bào:
-

Dạng thứ nhất: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với trypsin. Dạng này được phát
hiện ở rất nhiều serovar Salmonella; có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 56 đến 78
12


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm

-

-

kDa; không bị trung hoà bởi kháng thể kháng độc tố Shigella toxin hoặc Shigella - like.
Độc tố dạng này tác động theo cơ chế là ức chế tổng hợp protein của tế bào Hela và làm
teo tế bào.
Dạng thứ hai: Có nguồn gốc từ protein màng ngoài tế bào vi khuẩn có cấu trúc và chức

năng gần giống các dạng độc tố tế bào do Shigella và các chủng (ETEC) sản sinh ra.
Dạng độc tố này cũng phổ biến ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh.
Dạng thứ ba: Có trọng lượng phân tử khoảng 62 kDa; có liên hệ với độc tố Hemolysin.
Hemolysin liên hệ với các độc tố tế bào có sự khác biệt với các Hemolysin khác về trọng
lượng phân tử và phương thức tác động lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào
nội bào.
1.3.5. Cơ chế gây bệnh
Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu tế bào
trong một gram thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói
mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụthực phẩm bị nhiễm cho đến khi các
triệu chứng được biểu hiện là 12 – 36 giờ. Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2 – 7
ngày. Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễmSamonella đều bị ngộ
độc. Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễmSamonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm
thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy sản. Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này
thường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. Đặc biệt nguy
hiểm cho người là các loàiSamonella typhi, S.paratyphi A, B, C gây sốt thương hàn.

Các chủng Salmonella và các biểu hiện bệnh thường gặp

13


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
1.3.5.1.

Cơ chế gây bệnh thương hàn

Bệnh thương hàn do S.typhi và S.paratyphi A, B, C gây ra. Các yếu tố độc lực
chính của vi khuẩn thương hàn là khả năng bám và xâm nhập vào tế bào chủ, khả năng

nhân lên trong đại thực bào và nội độc tố. Kháng nguyên Vi có mặt ở S.typhi và
S.pararatyphi C là yếu tố độc lực quan trọng, những chủng vi khuẩn gây bệnh thương hàn
không có kháng nguyên Vi thì số lượng cần thiết để gây bệnh cao hơn rấtnhiều so với
những chũng có kháng nguyên này.
Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa do thức ăn hay nước uống bị
nhiễm bẩn, số lượng cần thiết để gây bệnh vào khoảng 10 5 đến 10 7
Đầu tiên, vi khuẩn thương hàn phải vượt qua môi trường axit của dạ dày, mặc dù
chúng có khả năng đề kháng với axit nhờ có gen art (acid response tolerance), nhưng ở
người bình thường, vi khuẩn thương hàn không thể tồn tại lâu, nuôi cấy dịch dạ dày âm
tính sau 30 phút. Sau khi vượt qua được rào cản ở dạ dày, vi khuẩn di chuyển xuống ruột
non rồi nhân lên ở đó, nhưng trong tuần đầu sẽ có 1 ít vi khuẩn đào thải theo phân, cấy
phân dương tính trong 5 ngày không có nghĩa là bệnh thương hàn sẽ xảy ra. Từ ruột non,
vi khuẩn thương hàn đi vào hạch mạc treo ruột nhờ tế bào M, một đại thực bào của mảng
Peyer. Sau đó theo đường bạch huyết và máu gây nhiễm trùng toàn thân. Sau khoảng một
tuần, nhiễm khuẩn huyết thứ phát xuất hiện. Vi khuẩn theo gan qua đường mật lại tiếp tục
xâm nhập vào ruột non, tiếp tục nhân lên ở các mảng Peyer. Từ máu, vi khuẩn tới lách và
các cơ quan khác. Trong ruột non, vi khuẩn chết và giải phóng ra nội độc tố. Nội độc tố
kích thích dây thần knh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử chảy máu và có thể gây thủng ruột,
vị trí gây tổn thương thường nằm ở các mảng Peyer. Đây là biến chứng hay gặp ở cá bệnh
nhân ăn sớm khi chưa bình phục, nhất là ăn các thức ăn cứng. Nội độc tố theo máu lên hệ
thần kinh và kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất ba. Giai đoạn toàn phát
bệnh, bệnh nhân sốt cao, biểu đồ thân nhiệt tăng lên theo thởi gian. Thân nhiệt tăng
những nhiệt độ không tăng gây ra hiện tượng mạch và nhiệt độ phân ly.

14


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm

Thời kì chưa có điều trị bằng kháng sinh, khoản một tuần ủ bệnh, diễn biến điển
hình của bệnh thương hàn trải qua 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn khoảng một tuần, Tuần thứ
nhất thân nhiệt tăng cao, tuần thứ hai thì đau bụng, gan và lách to dồng thời có sự xuất
hiện của các đốm hồng trên da, tuần thứ 3 có thể xuất hiện thêm các biến chứng như xuất
huyết, thủng ruột, tuần thứ 4 sẽ xuất hiện thêm các biến chứng nguy hiểm dẫn đến tử
vong, nếu không bệnh nhân sẽbình phục.
Bệnh nhân thường đau đầu, buồn nôn hoặc nôn, chướng bụng, tiêu chảy, khoảng
50% bệnh nhân sờ thấy gan và lá lách dưới sườn. Những trường hợp nặng thường có dấu
hiệu ly bì, hôn mê, trụy tim mạch, không chữa trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong. Những
biến chứng khác như viêm phổi cấp, viêm màng não, viêm gan, viêm tủy xương cũng có
thể gặp.
Những bệnh nhân qua khỏi có khoảng 5 – 10% vẫn tiếp tục thải vi khuẩn qua phân
trong quá trình hồi phục và 1- 4% trở thành người mang vi khuẩn lâu dài do vi khuẩn vẫn
tồn tại trong túi mật. Tình trạng này có thể kéo dài đến nhiều năm và họ trở thành nguồn
mang bệnh rất nguy hiểm.
1.3.5.2.

Cơ chế gây nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn

Bênh thường xảy ra do ăn phải thức ăn bị nhiễm Salmonella, nhưng cũng có thể
lây truyền trực tiếp. Căn nguyên thường do vi khuẩn S.enteritidis và S.typhimurium.
15


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
Vi khuẩn xâm nhập qua ruột non nhờ các tế bào M của mảng Peyer. Trên bộ gen
của Salmonella có các tác nhân gâyức chế các chất kháng khuẩn có trong lysosome, biến
đổi tế bào chủ đảm bảo cho sự tồn tại của vi khuẩn, làm cản trở hoạt động nội bào như
giảm lượng NADH oxidase rất cần thiết cho việc sản xuất các hợpchất kháng khuẩn.

Sự hủy hoại của đại thực bào và các tế bào biểu mô lân cận, sự chết của vi khuẩn
giải phóng nội độc tố đã gây nên tổn thương cho cơ thể vật chủ và gây ra các triệu chứng.
Thời gian ủ bệnh trung bình từ 10 – 48 giờ. Sau thời gian ủ bệnh, người nhiễm
thường có biểu hiện như sốt, nôn, đau bụng và tiêu chảy. Mức độ sốt khác nhau tùy vào
thể trạng từng người, tiêu chảy phân thường không có máu. Ở người lớn thường chỉ dẫn
đến tình trạng rối loạn đường tiêu hóa, nhưng ở trẻ sơ sinh thường gây ra nhiễm trùng rất
nặng, có thể dẫn đến tình trạng nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não và viêm xương. Ở
những người khỏe mạnh, nhiễm trùng do nhiễm độc thức ăn thường tự khỏi sau 2-5 ngày
rồi tự khỏi.
1.3.6. Nguồn gốc lây nhiễm
Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn. Tất cả các thức ăn
tươi sống có nguồn gốc động vật đều có thể là nguồn vi khuẩn Salmonella. Vi khuẩn này
sống tự do trong ruột động vật và có trên lông. Gia cầm có nhiều Salmonella nhất, tiếp
theo là các động vật nuôi trong nhà và động vật hoang (vẹt, rùa, chó, ếch, chim mông
biển, loài gặm nhấm, rắn). Vi khuẩn này có thể có trong thành phần dẫn xuất các chất từ
động vật như gelatin hoặc nước bọt động vật, bởi côn trùng, loài gặm nhấm, chim hoặc
các sản phẩm thịt nhiễm khuẩn gây nhiễm vào thực phẩm.
Ngoài ra có thể bị nhiễm từ người khỏe mạnh có mang vi khuẩn này. Thực phẩm
có nguồn gốc thực vật ít có nguy cơ nhiễm khuẩn. Vì lí do bị ức chế bởi pH < 4 và có mặt
vi khuẩn lactic nên các sản phẩm lên men ít bị nhiễm. Trứng và các sản phẩm trứng ví dụ
như bột nhào, nước sốt mayonnaise, protit đông tụ tách từ sữa, gia cầm là nguồn mang
nhiều Salmonella, nên trứng của nó cũng bị nhiễm vì vi khuẩn này có thể xuyên qua vỏ
trứng và sinh sản trong lòng đỏ trứng.
Các sản phẩm sữa như sữa không thanh trùng, phomát từ sữa tươi, kem chất béo
sữa, và các sản phẩm từ sữa nói chung được chế biến từ các nông trại, các thiết bị đều có
thể gây nhiễm vào nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi choSalmonella, và từ đó gây
nhiễm độc cho sản phẩm sữa. Nếu tiến hành axit hóa chậm thì vi khuẩn dễ dàng sinh sản
trong phomát nhưng nó bị phá hủy với pH < 4,5. Những sản phẩm có sữa phải được giám
sát chặt chẽ bởi chúng không được thanh trùng nữa, vì vậy nếu cóSalmonella trong sữa
16

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
bột thì chúng vẫn có thể sinh sản được bởi chúng có khả năng tồn tại ở điều kiện khô hạn
và lây nhiễm sang các sản phẩm khác
1.3.7. Tình hình nhiễm Salmonella trong nước và trên thế giới
1.3.7.1.

Trên thế giới

Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở châu Âu giảm đều đặn từ những năm 1990 trở lại đây,
trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người được phát hiện, sự
sai lệch của báo cáo này là rất lớn, số lượng thực tế rất có thể gấp 10 lần như thế. Ở Mỹ,
tình trạng có khá hơn, ổn định ở mức 15 ca trên 100.000 người từ năm 2001 do kiểm soát
tốt Salmonella trong thực phẩm từ năm 1990, bao gồm các thực phẩm sữa, trứng, nước
trái cây, sản phẩm tươi sống, rau, bánh kẹo, và đặc biệt là thịt. Một đợt dịch gần đây ở
Mỹ gây ra bởi S.typhimurium nhiễm trong bơ đậu phộng đã gây ảnh hưởng đến hơn 700
người trên khắp nước Mỹ
Từ tháng 7/2009 tới nay, số ca nhiễm khuẩn Salmonella được phát hiện ở Mỹ đã
tăng lên 184 người, thuộc 38 bang khác nhau. Cơ quan y tế của nước này vẫn chưa xác
định nguyên nhân chính xác khiến số ca nhiễm khuẩn Salmonella tăng nhanh như vậy.
Tuy nhiên, mới đây các chuyên gia y tế của bang Oregon cho rằng nguồn lây lan vi khuẩn
Salmonella từ các sản phẩm xúc xích.Vừa qua, các cơ quan điều tra Mỹ đã thu hồi hơn
560 tấn xúc xích do nghi bịnhiễm vi khuẩn Salmonella, tất cả số lượng này đều do Công
ty Daniele International sản xuất.Tuy nhiên, ông Jason Maloni, phát ngôn viên của công
ty này khẳng định: “Chưa có bằng chứng nào chứng minh các sản phẩm xúc xích của
chúng tôi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella”. Sự bùng nổ của số ca nhiễm khuẩn Salmonella
ở khu vực tây bắc Thái Bình Dương đã khiến các cơ quan điều tra nghi ngờ rằng nguồn
gây bệnh cho ổ dịch này là từ các sản phẩm xúc xích sau khi họ phát hiện rất nhiều người

ăn xúc xích mua tại các cửa hàng ở khu vực này bị nhiễm khuẩn Salmonella. Các nhân
viên điều tra tại bangWashington cũng cho biết 14 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn Salmonella
ở bang này, đã từng ăn xúc xích của hãng Daniele. Ngoài ra, các chuyên gia y tế khẳng
định họ đã kiểm tra và phát hiện khuẩn Salmonella có trong các mẫu xúc xích của công
ty này. Hiện tại, các nhân viên điều tra liên bang Mỹ vẫn đang làm việc để tìm ra nguyên
nhân chính xác gây ra dịch nhiễm khuẩn Salmonella ở nước này. Vì thế, họ vẫn chưa thể
kết luận sản phẩm xúc xích của Công ty Daniele có phải là nguồn lây bệnh chính hay
không. Vì thế, những sản phẩm xúc xích của công ty này bị thu hồi là do kiểm tra
bịnhiễm khuẩn Salmonella.
1.3.7.2.

Trong nước
17


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
Theo ông Nguyễn Công Khẩn, Cục trưởng Cục ATVSTP cho biết, hiện nay, mạng
lưới kiểm nghiệm ATVSTP đã được hình thành rộng khắp trong cả nước nhưng thực tế
năng lực kiểm nghiệm nhiều chỉ tiêu về an toàn thực phẩm tại các địa phương vẫn rất hạn
chế. Trong 330 mẫu hoa quả có tới 2,7% số mẫu có tỷ lệ tồn dư thuốc bảo vệ thực vật
cao, nhất là ở táo đỏ, quýt và lê. Đặc biệt, trong số 1.416 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt đã
phát hiện tới 40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây ra các bệnh về đường tiêu hóa.
Hơn nữa, khu vực TP Hồ Chí Minh và Đồng Nai là những địa phương có tỷ lệ mẫu thực
phẩm nhiễm Salmonella cao nhất, chiếm từ 84- 95% mẫu được giám sát.
1.3.8. Các chỉ tiêu về Salmonella trong thực phẩm
Hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các
nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm. Vì
vậy các phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu
thực phẩm nhất định. Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan chức

năng. Theo tiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế
4/1998, quy định không chấp nhận sự hiện diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml đối
với tất cả các loại thực phẩm. Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT của Bộ Y
tế đối với thực phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc phải kiểm tra
đối với tất cả các loại thực phẩm .Ủy Ban Châu Âu quy định không được phát hiện
Salmonella /25 g trong bất kỳ loại thực phẩm nào.
Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những bước
như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, các thử nghiệm sinh hóa và cuối cùng là thử
nghiệm huyết thanh, tính chung mất khoảng 7 ngày để có kết quả.Hiện nay đã có nhiều
nỗ lực để rút ngắn thời gian phát hiện Salmonella bằng những phương pháp như thử
nghiệm ELISA, và thử nghiệm DNA. Việc khẳng định kết quả âm tính trong vòng 48 giờ
đã là chuyện bình thường. Tuy nhiên một khi mẫu có khả năng dương tính, cần tiến hành
các thao tác truyền thống để khẳng định sự có mặt của Salmonella.
Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc
biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella.

18


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại thực phẩm theo Thông
tư 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
SALMONELLA
2.1.

Phương pháp truyền thống :

Phát hiện Salmonella bằng phương pháp nuôi cấy: Đây là phương pháp định tính
và kết quả được báo cáo là có hay không phát hiện Salmonella trên lượng mẫu được kiểm
nghiệm. Do quy định không cho phép có mặt trong thực phẩm nhưng lại khó phát hiện,
cho nên mẫu lấy tối thiểu phải 25g và quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải có
thêm giai đoạn tiền tăng sinh để đạt hiệu quả cao. Điều này cần thiết vì Salmonella
thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương nặng qua quá trình bảo quản
chế biến và sự tồn tại một số lượng lớn các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae,
những vi khuẩn này sẽ cạnh tranh hay ức chế sự phát triển của Salmonella.
Để phát hiện Salmonella cần tiến hành bốn giai đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh
chọn lọc, phân lập và khẳng định. Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm sinh
hóa và kháng huyết thanh phù hợp.
2.1.1. Giai đoạn tiền tăng sinh (pre – enrichment)

19


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
Đây là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với mẫu
kiểm nghiệm không phải là mẫu bệnh phẩm. Người ta thường sử dụng môi trường tiền
tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế đặc hiệu tạo điều
kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều vi sinh vật hiện diện trong mẫu
đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm.
Ví dụ: nước peptone đệm Buffered Peptone Water (BPW) là môi trường tiền tăng
sinh được khuyến khích sử dụng trong môi trường kiểm tra nhiều loại vi sinh vật gây
bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae; riêng FDA của Mỹ thì thường sử dụng Lactose broth
cho một số nhóm thực phẩm.
Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tiền tăng sinh
phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tiền tăng sinh là 1:9, tuy nhiên tùy
trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi.

2.1.2. Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment)
Giai đoạn này làm tăng mật độ Salmonella so với các vi sinh vật khác bằng cách
ức chế hoặc ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo thuận lợi
cho việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập.
Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonella thường được dùng là
Rappaport Vassiliadis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT), Selenite Cystein
Broth (SC) …Thông thường môi trường TT được dùng để phân tích các loại mẫu có
thành phần chính là những loại thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm vi sinh vật cao,
các loại thức ăn gia súc, hay các loại thực phẩm khác.
Một vài nghiên cứu gần đây của AOAC (Association of Official Analytical
Communities - Hiệp hội các nhà phân tích của Mỹ) cho rằng mặc dù môi trường Selenite
Cystein Broth có chứa selenite ức chế mạnh các vi khuẩn khác ngoại trừ Salmonella
nhưng muối sodium biselenite có thể gây ưng thư khi tiếp xúc với cơ thể người nên hạn
chế sử dụng và thấy rằng môi trường RV có thể thay thế cho các loại môi trường trên để
phân tích mẫu. Canh RV có tác dụng ức chế vi khuẩn khác nhờ vào MgCl 2 bằng cách tác
động lên thành tế bào vi khuẩn và nhờ vào màu xanh malachite ức chế các vi khuẩn
Gram dương .
Cần lưu ý là không môi trường tăng sinh chọn lọc nào là môi trường tối ưu chung
cho tất cả các dòng Salmonella. Mỗi loại môi trường tăng sinh chọn lọc được thiết lập
dựa trên một số đặc điểm phát triển khác nhau của Salmonella, một số dòng Salmonella
tăng trưởng được trong môi trường này nhưng lại không tăng trưởng được trong môi
20


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
trường khác. Ví dụ: S. typhi không phát triển được trong môi trường RV và TT; S. dublin
không phát triển được trong môi trường RV. Ngoài ra, mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở
một nhiệt nuôi cấy khác nhau như môi trường RV được ủ ở 42 0C, môi trường TT và SC
được ủ ở 370C trong 22 – 24 giờ.

Ngày nay, các yêu cầu về vệ sinh thực phẩm đều khuyếch khích các phòng thí
nghiệm sử dụng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc Salmonella để tăng cường
khả năng phát hiện tất cả các serotype Salmonella trong mẫu.
2.1.3. Giai đoạn phân lập (isolation)
Đây là bước tách biệt Salmonella trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của chúng.
Một số môi trường phân lập như Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth
Suffite Agar (BSA), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BGLS), Hektoen
Entric Agar (HE)…Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn
lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau.
Một số đặc điểm chính của các môi trường trên là với sự hiện diện của nấm men,
đường, peptone tạo thuận lợi cho sự tăng trưởng Salmonella và Shigella yếu ớt. Sự sản
sinh ra H2S cũng có thể xảy ra nhờ sự hiện diện của sắt thiosufate và sắt citrate đã thể
hiện bởi những khuẩn lạc có tâm đen do sự tạo nên sulfua sắt. Trên các môi trường phân
lập khác nhau Salmonella sẽ cho các kiểu khuẩn lạc đặc trưng khác nhau. Trên môi
trường XLD: khuẩn lạc màu hồng tròn, trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số
dòng Salmonella có khả năng sinh H 2S, trừ S. typhi thì khuẩn lạc trong suốt và không có
tâm đen.
Trên môi trường BSA: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay đen, có hay
không có ánh kim tím trên bề mặt khuẩn lạc, môi trường xung quanh có màu nâu chuyển
sang đen khi tăng thời gian ủ ấm, gây khó khăn cho việc nhận biết khuẩn lạc vi khuẩn
Salmonella. Một số chủng có thể sinh khuẩn lạc màu lục với môi trường xung quanh ít
nhiều có màu đen.
Trên môi trường BPLS: khuẩn lạc Salmonella điển hình trong suốt và hơi đỏ trong
môi trường, có màu đỏ hồng xung quanh khuẩn lạc. Một số Salmonella xuất hiện khuẩn
lạc màu lục trong suốt nếu bao quanh là vi khuẩn lên men lactose hoặc glucose gây ra
vùng đó màu vàng xanh hoặc xanh; dưới 1% Salmonella không điển hình, chúng lên men
đường lactose và xuất hiện khuẩn lạc vàng lục hoặc lục. [9, 37] Trên môi trường HE:
khuẩn lạc Salmonella có màu xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen.
Một số loài Salmonella có thể phát triển thành khuẩn lạc có các chấm màu đen bóng, lớn
21

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
hay phần lớn các khuẩn lạc hoàn toàn có màu đen. Một cách điển hình, có mộ số ít loài
Salmonella sinh ra khuẩn lạc màu vàng có hoặc không có tâm đen. [9, 20] Cũng như
bước tăng sinh chọn lọc, việc sử dụng hai hay nhiều môi trường phân lập sẽ cho phép gia
tăng sự phát hiện số lượng các kiểu huyết thanh khác nhau trong mẫu, trong đó môi
trường XLD được khuyến khích sử dụng. Hơn nữa, qua các bước tiền tăng sinh, tăng sinh
chọn lọc và phân lập thì tế bào Salmonella bị già và suy thoái, vì vậy cần phải phục hồi
chúng bằng một trong các môi trường như Tryticase Soya Agar (TSA) hay Brain Heart
Infusion (BHI) để nhân sinh khối và được dùng tiếp cho các phản ứng sinh hóa và phản
ứng ngưng kết kháng huyết thanh về sau
2.1.4. Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa
Đây là bước xác nhận các dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonella trên môi trường
phân lập bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng. Các biểu hiện sinh hóa
của Salmonella như sau: glucose (+), lactose (-), indol (+), lysine decarboxylase (+),
ornithine decarboxylase (+), urea (-), mannitol (+), sorbitol (+). Nếu các biểu hiện sinh
hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng các thử nghiệm ngưng kết với
kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá.
Vi khuẩn sau khi phục hồi được cấy chuyển sang các môi trường thử nghiệm sinh
hóa nhằm xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella.
2.2.

Phương pháp hiện đại :

Phương pháp truyền thống mất khá nhiều thời gian (5 ngày) để cho ra kết quả, do
đó người ta đã phát triển rất nhiều phương pháp thử nhanh để phát hiện Salmonella trong
các mẫu thực phẩm và mẫu nước trong thời gian ngắn, từ đó có biện pháp xử lý kịp thời
đối với các mẫu nhiễm. Xu hướng sử dụng PCR và IMS thường được sử dụng. Phương

pháp PCR giúp phát hiện nhanh; tuy nhiên dễ xảy ra hiện tượng âm tính giả, đòi hỏi các
thao tác phải thành thạo. Multiplex PCR giúp tiết kiệm thời gian, số lượng mẫu và chi
phí; tuy nhiên lại có độ nhạy kém hơn. Người ta đã phát triển thêm phương pháp Real
Time PCR từ PCR truyền thống. Phương pháp này có độ nhạy rất cao, cho kết quả sớm
hơn, không cần phải chạy điện di sau phản ứng khuếch đại. Phương pháp miễn dịch từ
phân tách là một lựa chọn tốt hơn. Nó có độ nhạy cao (< 104 CFU/ml), thời gian ngắn
(thí nghiệm được thực hiện trong 4-5 giờ).
Bên cạnh những kỹ thuật Sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định danh
Salmonella, còn có những phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch (huyết thanh
học, kỹ thuật ELISA, Western blot). Và đôi khi để tăng hiệu quả, độ tin cậy cho xét
22


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
nghiệm người ta còn kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR assay
(Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện Salmonella
trong thực phẩm.
2.2.1. Phương pháp PCR
Nguyên tắc :
Phương pháp định tính này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có được
khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm
khuếch đại trên gel agarose, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn
UV có bước sóng là 302 mm. Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất
hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định.
Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch đại
hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích.
- Thiết bị, dụng cụ, hoá chất và môi trường
• Thiết bị, dụng cụ :
+ Tủ ấm 370C.

+ Máy luân nhiệt.
+ Máy ly tâm dùng cho ống eppendorf 1,5 ml.
+ Máy lắc ống nghiệm.
+ Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di có điện thế hoạt động từ 80 đế150 volt.
+ Hộp đèn soi UV có kính lọc 302mm.
+ Bộ chụp ảnh trên đèn UV.
+ Ống Eppendorf 0,2. 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR.
• Hoá chất, môi trường:
 Mồi gồm hai mồi invA1 và invA2 được thiết lập cách nhau 520 bp trong gen invA có vai
trò trong quá trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và người. Trình tự của
hai mồi như sau :
• invA1 :5' -TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3'
• invA2 : 5' -CTGACTGCTACCTTGGCTGATG -3'
• Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 6 pM trong đệm TE.
Ðệm TE có thành phần như sau : 10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA.
 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật và các loại hoá chất khác : Khuyến khích sử dụng môi
trường nuôi cấy dạng bột khô và các vật liệu dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được
tổng hợp thành kit đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp như. Quá
trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong
trường hợp sử dụng các vật liệu hoá chất riêng lẻ, độ tinh khiết của các thành phần và
nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho vi sinh và sinh họcphân tử.
-

23


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
 Thang DNA :Nên sử dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 520

bp. Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp đã biết trước làm thang đo
trong phương pháp này.
 Agarose : Sử dụng trong kỹthuật này là loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏhơn
1000 bp.
•
•

•





+

+
+

Phương pháp tiến hành
Lấy mẫu : Cân chính xác 25 g mẫu (hoặc một khối lượng chính xác tuỳtheo yêu cầu) rồi
cho vào bình tam giác hoặc bao PE vô trùng.
Tăng sinh : Nhằm làm tăng số lượngSalmonella trong mẫu, các tế bào bị suy yếu hay tổn
thương cũng được phục hồi và phát triển. Giai đoạn này được tiến hành trong môi trường
không chọn lọc và trên nguyên tắc cứ một phần khối lượng mẫu sẽbổ sung9 phần khối
lượng môi trường tăng sinh. Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh
dung dịch pepton đệm. Ủ mẫu có môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 37,0 o C 1,0 o C trong
khoảng 18 giờ 2 giờ.
Xử lý mẫu giải phóng DNA : Giai đoạn này nhằm thu nhận sinh khối sau khi tăng sinh,
rửa sạch môi trường sau khi nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng DNA. Cách xử lý như
sau:

Lắc đều canh khuẩn tăng sinh. Hút 0,5 ml vào trongống eppendorf có thể tích 1,5 ml, ly
tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút rồi loại bỏ phần môi trường lỏng bên trên.
Rửa sinh khối bên dưới với nước cất vô trùng rồi tiếp tục ly tâm với chế độ như trên để
loại bỏ phần nước.
Huyền phù sinh khối trong ống với 0,5 ml nước cất vô trùng. Ðun sôi cách thuỷtrong 10
phút. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút để lắng
các mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên được coi là khuôn DNA để tiến
hành phản ứng khuếch đại.
•
Khuếch đại
 Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn DNA đícha trên máy luân
nhiệt (thermocycler) bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành
trong khoảng 30 chu kỳ.
• Chuẩn bị ống khuếch đại :
Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong ống nghiệm PCR có thể tích 0,2
hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 ml mỗi mồi invA1 và invA2 có nồng độ 6 pM và 3 ml mẫu
khuôn ADN. Tổng thể tích trong một ống khuếch đại là 50 ml.
Ðối chứng dương: thay dịch khuôn DNA mẫu bằng dịch ADN của Salmonella chuẩn đã
biết.
Ðối chứng âm: thay dịch khuôn DNA mẫu bằng nước cất vô trùng.
• Chương trình khuếch đại Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt.

24


GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Đề tài: Định tính Samonella trong thực phẩm
+

Chương trình khuếch đại như sau: Duy trì nhiệt độ 95 0C trong 5 phút để làm biến tính

hoàn toàn các sợi DNA trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như sau:
950C/60 giây; 540C/45 giây và 720C/60 giây. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở
nhiệt độ 720C trong 10 phút, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 200C cho đến khi điện di.

•
+
+

Ðiện di sản phẩm khuếch đại
Chuẩn bị gel điện di agarose 1%
Gel agarose 1 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy hoàn toàn và đổ vào khay điện di
đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3 - 4 mm. Gel sau khi
chuẩn bị được ngâm chìm hoàn toàn trong đệm TAE.
Chuẩn bị dịch điện di
Mẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x rồi trộn thật đều.
Ðiện di:Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang DNA chuẩn hay mẫu đối
chứng dương. Nạp 10 ml dịch điện di đã chuẩn bị vào trong gel agarose. Tiến hành điện
di trong 60 phútở hiệu điện thế100 vôn.
Nhuộm DNA, quan sát sản phẩm khuếch đại

+
+
+

•

25