Đề cương nuôi cấy mô tế bào thực vật

CôngBùi



Câu 1: Thế nào là nuôi cấy mô tế bào thực vật? Tại sao các mô đã chuyên hóa của
thực vật khi nuôi cấy invitro lại có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh?

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả
các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật , trên môi trường
dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm
hàng loạt các kĩ thuật khác nhau và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh
vực. VD: nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ứng dụng trong tạo và nhân nhanh dòng đồng nhất về
di truyền, làm sạch virus.

Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa
đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó, khi
gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Vì vậy
các mô đã chuyên hóa của thực vật khi được đưa vào môi trường nuôi cấy thích hợp
chúng sẽ thể hiện tính toàn năng của mình và phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Nói
một cách rõ rang hơn khi các mô chuyên hóa được đưa vào môi trường nuôi cấy phù hợp
chúng sẽ khôi phục khả năng phân chia, chuyển thành tế bào phân sinh và hình thành mô
sẹo. Trong đó một bộ phận tế bào hình thành tế bào cảm ứng hình thái, Chúng cảm ứng
các tín hiệu kích thích phân tử và xác định đường hướng mới của sự sinh trưởng và phát
triển tế bào, các tế bào dơn cực phát triển thành rễ, tế bào lưỡng cực phát triển thành
nhóm tế bào phôi, rồi hình thành tế bào phôi soma.
Câu 2: Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy invitro
diễn ra như thế nào?
•

Khái niệm về tính toàn năng của tế bào thực vật:

•

Haberlandt (1902) lần đầu tiên quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một
cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiền tàng để phát triển thành một cá
thể hoàn chỉnh
Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa
đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả cơ
thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát
triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào.

•

Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy invitro

•

Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấy
phân hóa thành cây hoàn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính toàn năng
của tế bào thực vật.
Khả năng biểu hiện tính toàn năng của các tế bào, mô của cơ thể là khác
nhau.
Tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy invitro biểu hiện qua ba giai
đoạn:

•

•
•

1

CôngBùi


•

Tế bào phản phân hóa với sự phát sinh tế bào khả biến

•
•

Sự định hướng phân hóa tế bào (hoặc tác dụng quyết định của tế bào).
Sự phát sinh hình thái và phát triển cơ quan

1. Sự phản phân hóa tế bào và sự hình thành tế bào khả biến
•

•

Sự phản phân hóa tế bào là quá trình mà tế bào đã phân hóa trong một
điều kiện nhất định, khôi phục khả năng phân chia, chuyển thành tế bào
phân sinh và hình thành mô sẹo.
Trong đó, có một bộ phận hình thành tế bào cảm ứng phát sinh hình thái,
tức là tế bào có thể cảm thụ tín hiệu kích thích phân tử, từ đó xác định
đường hướng mới của sự sinh trưởng và phát triển tế bào

•

Chu kỳ tế bào với sự phản phân hóa: tế bào trưởng thành phản phân hóa

thành ra tế bào mô phân sinh, bước vào chu kỳ tế bào ở thời kỳ G1 hoặc
thời kỳ G2. Điều này được quyết định bởi khả năng phân hóa và trạng thái
sinh lý ban đầu của nó.

•

Điều kiện và đặc trưng của sự phản phân hóa tế bào

•

Có rất nhiều nhân tố ảnh hưởng tới sự phân hóa của tế bào và mô tách rời,
trong đó nhân tố chủ yếu là chất điều tiết sinh trưởng thực vật thuộc nhóm
auxin và cytokinin. Tế bào và mô thực vật khác nhau thì điều kiện phản
phânhóa của chúng là không giống nhau.
Trong quá trình phản phânhóa tế bào thực vật, cách phân bào, biểu hiện
gen và sự chuyển hóa vật chất trong tế bào đều có đặc trưng rõ rệt: sự hòa
nhập của hạch nhân và nhân, sự dung giải màng nhân, sự phân bào có tơ
tạo tế bào đa nhân, sự biểu hiện của các kiểu gen đặc trưng.

•

•

Tế bào cảm biến:

•

Tế bào cảm biến là chỉ trạng thái của tế bào được hình thành sau giai đoạn
nuôi cấy khởi động và có khả năng cảm thụ tác nhân kích thích để phát
sinh hình thái.

Thời gian và điều kiện mà tế bào thực vật biến đổi về mặt hình thái để tạo
thành tế bào cảm biến có sự sai khác tương đối lớn: có trước khi tế bào
diễn ra phản phân hóa nhưng cũng có thể trong hoặc sau thời kỳ tế bào
phản phân hóa
Tế bào cảm biến có đặc trưng về cấu trúc và sự biểu hiện gen. ví dụ các tế
bào huyền phù của cà rốt.
Ví dụ: ở 5 kiểu gen mía có xuất hiện 63 loại protein chuyên phản phân
hóa, trong đó có 33 loại protein xuất hiện trong tất cả các kiểu gen, trong
protein chuyên phản phân hóa thì có 3 loại đặc hiệu cho sự phát sinh hình
thái và cảm ứng tạo mô sẹo và có 1 protein không có chức năng này.

•

•
•

2


CôngBùi


•

Phát hiện sự cảm thụ hình thái phôi tế bào thực vật với gen enzyme thụ thể
phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis receptor kinase - SERK) có
quan hệ với nhau, biểu hiện này được coi là dấu hiệu của tế bào thể phôi.
Trong cà rốt, SERK chỉ có trong tế bào thể phôi và biểu hiện ở thời kỳ đầu
phát triển tế bào thể phôi, sau thời gian phôi hình cầu thì ngừng biểu hiện.

2. Tác dụng quyết định của tế bào thực vật
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

Sự “quyết định” (determination) của tế bào là sự định hướng phân hóa và
trình tự phát triển của tế bào:
Trong quá trình nuôi cấy mô, sự quyết định này biểu hiện ở 2 mặt:
Sự định hướng sẵn có của tế bào mẫu cấy
Cảm ứng sự định hướng của tế bào nuôi cấy
Đặc trưng của tế bào quyết định
Biến đổi quá trình trao đổi chất
Biến đổi hình thái và cấu trúc tế bào, đặc biệt là màng tế bào
Các tế bào khác nhau có thời gian hoàn thành tác dụng quyết định không
giống nhau
Ví dụ: biến đổi tế bào của mô lá sơn trà khi hình thành phôi soma.
Tín hiệu phân tử của sự quyết định tế bào

•

Sự quyết định của tế bào là kết quả tác dụng của tín hiệu phân tử giữa tế
bào với tế bào.

•

Trong một cá thể thực vật hoàn chỉnh, sự sinh trưởng phát triển của mỗi tế
bào, mô hoặc cơ quan đều bị sự điều tiết bởi tín hiệu phân tử của tế bào,
mô và các cơ quan khác bên cạnh để duy trì sự sinh trưởng phát triển bình
thường của cây.
Trong điều kiện nuôi cấy invitro, tế bào cũng biểu hiện sự điều tiết tín hiệu
phân tử hoặc tác dụng truyền tin của nó.
Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh đều nêu trên. Ví dụ:

•
•
•

•

Tế bào biểu bì thuốc lá khi nuôi cấy đơn độc thì mẫu cấy chỉ có thể trương
to, không phân hóa cơ quan, nếu đưa tế bào biểu bì về vị trí cũ trong đoạn
thân thì lập tức bị kích thích để hình thành chồi.
Đã phát hiện ra vai trò phân tử tín hiệu quyết định phát sinh phôi của
arabinogalactan protein (AGP) và chito-oligosaccharide ở màng tế bào của
các cây cà rốt, cải dầu, sam vân (thông Nauy)…

3. Sự phân hóa tế bào và mô
•

Tế bào đã trải qua cảm ứng quyết định, trong điều kiện nhất định thì có thể
phân hóa thành mô, cơ quan và cây khác nhau, quá trình này gọi là sự tái
phân hóa. Sự phân hóa tế bào và mô là bước thứ nhất của sự phát sinh cơ
quan và phôi.

3


CôngBùi


•
•

Nghiên cứu sự phân hóa mạch dẫn được cọi là mô hình nghiên cứu sự
phân hóa tế bào trong nuôi cấy mô thực vật.
Sự phân hóa mô là cơ sở của phát sinh hình thái, khác biệt cơ bản trong
quá trình phát sinh hình thái thể hiện ở sự phân cực của tế bào.

Câu 4: Sự suy thoái tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy invitro
Trong thời gian nuôi cấy dài,sự tăng lên của số lần cấy chuyển, tiềm năng phát sinh hình
thái của mẫu nuôi cấy thực vật giảm đi hoặc bị mất, thậm chí sự phân chia và sinh trưởng
tế bào giảm dần đến chỗ ngừng hẳn.
Có một số giả thuyết về nguyên nhân của sự suy thoái này
• Giả thuyết di truyền: do sự thay đổi trong độ bội tế bào mẫu nuôi cấy, xuất hiện
thể không chỉnh bội, cấu trúc nhiễm sắc thể biến đổi và đột biến gen … dẫn đến
suy thoái tiềm năng phát sinh hình thái.
• Giả thuyết sinh lý : cho rằng sự biến đổi mức độ và sự cân bằng chất kích thích
sinh trưởng nội sinh là nhân tố của sự suy thoái tiềm năng phát sinh hình thái.
• Giả thuyết cạnh tranh: trong mô sẹo hoặc tế bào nuôi cấy, có sự kế tiếp và luân
phiên sinh trưởng của các loại tế bào khác nhau. Qua quá trình nuôi cấy lâu dài,
các tế bào không có tiềm năng phát sinh sẽ chiếm ưu thế hơn
Câu 6: Ảnh hưởng của các nhân tố vật lý(ánh sáng, nhiệt độ, nồng độ khí CO2) đến
quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro?
Ảnh hưởng của các nhân tố vật lý(ánh sáng, nhiệt độ, nồng độ khí CO2) đến quá trình

nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro:
 Ánh sáng:
•
Quá trình nuôi cấy mô TB diễn ra dưới ánh sáng nhân tạo
trong buồng nuôi có nhiệt độ được kiểm soát.
•
Nguồn ánh áng sử dụng là đèn huỳnh quang. Thông thường
trên giá đặt bình nuôi cấy, khoảng cách từ đèn chiếu sáng đến nắp bình nuôi cấy là 45 –
50 cm, đảm bảo sự khuyếch tán AS được đều khắp.
•
AS trong bình và ngoài bình khác nhau rất nhiều và sự
phân bổ AS trong bình phụ thuộc vào diện tích nắp bình, loại bình và sự sắp xếp bình
trên giá đặt bình nuôi.
•
Thông thường cường độ ánh sáng trong bình nuôi thấp hơn
10 lần so với AS tự nhiên ban ngày, giao động tỏng khoảng 40-140 mmol/m2/s ( tương
đương 3000-10000 lux). Việc sử dụng cường độ chiếu sáng thấp trong nuôi cấy in vitro
nhằm tiết kiệm chi phí năng lượng, giảm hiệu ứng nhà kính và do mẫu cây chủ yếu
sống theo phương thức dị dưỡng.
•
Tỷ lệ quang tử của vùng AS màu đỏ /gần đỏ và xanh/đỏ
ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái. Sự phát sinh hình thái xảy ra khi AS có bước
sóng thuộc vùng AS màu xanh (400-460nm),đỏ (620 – 680nm), gần màu đỏ (700 – 800
nm) và gần màu tím(300 – 4 nm).
•
Quang chu kỳ trong buồng nuôi thường được duy trì ở chế
độ 16h chiếu sáng/ngày.
 Nhiệt độ
4

CôngBùi



• Nhiệt độ trong bình nuôi thường cao hơn nhiệt độ ngoài bình một vài độ và phần đáy
bình thường sẽ ấm hơn so với phần nắp bình.
• Nhiệt độ trung bình của buồng nuôi cho nhiều loại cây thường là 250C (giao động từ 17
– 300C). các cây nhiệt đới cần nhiệt độ tủng bình của buồng nuôi ở mức cao hơn: 27,70
C (24 – 32).
• Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ban ngày (khi chiếu sáng) và ban đêm ( khi không chiếu
sáng) thường được duy trì từ 4 – 8 0C , ví dụ : nhiệt độ ban ngày là 25, ban đêm là 20,
hay 28 và 24…sự chênh lệch nhiệt độ như vậy hỗ trợ sự trao đổi khí của bình nuôi và
cải thiện sự sinh trưởng của cây nuôi cấy.
• Với mỗi loại cây khác nhau có khoảng nhiệt độ thích hợp riêng, VD: cây khoai tây s.tr
rất nhanh ở t0 ngày/đêm là 22/18, khi nhiệt độ ngày/đêm là 27/22 cây s.tr chậm hẳn.
• Tốc độ s.tr của mẫu cấy thường giảm dần khi nhiệt độ buồng nuôi thấp hơn nhiệt độ tối
thích nhưng giảm xuồng rất nhanh khi t0 buồng nuôi cao hơn nhiệt độ tối thích.
 Nồng độ khí CO2
• Nồng độ CO2 trong bình nuôi cáy các cây có diệp lục thường giảm thấp hơn điểm bù
CO2 (50 – 100 mmol/mol) trong hầu hết các chế độ quang chu kỳ.
• Nồng độ CO2 gia tăng trong giai đoạn tối (510mmol/mol) nhưng giảm sau thời gian
được chiếu sáng (100 mmol/mol) trong vài giờ, khi được đưa lại vào trong tối thì nồng
độ CO2 lại gia tăng trở lại. Ngay cả trong trường hợp thay nắp đậy cso khả năng trao
đổi khí, nồng độ CO2 giảm xuống còn 100 – 200 mmol/mol trong thời gian có chiếu
sáng do đó cây in vitro sống dị dưỡng. ( Kozai & Sekimoto, 1988)
Câu 7: Thế nào là sự phát sinh hình thái của tế bào?
Sự phát sinh hình thái (morphogenesis) là sự xuất hiện cấu trúc và cơ quan theo 1 hướng
nhất định của tế bào, mô nuôi cấy.
Bao gồm phát sinh cơ quan (organogeneis) và phát sinh phôi soma (somatic

embryogenesis).
Sự phát sinh hình thái có thể tiến hành theo:
 Phương pháp trực tiếp: trong quá trình phản phân hóa, tái phân hóa tế bào mẫu
nuôi cấy không xuất hiện mô sẹo (callus) 1 cách rõ rệt, mà trực tiếp tái sinh thành
cây.
 Phương thức gián tiếp: tế bào mẫu nuôi cấy phải trải qua cảm ứng tạo mô sẹo, sau
đó mới tái sinh cây. Ví dụ như tạo cây đơn bội.


Sự phát sinh phôi soma:

Những tế bào trong phôi hợp tử biểu hiện được gen cần thiết cho chương trình
phát triển phôi. Giai đoạn trước khi hình thành tế bào phôi soma được gọi là tế bào tiền
phôi. Tế bào tiền phôi phân chia để hệ thống tế bào phôi trực tiếp gọi là sự phát sinh tế
bào phôi trực tiếp.
Có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi không cần chất kích thích sinh trưởng, có nhiều tế
bào cần Auxin để tiến hành phân bào trước khi phát sinh tế bào phôi. Có nhiều tế bào
hình thành phôi từ mô sẹo, trong trường hợp này có sự phát sinh phôi soma được tiến
hành gián tiếp.
Hai danh từ tế bào tiền phôi PEDC ( Preembryogenic determined cell) và tế bào phát sinh
phôi IEDC ( induced embryogenic determined cell) dùng để phân loại mô, nhưng thực
5


CôngBùi



chất là 1 quá trình tiếp nối nhau, kết thúc sự phát triển là sự hệ thống những tế bào phôi
(EC- Embryogenic cell).

Những tế bào ở những mô có quan hệ với sự sinh sản như hạt phấn, chồi mầm có khả năng
hệ thống tế bào phôi dễ dàng hơn những tế bào ở những mô trưởng thành. Khi mô có chứa
tế bào phôi, kích thích sự phân chia tế bào trong giai đoạn này là cần thiết để duy trì tình
trạng phôi và hình thành tế bào phôi soma.
Tế bào sinh phôi có thể hệ thống ở những tế bào bình thường được nuôi cấy trên môi
trường có auxin và có thể không có cytokinin. Lượng cytokinin có trong tế bào cao thường
phát sinh phôi thấp. Khi một tế bào phôi được thu nhận, sự có mặt của auxin sẽ gây tổn hại
đến sự pt bt của phôi. Những nhân tố khác ảnh hưởng đến sự pt của phôi như tỉ lệ đạm
amonium và nitrate trong môi trường và pH thấp .. Hay sự lặp đi lặp lại chu kì phát sinh
phôi có thể bị phá vỡ do sự giảm hay bỏ hẳn auxin ra khỏi môi trường.
Sự hình thành phôi thông qua 2 con đưòng PEDC và IEDC. Con đường PEDC là con
đường phát sinh phôi không qua quá trình tạo mô sẹo và IDEC là con đường thông qua
quá trình tạo mô sẹo.
Có 2 bước dẫn đến sự hệ thống phôi:
1. Sự biệt hoá của tế bào có khả năng phát sinh phôi
2. sự phát triển của những tế bào phôi mới hệ thống.
Như vậy có 2 môi trường cần thiết cho nuôi cấy phôi:
1. Môi trường cần cho sự phát sinh tế bào phôi
2. Môi trường cần cho sự phát triển những tế bào này thành những tế bào có khả năng phát
sinh phôi.
Bước 1 cần có mặt auxin và bước 2 phải giảm thấp hay không có mặt của auxin.
Có hai yếu tố quan trọng trong phát sinh phôi: Auxin và nitrogen.
Phát sinh phôi soma là kiểu mẫu của tính toàn thế, có thể khảo sát toàn bộ tiến trình biệt
hoá của tế bào cũng như cơ chế thể hiện tính toàn năng của tế bào thực vật.
 Sự phát sinh cơ quan:
Là quá trình phát triển các chồi, rễ bất định từ các khối tế bào callus. Quá trình này xảy
ra sau thời điểm mà mẫu vật được đặt vào môi trường nuôi cấy và sự bắt đầu cảm ứng
tạo callus.
Câu 8: Các đường hướng phát sinh hình thái của tế bào, mô thực vật nuôi cấy in
vitro và những đặc trưng của hình thái này?

Trả lời:
Sự phát sinh hình thái là sự xuất hiện cấu trúc và cơ quan theo một hướng nhất định
của tế bào, mô nuôi cấy. Bao gồm phát sinh cơ quan và phát sinh phôi soma.
Có thể tiến hành theo
+ Phương thức trực tiếp: trong quá trình phản phân hóa, tái phân hóa tế bào mẫu nuôi
cấy không xuất hiện mô sẹo một cách rõ rệt, mà trực tiếp tái sinh thành cây.
+ Phương thức gián tiếp: tế bào mẫu nuôi cấy phải trải qua cảm ứng mô sẹo, sau đó
mới tái sinh cây.
 Sự phát sinh cơ quan: là quá trình tế bào nuôi cấy cảm ứng trong điều kiện nuôi
dưỡng thích hợp tạo ra cơ quan là chồi bất định và rễ bất định… từ đó hình thành
cây hoàn chỉnh.
6


CôngBùi



- Đặc trưng sự phát sinh cơ quan
Sự phát sinh hình thái tái sinh cây, có thể tổng hợp gồm 5 phương thức cơ bản:
+ Trước hết là hình thành rễ, trên rễ hình thành chồi, chẳng hạn nuôi cấy huyền phù tế
bào cà.
+ Trước hết hình thành chồi, sau đó hình thành rễ từ chồi, như sự tái sinh của đại đa
số mô thực vật nuôi cấy.
+ Trên mô sẹo sản sinh ra chồi và rễ, cấu trúc liên tiếp thành một trục thấp ví dụ như
cà rốt.
+ Hình thành thể dinh dưỡng khác như thân củ, thân vảy và thân hình cầu, ví dụ: tạo
củ lily, lay ơn, protocrom hoa lan.
+ Hình thành chồi hoa hoặc 1 bộ phận cơ quan sinh sản, như khi nuôi cấy tế bào trụ
phôi cây phong thì tế bào nuôi cấy có thể phân hóa thành hạt phấn và noãn…

- Hai đường hướng phân hóa cơ quan của tế bào nuôi cấy:
+ Phân hóa gián tiếp: mẫu cấy trước hết hình thành cụm mô sẹo, từ mô sẹo phát sinh ra
mô tương tự như mô phân sinh, phân hóa hình thành trung tâm phân sinh. Đặc điểm của
nó là tế bào nhỏ, đường kính tương đương nhau, màng mỏng, nhân lớn, bắt màu đậm. Từ
trung tâm phân sinh sau đó hình thành cơ quan chồi, rễ.
+ Phân hóa trực tiếp: Không có giai đoạn tạo mô sẹo rõ rệt, từ mẫu cấy trực tiếp hình
thành trung tâm phân sinh có thể có nguồn gốc từ 1 tế bào hoặc nhiều tế bào. Các tế bào
này bắt đầu phân chia, hình thành nên 2 – 3 tế bào ở gần nhau và tạo thành trung tâm
phân chia liên tục với tốc độ nhanh. Tế bào xung quanh chúng cũng phân chia nhưng với
tốc độ chậm. Từ trung tâm phân sinh hình thành cơ quan chồi, rễ.
 Sự phát sinh phôi soma
Sự phát sinh phôi soma là sự cảm ứng tế bào soma hình thành phôi hoàn chỉnh.
- Đặc trưng hình thành phôi soma
+ Sự hình thành phát triên phôi soma và phôi hợp tử giống nhau ở chỗ cần trải qua thời
kỳ hình cầu, thời kỳ hình tim, thời kỳ kình ngư lôi và thời kỳ hình thành lá mầm. Phôi
soma có cấu trúc hình thái tương tự như phôi hợp tử. Cuối cùng nảy maannm thành cây
con.
+ Nhưng phôi soma khác với phôi hợp tử là: không có sự phân hóa nội nhũ, sự phát triển
cuống phôi bị ức chế hoặc nó bị tiêu biến, nói chung phôi soma không có quá trình khô
phôi và ngủ nghỉ.
+ Có 3 điểm sai khác rõ rệt giữa phát triển phôi soma Và sự phát triển chồi bất định:
1. Thể phôi có sự phân hóa thành 2 cực là mầm rễ và mầm chồi, nhưng chồi bất định
chỉ có kết cấu đơn cực là mầm chồi.
2. Các bó mạch của thể phôi tách rời khỏi bó mạch của mẫu nuôi cấy nhưng ở chồi
bất định bó mạch của nó liên kết với mô bó mạch của mẫu nuôi cấy.
3. Tế bào phôi nảy mầm thành cây trong ống nghiệm, thông thường không cần giai
đoạn cảm ứng sinh rễ, nhưng chồi bất định cần phải chuyển sang môi trường nuôi
cấy cảm ứng rễ mới hình thành cây hoàn chỉnh.
- Con đường hình thành phôi soma.
+ Phát sinh trực tiếp: là thể phôi phát triển từ mẫu nuôi cấy.

Mẫu nuôi cấy có thể là biểu bì, chu bì, tiền phôi hợp tử, tế bào nuôi cấy huyền
phù và tế bào trần.
Ví dụ: Tế bào biểu bì trụ phôi hướng dương và tế bào phôi tâm cây cam quýt…
có thể trực tiếp phát sinh phôi.
7


CôngBùi



Phương thức pháp sinh trực tiếp phôi soma là do tế bào trong mẫu nuôi cấy tồn tại
tế bào tiền phát sinh phôi, trong nuôi cấy thì tế bào này trực tiếp bước vào giai đoạn phát
sinh phôi, hình thành thể phôi som.
+ Phát sinh gián tiếp: là thể phôi phát triển từ mô sẹo hoặc huyền phù tế bào. Thông qua
phản phân hóa đồng thời do cảm ứng định hướng phát triển tạo tế bào quyết định cảm
ứng phát sinh phôi và chúng phát triển hình thành phôi soma.
Câu 10: Nhân giống vô tính in vitro là gì? Những ưu thế và hạn chế của kỹ thuật
này?
Trả lời:
Nhân giống vô tính in vitro là quả trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh, từ
các bộ phận, cơ quan như: chồi, mắt ngủ, vảy củ, đoạn thân, lá … của cây mẹ ban đầu thông
qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
Ưu thế của kỹ thuật này:
+ Phương pháp cho hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di
truyền.
+ Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả những đối tượng khó nhân bằng
các phương pháp thông thường)
+ Chủ động kế hoạch trong sản xuất. đặc biệt là về giống.
+ Tạo ra các giống cây trồng sạch bệnh: nấm, vi khuẩn, đặc biệt là virus. VD: khoai tây, dứa

+ Các cây nhân sau in vitro có xu hướng được trẻ hóa  nâng cao hiệu quả nhân bằng các
phương pháp thong thường sau đó.
Nhược điểm của kỹ thuật này:
+ Chi phí cao hơn các phương pháp nhân giống khác nên giá thành không cạnh tranh.
+ Nhân giống in vitro không thể áp dụng trên tất cả các đối tượng, đặc biệt là phương pháp
vi nhân giống.
+ Một số loại cây trồng rát dẽ bị biến dị khi nhân giống vô tính in vitro.
Câu 11. Nên ứng dụng kỹ thuật nhân nhanh bằng nuôi cấy mô trong những
trường hợp nào? Vì sao?
• Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống
• Nhân nhanh các loại hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt.
• Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây
rau, cây hoa và cây trồng khác
• Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus
• Bảo quản giống gen in vitro
Vì
• Phương pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể tương đối đồng
nhất về mặt di truyền
• Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối
tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường)
• Chủ động kế hoạch sản xuất
• Dễ dàng tạo được cây sạch virus
• Các cây sau nhân in vitro có xu hướng được trẻ hóa giúp nâng cao hiệu
quả nhân nhanh bằng các phương pháp thông thường sau đó.

8


CôngBùi

Câu 12: Các bước cụ thể của quy trình nhân nhanh bằng nuôi cấy mô? Nêu 1 vd cụ thể về
một quy trình nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô để minh họa.
1. Các bước cụ thể của quy trình nhân nhanh bằng nuôi cấy mô

Bước 0: chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
 Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh.
 Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và
phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng
khả năng sống, sinh trưởng của mẫu nuôi cấy

Bước 1: nuôi cấy khởi động
 Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro.
 Yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.
 Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít
chuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ, …)
 Cần xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp. Thường dùng các chất: HgCl 2 0.1%
xử lý trong 5 – 10 phút, NaClO, Ca(Ocl) 2 5-7% xủ lý trong 15 – 20’ hoặc H2O2, nước
Brôm.

Bước 2: nhân nhanh
 Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông
qua: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, và tạo phôi vô tính.
 Chú ý xác định điều kiện môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để hiệu quả là
cao nhất: Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi,
nhiều auxin sẽ kích thích ra rễ. Chế độ nuôi cấy thường là 25 – 27°C, 16h chiếu
sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 – 4000lux

Bước 3: tạo cây in vitro hoàn chỉnh

 Để tạo rễ cho chồi phải cấy chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo
rễ. Môi trường ra rễ thường bổ sung 1 lượng nhỏ auxin. Tuy nhiên có một số chồi có
thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi
trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng.
 Đối với cac phôi vô tính thường chỉ gieo trên môi trường không có chất điều tiết sinh
trưởng hoặc môi trường có nồng độ cytokinin thấp để phôi phát triển thành cây hoàn
chỉnh.

Bước 4: thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm có tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo
một số yêu cầu:
 Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, chiều cao cây,
bộ rễ…)
 Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp (giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước).
 Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ
dinh dưỡng phù hợp.
2. Quy trình nhân giống hoa Lan bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro
2.1. Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy

Tách các vảy hành ra từ cây, bóc lần các lá già cho đến khi xuất hiện các mầm chồi bên
mang đỉnh sinh trưởng.

Cắt bỏ gốc của mỗi mầm, sau đó khử trùng bằng cách ngâm trong cồn 70% trong 30
giây, rửa sạch bằng nước cất vô trùng ngâm trong dung dịch Ca(OCl)2 2% trong 25 phút,
việc khử trùng được tiến hành trong tủ cấy. Mô được rửa lại với nước cất vô trùng 4 - 5 lần.
9


CôngBùi











Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng và cẩn thận tách các lá non.
Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn 700 trong 1 giây và rửa với nước cất vô trùng.
Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá mầm bằng dao nhọn vô trùng.
Dùng kìm nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mô và cấy vào môi trường
nhân giống ban đầu.
Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan là 220C - 260C và tuỳ vào mỗi loài.
Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn gọi là
thể chồi.
Thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng
tuỳ kích thước của chồi.
Lát cắt được chuyển vào môi trường duy trì (môi trường phát triển chồi). Mỗi đỉnh sinh
trưởng sẽ phát triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần, có thể cắt tiếp và cấy chuyền
sang môi trường mới.

2.2. Nhân giống

Môi trường nhân giống thường là môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ sung
các chất điều hoà tăng trưởng (auxin, cytokinin,…) với tỷ lệ phù hợp tùy loài nhằm tạo
điều kiện cho quá trình nhân chồi.

Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng nên giảm dần trong các lần cấy chuyển sau đó.

Các chất chiết trái cây cũng được đề nghị dùng như nước cốt cà chua, nước dừa, nước
chuối, nước khoai tây... Nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyển và thể tích
cũng không quá 10% thể tích môi trường.
2.3. Tái sinh cây hoàn chỉnh in-vitro

Khi đạt đến số cây giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi
trường có lượng auxin tăng lên để kích thích ra rễ).

Sau 4 -5 tháng, các thể chồi sẽ phát triển thành cây con.
2.4. Chuyển cây ra vườn ươm

Cây con cao 5-7 cm và có từ 3-4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có
bổ sung các chất dinh dưỡng.

Sau một thời gian cây phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu. Sau khi chuyển chậu
khoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật.

Như vậy, từ một mô hoa Lan được chọn nuôi cấy cho đến ra cây con có 3-4 lá chuyển
ra vườn trồng mất thời gian khoảng từ 8 đến 11 tháng.

Với phương pháp nhân giống vô tính như trên sẽ đảm bảo tạo ra cây con mang đặc tính
giống hoàn toàn với cây cha mẹ (cây con ổn định về mặt di truyền), cây con không nhiễm
bệnh và tạo được một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn.

Tuy nhiên, việc cấy mô phải được thực hiện thật nghiêm túc và tỉ mỉ theo đúng quy
trình, phải có điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt là
điều kiện vô trùng phải được đảm bảo nghiêm ngặt.

Cần chú ý thêm, đối với các loài không phải là cây bản địa, phải được thuần hoá tại
vùng mới chọn mẫu đem nuôi cấy, có như vậy mới đảm bảo hiệu quả từ khâu nuôi cấy

trong phòng thí nghiệm đến trồng ngoài vườn ươm.

10


CôngBùi



Câu 13: Những vấn đề tồn tại của kỹ thật nhân giống vô tính in vitro và các khắc
phục?
Các tồn tại của kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro và cách khắc phục:
1. Tính bất định về mặt di truyền.
- Mục đích của nhân giống in vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất với số lượng rất lớn.
Tuy nhiên trong một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra những biến dị soma.
Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào
mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh.
- Nguyên nhân gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ chủ yếu là do những biến đổi trong
vật chất di truyền như đứt gãy, chuyển đoạn ADN hoặt đảo đoạn. Những nhân tố gây ra
biến dị tế bào soma có thể là:
+ Kiểu di truyền (genotype): Tần số biến dị ảnh hưởng bởi genotype của các loài
cây trồng khác nhau. Nói chung cây càng có mức bội thể cao thì càng dễ biến dị.
+ Số lần cấy chuyển: số lần cấy chuyển càng nhiều thì độ biến dị càng cao. Theo
Amstrong và Phillips (1988): khi nuôi cấy lâu dài thường gây biến dị nhiễm sắc thể.
+ Loại mô: Nói chung nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh in vitro ít bị
biến dị hơn so với nuôi cấy các cơ quan khác.
2. Sự nhiễm mẫu.
Các VSV như nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùng mấu đưa vào nuôi
cấy. Tuy nhiên một sô loại vi khuẩn như: Agrobacterium, Bacillus, Corylabacterium,
Erwinnia và Pseudomonas có thể xâm nhiễm vào mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây

tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1- 2 tuần nuôi cấy). Để khắc phục hiện tượng
trên cần:
+ Trước hết cần phải lựa chọn cây mẹ đúng tiêu chuẩn.
+ Có thể sử dụng một số chất kháng sinh để chống hiện tượng nhiễm khuẩn và
nấm. Nhưng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và có phản ứng đến kiểu di truyền
do đó rất cẩn trọng khi sử dụng kháng sinh. Chất kháng sinh thường gây ra bới những
hủy hoại ở ty thể và lạp thể nên có ảnh hưởng đến di truyền tế bào chất.
3. Việc sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy:
Trong nuôi cấy mô thường quan sát thấy hiện tượng hóa nâu hay đen thẫm, mẫu này có
thể khuếch tán trong môi trường. Hiện tượng này là do mẫu cấy có chứa nhiều chất tanin
hoặc hydroxyphenol. Thí dụ các chất phenol eucomicacid và tyramine đã làm hóa nâu
mẫu cây lan Cattleya khi nuôi cấy.
Các phương pháp loại trừ sự hóa nâu:
+ Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy (0,1 – 0,3%): phương pháp này
đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya và Aerides. Tuy nhiên
than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ một số chất điều tiết
sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiết khác.
+ Bổ sung Polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hóa tốt ở mẫu một số
cây ăn quả (táo, hồng).
+ Sử dụng mô non, gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng.
+ Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xytric vài giờ trước khi cấy.
+ Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O2 thấp, không có ánh sáng (1 – 2 tuần).
+ Cấy chuyển mẫu liên tục (1 – 2 ngày/ lần) sang môi trường tươ trong 1 – 2 tuần.
4. Hiện tượng thủy tinh hóa

11


CôngBùi

- Cây bị “thủy tinh hóa” – thân lá mọng nước, trong suốt, cây rất khó sống khi đưa ra
ngoài môi trường do bị mất nước rất mạnh.
- Thường xảy ra khi nuôi cấy trong môi trường lỏng hay môi trường ít agar, sự trao đổi
khí thấp. Đặc biệt thường xảy ra khi nuôi cấy táo, mận, hoa cẩm chướng, hoa đồng tiền
và hoa cúc.
- Cây bị thủy tinh hóa thường có hàm lượng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều phân tử
phân cực nên dễ hấp thụ nước. Cây in vitro thường có mật độ khí khổng cao, khí khổng
có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong quá trình nuôi cấy.
- Để tránh hiện tượng thủy tinh hóa có thể tiến hành 1 số giải pháp sau:
+ Giảm sự tăng hấp thụ nước bằng cách tăng nồng độ đường trong nuôi cấy và
dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao, nhưng phương pháp này làm thay đổi sự tổng
hợp cấu trúc không gian của diệp lục và ức chế hình thành chồi.
+ Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trường.
+ Giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuôi cấy.
+ Xử lý axit absixic hoặc 1 số chất ức chế sinh trưởng.
+ Giảm gây vết thương trên mẫu qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi trường
cấy ít nhất. ABA ngăn chặn được sự hóa thủy tinh thể ở một số loài cây trồng.
+ Chuyển cây in vitro thuần hóa ngoài vườn ươm không ảnh hưởng đến cây bị thủy
tinh thể.
+Giảm etylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông khí tốt
+ Tăng nồng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy.
Câu 14. Các công nghệ mới trong vi nhân giống cây trồng (quang tự dưỡng,
bioreactor) và khả năng ứng dụng của chúng?
Những công nghệ mới trong vi nhân giống cây trồng
 Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng.
Nghiên cứu tập trung vào vấn đề nuôi cấy mô trên môi trường không có đường nhưng
được điều khiển chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2
VD: Phòng công nghệ tế bào viện sinh học nhiệt đới đã tiến hành nuôi cấy mô

quang
tự
dưỡng
thành
công
theo
2
phương
pháp:
1. Trao đổi khí tự nhiên (khí trao đổi bằng cách khuếch tán qua màng millipore hoặc nút
giấy): cây hồng, dâu tây
2.Bơm khí trực tiếp (khí được bơm trực tiếp vào hộp nuôi cấy): tre tầm vông, nho không
hạt.
• Ưu điểm:
- Tốc độ sinh trưởng, chất lượng và tỉ lệ sống của mô thực vật được nâng cao ở tất
cả các bước trong điều kiện tự dưỡng.
- Thiệt hại do sự nhiễm mẫu được hạn chế do không sử dụng đường trong môi
trường.
- Tỉ lệ đột biến có thể được giảm vì cây được nuôi trong điều kiện môi trường
giống tự nhiên.
- Tự động hóa do đó giảm chi phí lao động.
• Nhược điểm:
- Chi phí cao cho việc điều khiển môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, CO2, O2).
- Chi phí cao cho hệ thống bình nuôi chuyên dụng và chuẩn bị giá thể.
 Bioreactor
12


CôngBùi

•
•

Bioreactor là một hệ lên men hay nồi phản ứng sinh học.
Là thiết bị mà trong đó sự biến đổi hóa sinh được tiến hành bởi các tế bào sống
hoặc các thành phần tế bào invivo. Thường dùng để lên men liên tục, bán liên tục
hay gján đoạn.
• Có thể dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối.
• Cũng có thể dùng trong nuôi cấy mô để nhân nhanh các giống cây
• Takayama và Miasawa là những người đầu tiên sử dụng bioreactor vào nhân
giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly, hoa lan hồ điệp.
• Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị
bioreactor hoàn toàn tự động hóa.
VD: 1 bioreactor vibro-mixer trang bị với các ống silicone có khả năng sản xuất
100.000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong 1l dịch huyền phù nếu như dung
dịch đó được đặt trên 1tấm giấy lọc và phát triển trong 4 tuần.
Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật được cải tiến từ các loại
bioreactor trong nuôi cấy tế bào vi sinh
• Thuận lợi;
- Thể tích nuôi cấy tăng, thường là ít nhất 1l. Điều này cho phép sản xuất nhiều
phôi, chồi hơn mà không cần những kĩ thuật cao cấp.
- Hầu hết các bình bioreactor được thiết kế với cơ chế khuấy bằng cơ học hay thổi
khí để duy trì nuôi cấy gần như đồng dạng.
- Khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy và môi trường vật lí có thể
được kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng. Điều này không thể thực hiện với hệ thống
nuôi cấy bình tam giác.
• Nhược điểm: đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt là
khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy.

• Ứng dụng:
- Tạo chồi: chuối, dứa, hoa lan
- Tạo củ invitro: khoai tây, lily
- Tạo phôi soma: cà phê, cao su
VD: Hệ thống bioreactor nuôi cấy rễ tơ nhân sâm Hàn Quốc
Tổng hợp lượng lớn sinh khối tảo
Các bioreactor ứng dụng trong công nghiệp
SC Bioreactor™, Pg166 bioreactor, cây gỗ nghiến, xoan, nuôi cấy vô tính dứa.
Câu 15: Vì sao có thể tạo cây sạch virus bằng nuôi cấy meristem của cây bị nhiễm
virus.
Như ta đã biết virus sống kí sinh và tồn tại trong mọi tế bào sống. Tuy nhiên
những nghiên cứu của White (1934), Limasset và Cornuet (1950) và Martin (1952) đã
cho thấy những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn. The
Mathews, Wang et al Hu đã đưa ra giả thuyết về sự không tồn tại của virus ở meristem ó
thể do một số nguyên nhân sau:
- Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ thống dẫn, tuy nhiên hệ thống này không có
trong mô phân sinh đỉnh
- Trong sự phân chia, các tế bào phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các
thông tin di truyền của virus
13


CôngBùi



- Hệ thống vô hiệu hoá ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây
- Nồng độ auxin, cytokinin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao
chép thông tin của virus.
Chính vì khả năng này, khi tách lấy đỉnh sinh trưởng để đưa vào nuôi cấy, người

ta có thể hạn chế tối đa việc nhiễm virus của các tế bào nuôi cấy. Bên cạnh đó, hiện nay
việc nuôi cấy meristem còn được kết hợp với xử lý nhiệt độ hay xử lý hóa chất. Điều này
càng làm tăng độ sạch cho các mô đỉnh sinh trưởng, làm cho tỉ lệ tạo ra các cây sạch bệnh
trở nên rất cao.
Câu 16. Trình bày các kỹ thuật tạo cây sạch virus in vitro
Trong nuôi cấy mô có hai cách để chọn giống sạch bệnh virus:
• Cách 1: Dùng các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus để thanh lọc các mẫu
nhiễm bệnh trước khi đưa vào nuôi cấy, sử dụng nhân nhanh in vitro để nhân
nhanh các mẫu sạch
• Cách 2: Làm sạch virus ở mẫu đã bị nhiễm, sau khi đã tạo mẫu sạch thì tiếp tục sử
dụng biện pháp nhân nhanh invitro để nhân mẫu sạch.
1. Dùng các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus( cách 1)
Các phương pháp chẩn đoán bệnh virus
• Chẩn đoán bằng mắt.
• Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử.
• Chẩn đoán bằng cây chỉ thị.
• Phương pháp huyết thanh.
• Phương pháp kính hiển vi điện tử.
• Phương pháp ELISA.
• Phương pháp phân tích DNA
1.1. Phương pháp chuẩn đoán bằng mắt
Đây là các phương pháp chẩn đoán dựa trên các triệu chứng bệnh của cây.
- Ưu điểm: Đơn giản, ít tốn kém.
- Nhược điểm:
+ Phải có kinh nghiệm không dễ lẫn với các triệu chứng khác không phải là bệnh
+ Phương pháp này gặp khó khăn khi cây bị nhiễm tổ hợp virus.
+ Phụ thuộc vào ngoại cảnh, tuổi cây, đặc điểm của giống.
1.2. Chẩn đoán bằng cây chỉ thị
- Cây chỉ thị là cây khi bị nhiễm virus sẽ xuất hiện các triệu chứng đặc trưng. Phương
pháp này đã được tiến hành từ những năm 1940.

- Phương pháp thử bằng cây chỉ thị luôn được coi là phương pháp xác định đầu tiên và
cũng là phương pháp nhạy cảm nhất, tuy nhiên kết quả xét nghiệm cũng còn phụ thuộc
các yếu tố khác nữa.
- Ưu điểm: Nhạy và chính xác có thể phát hiện ở nồng độ virus thấp.
- Nhược điểm:
• Thời gian chẩn đoán dài, cần quá trình ủ bệnh.
• Phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm.
• Phương pháp lây nhiễm phức tạp.
• Tốn công chăm sóc cây chỉ thị, môi giới truyền bệnh, chi phí đầu tư cao.
• Một số bệnh virus không tiến hành được
1.3. Chuẩn đoán bằng kính hiển vi
14


CôngBùi



Kính hiển vi điện tử đã mang lại những kết quả đáng tin cậy đối với xét nghiệm hàng
loạt.
- Ưu điểm: + Chính xác, tin cậy.
+ Đơn giản, nhanh chóng.
- Nhược điểm: + Chi phí cao số lượng mẫu hạn chế.
+ Loại virus được chứng minh cũng chỉ là loại hình đũa và hình sợi. Nếu
virus tồn tại dạng cầu thì rất khó phát hiện vì nó khá giống các cơ quan tử của
tế bào thực vật bình thường.
1.4. Phương pháp huyết thanh
- Ưu điểm : + Tính đặc hiệu cao xác minh nhanh sự tồn tại của virus và phân loại chúng.
Kết quả thu được chậm nhất là sau 48 giờ.
+ Chi phí cho xét nghiệm thấp.

+ Độ chính xác cao.
- Nhược điểm:
+ Chưa sản xuất được kháng thể đối với tất cả các loài virus và kể cả khi có huyết thanh
rồi cũng chưa có thể nói rằng kết quả xét nghiệm hoàn toàn bảo đảm.
+ Không thể xác minh được đặc tính gây bệnh của từng loài virus đối với thực vật chủ
Có nhiều phương pháp huyết thanh khác nhau đã được ứng dụng phương pháp kết
tủa giọt, xét nghiệm khuyếch tán agar gel hai chiều, xét nghiệm latex,xét nghiệm miễn
dịch hướng tâm...
1.5. Phương pháp ELISA ( Enzymed linked immuno sorbent assay)
Nguyên lý chung:
Dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể nhưng ở đây kháng thể được liên kết với
một enzyme (enzymed linked). Phức kháng nguyên – kháng thể - enzyme dễ dàng nhận
biết màu do chính enzyme đó xúc tác.
- Enzym thông dụng là phosphataza kiềm.
- Cơ chất của phản ứng là 4- nitrophenylphophat. Khi bị tách phosphat sẽ thành α-nitro
phenol có màu vàng.
- Ưu điểm:
+ Mỗi enzyme xúc tác cho hàng ngàn phân tử cơ chất nên tín hiệu được khuếch đại rất rõ.
+ Có thể định tính, định lượng
1.6. Phương pháp phân tích ADN
- Xác định trực tiếp sự có mặt lõi ARN (hoặc ADN) của virus.
- Phương pháp này cho kết quả chính xác nhưng đắt tiền, yêu câu phải có trình độ kĩ thuật
cao.
- Sơ đồ nguyên lý:
Chiết tách ARN virus  cDNA  Phản ứng lai với ARN virus Nhận biết khi cDNA
gắn phản xạ hoặc enzyme.
2. Dùng kĩ thuật làm sạch virus bằng nuôi cấy meristem(cách 2)
Các kĩ thuật làm sạch virus in vitro
• Nuôi cấy meristem.
• Nuôi cấy meristem kết hợp xử lý nhiệt.

• Nuối cấy meristem kết hợp xử lý hóa chất.
• Vi ghép.
Nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng meristem

15


CôngBùi



Virus sống ký sinh và tồn tại trong mọi tế bào sống, tuy nhiên những nghiên cứu của
White (1934), Limasset và Cornuet (1950) và Martin (1952) đã cho thấy những tế bào
càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn
2.1. Nuôi cấy meristem
Tách chính xác meristem có kích thước nhỏ hơn 0,3 mm, nuôi cấy chúng trên môi trường
dinh dưỡng phù hợp để tái sinh thành cây nguyên vẹn. Sau đó kiểm tra độ sạch virus ở
cây tái sinh bằng các phương pháp khác nhau để thu nhận được cây sạch bệnh virus.
2.2. Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt
- Cơ sở: Ở nhiệt độ cao 36 – 370C thì một số loài virus không có khả năng nhân lên.
- Ưu điểm: Biện pháp này cho phép có thể tách meristem ở kích thước lớn hơn (0,5 –
1mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở kích
thước 0,3 – 0,5mm.
2.3. Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý hóa chất
- Có thể nuôi cấy meristem với kích thước lớn (0,5 – 1 mm) kết hợp với việc bổ sung vào
môi trường nuôi cấy các chất kháng virus để tạo môi trường sạch bệnh.
- Chất kháng virus như: 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng khả năng kháng của tế
bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus.
- Phương pháp này có hiệu quả cao trong việc tạo cây sạch bệnh ở thuốc lá, khoai tây, loa
kèn.

2.4. Vi ghép
Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên cây gốc sạch và kháng bệnh trong
điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch virus.
Kỹ thuật này thường sử dụng với các cây thân gỗ, đặc biệt là họ cam, chanh vì
meristem của chúng không thể sinh trưởng và tái sinh chồi khi nuôi cấy trực tiếp trên môi
trường nhân tạo.
Câu 18. Cây đơn bội và ý nghĩa của nó trong nghiên cứu di truyền và công tác giống
cây trồng
1. Khái niệm chung về thể đơn bội
- Các thể đơn bội là những cá thể thường là của những loài nhị bội hay đa bội khác nguồn
mà trong tế bào soma của chúng số lượng nhiễm sắc thể bằng nửa số lượng NST của loài
khởi đầu, trong mỗi cặp NST tương đồng nó chỉ có một NST(n)
- Các cách hình thành thể đơn bội:
+ Trinh sinh (gynogensis) và sinh sản đơn tính đực (androgensis).
+ Loại trừ nhiễm sắc thể và giảm nhiễm sắc thể soma.
+ Nuôi cấy thể đơn bội in vitro.
- Một số đặc điểm của thể đơn bội.
+ Trong cơ thể thực vật chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội.
Nếu chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n).
+ Ở thể đơn bội thì kiểu hình của cây phản ánh trung thực kiểu gen. Vì vậy thể đơn
bội là nguyên liệu lý tưởng cho công tác chọn giống cây trồng.
2. Ý nghĩa của cây đơn bội trong nghiên cứu di truyền và công tác giống cây trồng
- Khó khăn của việc tạo dòng thuần và hướng khắc phục
+ Trong chọn giống thực vật để tạo ra dòng thuần chủng người ta tiến hành tự thụ
phấn bắt buộc qua nhiều thế hệ, việc này tốn rất nhiều thời gian.

16


CôngBùi

+ Vì vậy vấn đề đặt ra là làm thế nào trong một thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo ra
được dòng thuần chủng. Năm 1934, Stow đã phát hiện ra sự phát triển khác thường của
hạt phấn thành những cấu trúc giống túi phôi đã xảy ra ở một số loài thực vật ở
Hyacinthus. Hiện tượng này đã cho thấy các hạt phấn có khả năng phân chia để hình
thành các tế bào mới hoặc các mô khi được sinh trưởng trong các điều kiện thích hợp và
chúng tiếp tục phát triển thành cây đơn bội
- Một số ưu điểm của đơn bội thể là: Sử dụng đơn bội thể có thể rút ngắn nhanh quá trình
đồng hợp tử hóa bằng cách chuyển từ đơn bội sang đơn bội kép. Cây đơn bội biểu hiện
tất cả thông tin di truyền ra kiểu hình, dễ dàng nhận biết các alen ẩn, khả năng kháng các
điều kiện bất lợi có thể nhận biết và chọn lọc.
- Khả năng ứng dụng của cây đơn bội.
+ Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen.
+ Tạo đột biến ở mức đơn bội.
+ Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ cho công tác chọn giống cây trồng.
+ Cây đơn bội có thể dùng trong chọn lọc hồi quy để tạo giống chống bệnh.
Câu 19: Trình bày nguyên lý, cách tiến hành, những nhân tố ảnh hưởng của các phương
pháp tạo cây đơn bội in vitro ( nuôi cấy bao phấn, hạt phấn, noãn chưa thụ tinh). Nêu ví
dụ cụ thể để minh họa cho các phương pháp trên?
I. Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn
1. Nguyên lý:
Dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn tính đực, người ta nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu
bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng
nhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội.
Các phương thức sinh sản đơn tính đực in vitro:
+ Sinh sản đơn tính đực trực tiếp: Ví dụ : thuốc lá, cà độc dược
Hạt phấn đơn nhân
Phôi in vitro

Cây in vitro
+ Sinh sản đơn tính đực gián tiếp: Ví dụ: ở lúa, ngô…
Hạt phấn đơn nhân
mô sẹo in vitro
Chồi in vitro
Cây in vitro
+ Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: Quá trình này diễn ra tương tự như sinh sản đơn tính
đực gián tiếp nhưng sự hình thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết. Ví dụ ở cây cà chua
2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy bao phấn, hạt phấn.
2.1. Kiểu gen
- Kiểu gen dóng vai trò chính quyết định sự thành công hay thất bại của thí ngiệm.
- Sản xuấy cây đơn bội bằng con đường nuôi cấy hạt phấn k;à rất hạn chế và không áp dụng
được cho 1 số loài. Ngoài ra, trong cùng 1 loài khả năng sản sinh cây đơn bội là cũng khác
nhau thí dụ 1 số dòng ngô (Zea mays L.) là hoàn toàn không có khả năng nuôi cấy hạt phấn
trong khi 1 số ít các cây đơn bội có thể thu được từ 1 số dòng khác.
- Do tác dụng của kiểu gen, việc sử dụng càng nhiều sự đa dạng về di truyền sẽ càng tốt khi
triển khai các quy trình để sản xuất cây đơn bội thông qua nuôi cấy hạt phấn.
2.2. Tình trạng của cây mẹ
- Tuổi và sinh lý của cây mẹ ảnh hưởng đến kết quả của việc nuôi cấy hạt phấn.
- Với hầu hết các loài, lượt thoa sản sinh đầu tiên thường cho kết quả tốt nhất. Như 1 nguyên
tắc chung, các hạt phấn cần được nuôi cáy từ nụ thu từ các lứa càng sớm càng tốt.
17


CôngBùi



- Các yếu tố môi trường khác nhau mà các cây mẹ đang trải qua cuãng có thể sẽ ảnh hưởng
đến sự tạo cây đơn bội. Cường độ ánh sáng, quang chu kì, và nhiệt độ đã được nghien cứu và

kết luận là có ảnh hưởng đến số lượng cây tái sinh từ nuôi cấy hạt phấn. Các điều kiện sinh
trưởng đặc trưng là khác nhau tùy vào các loài khác nhau. Nói chung, các kết quả tốt nhất
thường thu được từ các cây mẹ khỏe mạnh sinh trưởng tốt.
- Giai đoạn phát triển hạt phấn:
+ Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự sản xuất cây đơn bội từ hạt phấn là giai
đoạn phát triển của hạt phấn.
+ Đối với rất nhiều loài, hạt phấn trong giai đoạn đơn nhân cho phản ứng tạo cây đơn
bội tốt nhất.
+ Ngược lại, ở thuốc lá, phản ứng thích hợp cjir thu được khi nuôi cấy hạt phấn ở giai
đoạn ngay trước, trong và ngay sau khi quá trình phân bòa đầu tiên 9 giai đoạn tiểu bào tử
chuyển từ trạng thái đơn nhân sang hai nhân)
2.3. Xử lý trước khi nuôi cấy.
- Xử lý nhiệt độ cho các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tác bao phấn để cấy sẽ kích
thích sự phân chia của tiểu bào tử để tạo cây đơn bội. Đối với bất kì 1 loài, có thể có các tổ
hợp thích hợp giữa nhiệt độ và thời gian xử lý. Thông thường nhiệt độ thấp yêu cầu thời gian
xử lý ngắn hơn và ngược lại. Ví dụ:
+ Năng suất cây thuốc lá đơn bội thường tăng lên bằng việc xử lý nụ ở 7 – 8 0C trong
12 ngày hay ở 2 – 5 0C trong 2 – 3 ngày trước khi tách và nuôi cấy hạt phấn. Đối với các loài
khác, nhiệt độ từ 4 – 10 0C trong 3 ngày đến 3 tuần đã đượ sử dụng.
+ Nhiệt độ cao trước khi nuôi cấy có hiệu qủa cao ở một số loài, ví dụ sản xuất cây
đơn bội đã tăng lên ở nho khi nuôi cấy hạt phấn ở nhiệt độ 35 0C từ 1 – 3 ngày trước khi nuôi
cấy ở 25 0C.
2.4. Môi trường nuôi cấy.
- Cây đơn bội có thể được cảm ứng tạo ra trên môi trường đơn giản như là môi trường Nitsch
và Nitsch (1969) cho thuốc lá và một số loài khác.
- Với hầu hết các loài, môi trường phổ biến nhất dùng cho nuôi cấy hạt phấn là MS và N6 hay
các dạng biến đổi từ 2 môi trường này.
- Các hỗn hợp chất tự nhiên như: dịch nhiết khoai tây, nước dừa… tỏ ra có tác dụng tốt trong
quá trình nuôi cấy bao phấn.
- Nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng trong nuôi cấy bao phấn.

- Hàm lượng dường cao giúp làm tăng tings thẩm thấu hơn là nhu cầu dinh dưỡng (áp suất
thẩm thấu trong môi trường bao phấn thường khá cao. Các đường khác như ribose, maltose,
và glucose tỏ ra là tốt hơn so với saccarose ở 1 số loài.
- Bô sung chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường: đa số yêu cầu bổ sung 1 lượng nhỏ các
auin. Xytokinin đôi khi cũng cần thiết và được sử dụng kết hợp với auxin đặc biệt cho các loài
mà tạo calus là giai đoạn trung gian trong quá trình sản xuất cây đơn bội.
- Agar có thể chứa các hợp chất ức chế đến quá trình sinh sản vô tính đực ở 1 số loài agarose
đã được xem là yếu tố làm đông môi trường ưu việt hơn.
3. Cách tiến hành.
*Nuôi cấy bao phấn:
Quy trình chung tạo cây đơn bội từ bao phấn:
- Chọn bao phấn: tốt nhất là chọn bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào nguyên
nhiễm lần 1. Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn.
- Xử lý nụ hoa: Xử lý lạnh sẽ kích thích nhân dinh dưỡng phân chia. Chế độ xử lý nhiệt độ
18


CôngBùi



phụ thuộc vào loại cây. Ví dụ: lúa Japonica xử lý ở 10 0C trong 2 – 3 tuần, lúa Indica xử lý ở 7
0
C trong 1 tuần, ngô xử lý ở 4 0C trong 1 tuần…
- Chọn môi trường nuôi cấy thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy khác nhau mà sử dụng
môi trường tương ứng. Tuy nhiên có một số quy luật chung:
+ Các cây hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt là 2,4D ở nồng độ cao để khơi động sự
phân chia đầu tiên
+ Hàm lượng đường cao
+ Bổ sung các hỗn hợp chất tự nhiên: nước dừa, pepton…

* Nuôi cấy hạt phấn
- Kỹ thuật tách rời tiểu bào tử:
+ Các bao phấn vô trùng được nghiền hoặc ép trong môi trường lỏng để giải phóng
hạt phấn ra ngoài bao phấn. Tách hạt phấn ra khỏi bã túi phấn bằng cách rót dung dịch trên
qua lưới lọc có kích thước phù hợp.
+ Dung dịch sau lọc được li tâm 800 – 1000 rpm trong 3 – 5 phút để tách và làm sạch
hạt phấn. Thành phần nhẹ nổi lên trên được gạn đi trong khi hạt phấn lắng dưới đáy được rửa
sạch bằng môi trường mới và được ly tâm thêm 2 lần nữa để loại bỏ các chất ức chế trong túi
phấn.
+ Tạo huyền phù hạt phấn với mật độ 10 4 – 10 5 tế bào/ml
- Một số chú ý khi nuôi cấy hạt phấn:
+ Các hạt phấn nuôi cấy tách rời thường phát sinh phôi trực tiếp.
+ Để kích thích sự phát sinh phôi thường sử dụng phương pháp nuôi “ trợ dưỡng”:
nuôi kèm với bao phấn hay loại mô khác của cây mẹ.
+ Môi trường nuôi cấy hạt phấn cần bổ sung các axit amin (glutamin, serin…) với
nồng độ cao (100 – 1000 ppm) và có trường hợp không cần dùng chất điều tiết sinh trưởng
(thuốc lá, cải dầu,…)
* Tồn tại trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn:
+ Việc tạo cây đơn bội theo con đường nuôi cấy bao phấn và hạt phấn thường có tỷ lệ
bạch tạng cao. Do sự mất cân bằng giữa di truyền nhân và di truyền bào chất nên ở cây bạch
tạng thể tiền lạp không có ribosom nên không thể chuyển thành lục lạp
+ Chưa loại trừ một số cây nhị bội tái sinh từ vỏ bao phấn.
+ Hiện tượng không ổn định về mặt di truyền ở cây tái sinh.
II. Tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh.
1. Nguyên lý.
- Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh được gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay
trinh nữ sinh. Cây đơn bội từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh được hình thành do kích thích tế bào
trứng hay các tế bào cực, tế bào đối cực, tế bào kèm trong noãn phát triển và tái sinh tạo thể
đơn bội.
- Những năm 70 các nhà nghiên cứu đã tập trung giải quyết vấn đề tạo cây đơn bội bằng nuôi

cấy noãn chưa thụ tinh và đã thu được 1 số thành tựu trên các đối tượng: hành, củ cải đường,
hướng dương, ngô…
2. Một số nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh.
- Kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách noãn rất
khó khăn và dễ gây tổ thương.
+ Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này, người ta đang tập trung nghiên cứu các yếu tố như
kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi
cấy…
19


CôngBùi



- Kiểu gen của cây mẹ: là 1 trong nhân tố quan trọng nhất đối với sự cảm ứng tạo cây đơn bội
từ noãn chưa thụ tinh.
+ Ảnh hưởng của sự sai khác kiểu gen đến kết quả nuôi cấy đã được nghiên cứu trên
nhiều đối tượng khác nhau: lúa, hoa đồng tiền, láu mì, củ cải đường…
+ Người ta nhận thấy mỗi 1 kiểu gen khác nhau có phản ứng khác nhau trong sinh sản
đơn tính cái in vitro nên cần phải xác định quy trình tối ưu riêng cho từng kiểu gen.
- Giai đoạn phát triển của noãn: giai đoạn phát triển của noãn khi đưa nuôi cấy có ý nghĩa đặc
biệt đối với việc tạo thể đơn bội.
+ Nhiều tác giả xác nhận rằng giai đoạn túi phôi thành thục là giai đoạn phù hợp cho
hiệu quả cao trong nuôi cấy noãn.
+ Tuy nhiên, việc xác định giai đoạn phát triển của thể giao tử rất phức tạp vì túi phôi
nằm sâu trong bầu quả. Do khó có thể quan sát trực tiếp, để xác định giai đoạn phát triển của
noãn thường phải sử dụng các phương pháp tế bào học: tách túi phôi, nhuộm màu lát cắt
mỏng…
- Môi trường nuôi cấy:

+ Các môi trường nuôi cấy như: MS,B5,MF…thường sử dụng trong nuôi cấy noãn
chưa thụ tinh.
+ Dạng môi trường chủ yếu là môi trường đặc.
+ Để cảm ứng được sự trịnh sinh cần thiết phải bổ sung vào môi trường các chất điều
tiết sinh trưởng thực vật.
+ Nồng độ đường của môi trường nuôi cấy là 1 yếu tố phải quan tâm. Nồng độ đường
giao động tùy thuộc đối tượng nuôi cấy, ví dụ: đối với lúa nồng độ đường thường phù hợp là
3-6%, đối với cây hành là 10%...
+ Trong nhiều trường hợp, việc bổ sung nước dừa vào môi trường lam tăng khả năng
tạo callus phát sinh phôi và tái sinh cây.
- Điều kiện nuôi cấy
+ Quá trình nuôi cấy thường duy trì ở nhiệt độ ổn định: 25-280C.
+Đối với đa số loài, thường giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy( tạo callus) tiến hành
trong điều kiện tối, giai đoạn tái sinh cây tiếp theo sau yêu cầu chiếu sáng: 2000-3000lux.
- Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng con đường trinh nữ sinh biến động ở các loại cây khác nhau. Đối
với hành, củ cải đường tỷ lệ này là 5-20%; ỏ lúa 1,5- 12 %; ở dâu tằm 3-6%...
- Một lợi thế của con đường này là các cây tái sinh rát ít bị bạch tạng. Ngay cả với các loài hòa
thảo, hầu như các cây tái sinh khi nuôi cấy noãn chưa thụ tinh đều là cây xanh. Trong khi trên
các đối tượng này các cây tái sinh từ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn có tỷ lệ cây bạch tạng
chiếm tới 60-90%.
- Bằng phương pháp này đã tạo được trực tiếp các hạt ngô đơn bội in vitro với tỉ lệ 4-5%.
- Trong các cây ngũ cốc, ở cây ngô việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tương đối đơn giản và
thu được nhiều thành công hơn cả. Phương pháp nuôi cấy cùng 1 lúc nhiều noãn chưa thụ tinh
trên 1 phần lõi bắp ngô đã được thực hiện thành công ở Trung Quốc và Việt Nam.
Ví dụ: Viện di truyền nông nghiệp đã thành công trong nuôi cấy noãn chưa thụ tinh của cây
ngô theo 2 phương pháp: tái sinh cây từ noãn chưa thụ tinh tách rời và tái sinh cây từ noãn
chưa thụ tinh trên mô nuôi.
Câu 20: Tế bào trần là gì? Khả năng ứng dụng của tế bào trần trong công tác chọn
giống cây trồng ? cho ví dụ cụ thể để làm rõ các ứng dụng đã nêu
Trả lời

20


CôngBùi



1. Tế bào trần
Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào chỉ còn phần chất
nguyên sinh, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân biệt bên
trong và bên ngoài tế bào trần.
Tế bào trần được tách ra từ các mô hoặc các cơ quan khác nhau ở cây như lá, rễ, mô
sẹo nuôi cấy in vitro. Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách: từ dịch huyền phù
tế bào, tế bào mô sẹo hoặc từ mô tươi nguyên trạng như lá qua tác động của các enzym;
Pectinase phân hủy pectin, cellulas phân hủy hemicellulose. Các tế bào trần nếu để trên
môi trường dinh dưỡng thì sau 5-10 ngày sẽ tạo vách tế bào và phân chia.
Protoplast là cơ sở quan trọng cho các biện pháp lai soma và chuyển nạp gen nhằm cải
tạo các giống cây trồng.
2. Khả năng ứng dụng của tế bào trần trong công tác chọn giống cây trồng. Ví dụ
- Dung hợp tế bào protoplast (lai soma, lai vô tính tế bào thực vật)
+ Protoplast là các tế bào trần, không có vách cứng. Do vậy chúng có thể dung hợp vào
nhau để tạo tế bào lai vô tính mà vật chất di truyền gồm cả 2 hệ gen của 2 tế bào khác
nhau. Từ tế bào lai soma có thể hình thành cây lai. Bằng phương pháp dung hợp
protoplast có thể tạo ra con lai xa giữa hai loài khác nhau điều mà không thể thực hiện
bằng con đường lai hữu tính thông thường. Melcher (1977) dung hợp protoplast của cây
cà chua với khoai tây. Hai dạng cây lai đã được phát hiện. Dạng thứ nhất cây lai có hệ
gen lục lạp của khoai tây ( gọi là potatoes) và dạng thứ 2 có hệ gen lục lạp của cà chua
(topatoes). Hai dạng cây này đã hình thành bộ phận giống như củ nhưng hoa lại bất thụ.
Nhiều nhà khoa học cũng tiến hành dung hợp protoplast của nhiều loài khác nhau như
dung hợp protoplast của đỗ tương với lúa nước, thuốc lá và đỗ tương đã thu được cây lai

chỉ sống trong thời gian ngắn.
+ Các nhà chọn giống đã tạo ra đượ nhiều giống mới như khoai tây, cà chua chống virus,
chống rệp hoặc cây cải dầu, thuốc lá chống nấm, chống virus.
- Chọn dòng tế bào
+ Tế bào thực vật có vách xenlulose thường có kích thước lớn. Do vậy việc xử lý chọn
dòng tế bào với số lượng lớn là khó thực hiện hơn nhieeuf so với chọn lọc các vi sinh vật
có kích thước nhỏ hơn.
+ Khi loại bỏ vách xenlulose để tạo thành tế bào trần thì các tế bào riêng rẽ này có kích
thước nhỏ tương đương với tế bào vi sinh vật. Do vậy có thể sử dụng phương pháp chọn
dòng tế bào như phương pháp sử dụng đối với vi sinh vật.
+ Mỗi đĩa peptri có đường kính khoảng 5 – 7 cm cho phép nuôi cấy 5.106 tế bào trần
(protoplast của cây thuốc lá). Muốn nuôi hết 5.106 cây thuốc lá trên để kiểm tra cần
khoảng 100 ha đất canh tác. Do vậy cần phải tìm biện pháp chọn lọc bằng xử lý đột biến.
Ví dụ: các đột biến kháng với các chất kháng sinh rồi nuôi trong môi trường chứa kháng
sinh thì có thể chọn lọc dòng tế bào mong muốn. Nhìn chung các biện pháp chon lọc
dòng có thể phân biệt bằng hình thái cây lai, sử dụng gen đánh dấu hoặc sử dụng môi
trường chọn lọc thích hợp để chon lọc dòng.
- Biến nạp di truyền và chọn lọc cây chuyển gen
Tế bào trần không có vách xenlulose thuận lợi cho dùng phương pháp biến nạp gen, từ đó
tạo ra cây chuyển gen. Người ta đã chuyển nhiều gen quan trọng như gen chống sâu, chịu
thuốc diệt cỏ, gen kháng nấm, gen chịu hạn…vào tế bào thần của lúa, ngô, khoai tây . v.
v…để tạo ra cây trồng mới có đặc tính mong muốn.

21


CôngBùi

Câu 22: Mục đích điều kiện và cách tiến hành thụ phấn in vitro:
1. Mục đích:
- Khắc phục sự bất hợp trước thụ tinh khi lai xa.
- Thụ phấn, thụ tinh ở điều kiện in vitro tạo cơ hội sản xuất các phôi lai giữa các loài thực
vật không thể lai bằng các phương pháp gây giống cây trồng truyền thống.
2. Điều kiện có thể thụ phấn in vitro
- Phải nuôi cấy được bầu quả hay noãn trần của cây mẹ.
- Chủ động điều khiển quá trình nảy mầm của hạt phấn cây bố trên điều kiện vô trùng.
- Tiến hành thụ phấn để sự thụ tinh diễn ra và nuôi cấy hợp tử phát triển thành phôi lai
trên môi trường dinh dưỡng vô trùng.
3. Các bước tiến hành:
- Lấy nụ của hoa mẹ ở thời điểm trước khi nở hoa 2 ngày, khử trùng, tách lấy bầu quả hay
lá noãn nuôi cấy invitro.
- Lấy nụ hoa của cây bố vào ngày nở hoa, khử trùng, tách lấy bao phấn và để trong điều
kiện vô trùng đến khi chúng tung phấn.
- Lấy hạt phấn rắc trực tiếp lên mặt cắt của bầu quả hay lá noãn để thụ phấn in vitro.
- Khi noãn thụ tinh, chúng hình thành hợp tử và tạo phôi. Các phôi lai in vitro thường bỏ
qua giai đoạn ngủ, nghỉ và mọc thành cây in vitro.
* Các phương pháp thụ phấn in vitro
a. Thụ phấn bằng phương pháp cắt ngắn vòi nhụy
- Là phương pháp dễ và hiệu quả. Núm nhụy và 1 phần hoặc toàn bộ vòi nhụy của hoa
được cắt ngắn, sau đó hạt phấn của cây bố được thụ trực tiếp lên vòi nhụy đã cắt ngắn và
kết quả là có rất nhiều ống phấn đã kéo dài được tới bầu nhụy.
- Nhược điểm: số lượng hạt trong 1 quả ít. Có thể do ống phấn gặp khó khăn trong khi
đâm xuyên qua vách bầu.
b. Thụ phấn bằng phương pháp ghép vòi nhụy
- Hạt phấn cần thụ được “gửi” trên 1 núm nhụy thích hợp và nảy mầm, 1 ngày sau vòi
nhụy và 1/3 bầu của hoa chứa hạt phấn được cắt và ghép lên 3/4 bầu nhụy của hoa cây
mẹ cần thụ phấn.
- Theo Vantuyl và cộng sự(1991) thì một ngày sau khi “gửi” hạt phấn vòi nhụy được cắt

ngắn cách trên bầu 1-2mm và được gắn lên bầu nhụy của hoa cây mẹ. Bầu và vòi nhụy
ngoài đồng ruộng được kết hợp với nhau = ống nối còn trong invitro chỉ cần sử dụng agar
để cố định là đủ.
c. Thụ phấn cho giá noãn
- Bầu được cắt theo chiều dọc thành nhiều miếng vào ngày núm nhụy tiết ra dịch nhầy
hoặc 1-2 ngày sau đó. Mỗi 1 miếng sẽ chứa 1 giá noãn và 1 hàng noãn, có thể để lại hoặc
không để lại vách bầu. Một lượng lớn hạt phấn cần thụ được đặt theo giá noãn. Để kích
thích hạt phấn nảy mầm và đâm xuyên vào noãn có thể đặt vào môi trường nuôi cấy 1
hay 2 vòi nhụy.
- Có thể nuôi cấy ngoài sáng hay trong tối. Noãn nảy mầm sau 5-7 tuần thụ phấn và tiếp
tục được thụ phấn
- Thụ phấn bên trong bầu (intraovarian pollionation): cả vòi nhụy hoặc 1 phần của nó có
thể được tách ra và hạt phấn hoặc được đặt trên bề mặt vết cắt bầu quả hoặc chuyển qua
lỗ trên thành vòi nhụy đến bầu quả.

22


CôngBùi



Câu 24: Biến dị dòng vô tính là gì? Nêu các loại biến dị dòng vô tính và nguyên
nhân, cơ chế gây ra các biến dị đó?
Trả lời:
 Khái niệm về biến dị dòng vô tính
Biến dị dòng vô tính là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến dị thể hiện ở các tế bào,
mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin và Scowcropt, 1981). Biến
dị dòng vô tính còn được gọi là biến dị dòng soma.
 Các loại biến dị dòng vô tính

 Các biến dị kiểu gen: là các biến dị có khả năng di truyền, xảy ra với tỷ lệ rất
thấp( 10-5 – 10-7) và không có tính thuận nghịch. Chúng được chia làm 3 nhóm
chính:
o Các đột biến hệ gen: là các biến đổi về số lượng NST. Loại phổ biến là sự sai
khác về số lượng NST như đa bội, dị bội hay thể khảm. các loài có độ bội cao và
nhiều số lượng NST thường dễ bị biến đổi hơn những loài cso mức bội thể thấp
và ít NST.
o Các đột biến NST: là các biến đổi về cấu trúc NST. Các thay đổi này có thể bao
gồm các hiện tượng như mất đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hay nhân đoạn (tạo ra các
NST lớn hơn), chuyển đoạn và các biến đổi trong quá trình giảm phân.
o Các đột biến gen hay đột biến điểm là các biến đổi ở mức phân tử gồm: sự thay
đổi của một cặp bazo, thay đổi về số lượng bản sao của một trình tự đặc thfu, sự
thay đổi trong biểu hiện của các nhóm đa gen hay sự thể hiện của các gen nhảy.
 Các biến dị kiểu hình:
o Không liên quan đến sự thay đổi về trình tự của AND mà liên quan đên sự
thay đổi trong quá trình thể hiện của một gen nhất định. Điển hình là các quá
trình khuếch đại và methyl hóa gen.
o Các thay đổi về kiểu hình có thể tạm thời, không có tính di truyền, có thể phục
hồi trạng thái ban đầu và có tỷ lệ cao( 10-3). Tuy nhiên chúng có thể duy trì
trong suốt chu kỳ sống của các cây tái sinh
 Các nguyên nhân chính gây biến dị dòng vô tính:
 Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy
o Các mẫu cấy trên thực tế bao gồm nhiều loại tb khác nhau như là phloem,
xylem, nhu mô, mô vỏ… những tb này có thể có mức độ bội thể khác nhau.
Nói cách khác, có sự đa dạng tb giữa các loại tb trong cùng một mẫu cấy. Sự
đa dạng tb như vậy thường gọi là “polysomatic” (đa bội vô tính). Các loài như
lúa mỳ, thuốc lá đã được công bố là có các mô đa bội như thế.
o Nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm. Chúng chứa những lớp tb hoặc mô có
cấu trúc di truyền khác nhau được phát hiện từ meristem cso chứa lớp hay bộ
phận mô bị đột biến. Hiện tượng này đặc biệt phổ biến ở các cây thân gỗ.

 Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy
o Loại và nồng độ chất điều tiết sinh trưởng sử dụng
Các mô nuôi cấy dài ngày trong môi trường chứa các auxin mạnh như 2,4-D
hoặc 2,4,5-T thường gây ra các sai khác trong các cây tái sinh. Thí dụ các cây dừa
dầu tái sinh từ callus nuôi cấy dài ngày trên môi trường có chưuas 2,4-D có tỷ lệ
rất lớn các biến dị khi trồng trên đồng. Ở nho các tb phôi nuôi cấy kéo dài trong
vài năm đã mất dần khả năng phân hóa và tái sinh thành cây. Khi nuôi cấy tiểu
mạch trên môi trường chứa 2mg/l 2,4,5-T làm tăng tỷ lệ trao đổi chéo NST soma,
23


CôngBùi



nhưng khi bổ sung thêm kinetin thì tỷ lệ này giảm và nếu dùng 2,4-D thì không
thấy hiện tượng này.
o Thời gian nuôi cấy và số lần cấy chuyển
Việc nuôi cấy dài ngày trong điều kiện in vitro cũng như tăng số lần cấy
chuyển sẽ làm tăng khả năng xuất hiện các biến dị soma. VD: trong nhân giống in
vitro chuối tiêu “Nainco” sau 5,7,9,11 lần cấy chuyển liên tiếp tỷ lệ biến dị soma
là 1.3%; 1.3%; 2.9%; 3.8% (Rodrigues và cộng sự, 1998).
o Loại mẫu cấy
Các loại mẫu cấy khác nhau thường thể hiện mức độ biến dị khác nhau. Các
mẫu cấy có nguồn gốc từ các thể tiền chồi như chồi nách, chồi đỉnh hay meristem
thường có mức độ biến dị thấp hơn khi sử dụng các mẫu cấy có nguồn gốc không
phải từ đỉnh sinh trưởng như là lá, rễ hay protoplast. Khả năng xảy ra các biến dị
soma còn phụ thuộc vào kiểu gen cũng như tuổi cây mẹ. Các dòng già hơn thường
tiềm ẩn các biến dị sẵn có ở mức cao hơn các dòng trẻ hơn.
o Phương thức nhân giống in vitro

Các phương thức nhân giống khác nhau sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị vô
tính khác nhau. VD: giống chuối tiêu “ Grande Naine ” tái sinh cây qua con
đường tạo phôi vô tính có tỷ lệ biến dị soma 5,3%, còn tái sinh qua con đường tạo
chồi tỷ lệ này là 3,6%. Nhìn chung nếu chồi bất định được tái sinh từ một tế bào
thì cơ hội để xuất hiện các biến dị soma thường là lớn hơn rất nhiều so với các
chồi được tái sinh từ nhiều tb. Các quá trình nuôi cấy tái sinh cây từ callus, huyền
phù hoặc protoplast do đó thường có nhiều biến dị soma.
 Cơ chế gây ra các biến dị vô tính
 Sự thay đổi các kiểu methyl hóa bình thường của DNA genome
o Quá trình methyl hóa là một quá trình mà một nucleotit cụ thể, thường là
adenin hay cytosin – có một nhóm methyl ( CH3 ) gắn liền với nó. Khi quá trình
methyl hóa xảy ra như vậy trong một vùng DNA mã hóa cho một gen hoạt động,
nó sẽ cản trở gen này và gen bị làm cho bất hoạt.
o Việc bất hoạt gen do quá trình methyl hóa có thể có thể không được nhận biết
về mặt hiện tượng. Mặc dầu quá trình methyl hóa do nuôi cấy mô đã được tìm
thấy trong một số loài như ngô, khoai tây và nho, hiện tại chúng ta vẫn chưa biết
tại sao quá trình này đã xảy ra.
 Sự sắp xếp lại của NST
o Sự mất, nhân đôi và tái tổ hợp vô tính là các nguồn chính của các biến dị di
truyền thể hiện ở các dòng soma.
o VD: khi nghiên cứu về cơ chế dẫn đến sự thay đổi trong nhiễm sắc thể, một số
ý kiến cho rằng sự tái bản muộn của vùng dị nhiễm sắc là nguyên nhân chính dẫn
đến các biến dị dòng vô tính ở ngô và đậu lớn.
 Sự hoạt hóa các nhân tố chuyển vị
o Sự tách ra hay xen vào của các nhân tố này ảnh hưởng trực tiếp đến các gen
cấu trúc ở gần nó.
o Hơn thế sự tách ra không chính xác của các nhân tố chuyển vị có thể tạo ra sự
tái sắp xếp của các trình tự nucleotid phụ cận. Chúng là nguyên nhân của sự biến
đổi trong biểu hiện gen và cấu trúc NST.
o Các nhân tố chuyển vị như: Ac – Dx ở ngô, Tnt2 ở cây thuốc lá… được hoạt

hóa trong quá trình nuôi cấy mô.
24


CôngBùi



 Đột biến điểm
o Chúng có thể là đột biến lặn hay trội.
o Các đột biến gen đã được tìm thấy ở các cây cà chua ( 13 đột biến gen đơn
khác nhau ở 230 cây tái sinh), lúa mỳ, thuốc lá, Arabidopsis…
Câu 25. Khả năng ứng dụng của các biến dị dòng vô tính và chiến lược sử dụng đột
biến soma trong chọn tạo giống? Cho VD minh họa.
1. Khả năng ứng dụng
- Phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tưởng song còn thiếu một số tính trạng
mong muốn.
- Phân lập các biến dị có ích để sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp.
- Phân lập các biến dị có ích với khả năng kháng bệnh, chống chịu stress tốt hơn.
- Tạo các biến dị di truyền không qua lai hữu tính ở những dòng ưu tú
- Các biến dị soma sinh ra do cảm ứng là con đường tốt nhất để cải tạo các cây lâu
năm.
- Các hệ thống nuôi cấy tế bào giúp cho các nhà chọn tạo giống có môi trường được
xác định rõ ràng, nơi mà áp lực chọn lọc có thể làm trên hàng ngàn tế bào đơn và có
khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Như vậy, có thể chọn lọc từ lượng rất lớn các
vật liệu di truyền đồng nhất về di truyền và xây dựng các thử nghiệm nhanh chóng
trong 1 vài đĩa petri hay bình nuôi cấy.
- Có thể nghiên cứu 1 loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hay ngược lại vì điều kiện môi
trường đặc thù là có thể tạo ra ở bất cứ đâu.
2. Chiến lược sử dụng đột biến soma trong chọn tạo giống.

25