NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH KẾT HỢP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------

NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN
VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN
ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG
THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------

NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN
VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN
ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG
THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM.

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã Số: 60440118.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người Hướng Dẫn Khoa Học: TS. Phan Thị Tuyết Mai
TS. Bùi Xuân Thành

Hà Nội – 2015


LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.Phan Thị Tuyết Mai,
TS.Bùi Xuân Thành đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành luận văn này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Tạ Thị Thảo cùng các thầy cô
giảng dạy tại Khoa Hóa phân tích đã hết lòng giúp đỡ em trong quá trình học tập
và nghiên cứu.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự hộ trợ kinh phí và thiết bị máy
móc từ đề tài nghị định thư với Cộng hòa Pháp Lotus 2014- 2016, mã số
39/2014/HD- NĐT.
Cuối cùng em xin gửu lời cảm ơn tới gia đình và các bạn học viên,sinh viên
bộ môn Hóa Phân tích đã giúp đỡ em trong thời gian làm luận văn.

Hà nội, ngày 19 tháng 7 năm 2015
Học viên
Nguyễn Thị Ánh Tuyết


MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
CLS

Bình phương tối thiểu thông thường (classical least square)

ILS

Bình phương tối thiểu nghịch đảo (inverse least square)

PLS

Bình phương tối thiểu từng phần (partial least square)

PC

Cấu tử chính (Principal component)

UI
EtOH

Đơn vị quốc tế chuẩn hóa
(international unit)
Ethanol

KLTB

Khối lượng trung bình viên

PCR

Hồi qui cấu tử chính (principal component regression)

PEN

Penicillin


AMO

Amoxicillin

CEP

Cephalexin

Tbot

Tinh bột

CLO

Cloxacillin

SPE

Chiết pha rắn

ACN

axetonitril

AMP

Ampicillin


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

MỞ ĐẦU
Hiện nay hoạt động sản xuất và buôn bán kháng sinh nói riêng và tân dược
nói chung đem đến nguồn lợi nhuận khổng lồ khiến một số tổ chức, cá nhân đã tung
ra thị trường hàng triệu viên thuốc giả mỗi ngày. Thuốc giả không chỉ đánh lừa
người tiêu dùng, còn vô hiệu hóa các liệu pháp điều trị để cứu sống bệnh nhân và
trong rất nhiều trường hợp thuốc giả gây ra tác hại to lớn như gây ra các phản ứng
dị ứng, nhiễm độc kim loại nặng cũng như làm bệnh nhân dễ kháng thuốc. Đại diện
tổ chức Y Tế Thế giới cảnh báo thuốc giả đang chiếm 7-15% tổng số thuốc ở các
nước phát triển, 25% ở các nước đang phát triển, trong đó các nước ở khu vực Châu
Á chiếm 50%. Các mẫu thuốc giả thường được phát hiện chủ yếu là các loại kháng
sinh như Ampicillin, Penicillin…Điều khiến nhiều người quan tâm là tỉ lệ thuốc giả
ở Việt Nam ngày càng một gia tăng và diễn biến trở nên phức tạp hơn dẫn đến công
tác kiểm tra khó khăn hơn.
Vì vậy, vấn đề kiểm định thuốc đúng hoạt chất, và đúng hàm lượng hoạt
chất trong thuốc là một vấn đề hết sức cấp thiết. Hiện nay có rất nhiều phương pháp
xác định hàm lượng kháng sinh hiệu quả cao như phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao ( HPLC), huỳnh quang tia X, các phương pháp quang học hay các phương
pháp điện hóa để phân tích kháng sinh được qui định trong dược điển. Tuy nhiên, hầu
như các phương pháp trên đều được thực hiện trên các thiết bị đắt tiền, chi phí cho quá
trình phân tích tốn kém, quy trình xử lí mẫu và tách chất tốn dung môi và mất nhiều thời

gian không phải phòng thí nghiệm phân tích nào cũng thực hiện được.
Xuất phát từ thực tế này, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xây dựng
phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa
biến để định lượng đồng thời một sốhoạt chất có trong thuốc kháng sinh thuộc họ
β-Lactam”. Với mục tiêu là nghiên cứu quy trình phân tích nhóm β-Lactam bằng
phương pháp phổ hồng ngoại gần với kĩ thuật hồi qui đa biến để kiểm định nhanh
chất lượng lượng thuốc trên thị trường hiện nay.

Chuyên ngành hóa phân tích

7

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về nhóm kháng sinh β-lactam

1.1.1. Khái niệm và phân loạinhóm β-lactam
Kháng sinh là những chất kháng khuẩn (antibacterial substances) được tạo ra
bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes), có tác dụng ức chế sự
phát triển của các vi sinh vật khác [2].
Nhóm β-lactam là một họ kháng sinh rất lớn, bao gồm các kháng sinh có cấu trúc
hóa học chứa vòng β-lactam. Khi vòng này liên kết với một cấu trúc vòng khác sẽ

hình thành các phân nhóm lớn tiếp theo.
Cáckháng sinh β-lactam được chia thành 4 nhóm gồm các penicillin tự nhiên
và

tổng

hợp,cáccephalosporin

bán

tổng

hợp,các

chấtcarbapenem,

monobactam.Trong đó có hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất là nhóm các
penicillin và cephalosporin.
Các penicillin và cephalosporin tự nhiên được chiết tách từ môi trường nuôi
cây nấm penicilium notaum mà nay gọi là penicillin chrysogenum và
cephalosporium aeremonium [2].
1.1.1.1. Nhóm penicillin
Nguồn gốc: Lexander Fleming (1929) phát hiện môi trường nuôi cấy penicillium
notatum, P. chysogenum.Công thức cấu tạo của một số hoạt chất nhóm Penicillin
được đưa ra trong bảng 1.1.

Chuyên ngành hóa phân tích

8

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Bảng1.1. Công thức cấu tạo của một số hoạt chất nhóm Penicillin.
Công thức cấu tạo nhóm Penicillin

R

Tên thuốc

Kháng sinh thuộc họ penicillin có cấu trúc mạch vòng beta- lactam (amin nội
vòng) gắn với mạch ngang R-CO-NH, được gọi là các amin của 6-Amino
penicillanie (A.6.A.P) có công thức chung R – C9H11N2O4S [4,7].
Tính chất: Là chất bột màu trắng, dễ bị phá hủy trong môi trường oxi hóa, môi
trường có tính kiềm và nhiệt độ cao, hoặc do tác dụng của nước, của men penicillin
naza (do vi khuẩn đường ruột hay vi khuẩn Gr (-) sinh ra.
Phân loại:
Sự thay đổi nhóm thế trong cấu trúc của penicilin bán tổng hợp dẫn đến sự thay
đổi tính bền vững với các enzym penicilinase và β-lactamase, thay đổi phổ kháng
khuẩn cũng như hoạt tính kháng sinh trên các chủng vi khuẩn gây bệnh.
Dựa vào phổ kháng khuẩn, có thể tiếp tục phân loại các kháng sinh nhóm
Penicilin thành các phân nhóm với phổ kháng khuẩn tương ứng bảng như sau:
•

Penicillin nhóm 1: Các penicillin phổ kháng khuẩn hẹp gồm Gồm:
benzylpenicilin (penicillinG), phenoxymethylpenicilin (penicillin V),

Chuyên ngành hóa phân tích

9

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

penicillin chậm (procain benzylpenicilin, benzathin benxylpenicilin và
benethamin penicillin).
• Penicillin nhóm 2: Các penicillin phổ kháng khuẩn hẹp đồng thời có tác
dụng trên tụ cầu gồm Methicillin, oxacillin, Cloxacillin (CLO),
Dicloxacillin, Nafcillin.
Dược động học
Tất cả các thuốc (trừ methicilin) đều bền với axit dạ dày và hấp thu tốt
qua đường tiêu hóa.Thức ăn làm giảm hấp thu nên dùng trước và sau khi
ăn một giờ.
• Penicillin nhóm 3: Các penicillin phổ kháng trung bình gồm ampicilin và
amoxilin.
• Penicillin phổ rộng: Hay penicillin chuyên trị vi khuẩn nhóm
Pseudomonas aeruginosa gồm 2

nhóm nhỏ là Carboxypenicilin và

-

Ureidopenicilin
Carboxypenicilin: Gồm các thuốc: carbenicilin, ticarcilin, temocilin…có

-

phổ kháng khuẩn giống aminopenicilin nhưng rộng hơn.
Gồm các thuốc azlocilin, mezlocilin, piperacilin có phổ kháng khuẩn
giống carboxypenicilin cộng thêm Klebsiella và một số vi khuẩn Gr (-)

khác.
1.1.1.2.Nhóm cephalosporin
Nguồn gốc:
Cephalosporin trong tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm
Cephalosporin acremonium có hoạt tính kháng khuẩn thấp nên không được dùng
trong lâm sàng. Các cephalosporin hiện đang dùng là các chất bán tổng hợp từ 7amino-cephalosporinic (7ACA).Cấu trúc vòng 7ACA cũng dễ bị cephalosporinase
phá hủy làm mất tác dụng kháng khuẩn.
Cấu trúc chung gồm vòng β- lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh.
Khi thay đổi các gốc R được các cephalosporin có độ bền,tính kháng khuẩn và dược
động học khác nhau.
Công thức hóa học:

Chuyên ngành hóa phân tích

10

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Cấu trúc hóa học của các kháng sinh nhóm cephalosporin đều là dẫn xuất của
Axit 7-aminocephalosporanic (viết tắt là A7AC). Các cephalosporin khác nhau
được hình thành bằng phương pháp bán tổng hợp.Cấu trúc chung gồm vòng βlactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh. Khi thay đổi các gốc R 1, R2 được các
cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau. Công thức
cấu tạo của một số hoạt chất trong nhóm cephalosporin được đưa ra trong bảng 1.2.
Phân loại:
Dựa vào phổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ.Các
cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn G+ mạnh hơn nhưng trên vi
khuẩn G- yếu hơn thế hệ sau. Các tên thuốc sử dụng các thế hệ Cephalosporin được
đưa ra trong bảng 1.3.

Bảng 1.2.Công thức cấu tạo của các hoạt chất trong nhóm cephalosporin.

Chuyên ngành hóa phân tích

11

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Bảng 1.3.Các thế hệ Cephalosporin.

Chuyên ngành hóa phân tích

12

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Thế hệ

Tên thuốc
Cefazolin
Cephalexin

Cephalosporin thế hệ 1

Cefadroxil
Cefoxitin
Cefaclor
cefafrozil

Cephalosporin thế hệ 2

cefuroxim
cefotetan
ceforanid
Cefotaxim
Cefpodoxim
Ceftibuten

Cefdinir
Cefditoren
Ceftizoxim
Ceftriaxon

Cephalosporin thế hệ 3

Cefoperazon
Ceftazidim
Cephalosporin thế hệ 3

Cefepim

1.1.1.3.Các kháng sinh β-lactam khác.
Carbapenem
Dẫn xuất tự nhiên là thienamycin được lấy từ Streptomyces catteifa nhưng
không bền nên không dùng trong điều trị.
Imipenem là dẫn xuất của N-formidoyl và meropenem là dẫn xuất của
demethylcarbamoyl pyrolidinyl của thienamycin bền vững hơn.
Monobactam:

Chuyên ngành hóa phân tích

13

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Kháng sinh monobatam là kháng sinh mà công thức phân tử có chứa β-lactam
đơn vòng.Chất điển hình của nhóm này là aztreonam.
1.1.2. Tính chất vật lývà hóa học các kháng sinh nhóm β- Lactam
Các β- Lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong
nước, dạng muối natri và kali dễ tan, tan được trong metanol và một số dung môi
hữu cơ có độ phân cực vừa phải, tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần
chứa đồng thời nhóm -COOH và –NH2.
Cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy thuộc vào cấu trúc khác làm
dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài,
giảm độ hấp thụ).
•

Tính chất hóa học các kháng sinh nhóm β- Lactam

Tính không bền của vòng β-lactam:
Sự tấn công của các tác nhân thân điện tử (An): Các bazơ mở vòng azetidin-2on, tạo ra những dẫn xuất của axit cephalosporic không có hoạt tính sinh học [5].
Ví dụ: các bazơ (NaOH, KOH) đậm đặc tạo muối của axit cephalosporic.
Tính axit:
Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa=2,5-2,8 tùy vào cấu trúc
phân tử.Trong môi trường axit hoặc kiềm, β-lactamcó tác dụng phân cắt khung phân
tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.
Các penicillin là các axit khó tan trong nước, dạng muối natri hoặc kali dễ tan
dùng để pha thuốc tiêm.
Các cephalosporin có vòng β-lactam đều kém bền do cộng hưởng amid không
tồn tại. Cộng hưởng amit mất đi chủ yếu còn do có cộng hưởng “en-amin”.
So với penicillin thì các cephalosporin bền với axit hơn, tuy nhiên do cộng
hưởng en-amin mà phản ứng cộng hợp ái điện tử vẫn xảy ra tại trung tâm (-), kéo
theo cắt đứt đường nối amit. Đó là quá trình thủy phân axit, chất đầu tiên tạo thành

là axit cephalosporoic.Các cephalosporin có tính axit khá mạnh của axit α, β không
no.

Chuyên ngành hóa phân tích

14

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Phản ứng chuỗi acilamino
Bản chất của chuỗi acilamino ở 7-β xác định tính bền của cephalosporin.Một
sự cản trở không gian tạo ra ở gần vòng β-lactam thì không thuận lợi cho tác dụng
của β-lactam và vì vậy có tác dụng bảo vệ.
Phản ứng của nhóm thế R2 ( nhóm R2 thuộc cấu trúc cephalosporin)
Sự thay đổi nhóm thế R 2 tạo ra nhiều cephalosporin bán tổng hợp khác nhau.Vì
vậy, phản ứng tại các nhóm thế này rất quan trọng. Sự thay đổi trên R 2 làm thay đổi
đặc tính dược động học phân tử .
1.2.

Các phương pháp phân tích định lượng nhóm kháng sinh β-lactam.

1.2.1. Phương pháp đo quang
Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang
học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang…Các phương
pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định βlactam, đặc biệt trong dược phẩm [8 ].

Các β-lactam hấp thụ các tia UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ. Chúng
tạo thành phức chất với một số ion kim loại hoặc tham gia phản ứng quang hóa giúp
nâng cao độ nhạy của phép đo.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5147-90 đã qui định phương pháp gián tiếp sử
dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS xác định Penicillin tổng số trong thịt và
sản
phẩm thịt, dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. Phương pháp này dựa
vào phản ứng tạo phức đặc trưng và hoàn toàn định lượng của cadimi với thuốc thử
phenantrolin-cadimi sinh ra phức bền. Chiết phức này bằng nitrobenzen và đo phổ
hấp thụ nguyên tử AAS của kim loại cadimi trong phức ở pha hữu cơ, hay phân hủy
pha hữu cơ lấy cadimi vào dung dịch HCl 1% và đo phổ của cadimi. Phương pháp
này phức tạp, không đặc trưng và chỉ xác định được lượng tổng Penicillin.
Wei Liu và cộng sự [36] đã sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ
luminol – K3Fe(CN)6 kết hợp với phương pháp chiết pha rắn để phân tích một số β-

Chuyên ngành hóa phân tích

15

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

lactam trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0,5mg/l, cefadin là 0,04 mg/l, CEP là 0,1
mg/l .
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các
phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và

trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích việc
xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần
thủy phân mới phát hiện cũng được.
Sheikha M. Al- ghannam [35] cũng đã sử dụng phương pháp hấp thụ nguyên
tử AAS để xác định hai hợp chất của cephalosporins (Cephalexin monohydrate và
Cephradine). Các quy trình này dựa trên sự tạo phức cặp ion giữa các thuốc với
muối ammonium reineckate. Các kết tủa tạo thành dùng để định lượng hoặc bằng
phương pháp đo quang trắc hoặc bằng phương pháp AAS. Các phương pháp này
gồm phản ứng của các thuốc với muối. Reinecke trong môi trường axit ở nhiệt độ
25 ± 20. Quy trình phép phổ quang kế (quy trình 1) dựa trên sự hòa tan tạo kết tủa
bằng axeton, đo độ hấp thụ của dung dịch tại bước sóng 525 nm. Còn đối các quy
trình phổ hấp thụ AAS (quy trình 2) được định lượng trực tiếp hay gián tiếp thông
qua sự tạo thành các kết tủa crom hay lượng crom dư không phản ứng trong dung
dịch lọc tại bước sóng 358,6 nm. Theo định luật Lambert – Beer cho nghiên cứu các
mẫu thuốc trong khoảng 0,1-1,5 mg mL-1 cho phổ quang kế và 5-70 μg mL-1 cho
phương pháp AAS, hệ số tương quan ≥ 0,9965. Cả hai phương pháp đều có độ
chính xác khi phân tích các cephalosporins trong các mẫu thuốc và đều cho phần
trăm độ thu hồi tốt từ 98,90 ± 0,94 đến 100,15 ± 0,97 mà không cần thêm phụ gia.
1.2.2. Các phương pháp sắc ký
Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 197-2004 qui định phương pháp định lượng
Penicillin [13] trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản được tách ra khỏi nền mẫu bằng dung dịch đệm
phosphat, pH= 9, làm sạch và cô đặc dịch chiết trên cột Bond Elut C18, dẫn xuất
hoá và định lượng bằng HPLC với detector PDA. Qui trình này trải qua quá trình
dẫn xuất phức tạp và mới chỉ dừng lại ở phạm vi thuỷ sản.

Chuyên ngành hóa phân tích

16

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

TitusA.M.Msagati và cộng sự [4] đã xác định lượng dư các β-lactam trong thực
phẩm bằng sắc ký lỏng – khối phổ bằng hỗn hợp đệm phosphat,
tetraetylammoniumclorua (Et4NCl) và acetonitril.Sau đó, các β-lactam sẽ được tách
và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ chế độ ion dương (LC-PI-ESI-MS). Giới
hạn phát hiện của phương pháp này đối với penicillin G và penicillin V trong gan và
bầu dục là là 1 ng/kg, trong sữa là 0,7 µg/l.
Helio A.Martins-Júnior [25] cũng đã sử dụng phương pháp LC/MS để xác định
lượng dư kháng sinh có trong sữa. Mục đích của nghiên cứu này nhằm phát triển
một phương pháp phân tích mới đơn giản và nhanh chóng để xác định và định
lượng mười bốn kháng sinh từ các mẫu sữa khác nhau .Trong đó, có năm β-lactam,
bốn sulfonamides, ba tetracycline, một macrolid và một cephalosporin. Các chất
này đều được xác định trong khoảng nồng độ 0,75-3,75 mg L -1, hệ số tuyến tính (r2)
cao hơn 0,9960, với thời gian phân tích ít hơn 10 phút. Giới hạn định lượng thấp
nhất và cao nhất của Dicloxacillin và erythromycin tương ứng 0,05 và 9,77 µg L -1,
có hiệu suất thu hồi dao động từ 65-125%, độ lệch chuẩn từ 2,0 to 15%.
Phương pháp bằng sắc ký lỏng khối phổ-tandem (LC-MS / MS) cũng đã được
Frédérique van Holthoon và các cộng sự [23] sử dụng để xác định tám penicillin
trong các mô của heo, sữa và thức ăn gia súc . Kết quả đạt độ chính xác dao động
trong khoảng 94-113% (cơ bắp), 83-111% (thận) và 87-103% (sữa) và 88-116%
(thức ăn gia súc). Độ chính xác (độ lệch chuẩn tương đối (RSD) r) trong ngày dao
động từ 5-13% (cơ bắp, n = 18), 4-17% (thận, n = 7) và 5-18% (sữa, n = 7) đến 1132% (thức ăn gia súc, n = 18). Độ chính xác lặp lại giữa các ngày (RSDRL, n = 18)
dao động 6-23% (cơ bắp) để 11-36% (thức ăn gia súc).
Tác giả Yuko Ito và cộng sự [4] thuộc Viện sức khỏe cộng đồng (Nhật Bản)

đã ứng dụng kĩ thuật làm sạch qua cột trao đổi ion để xác định 6 penicillin:
Penicillin G, Penicillin V, Oxacillin, Cloxacillin, Nafcillin, và dicloxacillin trong
thịt. Các penicillin được chiết ra khỏi nền mẫu thịt lợn với nước, nền mẫu thịt bò
với NaCl 2%, làm sạch qua cột chiết pha rắn trao đổi ion và xác định bằng sắc ký

Chuyên ngành hóa phân tích

17

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

lỏng cặp ion với detectơ tử ngoại. Hiệu suất thu hồi của phương pháp từ 73 - 95%.
Giới hạn phát hiện của phương pháp cho các penicillin là 0,02 mg/viên.
Tác giả E.Benito-Pena và các cộng sự [22] đã sử dụng phương pháp HPLC,
detector UV để phân tích đồng thời các kháng sinh β-lactam (penicillin G,
amoxicillin, ampicillin, penicillin V, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin và nafcillin)
trong nước thải. Phương pháp này dựa trên chiết pha rắn (SPE) và sắc ký lỏng hiệu
năng cao. Các penicillin đã được tách ra bằng cách sử dụng cột LUNA C18 (150
mm x 4.6 mm, 5 µm), gradient rửa giải với các pha động bao gồm các axit
trifluoroacetic, dung dịch nước và acetonitril tại bước sóng 220 nm. Hiệu suất thu
hồi đạt trong khoảng 82-97% (RSD 2-9%) cho tất cả các kháng sinh trừ amoxicillin
(52%, RSD 8%), giới hạn phát hiện trong khoảng 8-24 ng L-1.
J.M.Cha và các cộng sự [27] cũng đã dùng phương pháp HPLC – MS để xác
định lượng vết của thuốc kháng sinh β-lactam trong mẫu nước tự nhiên và nước
thải. Mẫu nước được làm giàu bằng chiết pha rắn, cột Xterra MS C18 (2,1mm x

50mm,; 2,5 µm), pha động gồm axit focmic,metanol và acetonitil. Các chất phân
tích bao gồm amoxicillin (AMOX), ampicillin (AMP), oxacillin (OXA), cloxacillin
(ClOx) và cephapirin (CEP). Hiệu suất thu hồi trung bình trong các mẫu thường
trên 75% (trừ amoxicillin) với độ lệch chuẩn thấp hơn 10% trong các mẫu nước.
Amoxicillin có hiệu suất thu hồi kém (dưới 40%). Giới hạn phát hiện phương pháp
(MDL) được ước tính khoảng từ 8 - 10 ng/L với nước bề mặt, 13 - 18 ng / L với
nước thải trước xử lý và 8 - 15 ng / L nước thải sau xử lý của một nhà máy xử lý
nước thải.
Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments cùng các cộng sự [19] đã
sử dụng phương pháp HPLC để xác định 8 hợp chất penicillin (benzylpenicillin,
phenoxymethylpenicillin, ampicillin, amoxicillin, nafcillin, oxacillin, cloxacillin, và
dicloxacillin) ở mức lượng vết trong các mô cơ. Các điều kiện chiết các penicillin
với đệm phosphat có pH = 9 sau khi chiết bằng cột chiết tách pha rắn C18, phản
ứng với anhydrit benzoic ở 500C trong 5 phút và với 1,2,4-triazol, dung dịch thủy
ngân (II ) clorua có pH = 9 ở 650C trong 10 phút. Các hợp chất dẫn xuất được tách

Chuyên ngành hóa phân tích

18

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

rửa trên một cột C18 với pha động chứa acetonitril và đệm phosphat (pH=6; 0,1
mol/L) được nạp với natri thiosunfat và cặp ion tetrabutylammonium-hydro sunfat.
Giới hạn phát hiện phương pháp là khoảng 3-11 µg/l.

1.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại
1.2.3.1.Nguyên tắc phương pháp phổ hồng ngoại FTIR
Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (FTIR) là một trong những kỹ thuật
phân tích rất hiệu quả.Các hợp chất hoá học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ
hồng ngoại.Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất
hoá học dao động với nhiều tần số dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ
hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại
đặc trưng cho các nhóm chức và các liên kết có trong phân tử . Do vậy, phổ hồng
ngoại của một hợp chất hoá học coi như "dấu vân tay", có thể căn cứ vào đó để
nhận dạng chúng.
Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp phổ hồng ngoại
vượt trội hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng
hưởng từ điện tử vv…) là phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử
nhanh, không đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp. Phổ hấp thu hồng ngoại
là phổ dao động quay vì khi hấp thu bức xạ hồng ngoại thì cả chuyển động dao
động và chuyển động quay đều bị kích thích.
Bản chất của phương pháp phổ hồng ngoại là dựa trên hiện tượng các hợp chất
hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ hồng ngoại. Các phân tử chỉ có
khả năng hấp phụ bức xạ hồng ngoại khi chúng phải thỏa mãn 2 yếu tố:
- Một là tần số dao động tự nhiên của một phần phân tử (các nguyên tử và các
liên kết trong phân tử) bằng chính tần số dao động của bức xạ tới.
- Hai là một phân tử chỉ hấp thụ bức xạ hồng ngoại khi nào sự hấp thụ đó gây
nên sự biến thiên momen lưỡng cực của chúng.

Chuyên ngành hóa phân tích

19

Trường ĐHKHTN

Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Do sự hấp thụ chọn lọc này mà khi chiếu chùm bức xạ điện từ với một dải tần
số khác nhau đi qua môi trường vật chất thì sau khi đi qua, chum bức xạ này sẽ bị
mất đi một số bức xạ có tần số xác định nghĩa là các tia này đã bị hấp thụ.
*Các vùng phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại thường được ghi với trục tung biểu diễn độ truyền qua T hoặc
độ hấp thụ A, trục hoành biểu diễn số sóng (cm-1).
- Độ truyền qua T: là tỷ số của cường độ bức xạ truyền qua và cường độ bức xạ tới.
- Độ hấp thụ ánh sáng (A): là logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền quang.
Bức xạ hồng ngoại là một vùng bức xạ điện từ có độ dài bước sóng từ 0,8 đến
1000µm và chia thành ba vùng:
- Vùng hồng ngoại gần (near infrared): 12500-4000 cm -1 (λ = 0,8–2,5µm)
- Vùng hồng ngoại trung (medium infrared): 4000-400 cm -1 (λ = 2,5–50µm)
- Vùng hồng ngoại xa (far infrared): 400-10 cm-1 (λ = 50-100µm).
Hầu hết các nhóm nguyên tử trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ ở vùng 4000650cm-1.
1. Vùng hồng ngoại gần (NIR):

Trong vùng 12500 cm -1 -4000 cm-1 có rất nhiều đám phổ có liên quan đến
nguyên tử H. Trong số đó, dao động co giãn (bội) của O-H gần 7140 cm -1 và N-H
gần 6667 cm-1, đám phổ tổ hợp do các dao động co giãn và dao động biến dạng của
C-H của nhóm ankyl ở 1548 cm-1 và 3856 cm-1..
Độ hấp thụ của đám phổ NIR thấp hơn từ 10 đến1000 lần so với các đám phổ
vùng hồng ngoại giữa.Vùng NIR có thể ghi được với hệ quang học thạch anh, kết
nối với các detectơ nhạy với NIR và nguồn bức xạ mạnh hơn.
∗

Vùng hồng ngoại trung :

Chuyên ngành hóa phân tích

20

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Vùng này được chia thành vùng "tần số nhóm" 4000 – 1300 cm -1 và vùng"dấu vân
tay" 1300 - 650 cm-1. Trong khoảng 4000 – 2500 cm -1 sự hấp thụ đặc trưng cho dao
động co giãn của H với các nguyên tố khối lượng < 19.
Phần chủ yếu trong phổ giữa 1300 và 650 cm -1, là các tần số co giãn của liên
kết đơn và tần số các dao động uốn (các tần số bộ khung) của hệ nhiều nguyên tử.
Đó là vùng "nhận dạng" "(vùng "dấu vân tay").Vùng phổ này hết sức đa dạng, khó
cho việc nhận biết riêng rẽ các đám phổ một cách chắc chắn, nhưng kết hợp các
đám phổ hấp thụ, giúp cho việc nhận biết các chất.
∗

Vùng hồng ngoại xa:
Vùng 667 – 10 cm -1 bao gồm các dao động biên dạng của C, N, O, F với các

nguyên tử khối lượng > 19 và các dao động biến dạng trong hệ thống mạch vòng
hoặc chưa no. Vùng dao động tần số thấp trong phổ hồng ngoại rất nhạy đối với sự
thay đổi cấu trúc phân tử, bởi vậy đám phổ vùng hồng ngoại xa thường cho phép dự
đoán các dạng đồng phân.

1.2.3.2. Cách chuẩn bị mẫu đo hồng ngoại
Một trong các lợi thế vượt trội của phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) là có
thể phân tích được hầu hết các dạng vật chất như: chất lỏng, dung dịch, bột nhão,
bột khô, phim, sợi, khí và các bề mặt…
Các kỹ thuật chụp gồm: truyền qua, phản xạ, tán xạ, phản xạ suy giảm toàn
phần trong đó kỹ thuật truyền qua được sử dụng nhiều nhất.

Chuyên ngành hóa phân tích

21

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

Phổ FTIR của các hợp chất có thể được ghi ở pha hơi, pha lỏng hay ở pha rắn:
•

Mẫu ở thể rắn: Có ba cách đo khi mẫu ở thể rắn:

- Màng nhão: Nghiền nhỏ vài mg chất nghiên cứu với một vài giọt parafin lỏng
(nujol) và ép phần thu được giữa hai tấm NaCl. Để tránh các đỉnh pic hấp thụ mạnh
của parafin ở 2950-2850 cm

-1

và 1450-1350 cm

-1

khi khảo sát sự hấp thụ của các

nhóm C-H, người ta có thể thay parafin bằng hexaclo 1,3-butadien.
- Màng bột: Mẫu được trộn với dung môi, sau đó phết lên bề mặt cửa sổ KBr hoặc
NaCl, chờ đến khi dung môi bay hơi hết tạo thành một lớp màng bột trên cửa sổ thì
tiến hành đo mẫu. Yêu cầu đối với dung môi là không tác dụng với chất đo, dễ bay
hơi và phải khan nước.
- Mẫu ép màng KBr: Trộn mẫu thật đồng đều với KBr, rồi ép thành các viên mỏng
trong suốt bằng máy ép thuỷ lực. Do KBr có tính hút ẩm, trên phổ hồng ngoại
thường xuất hiện các vân hấp thụ của nước ở 3450 cm -1. Khi dùng KBr cũng cầu
lưu ý đến khả năng xảy ra phản ứng trao đổi cation hoặc anion trong trường hợp
chất nghiên cứu là muối hoặc phức chất vô cơ.
• Mẫu dạng màng lỏng:

Khi mẫu ở thể lỏng tinh khiết, người ta có thể chuẩn bị mẫu bằng cách nhỏ một giọt
chất lỏng giữa hai tấm NaCl để có một màng mỏng dày khoảng 0,01-0,1mm, gọi là
màng lỏng. Đây là kỹ thuật ghi phổ đơn giản nhất, thường sử dụng cho chất lỏng có
độ nhớt cao và ít bay hơi.
• Mẫu dung dịch :

Hoà tan chất nghiên cứu bằng dung môi thành dung dịch có nồng độ 1-5%.
Cho dung dịch và dung môi nguyên chất vào hai cuvet có bề dày 0,1-1,0 mm và
bằng việc so sánh hai chùm tia đi qua dung dịch và dung môi có thể loại được vân
hấp thu của dung môi.Kỹ thuật thường sử dụng cho các chất lỏng có độ nhớt thấp và
dễ bay hơi.Dung môi không được phép hấp thụ quá 65% bức xạ chiếu vào vì cường

Chuyên ngành hóa phân tích

22

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

độ bức xạ còn lại sẽ quá yếu. Ngoài ảnh hưởng do bản chất của dung môi, cũng cần
lưu ý đến bề dày của cuvet. Một số dung môi thường sử dụng là CCl 4, CHCl3,
CH2Cl2, Cl2C=CCl2… Mặc dù vùng không hấp thu của CHCl 3 hẹp hơn CCl4 nhưng
khả năng hoà tan các chất của CHCl 3 tốt hơn nên thường được sử dụng nhiều hơn.
Đặc biệt là có thể đo dung dịch đặc hơn trong các cuvet có bề dày nhỏ hơn. Các
cuvet thường có cửa sổ bằng NaCl, KBr, CaF 2 hoặc AgCl thì cửa sổ sẽ bị đen sau
một thời gian sử dụng.
• Mẫu ở thể hơi:

Khi mẫu ở thể hơi, hơi sẽ được đưa vào một cuvet dạng ống có chiều dài
khoảng 10 cm với hai đầu ống được bịt bằng các tấm NaCl hoặc KBr.
Trong thực tế, để phân tích các chất hữu cơ phức tạp, người ta thường sử dụng
máy hồng ngoại được ghép với máy sắc kí khí.Trong hệ thống sắc kí khí-hồng
ngoại (GC/IR), sau khi được tách bằng máy sắc kí khí, mỗi hợp phần đi ra từ cột sắc
kí (tương ứng với mỗi pic trên sắc kí đồ) sẽ được ghi phổ hồng ngoại (thường dùng
FTIR) và được lưu giữ trong bộ nhớ của máy tính. Máy có thể in ra những phổ đồ
hồng ngoại của các hợp phần ứng với các pic trên sắc kí đồ mà ta quan tâm. Nhờ so
sánh các phổ mẫu với thư viện phổ chuẩn lưu trong máy tính, máy có thể chỉ rõ cấu
tạo của các hợp chuẩn hoặc cho biết các nhóm chức có mặt trong hợp phần đó.

1.2.3.2. Ứng dụng của phương pháp phổ dao động
* Định tính các chất
Trước khi ghi phổ hồng ngoại, nói chung ta đã có thể có nhiều thông tin về
hợp chất hoặc hỗn hợp cần nghiên cứu, như: trạng thái vật lý, dạng bên ngoài, độ
tan, điểm nóng chảy, điểm cháy. Nếu có thể thì cần biết chắc mẫu là chất nguyên
chất hay hỗn hợp. Sau khi ghi phổ hồng ngọai, nếu chất nghiên cứu là hợp chất hữu
cơ thì trước tiên nghiên cứu vùng dao động co giãn của H để xác định xem mẫu
thuộc loại hợp chất vòng thơm hay mạch thẳng hoặc cả hai. Sau đó nghiên cứu các
vùng tần số nhóm để xác định có hay không có các nhóm chức. Trong nhiều trường

Chuyên ngành hóa phân tích

23

Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

hợp việc đọc phổ (giải phổ) và tìm các tần số đặc trưng không đủ để nhận biết một
cách toàn diện về chất nghiên cứu, nhưng có lẽ là có thể suy đoán được kiểu hoặc
loại hợp chất. Cũng cần tránh khuynh hướng cố gắng giải và gán cho mọi đám phổ
quan sát thấy, nhất là những đám phổ vừa và yếu trong vùng phổ phức tạp. Mỗi khi
phát hiện một loại chất, người ta so sánh phổ của chất nghiên cứu với phổ của chất
nguyên chất tương ứng để có thể nhận định đúng.
•

Xác định độ tinh khiết sản phẩm

Phổ hồng ngoại được dùng để xác định độ tinh khiết của các chất.Phổ hồng

ngoại của chất không tinh khiết thì thường độ rõ nét của đám phổ riêng biệt bị giảm,
sự xuất hiện thêm các đám phổ sẽ làm "nhoè" phổ [3].Khi tạp chất hấp thụ mạnh IR
mà ở đó thành phần chính không hấp thụ hoặc hấp thụ yếu thì việc xác định rất
thuân lợi.
•

Phân tích định lượng
Phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) còn có thể được ứng dụng trong phân

tích định lượng một chất trong dung dịch hoặc hỗn hợp. Khả năng ứng dụng phổ
FTIR để phân tích định lượng phụ thuộc trang thiết bị và trình độ của các phòng thí
nghiệm. Ngày nay, sự ra đời của các máy quang phổ hồng ngoại hiện đại, sự tăng tỷ
lệ tín hiệu/nhiễu làm cho việc phân tích định lượng càng thêm chính xác và do đó
mở rộng được phạm vi phân tích định lượng. Khi chiếu chùm bức xạ hồng ngoại đi
qua một lớp mỏng vật chất, thì sau khi đi qua cường độ bức xạ bị giảm do bị khuếch
tán hay hấp thụ trong lớp mỏng vật chất. Trong một vùng sóng nhất định thì độ hấp
thụ hay mật độ quang đều tỷ lệ tuyến tính với nồng độ dung dịch.
Nguyên tắc chung của phân tích định lượng bằng phổ hồng ngoại là thiết lập mối
quan hệ giữa tỷ số I0/I ở một bước sóng nhất định với nồng độ chất.
Theo định luậnt Lambert-Beer:
lg (I0/I)λ = ελ.d C
Trong đó: Io, I: Cường độ bức xạ hồng ngoại trước và sau khi qua mẫu.

Chuyên ngành hóa phân tích

24

Trường ĐHKHTN

Luận văn Thạc sỹ khoa học

Nguyễn Thị Ánh Tuyết- K23 Hóa Học

ελ – Hệ số hấp thụ
C – Nồng độ
d – Chiều dày lớp dung dịch hay chiều dày cuvet.
Do vậy, dựa vào phương trình này có thể xác định được hàm lượng của một
chất trong hỗn hợp và độ chuyển hóa của một phản ứng dựa vào cường độ của một
đỉnh píc đặc trưng cho nhóm chức có trong chất đó.
1.3.Ứng dụng của phương pháp phổ hồng ngoại để xác định nhóm kháng sinh
β- Lactam
1.3.1. Kỹ thuật đo hồng ngoại định lượng một hoạt chất trong thuốc
Andréia de Haro Moreno và cộng sự [18]cũng đã tiến hành định lượng
Ceftazidime bằng phương pháp phổ hồng ngoại trên các mẫu dược phẩm dạng bột
để tiêm bằng việc khảo sát cường độ hấp thụ của các đỉnh pic đặc trưng cho vòng
thơm trong vùng 1475-1600 cm-1. Kết quả cho thấy tá dược không làm ảnh hưởng
đến độ chính xác của phép phân tích . Đường chuẩn được thiết lập trong khoảng
nồng độ 0,5 – 0,7 mg, phần trăm hiệu suất thu hồi 98.98 ± 0.70.
Tác giả Macedo Vieira cùng các cộng sự [20] đã sử dụng phương pháp phổ
hồng ngoại để định lượng cefuroxime (CFU) dạng bột dùng để tiêm, phương pháp
này đo cường độ hấp thụ của các đỉnh pic hấp thụ đặc trưng cho vòng thơm trong
vùng từ 1475-1600 cm-1. Khoảng tuyến tính được xác định từ 5,0-20,0 μg.ml -1
(phương trình hồi qui: y = 0,5053x + 0,0114; r 2 = 0,9991). Độ chính xác của
phương pháp được cho là tốt với giá trị RSD gần 2 %, không lớn hơn 5%.
Eliane Gandolpho Tótoli và cộng sự [21] cũng đã phân tích định lượng Natri
Ampicillin dạng bột dùng để tiêm bằng phương pháp phổ FTIR bằng đo cường độ
hấp thụ các đỉnh pic đặc trưng cho các nhóm cacbonyl trong phân tử trong vùng

1800 -1700 cm-1. Hệ số tuyến tính r2 = 0,9993, trong khoảng nồng độ 1- 3mg/viên.

Chuyên ngành hóa phân tích

25

Trường ĐHKHTN