Đề Tài Nghiên Cứu Tách Dòng Và Xác Định Trình Tự Gene Lycopene Beta - Cyclase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
-------------------

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP BỘ

TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GENE LYCOPENE BETA CYCLASE
MÃ SỐ: B2009 – TN03 – 21

Chủ nhiệm đề tài:

ThS. Dương Văn Cường

THÁI NGUYÊN - 2011


1

Phần I
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tổng hợp chủ yếu trong thực
vật, tảo, vi khuẩn và nấm (Schmidt-Dannert et al., 2000). Carotenoid có vai
trò trong hình thành màu sắc, che chắn ánh sáng và hình thành các hormone
(Vershinin, 1999). Trong công nghiệp carotenoid được dùng làm dược phẩm,
thực phẩm dinh dưỡng, chất phụ gia thức ăn cho động vật, phẩm màu làm mỹ
phẩm và thực phẩm (Lee and Schmidt-Dannert, 2002).
Do khả năng chống oxi hóa, carotenoid mang lại lợi ích cho sức khỏe
con người, bảo vệ da dưới tác động của ánh nắng mặt trời, tăng cường chức

năng hệ miễn dịch, ngăn ngừa hay làm chậm quá trình phát bệnh của các
bệnh mãn tính, có tác dụng trong điều trị và phòng ngừa một số bệnh ung thư
(Giovannucci, 1999; Lee and Schmidt-Dannert, 2002; Lenore Arab and Steck,
2000; Lu et al., 2001).
ß-carotene, với vai trò là tiền chất vitamin A, tăng cường hệ miễn dịch
và chống một số bệnh ung thư (Bendich, 2004) đã trở thành một trong những
chất được quan tâm nhất trong nhóm carotenoid. Cơ thể con người không tự
tổng hợp được ß-carotene mà phải hấp thụ từ thức ăn (Fujisawa et al., 2008)
Carotenoids được xây dựng từ đơn phân isopentenyl diphosphate (IPP)
và dimethylallyl diphosphate (DMAPP). Hiện nay đã có hơn 20 gene crt chịu
trách nhiệm tổng hợp nên carotenoids được tách dòng từ các loại sinh vật như
vi khuẩn, vi khuẩn lam, nấm, tảo cho đến thực vật bậc cao (Joseph
Hirschberg, 1997 ). Một trong những vi khuẩn có thể cung cấp các gene
carotenoid để tổng hợp carotenoid là vi khuẩn Pantoea ananatis (trước đây
gọi là Erwinia uredevora) (Misawa et al., 1990). ß-carotene được tổng hợp từ
lycopene nhờ enzyme lycopene cyclase được mã hóa bởi gene crtY.
Hiện nay, mới chỉ có một số carotenoid bao gồm β-carotene, lycopene,
astaxanthin, canthaxanthin, capsanthin, lutein, Annatto, β-Apo-8-carotenal, và
β-Apo-8-carotenal-ester có thể được sản xuất thương mại bằng tổng hợp hóa


2

học, lên men hoặc tách chiết với số lượng nhỏ từ các nguồn có sẵn trong tự
nhiên (Johnson and Schroeder, 1996) . Ngày nay, khi mà các phương pháp
tổng hợp carotenoid bằng thực vật hay hóa học đều có những nhược điểm
nhất định thì phương pháp dùng vi sinh vật để tổng hợp carotenoid thân thiện
với môi trường hơn và có khả năng đáp ứng ngày càng tăng nhu cầu về
carotenoid.
Xuất phát từ những thực tế trên tôi thực hiện đề tài :

“Tách dòng và xác định trình tự gene crtY mã hóa cho enzyme
Lycopene cyclase từ vi khuẩn Pantoea ananatis”.
Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tạo ß-carotene tái tổ
hợp và các hợp chất khác trong nhóm carotenoids.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tách dòng và xác định trình tự gene crtY từ vi khuẩn Pantoea
ananatis
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Thực hiện được quy trình phân lập và tách dòng gene crtY từ vi khuẩn
Pantoea ananatis.


3

Phần II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cơ sở khoa học
2.1.1 Tổng quan về Carotenoids và ß-carotene
2.1.1.1. Carotenoid
Carotenoid : Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tổng hợp chủ
yếu trong thực vật, tảo, vi khuẩn và nấm (Schmidt-Dannert et al., 2000).
Carotenoid có màu từ màu vàng, màu cam tới đỏ (Devitt et al., 2010), được
Wackenroder phát hiện vào năm 1831 khi ông phân lập hợp chất từ cà rốt.
Năm 1837 Berzelius chiết xuất thành công hợp chất màu vàng từ lá mùa thu,
đặt tên là xantophyl. Năm 1911, một nhà khoa học phát hiện sự liên quan của
hai hợp chất này và đặt tên chung là “carotenoid” (Britton et al., 1996).
Năm 1948 Kauren phát hiện ra cấu trúc hóa học của carotenoid. Năm
1950 Kauren lần đầu tiên tổng hợp nhân tạo β-carotene và licopen trong
phòng thí nghiệm. Kể từ đó carotenoid trở thành đối tượng quan tâm của
những nghiên cứu liên ngành trong hóa học, sinh học, y học, vật lí học và

nhiều ngành khoa học khác (Britton et al., 1996).
a. Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa của carotenoid
Cấu trúc hóa học : Cơ sở cấu trúc hóa học của các carotenoid là cấu
trúc polyizopren gồm 40 nguyên tử cacbon, mỗi carotenoid chứa 8 phân tử
izopren (hình 1).

Hình 2. 1: Phân tử izopren
Mạch polyisopren ở nhiều sắc tố tận cùng bằng vòng ionon, một số
khác ở dạng mạch hở. Bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân, các nhà
khoa học đã xác định được vị trí nhóm -CH3 và - CH2 – trong phân tử. Nhóm


4

-CH3 có quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân khác biệt với nhóm - CH2 – được
quyết định bởi sprin và prin của các proton trong hệ thông liên kết đôi đơn
xen kẽ. Phương pháp này đã cho phép xác định được cấu trúc của các nhóm
tận cùng ở các Carotenoid.
Phần trung tâm phân tử carotenoid gồm 18 nguyên tử cacbon hình
thành một hệ thống các liên kết đôi xen kẽ liên kết đơn, trên đó có gắn thêm 4
nhóm CH3. Vòng ở 2 đầu có thể giống hoặc khác nhau như ở lycopen, phần
trung tâm nối liền nối liền với 2 vòng theo kiểu 1-1, ở γ-caroten là 1-2, ở βcaroten là 2-2, …
Tính chất lý hóa : Tính chất lí hóa của carotenoid được quyết định bởi
đặc tính cấu trúc. Các carotenoid có một lượng lớn các gốc kị nước, quyết
định tính kị nước của hợp chất này. Carotenoid không tan trong nước, tan
trong lipit và các dung môi hữu cơ, tính ưa lipit giảm dần khi tăng dần số
nguyên tử oxi.
Carotenoid được tách chiết bằng các dung môi hữu cơ không phân cực
(benzen, ete dầu hỏa…) hay phân cực (ete etylic, rượu, axeton…).
Sự hình thành màu sắc của carotenoid được quy định bởi hệ thống các

liên kết đơn, đôi xen kẽ trong các mạch phân nhánh, phần lớn là những
hidratcacbon được tạo nên từ 40 nguyên tử cacbon liên kết với Hidro hình
thành mạch phân nhánh dài. Màu sắc của carotenoid còn phụ thuộc vào cấu
trúc, trạng thái hòa tan trong các dung môi, dạng tinh thể hay phức hợp, tồn
tại ở dạng đồng phân cis hay trans (Britton et al., 1996).
b. Phân loại carotenoid
Hiện nay đã tìm thấy hơn 600 loại carotenoid khác nhau, được sắp xếp
theo hai nhóm : carotene và xanthophylls (Britton et al., 1996).
Caroten (C40H56) : Là một loại hidratcacbon chưa bão hòa, không tan
trong nước, chỉ tan trong lipit và các dung môi hữu cơ. Caroten khi để ngoài
không khí hấp thụ oxi (đến 40% so với trọng lượng), trở thành dạng oxi hóa.
Caroten nguyên chất là các tinh thể có màu đỏ sáng và có ánh kim,
dung dịch caroten có màu đỏ cam.
Phần trung tâm phân tử gồm 18 nguyên tử cacbon hình thành một hệ
thống các liên kết đơn, đôi xen kẽ, có 4 nhóm CH3 mạch nhánh.


5

Các loại caroten quan trọng như α-carotene, β-carotene, γ-carotene và
lycopen.
Xantophyl : Xantophyl là nhóm sắc tố màu vàng sẫm, có công thức
chung là C40H56On (n từ 1-6). Xantophyl là dẫn xuất của caroten, chứa oxi
trong các nhóm hydroxyl, ceto, cacboxyl….
Các Xantophyl quan trọng như Lutein, Zeaxantin.
Oxi trong các nhóm

% ở thực vật
40
2

34
19
4
Ở thanh tảo
Ở tảo nâu

Spiriloxantin

2 nhóm -OH
2 -OH
2 -OH, 2 O< (epoxi)
3 -OH, 1 O<
1 -OH
1 O= (xeto)
2 -OH, 1 O<, 1 O=,
1 nhóm axeton
2 -O-CH3

Astaxantin
Astaxin

2 -OH, 2 O=
4 O=

Xantophyl
Lutein
Zeaxantin
Violaxantin
Neoxantin
Kryptoxanti

Ekinenon
Fucoxantin

Ở tảo và vi
khuẩn

Bảng 2. 1: Những xantophyl thường gặp ở thực vật bậc cao và tảo
c. Sinh tổng hợp carotenoid
Carotenoid đều là hợp chất có mạch 40 cacbon, gồm 8 đơnvị giống
nhau, mỗi đơn vị gồm 5 cacbon phân nhánh (izopren). Các carotenoid được
tạo ra từ tiền chất isopentenyl diphosphate (IPP) và đồng phân của nó
dimethylallyl diphosphate (DMAPP) (Das et al., 2007). Hiện nay đã tìm ra 2
con đường sinh tổng hợp IPP và DMAPP là mevalonate và non-mevalonate
(Hình 2.2)


6

Hình 2. 2 : Con đường sinh tổng hợp IPP và DMAPP
A : Con đường Non-Mevalonate
B : Con đường Mevalonate
Sinh tổng hợp các carotenoid trong sinh vật có nhiều con đường khác
nhau. Carotenoid này có thể chuyển hóa thành carotenoid khác và ngược lại.
Quá trình chuyển hóa giữa các carotenoid được quy định bởi các gene mã hóa
cho các enzyme xúc tác quá trình chuyển hóa (hình 2.3).


7

Hình 2. 3: Con đường sinh tổng hợp các carotenoid trong sinh vật

A: con đường sinh tổng hợp của C30
B: con đường sinh tổng hợp của C40
C: con đường sinh tổng hợp của C50
d. Vai trò của carotenoid
Carotenoid có vai trò trong hình thành màu sắc, che chắn ánh sáng và
hình thành các hormone (Vershinin, 1999). Trong công nghiệp carotenoid
được dùng làm dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, chất phụ gia thức ăn cho
động vật, phẩm màu làm mỹ phẩm và thực phẩm (Lee and Schmidt-Dannert,
2002).
Ở thực vật, carotenoids đóng một vai trò trong trung tâm phản ứng
quang hợp. Carotenoids tham gia vào quá trình chuyển giao năng lượng, bảo
vệ trung tâm phản ứng. Ngoài ra carotenoids còn có ý nghĩa đối với chức


8

năng sinh sản, là thành phần của giao tử đực và giao tử cái. Ở thực vật bậc
cao, carotenoid quyết định màu vàng của phấn hoa (Thủy, 2005).
Cơ thể con người không tự tổng hợp được carotenoids mà phải hấp thụ
từ thức ăn (Fujisawa et al., 2008). Hiện nay, phát hiện khoảng 50 loại
carotenoid trong thực phẩm mà con người sử dụng hằng ngày trong đó 15 loại
carotenoid được tìm thấy trong máu và chúng đang được chứng minh có vai
trò khác nhau đối với sức khỏe và đời sống con người.
Do khả năng chống oxi hóa, carotenoids mang lại lợi ích cho sức khỏe
con người, bảo vệ da dưới tác động của ánh nắng mặt trời, tăng cường chức
năng hệ miễn dịch, ngăn ngừa hay làm chậm quá trình phát bệnh của các
bệnh mãn tính có tác dụng trong điều trị và phòng ngừa một số bệnh ung thư
(Giovannucci, 1999; Lee and Schmidt-Dannert, 2002; Lenore Arab and Steck,
2000; Lu et al., 2001).
2.1.1.2. ß-carotene

a. Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa
Công thức cấu tạo : ß-carotene có công thức cấu tạo là C40H56 (hình
2.4).

Hình 2. 4 : Công thức cấu tạo của ß-carotene
Tính chất lý hóa : ß-carotene có màu vàng cam, thường thấy trong các
phần xanh của thực vật và các loại rau quả có màu da cam như cà rốt, bí ngô,
đào, khoai lang đỏ, … (Thủy, 2005).
ß-carotene rất nhạy cảm với oxy trong không khí và ánh sáng. ßcarotene tan trong lipid và các chất hoà tan lipid, không tan trong nước (Thủy,
2005).


9

b. Vai trò của ß-carotene
ß-carotene, với vai trò là tiền chất vitamin A, tăng cường hệ miễn dịch
và chống một số bệnh ung thư như : ung thư tiền liệt tuyến, ung thư dạ dày,
ung thư đại tràng, ung thư da, ... (Bendich, 2004) đã trở thành một trong
những chất được quan tâm nhất trong nhóm carotenoid. Cơ thể con người
không tự tổng hợp được ß-carotene mà phải hấp thụ từ thức ăn (Fujisawa et
al., 2008).
Cơ thể con người có thể chuyển ß-carotene thành vitamin A. Quá trình
chuyển hoá các ß-carotene thành vitamin A trong cơ thể (hình 2.5) xảy ra chủ
yếu ở thành ruột non và là một quá trình phức tạp. Carotene không chuyển
thành vitamin A hoàn toàn mà chỉ khoảng 70 – 80% (Thủy, 2005).

Hình 2. 5 : Quá trình chuyển hoá β-carotene thành vitamin A
c. Sinh tổng hợp
Trong con đường sinh tổng hợp carotenoid, ß-carotene được tổng hợp
từ lycopene nhờ enzyme lycopene cyclase được mã hóa bởi gene crtY (hình

2.6).


10

Hình 2. 6 Con đường sinh tổng hợp carotenoid
2.1.2. Vi khuẩn Pantoea ananatis và gene crtY
Hiện nay, đã có hơn 20 gene crt chịu trách nhiệm tổng hợp nên
carotenoids được tách dòng từ các loại sinh vật như vi khuẩn, vi khuẩn lam,
nấm, tảo cho đến thực vật bậc cao (Joseph Hirschberg, 1997 ). Một trong
những vi khuẩn có thể cung cấp các gene carotenoid để tổng hợp carotenoid là
vi khuẩn Pantoea ananatis (trước đây gọi là Erwinia uredevora) (Misawa et
al., 1990).
Pantoea ananatis là vi khuẩn gam âm thuộc chi Pantoea, họ
Laspeyresiini, bộ Enterobacteriaceae, phân lớp Eubacteriales, lớp
Schizomycetes, ngành Proteobacteria. Đây là loài vi khuẩn gây bệnh trên một
số loại cây lương thực và lâm nghiệp như dứa, ngô, gạo, hành tây, dưa hấu,
và bạch đàn, …. (De Maayer et al., 2010). Tuy nhiên hệ gene của Pantoea


11

ananatis có các gene crt mã hóa các enzyme tham gia quá trình sinh tổng hợp
các carotenoid. Một số nghiên cứu đã chỉ ra có thể tách dòng thành công các
gene crtE, crtX, crtY, crtI, crtB, crtZ từ Pantoea ananatis và biểu hiện chúng
trong E.coli sản xuất các hợp chất khác nhau trong nhóm carotenoid (De
Maayer et al., 2010; Misawa et al., 1990).
Gene crtY mã hóa cho enzyme lycopene cyclase tham gia chuyển hóa
lycopene thành ß-carotene (hình 1.1) có chiều dài 1161bp với một bộ ba mã
mở đầu ATG và bộ ba mã kết thúc ATT đã được xác định trình tự nucleoid và

công bố trên ngân hàng gene NCBI với mã số D90087.2.
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tổng hợp chủ yếu trong thực
vật, tảo, vi khuẩn và nấm (Schmidt-Dannert et al., 2000). Hiện nay đã phát
hiện hơn 600 loại carotenoid, chúng đang được nghiên cứu.
Nghiên cứu của Yu và CS về sự tích lũy của carotenoid trong thực vật
bậc cao cho thấy sự tích lũy carotenoid được quy định bởi môi trường, loại
mô và giai đoạn phát triển của cây (Yu et al., 2008). Carotenoid được tích lũy
ở hoa, quả, hạt hoặc rễ và tạo ra các màu sắc khác nhau, từ màu vàng, màu
cam và đỏ (Devitt et al., 2010). Các sắc tố carotenoid trong trái cây là dấu
hiệu của quá trình chín (Blas et al., 2010). Carotenoid có ảnh hưởng đến thành
phần dinh dưỡng, chất lượng trái cây, thời gian sử dụng, và sở thích của người
tiêu dùng (Blas et al., 2010).
Carotenoid có vai trò trong hình thành màu sắc, che chắn ánh sáng và
hình thành các hormone (Vershinin, 1999), carotenoid cũng có vai trò cấu trúc
trong các khu phức hợp quang hợp ở thực vật (La Rocca et al., 2007).
Các con đường sinh tổng hợp carotenoid đã được nghiên cứu trong
nhiều sinh vật bao gồm cả sinh vật có gene carotenoid và sinh vật không có
gene caorotenoid (Devitt et al., 2010).
Kỹ thật di truyền, phân tử đã được ứng dụng để làm thay đổi khả năng
tích lũy carotenoids trong sinh vật. Bằng cách sử dụng can thiệp RNA, nghiên
cứu của Yu, B. và CS đã làm thay đổi khả năng tích lũy carotenoid trong hạt


12

giống của cây Brassica napus. (Yu et al., 2008), nghiên cứu làm tăng lượng
carotenoid trong hạt ngô (Harjes et al., 2008), đu đủ Carica (Blas et al.,
2010). Sử dụng hệ thống vector biểu hiện có chứa các gene crtI, crtY, crtW và

crtZ để sản xuất astaxanthin trong vi khuẩn quang hợp sulfidophilum
Rhodovulum (Mukoyama et al., 2006) ….
Các con đường sinh tổng hợp chính của carotenoids đã được làm sáng
tỏ ở cấp độ phân tử (Armstrong et al., 1990; Linden et al., 1994). Hơn 27 gene
mã hóa cho enzyme tổng hợp lên 150 carotenoid khác nhau đã được nhân bản
từ vi khuẩn, thực vật, tảo và nấm (Sandmann, 1994)
Carotenoid như lycopene, β-carotene và zeaxanthin đã được tổng hợp
trong vật chủ không có gene carotenoid bằng cách đưa các gene sinh tổng hợp
carotenoids vào Escherichia coli (Albrecht et al., 1997).
β-carotene một trong những chất được quan tâm nhất trong nhóm
carotenoid. Các nghiên cứu về β-carotene cho thấy vai trò của β-carotene
trong chế độ dinh dưỡng. β-carotene là tiền chất vitamin A, đây là chất chống
oxi hóa, có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch và chống một số bệnh ung thư
(Bendich, 1989).
Một nghiên cứu khác cho thấy Chế độ ăn uống thiếu vitamin A gây ra
các bệnh về mắt ở 40 triệu trẻ em mỗi năm và có khoảng 140-250 triệu trẻ có
nguy cơ bị rối loạn sức khỏe, tình trạng này đáng báo động ở các quốc gia
châu Phi cận Sahara (Harjes et al., 2008). Sự thiếu hụt vitamin A làm chậm
quá trình phát triển, gây thiếu máu, giảm khả năng đề kháng với nhiễm trùng,
suy giảm sự biệt hóa tế bào xerophthalmia, có thể gây mù lòa và tử vong
(Ribaya-Mercado et al., 2007).
ß-carotene được tổng hợp từ lycopene nhờ enzyme lycopene cyclase
được mã hóa bởi gene crtY. Trên thế giới, gene crtY đã được tách dòng thành
công từ vi khuẩn Pantoea ananatis (trước đây là Erwinia uredovora) (Misawa
et al., 1990). Các nghiên cứu về gene crtY cho thấy quá trình dịch mã tạo sản
phẩm protein tương ứng trong Escherichia coli bắt đầu tại codon mã mở đầu
ATG. Tuy nhiên nghiên cứu của Kim, S. W. và CS chứng minh enzyme này
cũng có thể được sản xuất trong E.coli mà không có sự hiện diện codon mã
mở đầu ATG. Kết quả nghiên cứu cho thấy đột biến điểm trình tự GTG(Val)

13

nằm phía sau trình tự ATG 24 bp có thể hoạt động như một codon mã mở đầu
tiềm năng (Kim et al., 2008). Một nghiên cứu khác chỉ ra enzyme lycopene
cyclase xúc tác cho phản ứng khử oxy hóa không phụ thuộc vào FADred (Yu
et al., 2010).
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở nước ta, carotenoids cũng đã được nghiên cứu, chủ yếu là các nghiên
cứu tách chiết các hợp chất carotenoid từ tự nhiên như : nghiên cứu tách chiết
các hợp chất carotenoid từ gấc Momordica cochinchinensis (Tran Thi Huyen
Nga, 2006), mướp đắng Momordica charantia (Lưu Vân Quỳnh, 2006), từ lá
của một số cây họ bầu bí Cucurbitaceae (Nguyễn Thu Huyền, 2007), cúc vạn
thọ Tagetes erecta L.(Hà Thị Tâm Tiến, 2006 ),…
Nghiên cứu điều tra các hợp chất carotenoid trong thực vật (Hà Thị
Bích Ngọc, 2007), trong một số loài rau (Nguyễn Thị Phương Thảo, 2007)
Nghiên cứu thử hoạt tính một số carotenoid (Nguyễn Văn Phòng,
2008), nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học của carotenoid như lutein (Hà
Thị Tâm Tiến, 2006 ), lycopen (Nguyễn Thị Hải Thanh, 2006), …
Nghiên cứu ảnh hưởng của lutein lên sự sinh trưởng của vi sinh vật bị
chiếu UV tia tử ngoại (Phùng Xuân Lê, 2008). Nghiên cứu tác động sinh học
của carotenoids và chất flavonoid từ lá của một số loài Camellia vàng (Do
Xuan Hoan, 2007), …
Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về tách dòng và xác định trình tự
các gene mã hóa cho enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp các
carotenoid cũng như các nghiên cứu về tổng hợp carotenoid từ vi sinh vật.


14

Phần III
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
- Vi khuẩn Pantoea ananatis được cung cấp từ hãng DSMZ (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen Zellkulturen GmbH) và được sử dụng làm
nguyên liệu DNA khuếch đại gene crtY
- Chủng vi khuẩn E.coli DH5α được cung cấp từ phòng thí nghiệm
Công nghệ tế bào thực vật, viện Công nghệ sinh học. Vi khuẩn E.coli DH5α
được sử dụng để làm vật chủ cho quá trình tách dòng gene crtY.
3.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Thiết bị
- Bộ điện di DNA Scie-plas
- Tủ cấy vô trùng RuifierTMClean
Bench
- Cân phân tích GM 612
- Máy lắc IKA®KS130
- Máy khuấy từ HI 310 Autospeed
- Máy vortex Genius 3
- Pipetman, đầu côn, ống eppendorf
- Lò vi sóng Wave Dom
- Tủ lạnh thường, tủ lạnh sâu, tủ ấm
Hóa chất
• Hóa chất dùng cho PCR :
- Dung dịch đệm 10xPCR có
chứa 20mM MgCl2,
- dNTP (1mM)
• Hóa chất điện di
- Agarose
- Dung dịch TE 1X

• Hóa chất tách plasmid

- Bể ổn nhiệt Multi temp III
- Máy ly tâm thường Mikro22Hettich.2entrifugen
- Máy PCR AB
- Tủ nuôi 370C OF-22
- Máy xác định trình tự DNA tự
động 3130 Genetic Analyzer
- Máy chụp ảnh gel CLS-Microdoc
- Máy soi gel Carestrealth IN

- Mồi (10 pm/µl)
- Taq-polymerase (5U/µl)
- H2O
- Đệm tra mẫu DNA
- Ethidium bromide


15

Sol I

:

Glucose
: 50 mM
Tris-HCl (pH=8) : 25 mM
EDTA (pH=8)
: 10 mM
Sol II :

NaOH
: 0,2 N
SDS
: 1%
Sol III :
CH3COOK (potassium acetal) 5M
: 60 ml/100ml
CH3COOH
: 11,5 ml/100ml
H2O
: 28,5 ml/100ml
TE
Tris-HCl (pH=8) : 10 mM
EDTA (pH=8)
: 1mM
• Một số hóa chất sử dụng trong tách dòng gene
- Cặp mồi khuếch đại gene crtY.
Chúng tôi sử dụng một cặp mồi để nhân đoạn gene crtY. Trình tự mồi
được thiết kế dựa trên trình tự gene công bố trên ngân hàng gene NCBI với
mã số D90087.2 .
Cặp mồi được đặt làm từ hãng Invitrogen. Trình tự và thông tin về cặp
mồi được thể hiện qua bảng 3.1
Bảng 3. 1 : Trình tự và thông tin về cặp mồi CrtY
Tên mồi

Trình tự mồi

crtY-F

5’TGAATTCAGGAGGTGTCTTAAATGGGAGCGGCTAT3’

crtY-R

5’GCAAGCTT TTAACGATGAGTCGTCATAATGG3’

- Vector tách dòng pLUG® TA-cloning (Intronbiotechnology)
Vector tách dòng pLUG® TA-cloning là một trong những vector được
sử dụng phổ biến trong tách dòng gene hiện nay. Vector pLUG® TA-cloning
có kích thước 2982bp, cấu trúc của vector được thiết kế gồm một gene kháng
kháng sinh Amp và một gene LacZα có chứa vị trí đa tách dòng giúp cho quá
trình chọn lọc.


16

Trên vùng gene LacZα có chứa vị trí đa tách dòng, chứa vị trí cắt của
11enzyme giới hạn: SacI, NotI, XbalI, BamHI, SamI, PstI, EcoRI, HindIII,
HindIII, SacI, KpnI. Những vị trí cắt của enzyme giới hạn này cho phép sử
dụng loại enzyme thích hợp trong các nghiên cứu tách dòng gene sử dụng
vector pLUG® TA-cloning.
Gene LacZα bị bất hoạt bởi sự gắn xen thành công đoạn DNA ngoại lai,
không sinh ra enzyme phân hủy X-Gal, IPTG, khuẩn lạc có màu trắng. Những
vector pLUG® TA-cloning tự đóng vòng sẽ biểu hiện gene LacZα, sinh ra
enzyme phân hủy X-Gal, IPTG, khuẩn lạc có màu xanh.

Hình 3. 1: Cấu trúc vector tách dòng pLUG® TA-cloning


17

- Enzym cắt sử dụng trong thí nghiệm được cung cấp từ hãng Fermentas.
- Enzym nối T4 DNA ligase được cung cấp từ hãng Intronbio
3.1.3. Phạm vi nghiên cứu
- Phân lập gene crtY từ vi khuẩn Pantoea ananatis trong điều kiện nhân tạo.
- Xác định trình tự gene crtY đã phân lập và so sánh trình tự gene này với các
trình tự gene đã công bố trên ngân hành gene quốc tế.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm : Phòng Sinh học phân tử và Kỹ thuật di truyền - viện Khoa hoc
sự sống - Đại học Thái Nguyên - Tổ 10 - Xã Quyết Thắng - TP Thái Nguyên.
Thời gian : Đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2009 đến tháng 10
năm 2010
3.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1 : Tách dòng gene crtY.
+ Nhân dòng gene crtY sử dụng cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng PCR từ vi
khuẩn Pantoea ananatis.
+ Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp thôi gel.
+ Gắn gene vào vector tách dòng pLUG® TA-cloning bằng enzyme T4 DNA
ligase
+ Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng E. coli DH5α khả biến.
+ Chọn lọc dòng mang gene crtY
+Tách chiết DNA plasmid bằng kit “DNA-spinTM” của hãng Intron
Biotechnology
+ Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn.
Nội dung 2 : Xác định trình tự gene crtY và so sánh với trình tự đã công bố
trên ngân hàng gene quốc tế.
+ Xác định trình tự gene bằng phương pháp giải trình tự tự động.
+ So sánh trình tự gene crtY với trình tự đã công bố trên ngân hàng gene quốc
tế thông qua chương trình BLAST.

18

3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Quy trình tách dòng gene crtY từ Pantoea ananatis
Trình tự gene đã công bố
PCR

Mồi đặc hiệu nhân gene

Pantoea ananatis (crtY )

Tinh sạch sản phẩm PCR bằng
phương pháp thôi gel

Gắn gene vào vector tách dòng pLUG

Biến nạp vào vi khuẩn Ecoli chủng DH5α
Cấy trải trên môi trường chọn lọc
Chọn lọc dòng mang gene cần chuyển

Tách DNA plasmid

Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp bằng
enzyme cắt giới hạnHindIII

Xác định trình tự gene bằng phương
pháp giải trình tự tự động

So sánh trình tự bằng phần mềm Blast

Hình 3. 2: Quy trình tách dòng và xác định tự gene crtY


19

3.4.2. Phương pháp thiết kế mồi cho gene crtY
Sử dụng phần mềm vector NTI của hãng Invitrogen để thiết kế mồi dựa
trên trình tự gene crtY đã công bố trên ngân hàng gene NCBI với mã số
D90087.2.
Đoạn mồi được thiết kế có đặc điểm: có khả năng bắt cặp được với 2
đầu của gen crtY cần nhân, mồi xuôi và mồi ngược không có khả năng tự bắt
cặp. Trong thiết kế mồi chúng tôi đưa vào 1 đầu của mỗi mồi một vị trí của
enzyme cắt giới hạn là EcoRI hay HindIII.
Mồi xuôi
crtY-F : 5’TGAATTCAGGAGGTGTCTTAAATGGGAGCGGCTAT3’ được
thiết kế gồm hai phần. Phần liên kết với DNA khuân được thiết kế dựa trên
trình tự 14 nucleotide đầu tiên của gene crtY (phần tô nền vàng). Trong đó
nucleotide G đầu tiên của gene crtY được thay thế bằng nucleotide A (màu
đỏ) nhằm tạo ra một bộ ba mã khởi đầu ATG, kế tiếp là trình tự 8 nucleotide
phía trước gene crtY (phần tô nền xanh), 8 trình tự này đảm bảo ribosome
hoạt động tối ưu. Phần đầu treo được thiết kế trình tự 6 nucleotide AGGAGG
là điểm bám của ribosome. Tiếp đến là Vị trí cắt của enzyme giới hạn EcoRI
(trình tự nucleotide màu đỏ, gạch chân), nucleotide T được thiết kế ngoài
cùng có tác dụng bảo vệ vị trí cắt enzyme giới hạn.
Mồi ngược
crtY-R : 5’GCAAGCTT TTAACGATGAGTCGTCATAATGG3’ cũng được
thiết kế gồm 2 phần. Phần liên kết với DNA khuân được thiết kế dựa trên trình
tự 23 nucleotide cuối cùng của gene crtY (tô nền xanh). Phần đầu treo thiết kế vị
trí cắt giới hạn của HindIII (màu đỏ, gạch chân), ngoài cùng là vị trí 2
nucleotide được thiết kế ngẫu nhiên có tác dụng bảo vệ vị trí cắt của enzyme

giới hạn.
Độ dài, trình tự mồi xuôi và mồi ngược đã được tính toán sao cho nhiệt
độ gắn mồi trong phản ứng PCR của 2 mồi gần tương đương nhau.
Trình tự hai mồi sau thiết kế được đặt làm tại hãng Invitrogen.
3.4.3. Phương pháp nuôi phục hồi khuẩn Pantoea ananatis
Khuẩn khi đặt mua từ hãng Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
Zellkulturen GmbH (DSMZ) ở dạng đông khô cần nuôi phục hồi để đảm bảo


20

khuẩn phát triển bình thường và sử dụng cho các mục đích thí nghiệm và bảo
quản lâu dài. Các bước nuôi phục hồi được tiến hành theo hướng dẫn của nhà
sản xuất :
- Hơ trên ngọn lửa đèn cồn vị trí cắt ống, dùng phanh vô trùng bẻ gẫy ống
mẫu, lấy khuẩn.
- Cho khuẩn vào 400 µl NB lỏng, nuôi lắc 200v/p trong 30 phút ở 250C
- Hút toàn bộ sang ống nghiệm mới chứa 7-8 ml NB, trộn đều
- Cấy 50 µl dung dịch chứa khuẩn lên đĩa thạch NB đặc (giữ giống)
- Hút 200 µl dung dịch chứa khuẩn sang ống nghiệm chứa NB lỏng, nuôi lắc
200v/p qua đêm ở 250C
- Thu khuẩn Pantoea ananatis sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
3.4.4. Phương pháp PCR khuếch đại gene crtY từ Pantoea ananatis
Thực hiên phản ứng PCR nhân bản đoạn gene crtY với cặp mồi đặc
trưng crtY-F và crtY-R.
Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích là 30 µl với các thành phần
phản ứng gồm:
Thành phần phản ứng

Thể tích

Nước cất khử ion

14.2 µl

DNA

2.0 µl

Buffer 5X

6.0 µl

MgCl2

3.0 µl

Enzym Taq-DNA Colymerase

0.3 µl

dNTP 10mM

1,5 µl

primer crtY-F (10pm/µl)

1.5 µl

primer crtY-R (10pm/µl)

1.5 µl

Tổng thể tích

30 µl


21

Dùng micropipet hút và trộn đều hỗn hợp rồi chuyển vào máy PCR,
chu trình nhiệt được cài đặt như sau:
+ 940c trong 5 phút
+ 940c trong 45 giây
+ 550c trong 45 giây
25 chu kỳ
0
+ 72 c trong 1 phút 30 giây
+ 720c trong 8 phút
+ 40c ∞
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%.
3.4.5. Phương pháp điện di
Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau:
+ Chuẩn bị gel agarose 1%
- Cân 1gam agarose cho vào 100 ml dung dịch TE 1X, đun sôi trong lò vi
sóng cho agarose tan hết.
- Chờ gel nguội đến 600C, đổ gel vào khuôn gel đã cài lược và để gel trong
30 phút cho gel đông lại, rút lược ra khỏi bản gel.
- Đặt bản gel vào bể điện di, đổ dung dịch TE 1X vào bể điện di sao cho vừa
ngập bản gel.

+ Tra mẫu và tiến hành điện di:
- Pha trộn mẫu : Trộn 6 µl DNA mẫu với 2 µl thuốc nhuộm (Dye), tra mẫu
vào giếng.
- Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 80V, khi vị trí vạch màu chạy đến 2/3 bản
gel thì dừng quá trình điện di.
+ Nhuộm và chụp ảnh bản gel điện di. Sau khi điện di, bản gel được nhuộm
với ethidium bromide trong 10 phút, tráng lai bằng nước sạch, soi và chụp
ảnh gel bằng máy CLS-Microdoc
3.4.6. Phương pháp tinh sạch gel điện di (thôi gel)
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agrose 1%, tiến hành nhuộm gel
bằng ethidium bromide sau đó soi gel trên đèn cực tím để cắt đoạn gel chứa
băng DNA cần tinh sạch. Các thao tác được thực hiện theo hướng dẫn của bộ
KIT MEGA- sinpTM Agarose Gel Extraction Kit của hãng INtRON


22

Biotechnology. Trước khi tiến hành tinh sạch cần bổ sung cồn tuyệt đối (98%)
vào Washing buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Các bước tinh sạch được tiến hành như sau:
- Lấy 1 ống eppendorf loại 1,5ml và cân khối lượng ống (K1)
- Cho bản gel lên máy soi và cắt đoạn gel điện di chứa băng DNA cần tinh
sạch, sao cho kích thước miếng gel nhỏ nhất có thể, chú ý không cắt vào
vạch DNA.
- Cho miếng gel vừa cắt vào ống eppendof, cân lại (K2) và suy ra khối lượng
của gel đã cắt K = K2 – K1.
- Bổ sung Agarose lysis buffer với lượng tương ứng vào các ống eppendof
theo tỷ lệ: 300µl/ 100mg gel
- Chuyển vào bể ổn nhiệt: nhiệt độ 550C trong 10 phút. Trong quá trình ủ cần
đảo đều 1-2 phút một lần cho gel tan hết.

- Hút 1000µl cho vào cột lọc đã đánh dấu
- Ly tâm 13000v/p trong 1phút, đổ bỏ dịch lỏng
- Bổ sung 700µl Washing buffer, sau đó ly tâm 13000v/p trong 1phút, đổ bỏ
dịch lỏng
- Ly tâm khô 13000v/p trong 1phút
- Chuyển cột sang ống eppendorf mới , bổ sung 50 µl Elution buffer, sau đó
ly tâm 13000v/p trong 1phút.
- Thu dung dịch có chứa DNA đã tinh sạch. Bảo quản sản phẩm ở -200C
- Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Sử dụng 6 µl DNA + 2µl Dye).
3.4.7. Phương pháp tách dòng gene
3.4.7.1 Phương pháp gắn gene crtY vào vector tách dòng pLUG
Sản phẩm PCR gene crtY được điện di trên gel agrose 1% và tinh sạch.
Sau khi tinh sạch, gene crtY được gắn vào vector tách dòng pLUG phương
pháp được tiến hành theo hướng dẫn của bộ Kit pLUG® TA-Cloing vector
Kit.
Thành phần phản ứng với tổng thể tích 10 µl gồm có:


23

Thành phần phản ứng
5X buffer
TA-cloning vecter

Thể tích
2µl
1µl

PCR product

6 µl

T4 DNA ligase
Tổng

1µl
10µl

Thành phần phản ứng được ủ trong bể ổn nhiệt ở 160C qua đêm
3.4.7.2. Phương pháp biến nạp DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả
biến chủng E.coli DH5α
Các bước tiến hành biến nạp DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả
biến chủng E.coli DH5α được thực hiện như sau:
được tiến hành bằng phương pháp sốc nhiệt.
+ Lấy ống tế bào khả biến E.coli DH5α ra khỏi tủ -800C và đặt trên đá
+ Hút toàn bộ sản phẩm gắn nối vào ống chứa tế bào khả biến, để trên
đá lạnh 20- 30 phút
+ Lấy ống tế bào khả biến trên ra khỏi đá và đặt vào bể ổn nhiệt đã đặt
sẵn 420C trong 30 giây, sau đó đưa nhanh ống tế bào đó vào đá để trong 2
phút
+ Bổ sung 1000µl LB lỏng (không có Amp) vào ống tế bào biến nạp,
nuôi lắc ở 370C trong 90 phút.
+ Ly tâm 4000v/p trong 3 phút, bỏ phần dịch nổi (thao tác nhẹ nhàng,
sau đó dùng pipet hút để không làm chết tế bào)
+ Bổ sung 100 µl LB lỏng (không có Amp), mix đều.
+ Cấy trải trên môi trường chọn lọc LB đặc, (amp 0.5µg/ml, 40µl XGal và 4µl IPTG), thao tác nhanh, trải đều đến khi bề mặt thạch se lại
+ Nuôi ở 370C qua đêm.


24

3.4.7.3. Phương pháp tách DNA plasmid
• Phương pháp tách chiết plasmid theo phương pháp Preparation of
Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation
Các bước tách plasmid được tiến hành như sau :
- Li tâm 13000v/p trong 5 phút 3ml dich khuẩn, bỏ phần dịch lỏng lấy cặn tế
bào
- Bổ sung 100µl dung dịch Sol I , votex cho tan hết cặn tế bào
- Bổ sung 200µl dung dịch Sol II đảo nhẹ đặt trên đá 10 phút
- Bổ sung 150µl dung dịch Sol III đảo nhẹ để trên đá 5 phút
- Li tâm 13000v/p trong 5 phút, thu dịch lỏng chuyển sang ống eppendof mới
- Bổ sung 2 thể tích cồn tuyệt đối, đảo nhẹ, để 2 phút
- Li tâm 13000v/p trong 2 phút, đổ bỏ phần dịch lỏng
- Bổ sung 500 µl cồn 70% để rửa, li tâm 13000v/p trong 2 phút
- Bỏ phần dịch lỏng “ cố gắng loại bỏ hết dịch “ để khô tự nhiên
- Bổ sung 30µl H2O để hòa DNA.
- Điện di kiểm tra mẫu tách triết (10µl DNA + 3µl Dye)
• Phương pháp tách plasmid theo Kit DNA-spinTM plasmid DNA
Purification Kit của hãng INtRON Biotechnology
Trước khi sử dụng bộ Kit cần bổ sung 40ml cồn tuyệt đối (99.7%) vào
Washing B buffer. Bổ sung 1µl RNase vào Resuspension buffer, bảo quản
Resuspension buffer ở 40C.
Các bước tách plasmid được tiến hành như sau:
- Li tâm 1300v/p trong 5 phút (3ml dịch khuẩn/ 1 eppendof) loại bỏ dịch lỏng
thu kết tủa .
- Hút 250 µl Resuspension buffer vào các ống chứa tế bào đã li tâm, vortex
đến khi tan hết
- Bổ sung 250 µl Lysis buffer, lắc nhẹ, để 4 phút
- Bổ sung 350 µl Neutralization buffer, đảo nhẹ , ly tâm 13000 v/p trong
10phút ở 40C, sau ly tâm hút dịch lỏng sang cột lọc có ghi số thứ tự tương

ứng.
- Ly tâm 13000v/p trong 60s, bỏ phần dịch lỏng