Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin b đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (2)

Trnh Thu Hng

Cao hc K17 Sinh hc

Lời Cảm ơn
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Lai
Thành, chủ nhiệm bộ môn Tế bào - Mô Phôi - Lý sinh, đồng thời là trởng
phòng Công nghệ Tế bào Động vật - Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống.
Thầy đã trực tiếp hớng dẫn tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện
luận văn này. Thầy đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi cả trong công việc, cũng
nh trong quá trình tôi thực hiện thí nghiệm tại phòng Công nghệ Tế bào Động
vật.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ và sinh viên Phòng
Công nghệ Tế bào Động vật - Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự
sống, những ngời luôn bên tôi trong công việc, luôn nhiệt tính giúp đỡ tôi trong
quá trình tôi làm việc và nghiên cứu tại phòng.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Bùi Thị Việt Hà , chủ nhiệm bộ môn
Vi sinh vật cùng tập thể các anh chị em ở phòng thí nghiệm Vi
sinh - Khoa Sinh học - Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, những ngời đã
nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn
này.
Tôi xin giửi lời cảm ơn tới tập thể các thầy cô giáo trong Khoa
Sinh học - Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô giáo

Lun vn thc s - Khoa Sinh hc


Trnh Thu Hng

Cao hc K17 Sinh hc

trong bộ môn Vi sinh vật học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức sinh
học trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua.
Tôi xin gửi cảm ơn chân thành nhất đến gia đình và toàn thể bạn
bè, những ngời đã luôn động viên, ủng hộ và là chỗ dựa tinh thần cho tôi trong
suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đề tài QG09.18 đã hỗ trợ nguồn kinh phí
cho tôi thực hiện luận văn này.
Hà Nội, tháng năm 2011
Học viên
Trịnh Thu Hằng

Lun vn thc s - Khoa Sinh hc


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Viết đầy đủ

CKS

Chất kháng sinh

DNA

Deoxyribonucleic acid

G(-)

Gram âm

G(+)

Gram dương

RNA

Ribonucleic acid

mRNA

Messenger Ribonucleic acid

tRNA

Transfer ribonucleic acid

VSV

Vi sinh vật

i

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học

Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

MỤC LỤC
Từ viết tắt...................................................................................................i
Viết đầy đủ..................................................................................................i
CKS.............................................................................................................i
Chất kháng sinh.........................................................................................i
DNA.............................................................................................................i
Deoxyribonucleic acid...............................................................................i
G(-)..............................................................................................................i
Gram âm.....................................................................................................i
G(+).............................................................................................................i
Gram dương...............................................................................................i
RNA.............................................................................................................i
Ribonucleic acid.........................................................................................i
mRNA.........................................................................................................i
Messenger Ribonucleic acid......................................................................i
tRNA...........................................................................................................i
Transfer ribonucleic acid .........................................................................i
VSV.............................................................................................................i
Vi sinh vật...................................................................................................i
MỞ ĐẦU....................................................................................................1

ii

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học

Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................4
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH......................................4
1.1.1. Chất kháng sinh....................................................................4
1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu CKS..........................................5
1.1.3. Phân loại CKS......................................................................6
1.1.4. Cơ chế tác dụng của CKS....................................................7
1.1.4.1. Ức chế tổng hợp thành tế bào.....................................8
1.1.4.2. Phá hủy màng sinh chất..............................................9
1.1.4.3. Ức chế tổng hợp protein...........................................10
1.1.4.4. Ức chế các con đường trao đổi chất.........................11
1.1.4.5. Ức chế sự tổng hợp acid nucleic..............................12
1.1.5. Thực trạng kháng kháng sinh của các chủng VSV gây bệnh
.................................................................................................14
1.2. PEPTIDE KHÁNG KHUẨN CECROPIN.................................15
1.2.1. Nguồn gốc của peptide kháng khuẩn.................................15
1.2.2. Phân bố tự nhiên của peptide kháng khuẩn.......................16
1.2.3. Cấu tạo của peptide kháng khuẩn......................................18
1.2.4. Tác động của peptide kháng khuẩn....................................19
1.2.4.1. Cơ chế tác động........................................................19
1.2.4.2. Sự tác động chọn lọc của peptide kháng khuẩn.......24
1.2.5. Ứng dụng của peptide kháng khuẩn...................................26
1.2.6. Peptide kháng khuẩn cecropin B........................................26
1.3. CHUYỂN GEN CECROPIN B VÀO TẾ BÀO VÀ CƠ THỂ
ĐỘNG VẬT..................................................................................28
1.4. GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN BÀO SỢI CHUỘT ĐƯỢC DÙNG
ĐỂ CHUYỂN GEN CECROPIN B..............................................30

iii

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

1.4.1. Nguồn gốc và đặc điểm nguyên bào sợi ...........................30
1.4.2. Ứng dụng của nguyên bào sợi nuôi cấy.............................32
1.5. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT GÂY
BỆNH............................................................................................33
Chương II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 35
2.1. NGUYÊN LIỆU..........................................................................35
2.1.1. Chủng giống.......................................................................35
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ...........................................................36
2.1.2.1. Hóa chất....................................................................36
Các hóa chất sử dụng trong đề tài được liệt kê ở Các hóa chất
sử dụng trong đề tài được liệt kê ở Các hóa chất sử dụng
trong đề tài được liệt kê ở Các hóa chất sử dụng trong đề
tài được liệt kê ở Các hóa chất sử dụng trong đề tài được
liệt kê ở ............................................................................36
Bảng 1: Các hóa chất được sử dụng trong đề tài...................36
2.1.2.2. Môi trường và dung dịch..........................................36
2.1.2.3. Dụng cụ và vật tư.....................................................37
2.1.2.4. Thiết bị.....................................................................38
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................................39
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và cấy chuyển nguyên bào sợi chuột

.................................................................................................39
Quy trình thí nghiệm được tóm tắt ở sơ đồ sau:.........................39
2.2.2. Phương pháp thu môi trường nuôi nguyên bào sợi chuột đã
được chuyển gen cecropin B:..................................................40
2.2.3. Phương pháp cô đặc môi trường nuôi nguyên bào sợi chuột
đã được chuyển gen cecropin B..............................................41

iv

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

2.2.4. Phương pháp nhân nuôi và cất giữ vi khuẩn......................41
2.2.5. Phương pháp đục lỗ...........................................................42
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn ..................44
Quy trình thí nghiệm được tóm tắt ở sơ đồ sau:..........................44
2.2.6.1. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của chất
kháng sinh...............................................................................44
2.2.6.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của peptide
cecropin B:..............................................................................45
2.2.6.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của CKS
kết hợp với peptide cecropin B:..............................................46
2.2.6.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của môi
trường nuôi cấy nguyên bào sợi chuột chuyển gen cecropin B:
.................................................................................................47
Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................49

3.1. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI VÀ ĐỘNG
VẬT...............................................................................................49
3.2. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
CỦA PEPTIDE CECROPIN B.....................................................51
3.3. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
CỦA CECROPIN B KẾT HỢP VỚI KHÁNG SINH...................54
3.3.1. Cecropin B gây nhạy cảm với kháng sinh ở chủng vi khuẩn
kháng thuốc.............................................................................55
3.3.2. Cecropin B làm tăng mức độ nhạy cảm kháng sinh ở chủng
vi khuẩn không kháng thuốc...................................................57

v

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

3.4. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI CHUỘT
NHẮT TRẮNG CHUYỂN GEN CECROPIN B..........................59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................62
KẾT LUẬN........................................................................................62
KIẾN NGHỊ.......................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................64

vi

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

DANH MỤC HÌNH ẢNH MINH HỌA
Hình 1. Cấu trúc peptide kháng khuẩn................................................19
Hình 2. Mô hình hoạt động kháng khuẩn của các peptide kháng
khuẩn...................................................................................................20
Hình 3. Cơ chế hoạt động của peptide kháng khuẩn...........................22
Hình 4. Cơ sở của chọn lọc phân tử tế bào của peptide kháng khuẩn
[54] . ....................................................................................................25
Hình 5. Cấu trúc của nguyên bào sợi hoạt động [57]..........................31
Hình 6. Kết quả đánh giá tác động của ampicillin và puromycin đối
với hai chủng vi khuẩn Shigella flexneri (A) và Vibrio cholerae (B)
..............................................................................................................50
Hình 7. Kết quả thăm dò hoạt tính kháng khuẩn của peptitde
cecropin B với vi khuẩn Escherichia coli.........................................52
Hình 8. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của chất kháng
sinh ampicillin và peptitde cecropin B với vi khuẩn Vibrio
cholerae...............................................................................................53
Hình 9. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của peptitde
cecropin B kết hợp với chất kháng sinh ampicillin với hai chủng
VSV Vibrio cholerae và Moraxella catarrhalis..............................55
Hình 10. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của peptitde cecropin B
kết hợp với chất kháng sinh ampicillin với chủng vi khuẩn Vibrio
cholerae...............................................................................................56

vii

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

Hình 11. Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn của hỗn hợp peptitde
cecropin B và chất kháng sinh trên hai chủng vi khuẩn Salmonella
typhi và Escherichia coli....................................................................58
Hình 12. Kết quả kiểm tra khả năng kháng khuẩn của môi trường đã
nuôi cấy nguyên bào sợi thai chuột sau chuyển gen.......................61

viii

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

MỞ ĐẦU
Từ lâu, vấn đề kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi sinh vật đã và
đang đặt ra thách thức đối với toàn nhân loại. Chỉ 3 năm sau khi kháng sinh
đầu tiên là penicillin được dùng trong điều trị, người ta phát hiện ra loại vi
khuẩn Staphylococcus aureus kháng lại "thần dược" này. Tuy nhiên, số lượng

các loại kháng sinh mới ngày càng ít đi và đã bắt đầu thời điểm mà các kháng
sinh có mặt không đủ để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.
Trước tình trạng bế tắc của việc tìm kiếm thuốc kháng sinh, các nhà
khoa học nhận thấy một triển vọng mới đầy hứa hẹn là các peptide kháng
khuẩn. Hiện nay, các peptide kháng khuẩn được coi như nguồn “kháng sinh
tự nhiên” của sinh giới đã được phát hiện ở nhiều loài sinh vật khác nhau.
Thuộc nhóm peptide này, Cecropin đã được phân lập đầu tiên từ nhộng bướm
tằm Hyalophora cecropia bị lây nhiễm vi khuẩn, và sau đó là ở nhiều loại côn
trùng 2 cánh.
Cecropin là peptide kháng khuẩn có hoạt tính mạnh, nó tác động lên cả
vi khuẩn Gram âm và Gram dương [9]. Cấu trúc và cơ chế hoạt động độc đáo
cho phép chúng dễ dàng kết hợp với màng của tế bào vi khuẩn, nấm và kí
sinh trùng, hình thành các lỗ trên màng và tiêu diệt các tác nhân đó. Gen mã
hóa cho một số cecropin được thiết kế và tổng hợp đã cho thấy hiệu quả
chống bệnh ở động vật và thực vật do vi khuẩn gây nên. Gen cecropin đã
được sử dụng để tạo ra thực vật biến đổi gen (như khoai tây, thuốc lá) biểu
hiện sự tăng cường tính kháng khuẩn hoặc nấm.
Họ cecropin gồm có ba nhóm chính là cecropin A, B và D [11]. Trong
đó cecropin B được biết đến với hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Với tính hiệu
quả trong việc kiểm soát mầm bệnh sinh ra do tác nhân vi khuẩn và côn trùng,

1

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

cecropin B cũng có thể có hiệu quả trong kiểm soát các mầm bệnh do các tác
nhân này gây nên ở cá, cũng như ở nhiều loài động vật. Vì vậy mục đích
chính của nhóm nghiên cứu là thử nghiệm chuyển gen cecropin B vào tế bào
chuột nuôi cấy nhằm đánh giá khả năng tiếp nhận và biểu hiện gen kháng
khuẩn này. Một công việc quan trọng trong quá trình nghiên cứu là thử
nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, cũng như các nồng độ kháng khuẩn tối ưu của
cecropin lên một số chủng vi sinh vật gây bệnh trên động vật để làm cơ sở
đánh giá cecropin tái tổ hợp được sản xuất trong tế bào nuôi cấy.
Vì thế chúng tôi đã tiến hành “Đánh giá khả năng kháng khuẩn của
cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật”.

2

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

3

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH
1.1.1. Chất kháng sinh
CKS (Chất kháng sinh - antibiotic) là các hợp chất hóa học do một số
VSV sinh ra mà ngay ở nồng độ thấp cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt
các VSV khác (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc...) một cách chọn lọc [1].
Một CKS tác động lên cả vi khuẩn G(+) lẫn vi khuẩn G(-) và nấm được
gọi là một CKS phổ rộng. Các CKS phổ hẹp chỉ tác dụng lên một nhóm VSV,
chẳng hạn vancomycin, một glycopeptide.
Trước đây, CKS được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng có
nguồn gốc từ VSV (như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn). Những năm gần đây với
những tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhiều CKS đã được tạo ra theo con
đường bán tổng hợp (ampicillin) hoặc tổng hợp mới hoàn toàn
(chloramphenicol) [41].
Như vậy, CKS là các chất kháng khuẩn tự nhiên, bán tổng hợp, hoặc
tổng hợp có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp. Mỗi CKS thường chỉ có tác
dụng với một nhóm VSV nhất định [4].
Số lượng CKS cách đây 1/4 thế kỷ chỉ khoảng vài trăm loại, nhưng đến
năm 1993 số lượng này đã lên đến 6.000. Đầu thập kỷ này đã phát hiện thêm
2.000 các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ
VSV. Ước tính số lượng thực sự của các chất này phải lên đến trên 15.000
chất [30].

4

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu CKS
Người đặt nền móng đầu tiên cho việc nghiên cứu CKS là Alexander
Fleming. Năm 1928, khi nuôi cấy tụ cầu vàng Staphylococcus aureus,
Alexander Fleming đã tình cờ để nhiễm một loại nấm mốc màu xanh. Loại
nấm này đã tiết ra một chất ức chế sự sinh trưởng của S. aureus và do đó tạo
thành một vòng vô khuẩn trong suốt bao quanh khuẩn lạc của nấm mốc.
Fleming đã phân lập định tên loại nấm này là Penicillium notatum và đặt tên
chất kháng khuẩn này là penicillin. Về sau ông còn phát hiện thêm là
penicillin còn ức chế sự sinh trưởng của hàng loạt vi khuẩn gây bệnh khác,
như trực khuẩn gây bệnh bạch cầu, bệnh thận ...
Sự ra đời của penicillin đã kéo theo sự ra đời của hàng loạt các chất
kháng sinh khác. Sau khi phát hiện ra penicillin, các nhà khoa học trên toàn
thế giới đã tích cực tìm kiếm, nghiên cứu thêm nhiều loại CKS có nguồn gốc
từ VSV.
Năm 1944, Abraham Waksman, Schatz và Bugie đã phát hiện ra
streptomycin dẫn đến một kỷ nguyên mới trong điều trị bệnh lao và bệnh
viêm màng não. Đây là một CKS phổ rộng, kháng được cả vi khuẩn G(-) lẫn
vi khuẩn G(+). Tốc độ tìm kiếm CKS ngày càng được đẩy mạnh. Những năm
1940 – 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của CKS. Hàng loạt CKS được
tách chiết và xác định: actinomicin (Waksman, 1940), chloramphenicol
(Erhlich, 1947), chlotetracylin (Dugar, 1948). Ngày nay số lượng CKS được
phát hiện lên tới trên 15000 chất, trong đó hàng trăm chất được dùng trong y
học thực tiễn.
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành Vi sinh vật học, Hóa
sinh học, Di truyền học phân tử và đặc biệt là sự ra đời của Công nghệ sinh

5

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học

Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

học (1975) đã tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực nghiên cứu CKS đạt được
những thành tựu lớn lao.

1.1.3. Phân loại CKS
CKS có thể được phân loại theo nhiều cách tùy thuộc vào tiêu chí của
các nhà nghiên cứu. Các nhà nghiên cứu dược liệu và các thầy thuốc muốn
phân loại theo hoạt tính sinh học của CKS (CKS kháng khuẩn, CKS kháng
nấm, CKS phổ rộng, CKS phổ hẹp, CKS kháng vi khuẩn G(-), CKS kháng vi
khuẩn G(+) ...). Các nhà hóa sinh, sinh học phân tử muốn phân loại theo cơ
chế tác động của CKS. Các nhà VSV muốn phân loại theo sản phẩm vi sinh
hay con đường sinh tổng hợp. Các nhà hóa học muốn phân loại theo các đặc
tính sinh lý, sinh hóa và nhiều tính chất khác dựa trên việc xác định rõ cấu
trúc hóa học.
Thông thường CKS được phân loại ra thành một số nhóm quan trọng
sau:
- Nhóm β – lactam: về cấu trúc chúng đều có vòng β – lactam. Nhóm
này bao gồm:
+ Các penicillin: gồm có Penicillin, Ampicillin, Amoxicillin,
Cloxacillin ...
+ Các cephalosporin: có 4 thế hệ I, II, III, IV. Thế hệ I, II chủ yếu để
điều trị các vi khuẩn G(+), thế hệ III, IV chủ yếu để điều trị vi khuẩn G(-).
Gồm có: Cefadroxil, Cephalexin, Cefaclor, Cefixim, Ceftriaxon ...

6

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

- Nhóm tetracycline: là các CKS có hoạt phổ rộng, gồm có Tetracyclin,
Doxycylin, Clotetracyclin, Minocyclin ....
- Nhóm Aminosid: có nguồn gốc từ vi sinh, có phổ tác dụng rộng, chủ
yếu trên vi khuẩn G(-). Gồm các kháng sinh Streptomycin, Neomycin,
Paromomycin, Gentamycin ...
-

Nhóm

Chloramphenicol

(hay

Phenicol):

Chloramphenicol,

Thiamphenicol
- Nhóm Lincosamid: Lincomycin, Clindamycin
1.1.4. Cơ chế tác dụng của CKS
Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác dụng lên
những vị trí khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của

VSV. Các CKS có thành phần và cấu trúc hóa học đặc trưng nên không có
một cơ chế tác dụng chung của các CKS đối với tất cả các VSV. Đặc tính và
cơ chế tác dụng của CKS phụ thuộc vào bản chất hóa học của từng chất, nồng
độ và cấu trúc hiển vi của VSV. Các chất có bản chất hóa học khác nhau thì
có ảnh hưởng khác nhau lên VSV, còn các chất có bản chất hóa học gần giống
nhau thì có hoạt phổ tương tự nhau. Một số CKS khi ở nồng độ thấp thì không
có tác dụng ức chế mà còn có tác dụng kích thích sinh trưởng của VSV.
Ngoài ra cùng một CKS nhưng ở các điều kiện khác nhau thì cơ chế tác dụng
lên VSV khác nhau.
Mỗi CKS có đích tác dụng và cơ chế tác dụng riêng nhằm ức chế hoặc
tiêu diệt hoàn toàn VSV kiểm định bằng cách tác động vào một hay nhiều
bước của quá trình tổng hợp. Có thể phân loại thành các cơ chế tác động sau:

7

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

1.1.4.1. Ức chế tổng hợp thành tế bào
Thành tế bào vi khuẩn là cấu trúc bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại áp
suất thẩm thấu. Thành phần cấu trúc chủ yếu của thành tế bào là peptidoglican
(PG). PG là một đại phân tử cấu tạo bởi các chuỗi polysaccarit bao gồm đơn
phân là các dẫn xuất của đường glucose nằm xen kẽ nhau và lặp lại một cách
liên tục (NAG – NAM). Để tạo thành mạng lưới thực sự vững chắc, các chuỗi
polysaccarit của PG phải liên kết chéo với nhau thông qua một đoạn peptide
ngắn giữa các tetrapeptide của tiểu phần NAM. Để có thể sinh trưởng và phân

chia, tế bào phải tổng hợp các đơn vị PG mới và vận chuyển nó tới đúng vị trí
sinh trưởng của thành tế bào [34]. Phần lớn các tác nhân kháng khuẩn thông
thường đều hoạt động dựa trên sự ức chế quá trình hình thành liên kết chéo
giữa các tetrapeptide của tiểu phần NAM. Nổi bật nhất giữa các chất này là
các chất kháng sinh β – lactam mà đại diện là penicillin và cephalosporin.
Đây là các kháng khuẩn có vùng chức năng là các vòng β – lactam.
Các kháng sinh β – lactam ức chế sự hình thành PG mới bằng cách gắn
chặt với enzyme transpeptidase cần thiết cho sự hình thành liên kết chéo giữa
các chuỗi PG, kìm hãm enzyme này và làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế
bào của vi khuẩn [45]. Trong khi đó tế bào vẫn sinh trưởng bình thường, thể
tích tế bào cứ tăng lên mãi mà thiếu thành tế bào nên yếu đi nhanh chóng, và
đến một lúc sẽ phân giải vì không chịu nổi áp suất thẩm thấu. Transpeptidase
được mọi β – lactam ưa gắn vào nên được gọi là protein gắn penicillin PBP
(Penicillin Binding Protein).
Tuy nhiên cần chú ý rằng các CKS này chỉ hoạt động ở giai đoạn sinh
trưởng của tế bào vi khuẩn mà không có tác dụng gì khi tế bào đã già hay
đang ở trạng trạng thái nghỉ vì khi đó hoạt động sinh tổng hợp PG đã ngừng
lại.
8

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

Các penicillin không thấm được qua thành tế bào của vi khuẩn G(-) nên
hiệu quả kháng các vi khuẩn này rất thấp. Tuy nhiên các penicillin và các
cephalosporin phổ rộng hoặc bán tổng hợp có thể vượt qua màng ngoài vi

khuẩn G(-) nên đã khắc phục được nhược điểm trên. Tế bào người không có
PG nên các kháng sinh β – lactam rất ít độc cho người [45].
Các CKS khác như vancomycin hay CKS bán tổng hợp cycloserin ức
chế sự hình thành tế bào theo một cách khác. Chúng cản trở trực tiếp sự hình
thành cầu D – alanin – D – alanin liên kết các tiểu phần NAM của các vi
khuẩn G(+). Tuy nhiên các vi khuẩn không có cầu D – alanin – D – alanin
kháng tự nhiên với các kháng sinh này.
Một CKS ức chế sự tổng hợp thành tế bào theo cách khác là bacitracin.
CKS này ngăn cản sự vận chuyển của các đơn vị PG mới từ tế bào chất đến vị
trí sinh trưởng của thành tế bào. Cũng như các kháng sinh β – lactam,
vancomycin, cycloserin và bacitracin làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào
làm cho tế bào vi khuẩn bị phân giải do áp suất thẩm thấu [45].
1.1.4.2. Phá hủy màng sinh chất
Một số CKS phá võ màng sinh chất của các tế bào đích bằng cách
tương tác với màng sinh chất và làm tổn thương tính nguyên vẹn của nó. Đây
là cơ chế hoạt động của một nhóm chất gọi là polyen. Amphotericin B là một
polyen có khả năng kháng nấm vì nó gắn với ergosterol – thành phần cấu tạo
nên màng sinh chất của nấm và tạo thành các lỗ rò trên màng. Do đó nội quan
của màng thất thoát ra môi trường bên ngoài. Màng sinh chất của tế bào người
và động vật có thể bị tổn thương bởi amphotericin B vì chúng chứa
cholesterol là các phân tử có cấu trúc tương tự như ergosterol, mặc dù cách
liên kết của amphotericin B với cholesterol hơi khác so với ergosterol.

9

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

Màng sinh chất của hầu hết vi khuẩn không chứa sterol nên chúng có
khả năng đề kháng với amphotericin B. Tuy nhiên polyen vẫn có khả năng
kháng vi khuẩn theo các cơ chế khác. Polymycin là một ví dụ, CKS này được
tạo ra bởi vi khuẩn Bacillus polymyxa có khả năng kháng đặc hiệu với vi
khuẩn G(-). Polymycin phá vỡ màng sinh chất của vi khuẩn bằng cách gắn
vào phospholipid của màng, làm méo mó bề mặt tế bào và thay đổi cấu trúc
của màng dẫn đến sự rò rỉ ra bên ngoài các nội quan của tế bào, gây chết tế
bào.
1.1.4.3. Ức chế tổng hợp protein
Protein là thành phần vô cùng quan trọng, không thể thiếu được của tế
bào. Do đó, việc cung cấp protein một cách liên tục là vấn đề quan trọng
mang tính sống còn của tế bào. Tất cả các sinh vật trong sinh giới đều có cùng
một kiểu tổng hợp protein từ ribosome dựa trên các thông tin mã hóa từ
mRNA. Các CKS ức chế sự tổng hợp protein có thể tiêu diệt được cả vi khuẩn
G(-) và vi khuẩn G(+).
Ribosome của vi khuẩn có sự khác biệt lớn đối với ribosome của sinh
vật nhân thực cả về cấu trúc và kích thước. Ribosome của vi khuẩn có hằng số
lắng là 70S, gồm hai tiểu phần là 30S và 50S. Trong khi đó ribosome của sinh
vật nhân thực có hằng số lắng là 80S, gồm hai tiểu phần là 40S và 60S. Nhiều
tác nhân kháng khuẩn có khả năng nhận biết sự khác biệt này của ribosome để
có thể tác dụng chọn lọc lên quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn mà không
ảnh hưởng đến tế bào nhân thực. Tuy nhiên một số CKSn thuộc nhóm này có
thể gây hại cho người và động vật do chúng tác dụng lên ribosome 70S của ty
thể hoàn toàn giống với ribosome của vi khuẩn.

10

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học

Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

Các tác nhân kháng khuẩn có đích tấn công là tiểu phần 30S của
ribosome gồm các aminogicoside và các tetracyclin. Aminoglycoside bao
gồm streptomycin, gentamycin, neomycin, kamacycin, tobramycin, ... Chúng
gắn vào tiểu phần 30S của ribosome, làm biến dạng tiểu phần này và gây ra
sự bắt cặp không chính xác giữa các codon của mRNA và các anticodon của
tRNA tương ứng. Kết quả là làm cho mã di truyền trên phân tử mRNA bị đọc
sai. Ví dụ dưới tác dụng của streptomycin, codon UUU mã hóa cho
phenylalanin bị đọc sai thành AUU mã hóa cho isoleucin. Tetracylin phong
bế vị trí gắn của phân tử RANt với RANm ở tiểu phần 30S, ngăn cản sự bổ
sung các acid amin vào chuỗi polypeptide đang được kéo dài [34].
Các tác nhân kháng khuẩn khác có đích tấn công là tiểu phần 50S của
ribosome. Chloramphenicol và một số CKS tương tự phong bế vị trí hoạt
động của enzyme xúc tác cho sự tạo thành liên kết peptide giữa các acid amin
trong chuỗi polypeptide đang kéo dài, ngăn cản sự tạo thành acid amin hoàn
chỉnh. Clindamycin và các tác nhân kháng khuẩn macrolit bao gồm
erythromycin gắn vào tiểu phần 50S ngăn cản sự dịch chuyển của ribosome từ
codon này đến codon kế tiếp. Kết quả là quá trình dịch mã bị cản trở và sự
tổng hợp protein bị dừng lại.
1.1.4.4. Ức chế các con đường trao đổi chất
Hầu hết các CKS loại này đều có cấu trúc tương tự các chất trao đổi
bình thường của tế bào như acid amin, coemzyme nên được gọi là các chất
trao đổi tác dụng theo kiểu ức chế cạnh tranh. Ở nhiều VSV acid para –
aminobenzoic (PABA) là cơ chất cho phản ứng enzyme dẫn đến sự tổng hợp
tetrahydrofolic (THF), một dạng của acid folic đóng vai trò như một

coenzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các purin và purimydin của
acid nucleic. Để tổng hợp THF PABA phải được acid dihidrofolic (DHF), rồi
11

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

từ DHF tổng hợp nên THF nhờ sự có mặt của các coenzyme xúc tác chuyển
PABA thành DHF. Kết quả là sự thiếu hụt DHF đã cản trở sự tổng hợp THF
gây ức chế sinh trưởng VSV.
Một tác nhân kháng chất trao đổi khác là trimetholprim cũng can thiệp
vào quá trình tổng hợp acid nucleic. Tuy nhiên thay vì gắn vào enzyme
chuyển hóa PABA thành DHF, trimetholprim lại gắn vào enzyme chuyển
DHF thành THF. Các chất kháng chất trao đổi rất có giá trị trong y học vì
chúng ức chế các tế bào vi khuẩn và động vật nguyên sinh mà không tác dụng
lên tế bào người và động vật. Nguyên nhân là do người không tổng hợp THF
từ PABA như vi khuẩn mà thay vào đó người thu nhận các acid folic đơn giản
từ các chất dinh dưỡng trong chế độ ăn uống rồi chuyển chúng thành THF.
1.1.4.5. Ức chế sự tổng hợp acid nucleic
Acid nucleic bao gồm DNA và RNA, là các đại phân tử sinh học không
thể thiếu đối với sự tổng hợp của tế bào. Một số CKS cản trở quá trình sao
chép DNA và phiên mã ở VSV. Các CKS này ảnh hưởng đến quá trình tổng
hợp acid nucleic bằng cách ức chế sự tổng hợp các nucleotide, ức chế sao
chép hoặc làm dừng phiên mã. Vì sự khác biệt giữa DNA của tế bào
prokaryote và eukaryote là rất nhỏ nên những CKS ức chế sinh tổng hợp acid
nucleic không chỉ tiêu diệt VSV mà nó còn gây độc với cả con người. Ví dụ

actinomycin gắn với DNA ức chế sự tổng hợp DNA và phiên mã không chỉ ở
các tế bào vi khuẩn mà cả với con người.
Nhìn chung các CKS này không được dùng để điều trị các bệnh truyền
nhiễm. Tuy nhiên chúng có thể được sử dụng để nghiên cứu quá trình sao
chép của DNA hoặc sử dụng nghiêm ngặt để làm chậm sự phát triển của tế
bào ung thư.

12

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

Các kháng sinh tổng hợp như quinolon và fluoroquinolon có khả năng
ức chế đặc hiệu DNA của tế bào prokaryote mà ít ảnh hưởng đến tế bào
eukaryote. Những kháng sinh này ức chế hoạt động của enzyme tháo xoắn sợi
DNA mạch kép trong quá trình sao chép DNA của tế bào. Ví dụ ciprofloxaxin
được kê đơn trong các trường hợp nhiễm trùng đường hô hấp, nhiễm trùng
đường tiết niệu hoặc trong các trường hợp nghi mắc bệnh than.
Các kháng sinh khác ức chế hoạt động của RNA polymerase trong quá
trình sinh tổng hợp RNA từ DNA mạch khuôn. Một số kháng sinh bao gồm
rifampin kết hợp mạnh mẽ với RNA polymerase của prokaryote nhưng ít ảnh
hưởng đến RNA polymerase của eukaryote. Kết quả là rifampin độc với vi
khuẩn gây bệnh hơn so với con người. Rifampin được sử dụng chủ yếu để
điều trị bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây ra. Clofazimin
gắn với DNA của vi khuẩn Mycobacterium leprae gây bệnh phong và làm cản
trở quá trình sao chép cũng như phiên mã bình thường của tế bào vi khuẩn.

Nó cũng được dùng để điều trị bệnh lao và các bệnh truyền nhiễm khác do
các vi khuẩn họ Mycobacteriaceae gây nên.
Các kháng sinh khác lại hoạt động như các chất trao đổi bằng cách cản
trở chức năng của các acid nucleic. Chúng được gọi là các chất tương đồng vì
cấu trúc giống với các nucleotide cấu tạo nên các acid nucleic. Chính đặc
điểm đó đã cho phép chúng kết hợp được với DNA và RNA của vi khuẩn gây
bệnh, làm thay đổi cấu trúc của chúng và dẫn đến làm dừng quá trình sao
chép, phiên mã, dịch mã. Các CKS này thường được dùng để điều trị các
bệnh do virus gây ra.

13

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

1.1.5. Thực trạng kháng kháng sinh của các chủng VSV gây bệnh
Kháng kháng sinh (hay còn gọi là kháng thuốc) là tình trạng các VSV
như vi khuẩn, virut, nấm và ký sinh trùng thay đổi cách thức làm cho các
thuốc trị bệnh do chúng gây ra trở nên vô hiệu. Vi khuẩn kháng hầu hết kháng
sinh gọi là vi khuẩn siêu kháng thuốc (superbug). Vấn đề kháng thuốc chẳng
còn mới mẻ, nhưng nó đã trở nên nguy hiểm, cấp bách, đòi hỏi sự nỗ lực hợp
nhất nhằm giúp nhân loại tránh quay ngược lại thời kỳ chưa có kháng sinh
(năm 1942).
CKS đã được sử dụng rộng rãi trong việc phòng chống bệnh cho cây
trồng, vật nuôi và bảo quản lương thực, thực phẩm ngay từ những năm 50 –
60 [51], [55]. Đến năm 1980 sản lượng CSK trên thế giới khoảng 25.000

tấn/năm. Trong đó sản lượng penicillin các loại là 17.000 tấn, tetracylin 5.000
tấn, ... [17]. Đến nay, nhiều vi khuẩn đã kháng với penicillin, do thuốc bị lạm
dụng, sử dụng quá mức hay không đúng yêu cầu. Một số vi khuẩn không còn
nhạy cảm với 8 hoặc 10 kháng sinh khác nhau. Bệnh lao, một thời bị
streptomycin khống chế, nay đã trỗi dậy với đại dịch AIDS và giết hại khoảng
3 triệu người hàng năm. Hiện nay, muốn tránh được tình trạng kháng thuốc,
cần phối hợp cả 2 hay 3 kháng sinh, hoặc phải liên tục có những kháng sinh
mới. Tiếc rằng từ năm 1970 sáng kiến đã lụi dần.
Có nhiều yếu tố gây nên tình trạng kháng kháng sinh. Một trong những
nguyên nhân kháng thuốc là việc sử dụng ồ ạt kháng sinh trong chăn nuôi để
chữa bệnh và bổ sung với liều lượng thấp các thuốc kháng sinh vào thức ăn để
thúc đẩy tăng trưởng gia súc. Năm 1974 Châu Âu đã cấm sử dụng penicillin,
tetracylin và nhiều kháng sinh khác để nuôi thúc súc vật. Sự xuất hiện ngày
càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh
mới làm cho chúng ta đang phải đối mặt với thời kỳ “hậu kháng sinh” [50].
14

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

Ngày càng có nhiều chủng VSV kháng kháng sinh. Báo cáo của WHO
cho thấy, mỗi năm trên thế giới ước tính có thêm 440.000 ca nhiễm mới bệnh
lao đa kháng thuốc gây ít nhất 15.000 ca tử vong. Ở Việt Nam con số này là
khoảng 5.900 ca nhiễm lao đa kháng thuốc gây tử vong ít nhất 1.800 ca mỗi
năm. Nghiêm trọng hơn là lao siêu kháng đa thuốc đã xuất hiện ở 58 quốc gia.
Hiện tượng kháng thuốc điều trị sốt rét, HIV, nhiễm khuẩn bệnh viện, nhiễm

khuẩn thuông thường đang tăng lên nhanh chóng [54].
Với vi khuẩn E. coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu,...) có
mức kháng cao tới 90% với kháng sinh Ampicillin, 80% với Cloramphericol
và Ciprofloxacin.
Kháng kháng sinh hiện nay đang là vẫn đề lo ngại toàn cầu vì nó sẽ dẫn
đến những hậu quả khôn lường đối với người bệnh và xã hội. Nó có thể gây
tử vong khi mà các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn kháng thuốc gây ra không
còn điều trị hiệu quả bởi các liệu pháp điều trị chuẩn. Khi đó mầm bệnh sẽ lây
lan và phát tán nhanh chóng. Hiện tại, các VSV kháng thuốc đang làm suy
yếu cuộc chiến chóng lại bệnh tật, như bệnh lao và bệnh sốt rét – những bệnh
đã ngăn chặn được từ nhiều thập kỷ trước. Đồng thời các căn bệnh khác đã có
từ lâu lại đang xuất hiện và có khả năng không có thuốc chữa. Đây là vấn đề
của toàn xã hội. Các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới đã và đang nỗ lực hết
sức để tìm ra những giải pháp cho vấn đề này.
1.2. PEPTIDE KHÁNG KHUẨN CECROPIN
1.2.1. Nguồn gốc của peptide kháng khuẩn
Peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptide – AMP) còn được gọi là
peptide bảo vệ vật chủ, là một họ các protein có trọng lượng phân tử nhỏ, hoạt
tính kháng khuẩn phổ rộng [25]. Peptide kháng khuẩn là một thành phần bảo

15

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học