Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------------

Nguyễn Đình Dũng

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN MALOLACTIC VÀ ỨNG DỤNG
TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VANG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------------

Nguyễn Đình Dũng

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN MALOLACTIC VÀ ỨNG DỤNG
TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VANG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 01 07
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA
HỌC:
TS. Trương Hương Lan

GS.TS. Phạm Văn Ty


Hà Nội – 2014


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực tập tốt nghiệp và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được
sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân.
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trương Hương Lan Chủ nhiệm bộ môn thực phẩm và dinh dưỡng - Viện Công nghiệp thực phẩm, người
đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cặn kẽ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và
hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS.
Phạm Văn Ty - Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, thầy đã hướng
dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành
luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể cán bộ, nhân viên trong
Phòng Thực phẩm và dinh dưỡng - Viện Công nghiệp thực phẩm đã quan tâm, giúp
đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt
nghiệp này.
Tôi cũng xin cảm ơn chân thành tới các thầy giáo, cô giáo, trong Khoa Sinh
học trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã chỉ bảo, tạo
điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và những người
thân đã ở bên tôi, tạo điều kiện cả về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2014
Học viên

Nguyễn Đình Dũng


MỤC LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG
3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men malolactic...................................................53

DANH MỤC CÁC HÌNH
3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men malolactic...................................................53
3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men malolactic...................................................53


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AG

Acid Grape - Nước nho axít

CoA

Coenzyme A

CFU

Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc

HDL

High density lipoprotein - Lipoprotein có tỷ trọng cao

LAB

Lactic acid bacteria - Vi khuẩn lactic

MRS

De Man, Rogosa and Sharp - Môi trường MRS

NAD+

Nicotinamit Adenin Dinucleotide

NADH

Nicotinamit Adenin Dinucleotide Hydrogen

EO

Chế phẩm Essential oenos

OD

Optical density - Mật độ quang

MLF

Melolactic fermentaeion - Lên men malolactic

MỞ ĐẦU
Rượu vang là đồ uống có cồn được sản xuất từ quá trình lên men dịch quả
nói chung mà phổ biến nhất là từ quả nho. Do nho là loại quả có thành phần hoá học
thích hợp cho nấm men phát triển và có hương thơm đáp ứng được những yêu cầu
cho sản xuất rượu vang chất lượng cao. Trải qua lịch sử hình thành và phát triển lâu
đời, rượu vang nho với nồng độ rượu vừa phải từ 10-14%v là đồ uống có lợi cho
sức khỏe của con người với giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon rất được ưa
chuộng ở khắp nơi trên thế giới. Từ nhiều năm nay, rượu vang nho đã trở thành
thức uống phổ biến ở nước ta. Thị trường rượu vang trong nước rất phát triển, tuy
nhiên vẫn chưa đáp ứng được yêu cầu cả về chất và lượng. Theo số liệu của Tổng
cục thống kê, kể từ năm 2010 đến nay, rượu vang nhập khẩu đã tăng khoảng 25%/
năm. Trong đó, Ninh Thuận được biết đến là vùng trồng nho chính có sản lượng lớn
nhất cả nước, hiện trồng chủ yếu là giống nho Red Cardinal thường dùng để ăn tươi
hơn là để lên men rượu vì cho màu sắc nhạt, không hấp dẫn. Do vậy, chất lượng
rượu vang Việt Nam hiện nay chưa thật cao khi so sánh với rượu vang nhập khẩu
do hương và vị sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn, màu sắc dễ bị nâu hoá, sản phẩm bị
lắng cặn…Với tiềm năng về thị trường lớn như ở nước ta, việc cải tiến công nghệ
để sản xuất rượu vang nho là vấn đề đang rất được quan tâm.
Nhiều nước trên thế giới đã giải quyết được vấn đề này bằng những nghiên
cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất rượu vang nho đi sâu làm rõ các cơ chế như: sự
chuyển hóa các thành phần trong nho thành các chất thơm trong rượu vang, tác
động của điều kiện môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
malolactic trong quá trình lên men malolactic[26, 27]…Quá trình lên men rượu
vang là quá trình lên men thực hiện chủ yếu nhờ nấm men và một phần bởi vi khuẩn
lactic có mặt trên quả nho hoặc trên thiết bị làm rượu. Nấm men sử dụng hệ enzym
của mình để chuyển hóa glucoza và một số đường khác thành rượu và các sản phẩm
phụ khác (rượu bậc cao, este, các axít hữu cơ...), trong khi đó vi khuẩn lactic
chuyển hóa axít malic thành axít lactic và CO 2 bằng quá trình lên men malolactic.
Lên men malolactic đóng vai trò quan trọng trong sản xuất rượu vang đỏ và 1 số

1


loại vang trắng, đây là một quá trình không thể thiếu trong việc làm biến đổi các
thành phần hóa học, mang lại cho rượu vang những hương vị đặc trưng. Với điều
kiện, công nghệ sản xuất rượu vang của Việt Nam hiện nay, việc phân lập và tuyển
chọn một số chủng vi khuẩn lactic để tối ưu hóa quá trình lên men malolactic là rất
cần thiết. Điều này đã giúp các nhà sản xuất rượu vang kiểm soát quá trình sản xuất
rượu vang được tốt hơn, giảm rủi ro tạo ra các sản phẩm hỏng hoặc có chất lượng
không ổn định, đồng thời làm đa dạng các chủng loại rượu vang phục vụ cho nhu
cầu người tiêu dùng. Từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới cho công nghệ sản xuất
rượu vang nho chất lượng cao của Việt Nam giải quyết những vấn đề thực tiễn của
ngành sản xuất rượu vang trong nước.Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang”.

2


CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu chung về rượu vang
1.1.1 Vài nét về rượu vang
Rượu vang là thức uống có cồn được sản xuất bằng phương pháp lên men
không chưng cất từ dịch nho. Nhờ tác nhân lên men (lên men một giai đoạn) hoặc
nhờ nấm men và vi khuẩn lactic (lên men hai gian đoạn) đã tạo cho rượu vang có
hương vị đặc trưng, cũng như giá trị dinh dưỡng cao hơn hẳn các loại rượu khác.
Thuật ngữ “Rượu vang”- tiếng la tinh là “vinum”, được bắt nguồn từ chữ “vinea”,
có nghĩa là cây nho. Trước tiên việc sản xuất rượu vang được tiến hành bằng cách
ép lấy dịch quả nho, sau đó lên men hoàn toàn tự nhiên trong các hang đá. Người La
Mã có công truyền bá nghề trồng nho làm rượu sang Pháp Marseilles từ thế kỉ II,
sau đó là vùng Champagne và Monselle Valley vào khoảng thế kỉ IV. Pháp bắt đầu

xuất khẩu rượu vang sang Anh và Đức vào thế kỉ XII. Vào năm 1857, lần đầu tiên
trong lịch sử, Louis Pasteur công bố những nghiên cứu về quá trình lên men, xác
định rõ vai trò quan trọng của nấm men trong quá trình lên men rượu và sự biến đổi
hoá sinh trong quá trình lên men của nấm men [8]. Đến nay đã có hàng trăm loại
rượu vang khác nhau đáp ứng được nhu cầu đa dạng của người tiêu dùng. Phân loại
rượu vang được dựa trên màu sắc: vang màu và vang trắng, trong các loại vang màu
thì rượu vang đỏ có giá trị cao nhất. Ngày nay nguyên liệu chế biến rượu vang được
mở rộng ra các loại nguyên liệu quả khác nhau, phong phú về màu sắc và chất lượng.
Trải qua nhiều thế kỷ, rượu vang đã khẳng định vai trò của nó với sức khỏe
con người. Louis Pasteur đã nhiều lần khẳng định: “Rượu vang là loại đồ uống rất
vệ sinh và rất có lợi cho sức khoẻ”. Khoa học hiện nay đã phát hiện trong rượu
vang đỏ có chứa chất trans-resveratrol là một chất chống oxi hóa, gặp trong vỏ của
quả nho đỏ (vỏ mỗi quả chứa khoảng 2µg trans-resveratrol). Các polyphenol trong
Chất này có tác dụng trung hòa các tác nhân oxi hóa, chẳng hạn các gốc tự do được
tạo thành trong quá trình trao đổi chất bình thường của tế bào. Các gốc tự do này sẽ
gây hư hại mô nếu không nhanh chóng được loại bỏ. Chính tác dụng nói trên của

3


trans-resveratrol đã góp phần làm giảm nguy cơ tử vong do bệnh nhồi máu cơ tim ở
người [30].
1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang [7, 8, 12]
Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương
ứng. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia các kiểu lên
men khác nhau. Có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu
khí. Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng
sẽ chuyển hóa đường thành ethanol và CO 2. Thực chất đây là quá trình oxi hoá khử có mặt các enzyme của nấm men. Năng lượng sinh ra phục vụ cho hoạt động
sống của nấm men hoặc bị tiêu hao dưới dạng nhiệt [7]. Sự thay đổi nhiệt độ trong
quá trình lên men có thể dẫn tới sốc nhiệt làm ảnh hưởng tới hoạt tính của nấm men.

Do vậy giữ nhiệt độ ổn định trong quá trình lên men là một yếu tố quan trọng giúp
quá trình lên men được hoàn thành. Nấm men nhạy cảm nhất với nhiệt độ trong giai
đoạn đầu phát triển và nhân lên và nó trở nên chống chịu tốt hơn trong giai đoạn
sau. Do vậy đối với lên men rượu vang thì giai đoạn đầu của quá trình lên men nên
duy trì ở nhiệt độ 18-22oC và sau đấy cho phép tăng dần lên [7, 12]. Nhiệt độ lên
men ban đầu quá cao có thể là nguyên nhân gây ra hiện tượng ì ở cuối quá trình lên
men.
Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính:
- Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm
men phát triển sinh khối.
- Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO 2: giai đoạn này nấm men
hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc
tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO 2.
Sản phẩm thu hồi của quá trình lên men rất phức tạp. Ngoài ethanol còn
nhiều chất khác như este, rượu bậc cao, các axit hữu cơ, glycerol, dầu fusel... Tỷ lệ
các sản phẩm phụ này phụ thuộc vào điều kiện của môi trường lên men.

4


Trong quá trình này, nấm men chuyển hóa đường thành rượu và giải phóng
CO2 dưới tác dụng xúc tác của enzyme do nấm men tạo ra theo con đường Enolpyruvat [7].

Nho đỏ
Nghiền/chà tách cuống
SO2

Cuống

Sulfite hóa

Ngâm
Tách dịch nho rỉ
Tách cặn

Nấm

Cặn

Hiệu chỉnh thành phần
dich nho

Hoạt hóa nấm men

Lên men

Vi khuẩn
lactic

Lên malolactic
Ủ rượu
Ổn định rượu
Làm trong
Rót sản phẩm

Rượu Vang

5

Cặn

Sơ đồ: 1.1 Quy trình công nghệ sản xuất rượu vang đỏ trên thế giới.
Trong quả nho và nhiều loại quả khác, hầu như chỉ có đường khử glucoza,
fructoza. Vì vậy nếu sử dụng dịch lên men hoàn toàn từ dịch ép quả thì quá trình lên
men rất thuận lợi. Sản phẩm thu hồi của quá trình lên men rất phức tạp. Ngoài
etanol, còn có nhiều các hợp chất khác như este, rượu bậc cao, các axít hữu cơ,
glyxerol...
Este: Các este được cho là có ý nghĩa lớn nhất đối với sự hình thành hương

vị rượu vang [40]. Mùi quả đặc trưng của vang chủ yếu nhờ vào một hỗn hợp của
hexyl axetat, etyl caprilat. Este có mặt nhiều nhất trong rượu vang là etyl axetat. Nó
được hình thành trong quá trình lên men và trong quá trình lưu giữ ở thùng gỗ sồi.
Ngưỡng cảm nhận của etyl axetat là 160 mg/l [41]. Trên ngưỡng này, nó ảnh hưởng
xấu đến hương vị của rượu nhưng ở nồng độ thấp hơn thì nó lại đóng góp tích cực
vào giá trị cảm quan của vang.
Rượu bậc cao: Rượu bậc cao được hình thành trong quá trình lên men rượu
và đạt tới nồng độ từ 150-550 mg/l [41]. Rượu bậc cao và các este của nó đóng vai
trò quan trọng đến việc tạo hương cho rượu. Các rượu bậc cao chủ yếu là các
isobutyl và các amyl alcohol. Ở nồng độ thấp hơn 300 mg/l, nó tạo hương rất tốt
cho rượu nhưng ở nồng độ cao hơn, hương của nó không chấp nhận được.
Các axít hữu cơ: Các axít hữu cơ có tác dụng làm bền và nâng cao giá trị
cảm quan của rượu, đặc biệt là rượu vang trắng [31]. Đặc tính bảo quản của nó cũng
làm tăng độ bền hóa lý và vi sinh vật của rượu vang. Các axít hữu cơ chủ yếu được
hình thành trong quá trình lên men là axít lactic, axít sucxinic, axít axetic, ngoài ra
còn có một lượng nhỏ axít butyric, axít formic và propionic,... nhưng nhiều hơn cả
là axít lactic và axít axetic. Các axít hữu cơ có tác dụng làm giảm pH môi trường
trong quá trình lên men. Chúng ít ảnh hưởng đến thành phần hương của rượu trừ
axít axetic tạo ra mùi dấm chua. Không thể sản xuất ra rượu mà không có ít axít
axetic nào. Hàm lượng trung bình của nó trong rượu vang bàn là nhỏ hơn 0,4g/l

6


trong khi ngưỡng phát hiện của nó là 3g/l. Nhiệt độ lên men malolactic cao thúc đẩy
sự tạo thành axít bay hơi nhiều hơn [27].
Ngoài ra, các thành phần như aldehyt, glyxerol được tạo ra bởi nấm men
trong quá trình lên men đều có tác dụng tạo nên hương thơm đặc trưng của rượu
vang. Quá trình lên men rượu đã giải phóng 40 kcal năng lượng tự do trên một phân
tử đường. Quá trình lên men thường chứa khoảng 180g đường/lít, do đó sự giải
phóng nhiệt về lí thuyết sẽ làm cho nhiệt độ lên men tăng từ 20oC lên 45oC [32].
Như vậy, ban đầu là quá trình lên men rượu được nấm men Saccharomyces
cerevissiae đảm nhận. Tiếp theo là hoạt động của các vi khuẩn Leuconostoc oenos,
Lactobacillus, Pediococcus chuyển hoá đường sót trong rượu vang non và quan trọng
hơn cả là quá trình lên men axít malic thành axít 1 actic và axít xitric thành axít axetic,
axetoin, diaxetyl, butađiol 2-3, góp phần đáng kể vào sự hình thành hương vị đặc trưng
của rượu vang, “Đây chính là quá trình lên men Malolactic ”. Trong công nghệ sản

xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiến hành sau khi lên men chính,
dịch lên men được gọi là “vang non” được tiến hành lắng gặn cặn và được chuyển
sang bồn hay nồi lên men tiếp theo [4].
1.2 Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là một bộ phận của hệ vi sinh vật tự nhiên trên quả nho,
trong dịch đường và rượu vang. Vi khuẩn lactic là những tế bào Gram dương, dị
dưỡng hoá năng hữu cơ, hoạt tính catalaza âm tính và axít lactic được xem là sản
phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất của chúng [4]. Chính pH axít, hàm
lượng êtanol và các thành phần khác của rượu vang tạo ra áp lực chọn lọc đối với
các vi khuẩn lactic. Chỉ có một số loài rất nhỏ có khả năng tự phát triển trong các
loại dịch đường và rượu vang. Các loài thường gặp trong sản xuất rượu vang chủ
yếu thuộc các giống sau: Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcus và Lactobacillus.
Sự xuất hiện của các loại vi khuẩn lactic này trên bề mặt quả nho là rất nhỏ, khoảng

100 tế bào/g quả [43]. Mật độ quần thể vi khuẩn lactic phụ thuộc rất nhiều vào điều
kiện khí hậu trong những ngày cuối cùng của quá trình chín, độ chín và trạng thái
vệ sinh của quả nho. Các quần thể vi sinh vật có mặt nhiều hơn trên vỏ quả nho chín

7


hoặc có tình trạng vệ sinh kém. Khi quá trình chín của quả nho kết thúc bởi một giai
đoạn nóng và ít mưa kéo dài, thì các vi khuẩn lactic sẽ xuất hiện nhiều hơn trên bề
mặt quả nho. Tuy nhiên, các loài vi sinh vật ban đầu này xuất hiện rất ít trong rượu
vang mà phần lớn là các loại vi khuẩn nhiễm tạp từ các dụng cụ làm rượu trong các
giai đoạn khác nhau diễn ra trong quá trình bơm dịch nước nho vào thùng lên men.
Mặc dù người ta có thể bắt gặp trong các loại rượu vang một số vi khuẩn tự nhiên từ
quả nho, nhưng chủ yếu vẫn là các vi khuẩn có nguồn gốc từ các thiết bị trong hầm
rượu. Tương tự như vậy đối với trường hợp của nấm men. Nấm men tự nhiên trên
bề mặt quả tự phát triển sau các thao tác công nghệ khác nhau diễn ra tiếp sau quá
trình thu hái và quá trình chuyển bơm dịch nước nho vào thùng lên men, cho tới tận
khi dịch đường nước nho được cấy giống. Tuy nhiên, cũng có thể là có sự phát triển
của các loại nấm men có nguồn gốc từ các vật liệu tiếp xúc với dịch nước nho. Do
vậy, sau giai đoạn thu hoạch nho, các nấm men nhanh chóng phát triển và chiếm
lĩnh hầm rượu. Trên thực tế, người ta vẫn chưa làm sáng tỏ được là con đường nào
trong hai con đường gieo giống tự nhiên này là có vai trò quan trọng hơn.
Trong suốt quá trình sản xuất rượu vang, các vi khuẩn lactic phát triển,
không chỉ về số lượng mà còn có cả sự thay đổi của các loài. Vi khuẩn phân lập
được trên vỏ quả nho trước khi thu hoạch thuộc chủ yếu là các loài Lactobacillus
plantarum, L. hilgardii và L. Casei. Loài Oenococcus oeni trước đây được gọi là
Leuconostoc oenos xuất hiện muộn hơn nhưng lại là quan trọng nhất, rất hiếm khi
chúng có mặt trên lá nho, quả nho và chỉ có số lượng rất ít. Trong thực tế, loài này
rất ít xuất hiện ở giai đoạn đầu của quá trình lên men. Các loại trực khuẩn và cầu
khuẩn xuất hiện trên quả nho thường xuyên hơn so với O.oeni. Trong số tất cả các

loài này nói trên, loài cuối cùng O.oeni được coi là có khả năng chống chịu cao nhất
đối với các điều kiện môi trường bất lợi của rượu vang như pH thấp, hàm lượng cồn
và SO2 cao và do vậy chịu trách nhiệm chính cho quá trình lên men malolactic
trong đa số các trường hợp[4].
Số lượng tế bào vi khuẩn lactic đạt 103 - 104 tế bào/ml sau quá trình ép nho
[43]. Dịch nước nho ngay sau khi được đưa đến thùng lên men có chứa một hệ vi

8


sinh vật rất đa dạng, phần lớn bao gồm các loài Lactobacillus plantamm, L. casei, L.
hilgardii, L. brevis,

Pediococcus

dcimnosLis, p. pentosaceus, Leuconostoc

mensenteroides và Oenococcus oeni. Tuy nhiên, trong tình trạng vệ sinh kém hoặc

trong các điều kiện vận chuyển hoặc mức độ sạch của các thiết bị trons, hầm rượu
không cao, số lượng tế bào vi khuẩn lactic có thể lên tới 106 tế bào/ml. Bên cạnh đó,
trong giai đoạn đầu của quá trình lên men rượu, các tế bào nấm men cũng có số
lượng tương tự. Điều này rất có thể dẫn đến sự nguy cơ cạnh tranh pháp triển giữa
vi khuẩn và nấm men. Hơn nữa pH của dịch nước nho chín kỹ thường rất cao tạo
điểu kiện thuận lợi cho các vi khuẩn. Đây là tác nhân quyết định chính tới số lượng
của quần thể các vi khuẩn và đối với sự phát triển của chúng trong giai đoạn đầu
của quá trình lên men. Trong quá trình sản xuất rượu vang, có lên men malolactic,
quần thể vi khuẩn tự nhiên pháp triển trải qua rất nhiều pha khác nhau. Trong những
ngày đầu tiên của quá trình lên men rượu, các loại vi khuẩn và nấm men tự phát
triển. Nhưng các nấm men thích nghi với dịch đường của nho nhiều hơn, tự sinh sản

rất nhanh đạt tới các quần thể rất lớn. Lafon- Lafourcade, 1983 đã bắt gặp, sự phát
triển của các vi khuẩn lactic đồng thời với sự phát triển của các nấm men trong giai
đoạn đầu của quá trình lên men nhưng nó chỉ dừng lại ở giới hạn từ 10 4 đến 105 tế
bào vi khuẩn lactic/mL [43]. Sự phát triển này phụ thuộc vào các điều kiện hoá lý
của môi trường và sự phát triển này còn cao hơn khi pH cao và hàm lượng SO 2 thấp
[29]. Sự phát triển của các vi khuẩn laclic trong giai đoạn đầu của quá trình lên men
nrợu mang tính chuyển tiếp. Trong giai đoạn hoạt động mạnh nhất của quá trình lên
men rượu và tới tận khi hàm lượng đường đã bị cạn kiệt, số lượng các vi khuẩn
giảm xuống nhanh chóng, chỉ còn 102 - 103 tế bào/ml và thậm chí còn thấp hơn do
sự cạnh tranh với các loại nấm men và các điều kiện môi trường. Trong quá trình
lên men rượu, sự cạnh tranh của nhiều loài vi khuẩn khác nhau diễn ra liên tục và
tới cuối quá trình lên men rượu thì chỉ có những loài chịu được với môi trường
êtanol tốt hơn tồn tại được, đặc biệt là các vi khuẩn O.oeni [35]. Cuối quá trình lên
men rượu, sẽ còn khoảng 102 - 103 tế bào/mL vi khuẩn O.oeni. Chính loài này sẽ tự
sinh sản ngay sau đó và tạo ra hệ vi sinh vật chịu trách nhiệm lên men malolactic.

9


Cũng có thể có các đại diện của các loài khác còn sống sót với số lượng rất nhỏ sau
quá trình lên men, chúng có thể phát triển nếu như rượu vang không được bảo vệ tốt
và đây chính là nguyên nhân làm hỏng rượu vang. Liên quan tới quá trình chuyển
hoá axít malic, loài O.oeμni này được khởi động ngay sau khi số lượng quán thể đủ
lớn để khởi động (thường là 10 6 tế bào/mL). Sự phát triển này có thể kéo dài trong
nhiều ngày hoặc nhiều tuần tuỳ theo các trường hợp. Lên men malolactic có thể
hoàn thành ở cuối pha tĩnh hoặc đầu pha suy vong. Nhưng nếu có các điều kiện là
thích hợp, lên men malolactic có thể kết thúc ở cuối pha phát triển. Cuối cùng, khi
kết thúc lên men malolactic, cần phải Sulfit hoá rượu vang để loại bỏ hoàn toàn các
vi khuẩn còn sống [14].
1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang

Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm các vi sinh vật Gram dương và do vậy được
nhuộm mầu bằng phép thử Gram có liên quan tới cấu tạo của thành tế bào. Các vi
khuẩn Leuconostoc và Oenococcus (hình 1-2) có dạng hình cầu. Đó là các tế bào nhỏ
(kích thước từ 0,5 - 1 μm) tròn hoặc hơi dài tạo ra các cặp hoặc chuỗi.

Hình 1.1 Tế bào dạng chuỗi của chủng O.oeni.
Tuỳ vào sự đa dạng của các sản phẩm trao đổi chất của các loại đường, các
vi khuẩn lactic được phân biệt thành 2 nhóm:
- Nhóm sinh axít lactic (> 85%) từ glucoza được gọi là lên men đồng hình như
các loài thuộc giống Pediococcus và loài Lactobacillus mali. Các vi khuẩn này phân

10


huỷ glucoza thành pyruvat theo con đường đường phân truyền thống. Pyruvat tiếp
theo bị khử thành axít D và/hoặc L - lactic phụ thuộc vào từng loài bởi các enzim
lactate dehydrogenaza L và/hoặc D. Quá trình này cho phép ôxy hoá khử các phân
tử NADH2+ thu được từ quá trình đường phân thành NAD+.
- Nhóm mà bên cạnh axít lactic, còn sản xuất axít axêtic, ethanol và CO 2, được
gọi là lên men dị hình. Người ta phân biệt:
+ Các loài dị hình nghiêm ngặt như các loài thuộc giống Leuconostoc và một vài
loài thuộc giống Lactobacillus (L. brevis, L. hilgardii...). Chúng không có enzim
aldolaza của hai con đường (đường và pentoza -photphat) phân và do vậy không thể
lên men các loại đường theo con đường lên men dị hình của các pentoza-photphat.
+ Các loài lên men dị hình tuỳ tiện như O.oeni, Lactobacillus casei và
Lactobacillus plantarum có các enzym của cả hai con đường (đường phân và

pentoza-photphat) và chúng thích nghi với một trong hai con đường này phụ thuộc
vào điều kiện môi trường [14].
1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni

Mặc dù có rất nhiều loài vi khuẩn malolactic sử dụng trong sản xuất rượu
vang nhưng O. oeni vẫn là loài vi khuẩn được lựa chọn bởi đa số các nhà sản xuất
rượu vang. O. oeni có tên gọi trước đây là Leuconostoc oenos, là một loài hiếu khí
tùy tiện và có thể sinh trưởng trên môi trường có pH thấp (pH 4,2-4,8) được bổ
sung nước cà chua hoặc nước nho [26]. Ở các vùng sản xuất rượu nho, nó có mặt
trong dịch hèm cũng như trong rượu vang non. Nguồn cacbon (có nguồn gốc từ các
loại đường), nitơ (từ các axit amin tự do hoặc các chuỗi peptit ngắn), các vitamin
(axit nicotinic, thiamin và uracil) là toàn bộ nhu cầu cho sự sinh trưởng tối ưu của vi
khuẩn này. O.oeni có khả năng chuyển hoá axít L-malic thành axít L-lactic, lên
men fructoza, glucoza và trehaloza. Quá trình lên men glucoza tạo ra axít D-lactic,
C02, axít axetic và etanol. Một số loài thuỷ phân arginin và một số khác lên men
axít xitric khi có mặt các loại đường có thế lên men, nhưng các tính chất này bị mất
đi sau một vài lần cấy liên tiếp [46].
Tế bào O. oeni có hình cầu và tồn tại ở dạng chuỗi khi sinh trưởng trên môi

11


trường rắn. Sự sinh trưởng tương đối chậm và có thể mất từ 5-7 ngày để hình thành
các khuẩn lạc có thể quan sát được tại nhiệt độ từ 20-30°C. Mặc dù trước đây chúng
được xếp vào cùng nhóm với các loài Lenconostoc, nhưng phân tích ADN đã chỉ ra
chúng là một nhóm tách biệt hoàn toàn với loài Leuconostoc [46].
O. oeni được coi là ứng viên tốt nhất để tiến hành lên men malolactic nhờ

sự thích nghi của chúng với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường, đặc biệt là
điều kiện axít và hàm lượng cồn cao trong rượu. Rượu vang cấy các chủng O . oeni
đã tuyển chọn cho phép dễ dàng kiểm soát toàn bộ quá trình lên men malolactic.
Ngoài ra, việc lựa chọn một chủng o. oeni có thể cho phép các nhà sản xuất rượu
đảm bảo về các tính chất được tạo ra trong sản phẩm cuối cùng. Do vậy, rượu vang

tạo ra đặc trưng. Mặc dù, thường chỉ một chủng vi khuẩn được lựa chọn, nhưng
trong một số trường hợp thỉ một hỗn hợp các chủng có thể được sử dụng để cấy
giống. Điều này không chỉ tạo ra các đặc tính được yêu thích hơn của rượu vang,
mà còn tạo ra khả năng sống sót cao nhất của vi khuẩn nếu có một thực khuẩn thể
trong rượu [26].
1.3 Quá trình lên men malolactic
1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic
Trong lên men rượu vang người ta gọi quá trình phân giải axit malic và
xitric dưới tác dụng của enzym malolacticase của O. oeni là quá trình lên men lactic,
một quá trình quan trọng bậc nhất trong giai đoạn lên men phụ của rượu vang và
sâm panh [3, 42]. Vi khuẩn lactic tự nhiên luôn có mặt trên vỏ quả nho sau khi chín
với số lượng từ 103 đến 104 CFU/ml và đi vào vang non theo dịch nước quả. Tuy nhiên,
số lượng của chúng lúc này cũng bị giảm đáng kể do bị ức chế và tiêu diệt bởi S0 2
(khoảng 50 mg/ml) ở giai đoạn sunfit hoá và nồng độ cồn cao (khoảng 14-15° cồn)
sinh ra sau quá trình lên men rượu. Do vậy, trong rượu vang non, các loại trực khuẩn
và cầu khuẩn lactic bị tiêu diệt gần như hoàn toàn và chỉ còn sót lại số lượng ít ỏi các tế
bào vi khuẩn O. oeni từ 102-103 CFU/ml. Tuy nhiêu, đây chính là tác nhân chính của
một quá trình quan trọng nhất trong giai đoạn lên men phụ kéo dài đó là quá trình lên
men malolactic.

12


Hình 1.2. Quá trình trao đổi chất của các vi khuẩn lactic lên men dị hình [32]
Đặc trưng cơ bản nhất của quá trình này là sự chuyển hoá hoàn toàn các
diaxít như malic và xitric có trong dịch quả và một phần sinh ra sau quá trình lên men
chính (khoảng 10 g/1) thành các monoaxít như lactic và axetic bởi các vi khuẩn O. oeni
[32]. Axit malic và xitric chủ yếu vào dịch lên men từ quả và chỉ một lượng ít được

tạo ra từ quá trình lên men rượu. Khi axit malic và xitric bị phân giải sẽ làm vang

chua dịu hơn và vị hài hoà hơn, một khi rượu vang không còn hai loại axit thì ít có
nguy cơ biến đổi độ chua và làm chất lượng vang ổn định hơn. Sản phẩm của quá
trình lên men malolactic từ axit malic là axit lactic và CO 2, còn từ axit xitric là
diaxetyl, axetoin, 2,3 - butadiol đây là những tiền chất tạo nên hình thơm đặc trưng
cho vang, ngoài ra còn tạo thành axít axêtic.
Cơ chế của quá trình lên men malolactic được trình bày tóm tắt theo sơ đồ
dưới đây:

Hình 1.3. Cơ chế của quá trình lên men malolactic

13


Lên men malolactic là một chuỗi các phản ứng hoá học phức tạp được xúc tác
bởi một hệ enzim có trong vi khuẩn L.oenos. Ban đầu là enzim malat dehydrogenaza
chuyển hoá axít malic thành axít oxaloaxetic, tiếp theo là phản ứng decacboxy được
xúc tác bởi enzim oxaloaxetat decacboxylaza để tạo thành axít pyruvic. Sản phẩm trung
gian này cuối cùng bị chuyển hoá thành axít D hoặc L-lactic bởi enzim D hoặc L-lactic
dehydrogenaza [12].

1.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic
Những nghiên cứu gần đây cho thấy, rượu vang được trải qua lên men
malolactic cho chất lượng cao hơn hẳn khi không trải qua giai đoạn này. Sự biến đổi
chất lượng của vang sau quá trình lên malolactic đã được chỉ ra là vì ba lí do chủ
yếu sau [3,4,42].
- Để giảm độ chua của vang do axit malic (diaxit) được chuyển thành axit
lactic (monoaxit), điều này làm giảm độ axit và tăng đọ pH nhờ đó mà vang thay vì
vị chua gắt của axit malic sẽ trở nên dịu hơn và vị hài hòa hơn.
- Làm tăng tính ổn định sinh học của rượu vang bởi vì sự phát triển của vi
khuẩn sẽ làm nghèo nguồn dinh dưỡng và loại khỏi môi trường hai axit hữu cơ quan

trọng là axit malic và axít xitric. Đảm bảo giảm tối thiểu quá trình lên men chậm
của vi khuẩn lactic khi bảo quản vang trong chai và sự phát triển một cách tự phát
của các vi sinh vật không mong muốn gây nên các bệnh cho vang.
- Làm tăng tổ hợp thơm của vang vì các hợp chất diaxetyl, axetoin và 2,3butanediol tạo ra từ quá trình chuyển hóa axit xitric bởi vi khuẩn là các hợp phần
tạo nên hương thơm cho vang. Những thành phần khác ảnh hưởng đến hương vị
cũng tăng như axit bay hơi, dietyl suxinat, một số este bay hơi, etyl axetat, npropanol, 2-butanol, n-hexanol, etyl lactate và 2,3 butanediol. Một số thành phần
khác cũng tăng nhẹ như 3-methy-n-butal axetat, n-hexyl axetat, 2-phenyletyl-axetat
và 2-etyl-n-hexanoat [42,44].

14


1.3.3 Ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến thành phần và chất
lượng rượu vang
1.3.3.1 Sự giảm độ chua
Mỗi phân tử axit L-malic chuyển hóa tạo ra axit L-lactic do sự mất đi nhóm
cacboxyl và làm giảm tương ứng độ axit của rượu vang. Độ giảm axít sau quá trình
lên men malolactic rất khác nhau phụ thuộc vào nồng độ axít malic. Độ giảm này từ
2-3 g/l (H2SO4). Lên men 1 g axít malic trong 1 lít rượu vang non sẽ làm giảm axít
tổng số xấp xỉ 0,4 g/1. Trong quá trình lên men malolactic, hàm lượng axít bay hơi
thường xuyên tăng lên, có thể một phần là do sự phá hủy của axít xitric. Vi khuẩn
cũng sản xuất axít axetic từ sự phân giải đường pentoza. Sự phân hủy axít malic
dường như là không đủ cung cấp năng lượng cho hoạt động tế bào [28].
Bảng 1.1. Phân tích rượu vang đỏ trước và sau lên men malolactic
Trước lên men

Sau lên men

Axít tổng số

(g/1 H2SO4)
4,9

(g/1 H2SO4)
3,8

Axít bay hơi

0,21

0,28

Axít malic

3,2

0,5

Axít lactic

0,12

1,8

Axít

Lên men malolactic được thừa nhận là có ảnh hưởng tới sự ổn định vi sinh
vật và sự phức tạp của hương vị, cần thiết để điều chỉnh độ axít và pH của rượu
vang. Sự tăng lên của pH đi kèm với lên men malolactic có thể cũng ảnh hưởng đến
màu sắc của rượu vang.

1.3.3.2 Những thay đổi về hương
Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn malolactic khác nhau
có thể tăng hoặc giảm cường độ của các đặc tính hương và vị của rượu vang và
những thay đổi này phụ thuộc vào chủng vi khuẩn. Ngoài ra, hương rượu vang chịu
tác động của lên men malolactic có thể là mùi bơ, mùi hạt dẻ, mùi nấm men, mùi gỗ

15


sồi, mùi mồ hôi và mùi đất. Lên men malolactic cũng tác động đến hương hoa và
quả cũng như cảm giác mềm mại của rượu vang [28,32]. Cơ chế ảnh hưởng của vi
khuẩn malolactic đến hương rượu vang có thể là:
- Loại bỏ những hợp chất tạo hương có trong rượu vang non bởi sự trao đổi
chất và hấp thụ với thành tế bào.
- Tạo ra các họp chất tạo hương mới từ vi khuẩn nhờ quá trình trao đổi chất
của đường, axít amin và các cơ chất khác.
- Sự trao đổi chất và biến đổi các sản phẩm thứ cấp từ nấm men và nho tới các
sản phẩm cuối cùng tạo ra tác động lớn hơn hoặc nhỏ hơn đối với giá trị cảm quan
của rượu.
Các chủng vi khuẩn lên men malolactic có khả năng tạo ra diaxetyl có mùi
bơ, mùi hạt dẻ. Mặc dù hàm lượng thấp từ 1-4 mg/1 tạo ra hương bơ đặc trưng cho
rượu vang nhưng hàm lượng vượt quá 5-7 mg/1 có thể ảnh hưởng bất lợi tới chất
lượng rượu vang và gây hỏng rượu [17,39].
Sự tạo thành diaxetyl chịu ảnh hưởng bởi các vi sinh vật, môi trường và các
yếu tố sản xuất. Ngoài yếu tố chủng vi sinh vật, các yếu tố sản xuất cũng có một tác
động đáng kể đến hàm lượng diaxetyl, bao gồm loại rượu, tương tác giữa cặn nấm
men và vi khuấn, thời gian hoàn thành lên men malolactic, sự tiếp xúc giữa rượu
vang và không khí, sự bổ sung S02, hàm lượng axit xitric và đường, nhiệt độ và pH.
Một số tiêu chí cho rằng để đạt được hàm lượng diaxetyl cao trong rượu vang bao
gồm sử dụng một chủng vi sinh vật có khả năng tạo ra hàm lượng diaxetyl cao, tỷ lệ

cấy giống vi khuẩn thấp, pH và nhiệt độ thấp hơn [11,37].
Hương quả của rượu vang không nhất thiết bị giảm bởi quá trình lên men
malolactic, thậm chí trong một số trường hợp nó có thế còn tăng lên do nó có thể
tạo ra các este như etyl lactat và isoamyl axetat. Điều thú vị là sự tăng lên của
hương quả nhờ quá trình lên men malolactic liên quan tới sự giảm đi của mùi rau.
Sự giảm đi của mùi rau trong rượu vang Chardonnay sau quá trình lên men
malolactic là loại bỏ mùi tỏi chín và mùi giống ure của 1-octanol và l-octene-3-ol [32] .

16


1.3.3.3 Ảnh hưởng đến màu sắc của rượu vang đỏ
Lên men maloactic rượu vang đỏ có thể làm giảm cường độ màu của rượu
vang đỏ. Ví dụ như sự tăng lên của pH trong quá trình lên men malolactic có thể tác
động đến sự cân bằng phụ thuộc pH của các chất màu anthocyanin, dẫn tới mất đi
màu đỏ. Sự giảm màu sắc của rượu vang đỏ tăng lên liên tục bởi sự kết tủa của các
phân tử anthocyanin được giải phóng với các polysaccharit. Lên men malolactic
cũng làm tăng sự kết tủa anthocyanin và tannin. Phản ứng này làm ổn định màu của rượu.
Tính chất cảm quan của rượu cũng được tăng lên nhiều. Hương của rượu
trở nên quyến rũ hơn. Rượu trở nên mềm mại hơn do sự khử gần như hoàn toàn axit
malic thành axít lactic. Kết thúc quá trình lên men malolactic, hương và vị của rượu
đầy đủ hơn nhưng lại thanh hơn [7].
1.3.3.4 Các chất ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và quá trình lên
menmalolactic
Thành phần rượu vang, phương pháp sản xuất và mối tương tác giữa vi
khuẩn malolactic và các vi sinh vật khác có thế ảnh hưởng tới sự sống sót và sinh
trưởng củavi khuấn malolactic trong rượu vang và vì vậy ảnh hưởng tới quá trình
lên menmalolactic. Tuy nhiên, các điều kiện môi trường như pH, nhiệt độ, độ cồn,
tình trạng dinh dưỡng, và S02 cũng chiếm một vai trò đáng kể (hình 1.4).
pH

INCLUDEPICTURE "C:\\Users\\My
PC\\Desktop\\tong quan

malolactic\\media\\image4.jpeg" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE
"C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\Dung thesis\\media\\image4.jpeg" \*
MERGEFORMATINET

17


Hình 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic [7]
Giá trị pH nhỏ nhất mà tại đó vi khuẩn sinh trưởng được trong rượu vang
xấp xỉ 2,9-3,0. Sự sinh trưởng của vi khuẩn nhanh hơn và quá trình lên men
malolactic hoàn thành sớm hơn khi pH tăng trên 3,0. Mặc dù pH 6,3 là tối ưu cho
hoạt động của các enzym malolactic, nhưng sự phân giải axit malic lại diễn ra
nhanh nhất tại các giá trị pH thấp hơn.
Khả năng chịu cồn là một đặc tính quan trọng của nhiều vi khuẩn
malolactic. Hầu hết các chủng không có khả năng phát triển trong rượu vang có
hàm lượng cồn lớn hơn 15% v/v nhưng một số lại quan sát thấy sự sinh trưởng ở độ
cồn 20% v/v.
Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu đối với phòng thí nghiệm v i khuẩn lactic là từ
25-27°C và tỷ lệ phân giải malatcao nhất tại nhiệt độ gần đó. Tốc độ sinh trưởng
của vi khuẩn malolactic và tốc độ lên men malolactic bị ức chế tại nhiệt độ thấp.
SO2 có tác dụng ức chế vi khuẩn malolactic, SO 2 còn có tác dụng thúc đẩy
quá trình lắng trong dịch nho. Theo Navarre (1994), đó là do sự ức chế hệ vi sinh
vật có trong nguyên liệu của SO2 nên không xảy ra hiện tượng lên men tự nhiên
trong hỗn hợp nho sau quá trình nghiền xé. Nhờ đó mà sự kết lắng của các cấu tử lơ
lửng trong dịch nho sẽ diễn ra nhanh và hiệu quả.
Sự có mặt của thực khuẩn thể có thể cũng ức chế quá trình lên men
malolactic trong rượu vang. Các chủng thực khuẩn thể chống lại các điều kiện bất

18